CN110333308B - 一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中nnal和可替宁的方法 - Google Patents

一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中nnal和可替宁的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法。该方法包括下述步骤：1)配制含有NNAL、可替宁、同位素标记的NNAL、同位素标记的可替宁的单一标准品储备溶液；2)分别配制含有NNAL、可替宁的系列浓度的混合标样工作液，制成标准曲线；3)取待测尿样，加入含同位素标记内标的磷酸盐缓冲溶液，加入15‑25μLβ‑葡萄糖醛酸苷酶酶解；4)将酶解后的样液取出并放置至常温，进行固相萃取，进行仪器分析，根据步骤2)制成的标准曲线计算得到NNAL和可替宁的含量。该方法有效解决了现有的尿液中NNAL和可替宁的同时测试方法前处理繁琐、耗时长的问题，同时大大降低了尿液中的基质效应，提高了检测灵敏度和准确性。

Description

一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的 方法
技术领域
本发明属于烟草烟气暴露生物标记物检测领域，具体地，涉及一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法。
背景技术
烟草的使用导致了全球每年数百万人死亡，造成了严重的公共卫生问题。烟草烟气中包含了已确认的60余种致癌物，对这些致癌物暴露及危害进行评价时，常需要选取适当生物标志物对烟草烟气的摄入量、致癌物摄入量和健康效应等进行评价。尼古丁作为存在于烟草中的一种成瘾性生物碱，在较短时间内，大部分尼古丁在肝脏中被代谢为可替宁，最终一部分尼古丁和可替宁随尿液排出。因此尿中的可替宁是评价环境烟草烟雾暴露的关键生物标志物。烟草特有亚硝胺(Tobacco-specific nitrosamines,TSNAs)是一类在烟草生产加工和燃烧中产生的亚硝胺，具有极强的致癌作用。4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol,NNAL)既是TSNAs的成员之一，同时又是NNK的主要代谢产物，NNAL经过代谢活化后具有较强的致癌性，其清除半衰期较长(约40天)，在尿样中含量较高。因此，尿样中NNAL含量被广泛的用于与烟草摄入相关的TSNAs暴露评价。为了有效的评估烟草摄入量和烟草特有亚硝胺致癌物摄入水平，建立同时测定尿中可替宁和NAAL方法是必要的。
液相色谱法(Liquid chromatography,LC)与串联质谱(Tandem massspectrometry,MS/MS)联用是测定NNAL和可替宁的首选方法，目前仅见一篇两者同时分析的文献报道，但采用的两次固相萃取进行样品前处理，操作繁琐耗时，不适用于快速、准确的批量分析，且灵敏度不高，NNAL和可替宁的检出限分别为12.54ng/L和73.92μg/L，无法满足非吸烟者尿样的分析。生物样品中NNAL的含量极低，在大部分非主动吸烟者尿样中不到10ng/L，因测定时样品基质影响较大，常常导致非吸烟者检出率很低。固相萃取法被广泛的应用于样品净化和富集，以去除基质效应，提高方法灵敏度。在NNAL分析中，TSNAs专用的分子印迹聚合物(Molecular imprinted polymer，MIP)、MCX、HLB固相萃取柱被大多学者采纳。MIP能有效去除基质效应，Bernert John T.等报道，采用MIP进行尿样前处理，联用反相高效液相色谱串联质谱检测，非吸烟者尿样检出率能达到近半，但MIP柱价格昂贵，不易普及；MCX、HLB虽可以减少部分样品干扰，但共洗脱物产生的基质效应不容忽视，往往达不到非吸烟者尿样检测的灵敏度要求。在这种背景下，迫切需要建立一种灵敏高效的方法，既能实现尿中NNAL和可替宁的同时分析，又能同时满足吸烟者和非吸烟者尿样中NNAL检测的灵敏度要求，现有文献报道中尚未有很好的解决办法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，该方法有效解决了现有的尿液中NNAL和可替宁的同时测试方法前处理繁琐、耗时长的问题，同时大大降低了尿液中的基质效应，提高了检测灵敏度和准确性。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：
一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，包括下述步骤：
