CN101444563A - 金樱根提取物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种金樱根提取物作为制备肝炎治疗、肝损伤保护或肝功能改善的药物或食品的用途。所述食品是保健食品或食品添加剂。药物可制成片剂、颗粒剂、胶囊剂或复方制剂。本发明是基于以下实验基础提出的：金樱根用于治疗或改善由粉刺杆菌－脂多糖等细菌性或生物化学物质感染引起免疫机能紊乱、机体过氧化及炎症因子增加等因素，进而导致的肝炎或肝损伤；也可以用于治疗由应激负荷引起免疫机能紊乱、机体过氧化及炎症因子增加等因素，进而导致的肝损伤保护或肝功能低下。

Description

金樱根提取物的用途

技术领域

本发明涉及金樱根提取物的用途，属于药品和食品领域。

背景技术

中医理论认为，在脏腑器官中，肝脏受情志影响最大，其理由是肝主疏泄，具有调畅气机、情志的作用，故情志所伤大多与肝脏有着密切的关系。现代医学研究也证实情绪性应激负荷可以明显影响机体的神经、内分泌和免疫等功能，应激或心理防御机制的破坏与多种疾病的发生发展有着密切的关系。研究提示急性拘束应激可以导致小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶明显升高，诱发肝炎发生(中国药理学通报，2006，22(10)：1249-1253)。肝脏是人体中血流最为丰富的器官之一，对缺血缺氧极为敏感，是各种活性氧攻击的主要目标，氧自由基的毒害作用在肝损害发病过程中起着关键性作用。机体通过酶系统与非酶系统产生的氧自由基，能够攻击生物膜中的不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)而引发脂质过氧化反应，生成脂质过氧化产物如：丙二醛(MDA)、酮基、羟基、氢过氧基或内过氧基，以及新的氧自由基等。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或链式支链式反应放大活性氧作用。肝细胞膜在受损伤的同时产生大量新的活性氧基团，促发脂质过氧化的链式反应，由此产生的脂质过氧化物可以损伤肝脏中的各种细胞，故肝细胞膜的脂质过氧化是肝细胞损伤时的主要作用机制之一。因而测试最主要的脂质过氧化物MDA的含量可以部分反映肝脏内脂质过氧化状态，间接反映出肝脏细胞受损伤的程度。氧自由基引起的脂质过氧化作用还表现为：使肝细胞膜的通透性增加，丙氨酸氨基转移酶释放入血，血中酶活力增加。因而测定血浆或血清中丙氨酸氨基转移酶的活力也可以作为肝损伤诊断的一个重要指标。

肝炎(包括病毒性肝炎、血吸虫病、慢性酒精中毒肝炎、药物及化学毒物肝炎、营养不良、循环障碍、胆汁淤积、肠道感染及炎症、代谢性疾病等多种因素导致)是指肝脏有炎症性损害。热灭活P.acnes和LPS共同诱发的肝损伤是目前较为常用的自身免疫性肝损伤动物模型(Immunol Lett，2004，94(1-2)：47-55)。当LPS静脉注射P.acnes负荷小鼠后，即可激活肝脏库普弗细胞(Kupffer cell)，活化巨噬细胞及相关细胞因子，继而诱发炎症反应(Biol Pharm Bull，2003，26(10)：1393-1397)。与其他肝损伤动物模型相比，P.acnes-LPS诱导的肝损伤更近似自身免疫性肝炎的病理过程，其病变与慢性肝炎非常接近(Biol Pharm Bull，1997，20(4)：381-385)。

金樱根又名金樱蔃、脱骨丹，英文名为Root of Cherokee Rose，为双子叶植物药蔷薇科植物金樱子(Rosa laevigate Michx.)的根或根皮。常绿攀援灌木，分布于广泛。金樱根功能固精涩肠，主治滑精，遗尿，痢疾泄泻，烫伤等症。金樱根在历代医书，如《日华子本草》、《纲目》、《岭南采药录》、《陆川本草》及《江西民间草药验方》等均有记载。金樱根富含鞣质(tannin)，文献中未见对其化学成分所作的研究工作。

近年，对金樱根抗氧自由基的作用等已有一些研究(赣南医学院学报2003，23(5)：488-490)，但至今为止有关金樱根的提取物在肝炎治疗及肝损伤保护方面的用途尚未见任何报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金樱根提取物作为制备肝炎治疗、肝损伤保护或肝功能改善的药物或食品的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种金樱根提取物作为制备肝炎治疗、肝损伤保护或肝功能改善的药物或食品的用途。

