CN107688063A - 一种同时测定牛肝菌中12种生物碱的方法 - Google Patents

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陈欢
付亚宁
刘彤
李翔宇
张洪非
罗彦波
庞永强
韩雪
侯宏卫
胡清源
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Abstract

本发明涉及一种同时测定牛肝菌中12种生物碱的方法，属于理化分析技术领域。该方法包括以下步骤：（1）采用5%的氢氧化钠水溶液将植物中的生物碱游离出来；（2）使用二氯甲烷/甲醇混合溶液（V二氯甲烷/V甲醇=4:1）作为萃取剂进行液液振荡萃取；（3）离心后，取下层有机相转移到色谱分析瓶中进行GC‑MS分析。本发明中12种生物碱的加标回收率在97.60%~112.67%之间，精密度不高于6.10%，方法检出限在2.13~22.38 ng/g，具有操作简便、通量高、灵敏度高、回收率及重复性好等优点。

Description

一种同时测定牛肝菌中12种生物碱的方法
技术领域
本发明属于理化分析技术领域，具体涉及一种同时测定牛肝菌中12种生物碱的方法。
背景技术
生物碱是指一类存在于生物体内的含有氮杂环的有机化合物（蛋白质、钛类、氨基酸、氨、氨基糖、核苷酸、核酸除外），一般具有碱性并表现出一定的生理活性。烟碱是一类重要的最广为人知的生物碱，在烟草中含量很高，是烟草中最重要的生物碱。此外，烟碱在牛肝菌等植物中也广泛存在，除烟碱外，其他次要生物碱还包括降烟碱、新烟草碱、假木贼碱、麦斯明、β-二烯烟碱等。生物碱具有一定的生理活性，一些国家对部分食品中得烟碱含量作出限制，如欧盟规定烟碱在食用菌鲜品和干品的最高限量分别为0.036 mg/kg和1.17 mg/kg，而在牛肝菌干品的最高限量则为2.3 mg/kg，日本对其他食品中烟碱的最大限量为2mg/kg。人们对食品中烟碱的研究相对较多，测定方法包括气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、液相色谱-串联质谱法等（LC-MS/MS）、液相色谱法（HPLC）等。但是，人们对其他次要生物碱的研究较少。
发明内容
本发明的目的正是基于上述技术不足，建立了一种同时测定牛肝菌中12种生物碱的方法。本方法经过一次样品前处理过程即可同时测定牛肝菌中的12种生物碱，具有操作简便、通量高、灵敏度高、回收率及重复性好等优点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种同时测定牛肝菌中12种生物碱的方法，这12种生物碱分别为：烟碱、N-甲基假木贼碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、β-二烯烟碱、新烟草碱、2,3’-联吡啶、β-二烯降烟碱、可替宁、哈尔碱、烟台林，其特征在于：使用5%的氢氧化钠溶液将目标样品中的生物碱游离出来，再用二氯甲烷/甲醇混合溶液（V二氯甲烷/V甲醇=4:1）进行液液萃取，以气相色谱-质谱联用法进行测定，内标法定量。具体包括以下步骤：
1）标准工作溶液的制备
分别制备具有8级浓度梯度的12种生物碱标准工作溶液，其中，降烟碱的定量采用降烟碱-2,4,5,6-d4作为内标，其它生物碱的定量采用2,2’-联吡啶-d8作为内标；
2）样品前处理
准确称取约0.5 g经过真空冷冻干燥并粉碎的样品于15 mL塑料离心管中，再分别加入内标溶液和5%的NaOH水溶液，震荡混匀后，静置约20 min。然后加入10.0 mL二氯甲烷/甲醇混合溶液，加盖密封后置于涡旋振荡器中，以2000 rpm的速度涡旋振荡提取40 min。以10000 rpm的速度离心5 min后，取下层有机相转移到色谱分析瓶中进行GC-MS分析。
3）气相色谱-质谱分析
利用气相色谱仪配备质谱检测器对所制待测样品溶液和标准工作溶液进行分析，得到相关色谱图；
4）标准曲线绘制及结果计算。
本发明更具体的说包括以下内容：
1 标准溶液的配制
1.1 内标溶液的配制
分别准确称取约100.0 mg 降烟碱-2,4,5,6-d4、100.0 mg 2,2’-联吡啶-d8于50 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容，即得内标储备液。降烟碱-2,4,5,6-d4作为降烟碱内标，而2,2’-联吡啶-d8作为其他11种生物碱内标。将内标储备液以甲醇稀释50倍，即得到内标溶液。
1.2 一级标准储备液的配制
准确称取约20.0mg生物碱，置于25 mL的棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度。该溶液应在4℃～8℃条件下避光保存。
1.3 二级标准储备液的配制
准确移取约0.1 mL一级标准储备液于10 mL的棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度。该溶液应在4℃～8℃条件下避光保存。
1.4 标准工作溶液的配制
分别准确移取10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、1000 μL、2000 μL的二级标准储备液于不同的10 mL棕色容量瓶中，再分别准确加入50 μL内标溶液，用二氯甲烷稀释定容至刻度，即得到不同浓度的系列标准溶液。