1)分别配制含有4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁、同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、同位素标记的可替宁的单一标准品储备溶液；
2)分别配制含有4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁的系列浓度的混合标样工作液，系列浓度的混合标样工作液中，同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、同位素标记的可替宁的浓度保持不变，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁的浓度成比例增大；将系列浓度的混合标样工作液注入色谱柱进行仪器分析，制成标准曲线；
3)取待测尿样，加入含同位素标记内标的磷酸盐缓冲溶液，尿样与磷酸盐缓冲溶液的体积比为8-12:1，磷酸盐缓冲溶液中同位素标记4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇和同位素标记的可替宁浓度为10ng/L和100μg/L，加入15-25μLβ-葡萄糖醛酸苷酶酶解，混合后，于36-38℃恒温放置4～24小时；
4)将步骤3)酶解后的样液取出并放置至常温，选用PRiME HLB固相萃取柱进行固相萃取，固相萃取柱先以甲醇和超纯水活化平衡，然后以乙酸乙酯作为洗脱液洗脱，收集洗脱液；取部分洗脱液以恒流氮气将洗脱液吹蒸至干，乙腈充分复溶后，取上清液进样进行仪器分析，用于检测4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇，另一部分洗脱液直接上样用于检测可替宁，根据步骤2)制成的标准曲线计算得到4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇和可替宁的含量。
NNAL(4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇)和可替宁的化学结构式如下所示：
Figure BDA0002135107820000021
具体地，步骤2)中，以4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁的浓度为横坐标，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁与同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、同位素标记的可替宁的比值为纵坐标，制成标准曲线。
进一步地，步骤2)所述系列浓度的混合标样工作液中，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇的浓度范围是0～3000ng/L，可替宁的浓度范围是0～400μg/L；标准曲线绘制方法为：取NNAL和可替宁标准品储备溶液，以乙腈为溶剂配制得到NNAL浓度为0、5、10、20、50、100、300、600、3000ng/L以及可替宁浓度为0、10、20、50、80、100、200、300、400μg/L的系列标准混合溶液，系列标准混合溶液中13C6-NNAL、D3-尼古丁的浓度保持不变；将系列标准混合溶液注入液相色谱-串联质谱条件进行检测，以4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁的浓度为横坐标，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁与同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、同位素标记的可替宁的峰面积的比值为纵坐标，制成标准曲线。
具体地，步骤4)中，以甲醇和超纯水活化平衡的具体步骤为：取步骤3)酶解后的样液的上层清液上样，流出速度控制为每滴2-4s；淋洗采用体积比为5％甲醇水溶液，流出速度控制为每滴2-4s，完成后以空气吹干固相萃取柱。