所述食品是保健食品或食品添加剂。

所述药物制剂为片剂、颗粒剂、胶囊剂或复方制剂。

所述金樱根提取物的高效液相色谱图的色谱峰表示的化学物质及其保留时间是：没食子酸gallic acid(峰1，6.999min)，异小木麻黄素isostrictinin(峰2，13.721min)，儿茶素(+)-catechin(峰3，17.385min)，3，4-二羟基苯乙醇4-O-(6＂-O-没食子酰基)-葡萄糖苷3，4-dihydroxyphenethyl alcohol4-O-(6＂-O-galloyl)-glucopyranoside(峰4，23.842min)，表儿茶素(+)-epicatechin(峰5，24.908min)，鞣花酸-4′-O-阿拉伯呋喃糖苷和鞣花酸-4′-O-木糖糖苷4′-O-arabinfuranosyl ellagic acid and 4′-O-xlyopyranosyl ellagic acid(峰6，38.592min)，鞣花酸ellagic acid(峰7，40.050min)。

所述金樱根提取物是采用制药工业常规的工艺制得。金樱根药材直接粉碎化、超音波破碎，采用热水、加压热处理、高温饱和水蒸汽处理、酶处理、或用水与低级醇类、极性溶剂的一种或二种以上的任意混合溶剂进行提取。提取时，金樱根与溶剂的比率没有特定限制，但以1∶1～30的重量比为宜；本发明对提取温度没有特定限制，从室温到溶剂沸点范围都可适用；提取时间可以从10秒到24小时。

本发明提供的金樱根提取物的使用量一般以干品计，在药物、保健食品或食品添加剂的各种成品中占0.001～100％的重量比。当制备饮料时所添加浓度一般在0.1％至50％(W/W)范围较为适宜，在这个浓度范围内，金樱根提取物适于直接服用，容易被消费者接受，可以作为日常饮料提供给消费者。随着金樱根提取物加入量的增大，可能会出现苦涩感觉。其解决办法可以根据市场需要及消费者的要求改换剂型，如用片剂、颗粒剂、胶囊剂等剂型。

金樱根提取物也可以添加常用的赋形剂等医药用载体后制成制剂。必要时也可以添加一些防腐剂、抗氧化剂(antioxidant)、着色剂、甜味剂等制剂添加物。比较适宜的赋形剂，可考虑用乳糖、白糖、D-甘露醇、淀粉、结晶纤维素等。润滑剂可用硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉等。溶剂可用精制水、乙醇、丙二醇等。防腐剂可用氯丁醇、苄醇、二羟基乙酸等。抗氧化剂通常以亚硫酸盐、抗坏血酸等比较适宜。

金樱根提取物，可以取其浸膏状的提取物或粉末状干品添加到辅料等制品中用于口服，也可以和其它的药材一起作为复方制剂服用。金樱根提取物也可与其它植物提取物一起制成饮料，如金樱根饮料、凉茶等。金樱根提取物食品还可以考虑制成糖果类、口香糖类、果冻、点心类等日常食品。

本发明中，金樱根提取物的给药剂量，可以根据使用者的相对健康状态、年龄、性别及体重等条件适当选择。成人平均体重以60公斤计算，一天口服金樱根提取物一般可以考虑在0.6克至5克范围内，分次服用。

本发明的作用机理是：粉刺杆菌-脂多糖等细菌性或生物化学物质可引起免疫机能紊乱、机体过氧化及炎症因子增加等因素，进而导致的肝脏疾病及肝功能低下。应激负荷也可引起免疫机能紊乱、机体过氧化及炎症因子增加等因素，进而导致肝损伤及肝功能低下。本发明提供的金樱根提取物及其所含活性成分可以作为药物、保健食品或食品添加剂，用于预防及改善肝脏炎症，或者因应激负荷引起的疲劳和肝损伤及其临床症状。

本发明相对现有技术具有如下的优点及效果：本发明以拘束负荷及P.acnes-LPS诱发小鼠肝损伤为实验模型，评价金樱根提取物对小鼠血浆中丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性，肝脏丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，肝脏总抗氧化能力指数(ORAC)等指标的影响，结果显示，金樱根提取物对以拘束负荷及P.acnes-LPS诱发小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶升高表现出统计学上有意义的改善效果，从而确认了本发明金樱根提取物作为制备肝炎治疗、肝损伤保护或肝功能改善的药物或食品的新用途。