仪器分析条件
所述方法的仪器分析条件为：
色谱柱：DB-35MS毛细管色谱柱，固定相：（35%-苯基）-甲基聚硅氧烷，规格：30 m ×0.25 mm × 0.25 μm。
进样口温度：250 ℃；进样量：1 μL；载气：氦气（纯度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0 mL/min。
柱升温程序：不分流进样；溶剂延迟：10 min；升温程序：初始温度80 ℃，保持1min，以8 ℃/min的速率至250 ℃，保持1 min，再以40 ℃/min的速率至280 ℃，保持5 min。运行总时间为29 min。
电离方式：电子轰击源（EI）；电离能量：70 eV；传输线温度：280 ℃；离子源温度：250 ℃；扫描离子范围：80～250 amu；质谱扫描方式：选择离子监视方式（SIM）扫描，目标物及内标的保留时间、定量及定性选择离子参数如表1所示。
样品前处理
准确称取约0.5 g经过真空冷冻干燥并粉碎的样品于15 mL塑料离心管中，再分别加入50 μL内标溶液和3.0mL5%的NaOH水溶液，震荡混匀后，静置约20 min。然后加入10.0 mL二氯甲烷/甲醇混合溶液（V二氯甲烷/V甲醇=4:1），加盖密封后置于涡旋振荡器中，以2000 rpm的速度涡旋振荡提取40 min。以10000 rpm的速度离心5 min后，取下层有机相转移到色谱分析瓶中进行GC-MS分析。
加标回收率和精密度
分别按照低、中、高3种水平加入12种生物碱标准品，每个添加水平重复测定5次，实验结果见表2。由表可知，12种生物碱的平均加标回收率在97.60%~112.67%之间，精密度不高于6.10%。
线性范围、检出限及定量限
本研究采用内标法进行定量，以各目标化合物的浓度为横坐标，分析物与内标物的峰面积比为纵坐标建立标准曲线。在优化条件下，考虑到样品中目标化合物的浓度范围，确定了方法的线性范围，并按照目标物信噪比为3时对应的浓度作为检出限，如表3所示。由表可知，标准曲线的相关系数不低于0.997，方法检出限在2.13~22.38 ng/g。
总之，建立了一种同时测定牛肝菌中12种生物碱的GC-MS高通量检测方法。本方法经过一次样品前处理过程即可同时测定目标植物中的12种生物碱，具有操作简便、通量高、回收率及重复性好等优点。
附图说明
图1为标准工作溶液选择离子流图;
图中：1：烟碱；2：N-甲基假木贼碱；:3：降烟碱及降烟碱-2,4,5,6-d4；4：麦斯明；5：2,2’-联吡啶-d8；6：假木贼碱；7：β-二烯烟碱；8：新烟草碱；9：2,3’-联吡啶；10：β-二烯降烟碱；11：可替宁；12：哈尔碱；13：烟台林。
图2为12种生物碱及其结构式。
具体实施方式
本发明通过以下具体实施例作进一步描述，但不限制本发明。
实施例1：
1、仪器及试剂
仪器：气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 7890B-5977A型）；AE163电子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler公司）；Talboys数显型多管式旋涡混合器；冷冻干燥机（FreeZone2.5 Plus，LABCONCO）；离心机（3-30K，SIGMA）。
试剂耗材：降烟碱由alfa购得，其他11种生物碱均由TRC购得，降烟碱-2,4,5,6-d4（CDN Isotopes），2,2’-联吡啶-d8（CDN Isotopes），甲醇（DUKSAN，色谱纯），二氯甲烷（DUKSAN，色谱纯），氢氧化钠（国药，分析纯），所用水由Milli-Q系统（Milford，MA，USA）制得。
2、样品前处理
准确称取约0.5 g经过真空冷冻干燥并粉碎的样品于15 mL塑料离心管中，再分别加入50 μL内标溶液和3.0mL5%的NaOH水溶液，震荡混匀后，静置约20 min。然后加入10.0 mL二氯甲烷/甲醇混合溶液（V二氯甲烷/V甲醇=4:1），加盖密封后置于涡旋振荡器中，以2000 rpm的速度涡旋振荡提取40 min。以10000 rpm的速度离心5 min后，取下层有机相转移到色谱分析瓶中进行GC-MS分析。
3、仪器分析条件
所述方法的仪器分析条件为：
色谱柱：DB-35MS毛细管色谱柱，固定相：（35%-苯基）-甲基聚硅氧烷，规格：30 m ×0.25 mm × 0.25 μm。
进样口温度：250 ℃；进样量：1 μL；载气：氦气（纯度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0 mL/min。
柱升温程序：不分流进样；溶剂延迟：10 min；升温程序：初始温度80 ℃，保持1min，以8 ℃/min的速率至250 ℃，保持1 min，再以40 ℃/min的速率至280 ℃，保持5 min。运行总时间为29 min。
电离方式：电子轰击源（EI）；电离能量：70 eV；传输线温度：280 ℃；离子源温度：250 ℃；扫描离子范围：80～250 amu；质谱扫描方式：选择离子监视方式（SIM）扫描，目标物及内标的保留时间、定量及定性选择离子参数如表1所示。
根据上述测定方法，选择3种牛肝菌样品（干重），测得12种生物碱含量如下表所示（单位：烟碱为μg/g，其他生物碱为ng/g）：