具体地，步骤3)中所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4，尿样与磷酸盐缓冲溶液的体积比为8-12:1；β-葡萄糖醛酸苷酶的加入量为15-25μL。磷酸盐缓冲溶液(PBS)配制方法为：称取80g NaCl，2.0g KCl，14.4g Na2HPO4，2.4g KH2PO4溶解于800mL超纯水中，调节pH至7.4并用超纯水定容至1L。于4℃长期保存，临用前复温。酶用量：取尿样1.5mL尿样于离心管中(如尿样为经过冷冻处理的样品，则将尿样取出放置于室温下自然解冻，混匀后取尿样1.5mL尿样于离心管中)；按比例加入含13C6-NNAL和D3-可替宁的PBS溶液，混匀后加入15-25μLβ-葡萄糖醛酸苷酶；混合后，于37℃恒温过夜。同位素标记的终浓度范围：同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇为10ng/L，同位素标记的可替宁100μg/L。
步骤2)和3)中所述仪器分析为液相色谱串联质谱法分析。
所述液相色谱仪采用ACQUITY
Figure BDA0002135107820000031
BEH HILIC色谱柱进行色谱分离；色谱条件为：流动相A为3mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为纯乙腈，采用梯度洗脱：0～0.8min保持流动相B 97％，0.8～0.9min流动相B降至75％，0.9～4.0min保持流动相B比例为75％，4.0～4.2min流动相B上升至97％，4.2～10min保持流动相B比例为97％；流速为0.3mL/min；进样量5μL；柱温箱温度恒定为40℃，单次进样运行时间为10min。
质谱条件为：采用电喷雾电离源，扫描模式为正离子模式，多反应监测模式下检测；待测物扫描时间均为0.309s，采集时间为0～7.0min；仪器其它参数为：接口电压4.0kV；雾化气为高纯氮气，3L/min；加热气为无水空气，10L/min；干燥气为氮气，10L/min；碰撞气为氩气，270kPa；接口温度300℃；DL管温度250℃；加热块温度400℃；
多反应监测模式参数和其它的质谱条件为：
Figure BDA0002135107820000041
*定量离子
具体地，PRiME HLB固相萃取柱为60mg/3cc小柱。
具体地，步骤1)中各标准储备溶液制备方法为：
4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇标准储备溶液：称取适量4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇标准品，以乙腈为溶剂溶解并定容，配制成500mg/L NNAL的标准储备溶液；
13C6-NNAL标准储备溶液：称取适量13C6-NNAL标准品，乙腈为溶剂溶解并定容，配制成50mg/L 13C6-NNAL的同位素标准溶液；
D3-可替宁标准储备液：称取10mg D3-可替宁，以10mL乙腈溶解，配制成1.0g/L标准储备溶液；
可替宁标准储备溶液：1.0g/L可替宁标准储备溶液。
系列浓度的混合标样工作液可以根据上述单一标准品储备溶液进行配制，具体配制方法为：分别取NNAL、13C6-NNAL、可替宁、D3-可替宁标准储备溶液适量，均以乙腈为溶剂稀释，配制成适合浓度的标准应用液。
本发明的方法中，通过对内标、固相萃取柱、柱子平衡、淋洗、洗脱、亲水作用色谱等关键检测步骤和检测参数的控制，能够解决现有的尿液中NNAL和可替宁的同时测试方法前处理繁琐、耗时长的问题，同时大大降低了尿液中的基质效应，提高了检测灵敏度和准确性。其具体处理方法为：
1.内标：标准曲线系列和样品分别加入13C6-NNAL、D3-尼古丁，然后进行标准系列配制和样品前处理，采用内标校正标准曲线用于定量，即以待测物浓度为横坐标，待测物与同位素内标峰面积的比值为纵坐标。
2.酶解：将尿样取出放置于室温下自然解冻，混匀后取1.5mL尿样于离心管中；加入含10ng/L13C6-NNAL和100mg/L D3-可替宁的PBS溶液，混匀后加入β-葡萄糖醛酸苷酶；混合后，于37℃恒温过夜。样液取出并放置至常温后，以4000rpm离心5min待上样固相萃取柱。
3.固相萃取柱：选用PRiME HLB(3cc,60mg)固相萃取柱。
4.固相萃取柱的活化平衡处理：以3.0mL甲醇和2.0mL超纯水对柱子进行活化平衡。
5.固相萃取柱上样，淋洗：取酶解液上层清液3.0mL上样，流出速度控制为每滴约3s；淋洗采用2.0mL 5％甲醇水溶液(v:v)，流出速度控制为每滴约3s，完成后以空气吹干固相萃取柱。
6.固相萃取柱的洗脱和浓缩：以5.0mL乙酸乙酯作为洗脱液洗脱，流出速度控制为每滴约3s，尖底离心管收集洗脱液。取4.5mL洗脱液以恒流氮气将洗脱液吹蒸至干，45μL乙腈充分复溶后，12000rpm的速度离心5min，取上清液供LC-MS/MS进样分析NNAL，其余洗脱液过滤后直接进样测定可替宁。
7.亲水作用色谱：实验采用ACQUITY
Figure BDA0002135107820000051