附图说明

图1是金樱根提取物的HPLC指纹图谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 金樱根提取物的制备

1、取金樱根干品2.0kg，粉碎，加入蒸馏水5000mL回流提取1.5h，提取液经纱布过滤后，在经离心(1000rpm，5min)分离，回收上清液冷冻干燥即得金樱根提取物120.0g，回收率为6.0％。

2、取金樱根干品2.0kg，粉碎，加入60％乙醇水溶液5000mL回流提取1.5h，提取液经纱布过滤后，在经离心(1000rpm，5min)分离，回收上清液冷冻干燥即得金樱根提取物200.0g，回收率为10.0％。

实施例2 金樱根提取物在药品中的运用

1、金樱根片的制备：取金樱根药材4.0kg，水煎煮3次，每次1h，煎液滤过合并，浓缩，喷雾干燥的金樱根提取物300.0g，加药用淀粉100.0g，压制成1000片，即得。

2、金樱根颗粒剂的制备：取金樱根药材2.00kg，水煎煮3次，每次1h，煎液滤过合并，浓缩得稠膏浓缩至相对密度为1.30～1.33的浸膏(约1份浸膏相当于5份的药材)，加入30.0g蔗糖粉与糊精的混合物(蔗糖∶糊精＝3∶1)，拌合成软材，挤压过筛(12目～14目)制颗粒，60℃干燥，整粒，按每袋相当于金樱根提取物2.0g分装于塑料袋中，密封，即得。

3、金樱根胶囊剂的制备：取金樱根药材1.0kg，水煎煮3次，每次1h，煎液滤过合并，浓缩，喷雾干燥的粉末50.0g，过筛，过80目筛，与淀粉15.0g混匀，加入10％淀粉浆10mL，拌和制成软材，压过80～100目筛制粒，于60℃～70℃干燥，整粒，加入硬脂酸镁0.2g，混合均匀，装胶囊300个。口服，一次1～3粒，一日3次。