Claims (3)

1.一种同时测定牛肝菌中12种生物碱的方法，这12种生物碱分别为：烟碱、N-甲基假木贼碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、β-二烯烟碱、新烟草碱、2,3’-联吡啶、β-二烯降烟碱、可替宁、哈尔碱、烟台林，其特征在于：使用5%的氢氧化钠溶液将目标样品中的生物碱游离出来，再用二氯甲烷/甲醇混合溶液进行液液萃取，以气相色谱-质谱联用法进行测定，内标法定量，
具体包括以下步骤：
1）标准工作溶液的制备
分别制备具有8级浓度梯度的12种生物碱标准工作溶液，其中，降烟碱的定量采用降烟碱-2,4,5,6-d4作为内标，其它生物碱的定量采用2,2’-联吡啶-d8作为内标；
2）样品前处理
准确称取0.5 g经过真空冷冻干燥并粉碎的样品于15 mL塑料离心管中，再分别加入内标溶液和5%的NaOH水溶液，震荡混匀后，静置约20 min；然后加入10.0 mL二氯甲烷/甲醇混合溶液，加盖密封后置于涡旋振荡器中，以2000 rpm的速度涡旋振荡提取40 min；以10000rpm的速度离心5 min后，取下层有机相转移到色谱分析瓶中进行GC-MS分析；
3）气相色谱-质谱分析
利用气相色谱仪配备质谱检测器对所制待测样品溶液和标准工作溶液进行分析，得到相关色谱图；
4）标准曲线绘制及结果计算。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二氯甲烷/甲醇混合溶液的比例为V二氯甲烷/V甲醇=4:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，气相色谱-质谱分析过程的仪器分析条件为：
色谱柱：DB-35MS毛细管色谱柱，固定相：（35%-苯基）-甲基聚硅氧烷，规格：30 m ×0.25 mm × 0.25 μm；
进样口温度：250 ℃；进样量：1 μL；载气：氦气（纯度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0mL/min；
柱升温程序：不分流进样；溶剂延迟：10 min；升温程序：初始温度80 ℃，保持1 min，以8 ℃/min的速率至250 ℃，保持1 min，再以40 ℃/min的速率至280 ℃，保持5 min，运行总时间为29 min；
电离方式：电子轰击源（EI）；电离能量：70 eV；传输线温度：280 ℃；离子源温度：250℃；扫描离子范围：80～250 amu；质谱扫描方式：选择离子监视方式（SIM）扫描，目标物及内标的保留时间、定量及定性选择离子参数如下表所示：
。
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