BEH HILIC色谱柱(50×3.0mm,1.7μm)进行色谱分离；流动相A(A相)为3mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B(B相)为纯乙腈，采用梯度洗脱。单次进样运行时间为10min。
8.样品的保存：样品收集于已编号的50mL聚丙烯塑料离心管中，于-80℃冰箱中长期保存，样品至少稳定1个月。
本发明涵盖了上述的实施要点的所有合适的组合。
本发明具有的有益效果是：
1、本方法采用了新型的PRiME HLB固相萃取柱，仅需一次固相萃取即可有效地去除样品基质效应，通过对固相萃取条件的优化，使得基质效应降到低水平，仅需1.5mL样品，方法灵敏度可满足非吸烟人群尿样的检测，大大提高了低浓度非吸烟人群的检出率和工作效率；
2、本发明采用的PRiME HLB固相萃取柱是商品化的小柱，其操作说明书指明无需进行活化和平衡步骤，可直接上样，但本发明发现用甲醇和水活化平衡后，可大大降低固相萃取柱的内源性基质效应，使其净化效果比实验室常规配置的MCX、HLB固相萃取柱更好，而检测成本相较NNAL专用柱Supel MIP柱可大大降低；
3、本方法采用了亲水作用色谱分离，进一步降低了样品基质效应带来的干扰，同时，在10min内完成了尿样中可替宁和NNAL的同时分析，提高了方法灵敏度和工作效率；
4、本发明方法用同位素内标法进行定量，减小甚至消除了尿样基质效应对定量带来的干扰，准确性高。
5、本发明从内标、酶解、固相萃取柱的选择、固相萃取柱的活化平衡处理、选择亲水作用色谱分离、同位素内标法进行定量等各方面对方法进行了优化，方法的灵敏度和定量准确性得到大幅提高。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1是NNAL、可替宁及其相应的同位素内标物的提取离子色谱图；
图2是待测尿样的NNAL、可替宁及其相应的同位素内标物提取离子色谱图；
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
随机采集20份吸烟者尿样，运用本发明的亲水作用色谱串联质谱分析尿液中NNAL和可替宁，包括以下步骤。
(1)选取NNAL和可替宁作为烟草特有亚硝胺(Tobacco-specific nitrosamines,TSNAs)和烟草暴露的特征代谢产物；配制含有上述两种特征代谢产物的单一标准品储备溶液、含有上述两种特征代谢产物的同位素内标物的单一标准品储备溶液、以及含有上述两种种特征代谢产物及其相应同位素内标物的混合标准品溶液；
其中的NNAL标准品(纯度95％)、13C6-NNAL标准品(纯度98％)购自加拿大TorontoResearch Chemicals公司。可替宁标准溶液(1.0g/L甲醇溶液)购自美国Sigma-Aldrich公司；D3-可替宁标准品(纯度≥98％)购自加拿大C/D/N ISOTOPES公司。
(2)配制系列浓度的混合标样工作液；系列混合标样工作液中，内标的浓度保持不变，而目标化合物的浓度成比例增大；将系列浓度的混合标样工作液注入色谱柱进行仪器分析，以(标样峰面积/内标样峰面积)为响应值；根据响应值与工作标样浓度之间存在的线性关系，制成标准曲线；
步骤2)所述系列浓度的混合标样工作液中，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇的浓度范围是0～3000ng/L，可替宁的浓度范围是0～400μg/L；标准曲线绘制方法为：取NNAL和可替宁标准品储备溶液，以乙腈为溶剂配制得到NNAL浓度为0、5、10、20、50、100、300、600、3000ng/L以及可替宁浓度为0、10、20、50、80、100、200、300、400μg/L的系列标准混合溶液，系列标准混合溶液中13C6-NNAL、D3-尼古丁的浓度保持不变；将系列标准混合溶液注入液相色谱-串联质谱条件进行检测，以4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁的浓度为横坐标，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁与同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、同位素标记的可替宁的峰面积的比值为纵坐标，制成标准曲线。
各个化合物的标准曲线以及定量范围，仪器检测限(LODs)和方法检测限(MLDs)见表3。
表3：各个化合物的标准曲线、保留时间、定量范围，仪器检测限(LODs)
和方法检测限(MLDs)
Figure BDA0002135107820000071