4、金樱根复方片：金樱根提取物2.0g，茶叶水提取物18.0g，五指毛桃水提取物80.0g，煎液滤过合并，浓缩，喷雾干燥，加淀粉100.0g，压制成1000片。

实施例3 金樱根提取物在食品中的运用

1、金樱根润喉糖：金樱根提取物10.0g，优质白砂糖40.0g，甲级葡萄糖20.0g，制成金樱根润喉糖20粒。

2、金樱根复合茶的制备：金樱根提取物1.0g，天然中草药野菊花提取物1.0g，和绿茶1.0g混合，加天然矿泉水1000mL，加蔗糖配制而成。

实施例4 金樱根HPLC指纹图谱的建立和主要色谱峰的指认

将实施例1所得金樱根提取物15.0mg，溶于1.0mL水中，过0.45μm的微孔滤膜后HPLC分析，再对HPLC不同分离条件摸索色谱条件，最终确定流动相A为甲醇含0.5％的冰醋酸，流动相B为水含0.5％的冰醋酸，1min10％A，60min 64％A梯度洗脱，流速为1mL·min^-1，选择检测波长为280nm，色谱柱Ultimate XB-C18(5μm，4.6*250mm)，柱温35℃。利用以上的色谱条件建立了指纹图谱，从指纹图谱中分析得出，有7个主要色谱峰，占总峰面积的84.68％(见图1)。将实施例1所得金樱根提取物混悬于水中，采用大孔树脂Diaion HP-20开放柱色谱，以水、30％乙醇-水、50％乙醇-水和95％乙醇-水梯度洗脱。分别减压回收溶剂，得水洗脱物(JYG-I)340g、30％乙醇-水洗脱物(JYG-II)70g、50％乙醇-水洗脱物(JYG-III)35g，及95％乙醇-水洗脱物(JYG-IV)15g。对JYG-I采用ODS柱色谱，以甲醇-水(10，30，50，100％)梯度洗脱。其ODS柱下10％甲醇洗脱部分(JYG-IA)经反相高效液相分离(15-20％甲醇-水，含0.2％醋酸)得到化合物I、II、III。对JYG-II采用ODS柱色谱，以甲醇-水(10，30，50，100％)梯度洗脱。其ODS柱下30％甲醇洗脱部分(JYG-IIB)经反相高效液相分离(30-40％甲醇-水，含0.2％醋酸)得到化合物IV、V、VI。对JYG-III采用ODS柱色谱，以甲醇-水(10，30，50，100％)梯度洗脱。其ODS柱下30％甲醇洗脱部分(JYG-IIIB)经反相高效液相分离(25-30％甲醇-水，含0.2％醋酸)得到化合物VII。通过理化常数和现代波谱学手段(MS、NMR)，结合文献相关数据，确认各峰的主要成分分别为：没食子酸gallic acid(化合物I，核磁数据见表1，溶剂为DMSO-d6)，异小木麻黄素isostrictiniin(化合物II，核磁数据见表2，溶剂为MeOD)，儿茶素(+)-catechin(化合物II，核磁数据见表3，溶剂为DMSO-d6)，3，4-二羟基苯乙醇4-O-(6＂-O-没食子酰基)-葡萄糖苷3，4-dihydroxyphenethyl alcohol 4-O-(6＂-O-galloyl)-glucopyranoside(化合物II，核磁数据见表4，溶剂为Acetone-d6+D2O)，表儿茶素(+)-epicatechin(化合物V，核磁数据见表5，溶剂为DMSO-d₆)，鞣花酸-4′-O-阿拉伯呋喃糖苷和鞣花酸-4′-O-木糖糖苷4′-O-arabinfuranosyl ellagic acid and4′-O-xlyopyranosyl ellagic acid(化合物VI，核磁数据见表6，溶剂为DMSO-d₆)，鞣花酸ellagic acid(化合物VII，核磁数据见表7，溶剂为DMSO-d₆)。化学式如图1所示。

表1  化合物I核磁数据

注：参考文献：中国中药杂志，2001，26(4)：256

表2  化合物II核磁数据

注：参考文献：中国中药杂志，2000，25(10)：615

表3  化合物III核磁数据

注：参考文献：中国药科大学学报，2004，35(2)：114

表4  化合物IV核磁数据

注：参考文献：chem.Pharm.Bull.，1988，36(3)：870

表5  化合物V核磁数据

注：参考文献：中国中药杂志，2007，32(18)：1893

表6 化合物VI核磁数据

注：参考文献：中国药科大学学报，2002，33(5)：370

a：鞣花酸-4′-O-木糖糖苷b：鞣花酸-4′-O-阿拉伯呋喃糖苷

n.o.：无信号峰.

表7 化合物VII核磁数据

注：参考文献：Magn.Reson.Chem.1999，37：856

实施例5 金樱根提取物对拘束应激负荷小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的影响

应激负荷实验使用动物为7周龄雄性昆明种小白鼠，由广东省医学实验动物中心购入(许可证号为2004A019)。饲养温度23±2℃，照明时间12h/d(7:00～19:00开灯)。经饲养一周后进行实验。在束缚应激实验中，按500mg·kg^-1及125mg·kg-1剂量经口给药给予金樱根提取物水溶液，对照组给与等体积蒸馏水。小鼠每组7只，每只小鼠禁食强制放入拘束装置，空白对照组仅禁食。拘束16h后在乙醚麻醉下由心脏采血放入肝素处理过的离心管中，经5000rpm离心5min后分离血浆。利用ALT在37℃及pH7.4条件下，作用于丙氨酸及α-酮戊二酸组成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。反应半小时后，加入2，4-二硝基苯肼(DNPH)盐酸溶液，即终止反应。因DNPH与酮酸中羰基加成生成丙酮酸苯腙，苯腙在碱性条件下呈红棕色在505nm下以比色法进行测定。实验结果以t检验做统计学处理，结果如Table 8所示。结论：与正常对照组相比，小鼠拘束负荷后血浆中ALT含量显著升高，而金樱根提取物给药的拘束负荷小鼠后ALT含量明显下降，提示金樱根可以减少应激所致的肝损伤作用。

表8  金樱根提取物对拘束负荷小鼠血浆ALT水平的影响(mean±S.D.，n＝7)