(3)取待测尿样，将尿样取出放置于室温下自然解冻，混匀后取1.5mL尿样于离心管中；按比例加入含同位素标记内标的PBS溶液，同位素标记的终浓度范围：同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇为10ng/L，同位素标记的可替宁100μg/L，混匀后加入20μLβ-葡萄糖醛酸苷酶；混合后，于37℃恒温放置6小时。样液取出并放置至常温后。固相萃取选用PRiME HLB(3cc,60mg)固相萃取柱，先以甲醇和超纯水活化平衡(虽然根据该柱的使用说明，可以不需活化平衡，但测定NNAL时，若不活化平衡，其萃取柱的内源性基质干扰较大，使得回收率和灵敏度均会大幅下降)。取酶解液上层清液上样，流出速度控制为每滴约3s(下同)；淋洗采用5％甲醇水溶液(v:v)，完成后以空气吹干固相萃取柱；最后，以乙酸乙酯作为洗脱液洗脱，尖底离心管收集洗脱液。取出部分以恒流氮气将洗脱液吹蒸至干，乙腈充分复溶后，取上清液测定NNAL，其余乙酸乙酯洗脱液进样分析可替宁，得到两种特征代谢产物的响应值；
步骤(2)和(3)中所述仪器分析为超高压液相色谱串联质谱法，分析仪器采用Nexera X2超高效液相色谱仪(SHIMADZU,日本)和LC-MS 8050串联质谱仪(SHIMADZU，日本)。
采用电喷雾电离源(Electrospray ionization,ESI)，扫描模式为正离子模式，多反应监测(Multiple Reaction Monitoring,MRM)模式下检测，MRM参数见表1。待测物扫描时间均为0.309s，采集时间为0～7.0min。仪器其它参数为：接口电压4.0kV；雾化气为高纯氮气，3L/min；加热气为无水空气，10L/min；干燥气为氮气，10L/min；碰撞气为氩气，270kPa；接口温度300℃；DL管温度250℃；加热块温度400℃。其它的质谱条件详见表1；实验采用ACQUITY
Figure BDA0002135107820000081
BEH HILIC色谱柱(50×3.0mm,1.7μm)进行色谱分离；流动相A(A相)为3mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B(B相)为纯乙腈，采用梯度洗脱：0～0.8min保持B相97％，0.8～0.9min B相降至75％，0.9～4.0min保持B相比例为75％，4.0～4.2min B相上升至97％，4.2～10min保持B相比例为97％；流速为0.3mL/min；进样量5μL；柱温箱温度恒定为40℃。单次进样运行时间为10min。
步骤(3)所述的固相萃取小柱
Figure BDA0002135107820000082
PRiME HLB(3cc,60mg,购自Waters公司(美国))。
(4)根据内标标准曲线，求出尿样中两种特征代谢产物的浓度。
按照本实施例的检测方法，20份吸烟者尿样检测结果如下表及附图所示。
图1是NNAL、可替宁及其相应的同位素内标物的提取离子色谱图；图2是待测尿样的NNAL、可替宁及其相应的同位素内标物提取离子色谱图(选自20份吸烟者尿样检测结果中的一份)。
NNAL和可替宁含量存在显著相关性(r＝0.487，p<0.05)，说明吸烟者烟草暴露水平与烟草特异亚硝胺暴露水平相关。
Figure BDA0002135107820000083
检测结果经同位素内标和尿样肌酐校正后，吸烟者尿样中NNAL浓度为1.55～66.71ng/g.cr，中位数为10.3ng/g·Cr。可替宁浓度为3.2～1347.6μg/g.cr，中位数为812μg/g·Cr。
从以上实验结果可以看出，吸烟者NNAL和可替宁的检出率为100％，方法检出限很低，NNAL和可替宁的检出限分别为0.058ng/L和0.024μg/L，远低于文献报道值(Kotandeniya Delshanee,et al.Combined Analysis of the Tobacco MetabolitesCotinine and 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol in HumanUrine.Analytical Chemistry,2015,87(3):1514.NNAL和可替宁的检出限分别在12.54ng/L and 73.92μg/L)；且整个实验仅需一次固相萃取，所需时间远低于文献报道(Kotandeniya Delshanee,et al.)，固相萃取在60min内即可完成，而文献约需3小时。
实施案列2
随机采集10例非吸烟人群的尿样，运用本发明的亲水作用色谱串联质谱分析尿液中NNAL和可替宁。
随机采集10份非吸烟者尿样，运用本发明的亲水作用色谱串联质谱分析尿液中NNAL和可替宁，包括以下步骤。
(1)选取NNAL和可替宁作为烟草特有亚硝胺(Tobacco-specific nitrosamines,TSNAs)和烟草暴露的特征代谢产物；配制含有上述两种特征代谢产物的单一标准品储备溶液、含有上述两种特征代谢产物的同位素内标物的单一标准品储备溶液、以及含有上述两种种特征代谢产物及其相应同位素内标物的混合标准品溶液；
其中的NNAL标准品(纯度95％)、13C6-NNAL标准品(纯度98％)购自加拿大TorontoResearch Chemicals公司。可替宁标准溶液(1.0g/L甲醇溶液)购自美国Sigma-Aldrich公司；D3-可替宁标准品(纯度≥98％)购自加拿大C/D/N ISOTOPES公司。
(2)配制系列浓度的混合标样工作液；系列混合标样工作液中，内标的浓度保持不变，而目标化合物的浓度成比例增大；将系列浓度的混合标样工作液注入色谱柱进行仪器分析，以(标样峰面积/内标样峰面积)为响应值；根据响应值与工作标样浓度之间存在的线性关系，制成标准曲线(具体方法参照实施例1)；
各个化合物的标准曲线以及定量范围，仪器检测限(LODs)和方法检测限(MLDs)见表3。
表3：各个化合物的标准曲线、保留时间、定量范围，仪器检测限(LODs)和方法检测限(MLDs)
Figure BDA0002135107820000091
(3)取待测尿样，将尿样取出放置于室温下自然解冻，混匀后取1.5mL尿样于离心管中；加入含内标的PBS溶液，混匀后加入β-葡萄糖醛酸苷酶；混合后，于37℃恒温过夜。样液取出并放置至常温后。固相萃取选用PRiME HLB(3cc,60mg)固相萃取柱，先以甲醇和超纯水活化平衡；取酶解液上层清液上样，流出速度控制为每滴约3s(下同)；淋洗采用5％甲醇水溶液(v:v)，完成后以空气吹干固相萃取柱；最后，以乙酸乙酯作为洗脱液洗脱，尖底离心管收集洗脱液。取部分洗脱液以恒流氮气将洗脱液吹蒸至干，乙腈充分复溶后，取上清液进样LC-MS/MS分析NNAL，剩余洗脱液直接进样分析可替宁，得到两种特征代谢产物的响应值；
步骤(2)和(3)中所述仪器分析为超高压液相色谱串联质谱法，分析仪器采用Nexera X2超高效液相色谱仪(SHIMADZU,日本)和LC-MS 8050串联质谱仪(SHIMADZU，日本)。
采用电喷雾电离源(Electrospray ionization,ESI)，扫描模式为正离子模式，多反应监测(Multiple Reaction Monitoring,MRM)模式下检测，MRM参数见表1。待测物扫描时间均为0.309s，采集时间为0～7.0min。仪器其它参数为：接口电压4.0kV；雾化气为高纯氮气，3L/min；加热气为无水空气，10L/min；干燥气为氮气，10L/min；碰撞气为氩气，270kPa；接口温度300℃；DL管温度250℃；加热块温度400℃。其它的质谱条件详见表1；实验采用ACQUITY
Figure BDA0002135107820000102
BEH HILIC色谱柱(50×3.0mm,1.7μm)进行色谱分离；流动相A(A相)为3mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B(B相)为纯乙腈，采用梯度洗脱：0～0.8min保持B相97％，0.8～0.9min B相降至75％，0.9～4.0min保持B相比例为75％，4.0～4.2min B相上升至97％，4.2～10min保持B相比例为97％；流速为0.3mL/min；进样量5μL；柱温箱温度恒定为40℃。单次进样运行时间为10min。
步骤(3)所述的固相萃取小柱
Figure BDA0002135107820000103
PRiME HLB(3cc,60mg,购自Waters公司(美国)。
(4)根据内标标准曲线，求出尿样中两种特征代谢产物的浓度。
按照本实施例的检测方法，10份非吸烟者尿样检测结果如下表所示。
Figure BDA0002135107820000101
仅一份尿样NNAL含量低于方法检出限，无检测数据，其余9份均检出NNAL，检测结果经同位素内标校正后，非吸烟者尿样中NNAL浓度为0.58～6.68ng/g·Cr，中位数为4.21ng/g·Cr；可替宁浓度为1.42～229.7μg/g·Cr，中位数为5.69μg/g·Cr。