注：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01和应激对照组比有统计学差异

实施例6  金樱根提取物对拘束负荷小鼠肝脏丙二醛(MDA)含量的影响

机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化产物——丙二醛(MDA)，导致细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。因而测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化程度，间接地反映出细胞受损伤的程度。拘束应激负荷及分组给药方案同实施例四。将束缚应激后的小鼠在乙醚麻醉状态下取出肝脏，用生理盐水制取5％肝组织匀浆，3000rpm10min，取组织匀浆上清液测定其中丙二醛含量。测定原理利用丙二醛可与硫代巴比妥酸(TBA)缩和，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰的性质，通过比色法进行测定。测定使用丙二醛测定试剂盒(南京建成)，反应在96孔板中进行，使用酶标仪(芬兰雷博MK3酶标仪)在532nm下测定吸光率(具体测定过程参见试剂盒说明书)。计算组织中的丙二醛含量需要已知组织中的蛋白含量。因此，同样以生理盐水制取2％肝组织匀浆，利用考马斯亮兰法测定组织中的蛋白含量(使用蛋白定量试剂盒，南京建成，具体操作方法见试剂盒说明书)。实验结果如Table 9所示，金樱根提取物高(500mg·kg^-1)及低(125mg·kg^-1)剂量组小鼠肝组织中的MDA含量均较应激模型组均明显降低(^**P<0.01)。结论：与正常对照组相比小鼠拘束负荷后肝脏中MDA含量显著升高，而金樱根提取物处理拘束负荷小鼠后MDA含量均明显下降，提示金樱根可以减少过氧化对机体的损伤，对拘束负荷下机体的氧化应激损伤有一定的改善作用。

表9  金樱根提取物对拘束负荷小鼠肝脏丙二醛水平的影响(mean±S.D.，n＝7)

注：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01和应激对照组比有统计学差异

实施例7 金樱根提取物对束缚应激负荷小鼠肝脏总抗氧化能力指数(ORAC)水平的影响

拘束应激负荷及给药方案同实施例四。将束缚应激后的小鼠在乙醚麻醉状态下取出肝脏，用生理盐水制取5％肝组织匀浆，再经终浓度为3％高氯酸除蛋白后，通过15000rpm 15min回收非蛋白上清液用于ORAC分析。血浆ORAC分析使用多功能荧光分析仪(Tecan Genios，Austria)，激发和发射波长分别为485nm和525nm，攻击荧光素(disodium fluorescein)的氧化剂使用2，2′-azobis-2-amidinopropane-dihydrochloride(AAPH；Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.Osaka，Japan)。效价单位参照水溶性维生素E(6-hydro-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid；Trolox，Wako PureChemical Industries，Ltd.)，详细方法参照论文(JAgric Food Chem.，51：3273-3279，2003)。实验结果以t检验做统计学处理，结果如Table10所示。结论：金樱根能通过增强机体清除自由基的能力而发挥抗应激作用和肝保护作用。

表10 金樱根提取物对拘束负荷小鼠肝脏总抗氧化能力指数水平的影响(mean±S.D.，n＝7)

注：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01和应激对照组比有统计学差异

实施例8 金樱根提取物对P.acnes-LPS肝炎模型小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的影响

SPF级7～9周龄BALB/C小鼠，雄性，体重18～22g购自广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)20030002。实验动物在清洁级层流架中饲养，环境温度23士2℃，照明时间12h/d(7:00～19:00开灯)。饲养一周后进行实验。实验动物随机分为空白对照组、P.acnes-LPS模型组、P.acnes-LPS模型+金樱根提取物125mg·kg^-1组、P.acnes-LPS模型+金樱根提取物500mg·kg^-1组共四组，每组7只小鼠。除空白对照组外，小鼠尾静脉注射20mg·kg^-1热灭活P.acnes生理盐水溶液，P.acnes负荷5d后尾静脉注射5μg·kg^-1LPS-PBS溶液。实验动物在LPS注射5h后乙醚麻醉下心脏取血，置于肝素处理后的离心管中，5000rpm 5min，回收上清液储存在-20℃用于ALT分析。P.acnes负荷前一天起每天一次连续7d灌胃给予SGE水溶液，末次给药在LPS注射30min前，对照组给予等容量水溶液。实验结果以t检验做统计学处理，结果如Table11所示。结论：金樱根提取物能够显著降低P.acnes-LPS诱发小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)的升高，显示抑制细菌性或者生物化学物质引起的肝损伤的药理活性，具有良好的抗肝炎作用。

表11 金樱根提取物对肝炎模型小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶水平的影响(mean±S.D.，n＝7)