非吸烟者NNAL的检出率为90％，远高于现有的检出率(41％，采用SupelMIP SPE特异NNAL固相萃取柱，Bernert John T.,et al.Urine Concentrations of a Tobacco-Specific Nitrosamine Carcinogen in the U.S.Population from Secondhand SmokeExposure.Cancer Epidemiology Biomarkers&Prevention,2010,19(11):2969.)。可替宁的检出率为100％，和NNAL存在显著相关性(r＝0.786,p<0.05)，说明非吸烟者中烟草暴露水平与烟草特异亚硝胺暴露水平相关。此外，主、被动吸烟者之间，尿样中NNAL及可替宁含量水平具有显著性差异(p<0.05)，主动吸烟者尿样含量更高。
因采用了新型的HLB Prime固相萃取柱，联合亲水作用色谱串联质谱分析，一次固相萃取，大大的降低了样品基质效应，获得了较高的灵敏度，方法检出限很低，NNAL和可替宁的检出限分别为0.058ng/L和0.024μg/L，远低于文献报道值(Kotandeniya Delshanee,et al.Combined Analysis of the Tobacco Metabolites Cotinine and4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol in Human Urine.AnalyticalChemistry,2015,87(3):1514.NNAL和可替宁的检出限分别在12.54ng/L and 73.92μg/L)，能检出大部分非吸烟者尿样，方法适用于吸烟者和非吸烟者中NNAL和可替宁快速批量分析。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)分别配制含有4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁、同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、同位素标记的可替宁的单一标准品储备溶液；
2)分别配制含有4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁的系列浓度的混合标样工作液，系列浓度的混合标样工作液中，同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、同位素标记的可替宁的浓度保持不变，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁的浓度成比例增大；将系列浓度的混合标样工作液注入色谱柱进行仪器分析，制成标准曲线；
3)取待测尿样，加入含同位素标记内标的磷酸盐缓冲溶液，尿样与磷酸盐缓冲溶液的体积比为8-12:1，所述磷酸盐缓冲溶液中同位素标记4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇和同位素标记的可替宁浓度为10ng/L和100μg/L，加入15-25μLβ-葡萄糖醛酸苷酶酶解，混合后，于36-38℃恒温放置4～24小时；
4)将步骤3)酶解后的样液取出并放置至常温，选用PRiME HLB固相萃取柱进行固相萃取，固相萃取柱先以甲醇和超纯水活化平衡，然后以乙酸乙酯作为洗脱液洗脱，收集洗脱液；取部分洗脱液以恒流氮气将洗脱液吹蒸至干，乙腈充分复溶后，取上清液进样进行仪器分析用于检测4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇，另一部分洗脱液直接上样用于检测可替宁，根据步骤2)制成的标准曲线计算得到4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇和可替宁的含量；
步骤2)中所述仪器分析为亲水作用液相色谱串联质谱法分析；
液相色谱仪采用ACQUITY
Figure FDA0002842985850000011
BEH HILIC色谱柱进行色谱分离；色谱条件为：流动相A为3mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为纯乙腈，采用梯度洗脱：0～0.8min保持流动相B97％，0.8～0.9min流动相B降至75％，0.9～4.0min保持流动相B比例为75％，4.0～4.2min流动相B上升至97％，4.2～10min保持流动相B比例为97％。
2.根据权利要求1所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，步骤2)中，以4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁的浓度为横坐标，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁与同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、同位素标记的可替宁的比值为纵坐标，制成标准曲线。
3.根据权利要求2所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，步骤2)所述系列浓度的混合标样工作液中，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇的浓度范围是0～3000ng/L，可替宁的浓度范围是0～400μg/L；标准曲线绘制方法为：取NNAL和可替宁标准品储备溶液，以乙腈为溶剂配制得到NNAL浓度为0、5、10、20、50、100、300、600、3000ng/L以及可替宁浓度为0、10、20、50、80、100、200、300、400μg/L的系列标准混合溶液，系列标准混合溶液中13C6-NNAL、D3-尼古丁的浓度保持不变；将系列标准混合溶液注入液相色谱-串联质谱条件进行检测，以4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁的浓度为横坐标，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁与同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、同位素标记的可替宁的峰面积的比值为纵坐标，制成标准曲线。
4.根据权利要求1所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，步骤4)中，以甲醇和超纯水活化平衡的具体步骤为：取步骤3)酶解后的样液的上层清液上样，流出速度控制为每滴2-4s；淋洗采用体积比为5％甲醇水溶液，流出速度控制为每滴2-4s，完成后以空气吹干固相萃取柱。
5.根据权利要求1所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，步骤3)中所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4，尿样与磷酸盐缓冲溶液的体积比为8-12:1；β-葡萄糖醛酸苷酶的加入量为15-25μL。
6.根据权利要求1所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，流速为0.3mL/min；进样量5μL；柱温箱温度恒定为40℃，单次进样运行时间为10min。
7.根据权利要求1所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，质谱条件为：采用电喷雾电离源，扫描模式为正离子模式，多反应监测模式下检测；待测物扫描时间均为0.309s，采集时间为0～7.0min；仪器其它参数为：接口电压4.0kV；雾化气为高纯氮气，3L/min；加热气为无水空气，10L/min；干燥气为氮气，10L/min；碰撞气为氩气，270kPa；接口温度300℃；DL管温度250℃；加热块温度400℃；
多反应监测模式参数和其它的质谱条件为：
Figure FDA0002842985850000021
Figure FDA0002842985850000031
*为定量离子。
8.根据权利要求1所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，PRiME HLB固相萃取柱为60mg/3cc小柱。
9.根据权利要求1所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，步骤1)中各标准储备溶液制备方法为：
4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇标准储备溶液：称取适量4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇标准品，以乙腈为溶剂溶解并定容，配制成500mg/L NNAL的标准储备溶液；
13C6-NNAL标准储备溶液：称取适量13C6-NNAL标准品，乙腈为溶剂溶解并定容，配制成50mg/L 13C6-NNAL的同位素标准溶液；
D3-可替宁标准储备液：称取10mg D3-可替宁，以10mL乙腈溶解，配制成1.0g/L标准储备溶液；
可替宁标准储备溶液：1.0g/L可替宁标准储备溶液。
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