注：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01和应激对照组比有统计学差异

实施例9 金樱根提取物对P.acnes-LPS肝炎模型小鼠肝脏丙二醛(MDA)含量的影响

P.acnes-LPS肝炎模型及分组给药方案同实施例七。将小鼠在乙醚麻醉状态下取出肝脏，用生理盐水制取5％肝组织匀浆，3000rpm 10min，取组织匀浆上清液测定其中丙二醛含量。丙二醛测定原理及方法同实施例五。实验结果如Table 12所示，金樱根提取物高(500mg·kg^-1)及低(125mg·kg^-1)剂量组均较应激模型组小鼠肝组织中的MDA含量均明显降低(P<0.01)。结论：P.acnes-LPS引起小鼠肝脏MDA含量显著升高，而金樱根提取物处理P.acnes-LPS肝炎模型小鼠后小鼠肝脏MDA含量均明显下降，提示金樱根可以减少自由基对机体的损伤，对氧化应激引起的肝炎有一定的改善作用。

表12 金樱根提取物对肝炎模型小鼠肝脏丙二醛水平的影响(mean±S.D.，n＝7)

注：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01和应激对照组比有统计学差异

实施例10 金樱根提取物对P.acnes-LPS肝炎模型小鼠肝脏总抗氧化能力指数(ORAC)水平的影响

P.acnes-LPS肝炎模型及给药方案同实施例七。将实验小鼠在乙醚麻醉状态下取出肝脏，用生理盐水制5％肝组织匀浆，再经终浓度为3％高氯酸除蛋白后，通过15000rpm 15min回收非蛋白上清液用于ORAC分析，ORAC的实验原理及方法同实施例六。实验结果以t检验做统计学处理，结果如Table 13所示。结论：P.acnes-LPS也能引起小鼠肝脏ORAC水平显著下降，而金樱根提取物处理P.acnes-LPS肝炎模型小鼠后小鼠肝脏ORAC水平均明显增高，提示金樱根可以增强机体自由基清楚能力，缓解及改善氧自由基爆发性增高从而导致的肝炎。

表13 金樱根提取物对肝炎模型小鼠肝脏总抗氧化能力指数水平的影响(mean±S.D.，n＝7)

注：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01和应激对照组比有统计学差异

实施例11 金樱根提取物对P.acnes-LPS肝炎模型小鼠肝脏单核淋巴细胞(MNC)总数及T淋巴细胞亚群的影响

P.acnes-LPS肝炎模型及给药方案同实施例七。乙醚麻醉小鼠，用酒精消毒皮毛后打开腹腔，门静脉插管，连接10mL注射器。剪断后腔静脉放血，快速灌注10mL Hanks液至肝脏变白，流出液不带血色。小心摘除肝脏，在灭菌培养皿内的200目钢丝网上轻轻研磨，收集过网后的细胞，悬浮在15mL含5％小牛血清的RPMI 1640培养基上。300rpm离心悬液2min，取上层悬液于另一洁净无菌的离心管中，1800rpm离心10min。弃上清，用含100U/mL肝素的40％Percoll溶液8mL悬浮，然后750g冷冻离心20min。小心收集管底的单核细胞，悬浮在1mL的红细胞裂解液中，冰上静置7min后，加入3mL的Hanks终止反应。离心收集细胞，清洗两次后，重悬在RPMI1640培养基中备用。根据浓度在台盼蓝溶液中适当稀释细胞悬液，并在荧光显微镜下直接计算细胞的数量。调整肝脏单核细胞悬液浓度为1×10⁶·mL^-1，取流式细胞分析专用管，每管加入细胞悬液100μL。每个样本制备两管，进行FITC、PE双色荧光抗体标记。第一管加入2μL PE标记抗CD3抗体和1μLFITC标记抗CD4抗体；第二管加2μL PE标记抗CD3抗体和3μL PE标记抗CD8抗体，室温闭光孵育20min后各管加入500μL PBS，振荡混匀，准备上机分析，记录各管CD3⁺细胞％、CD3⁺CD4⁺细胞％、CD3⁺CD8⁺细胞％，CD3⁺CD4⁺为Th亚群细胞，CD3⁺CD8⁺为Tc亚群细胞。实验结果以t检验做统计学处理，结果如Table 4所示。结论：P.acnes-LPS能引起小鼠肝脏MNCs显著升高同时T淋巴细胞亚群紊乱，而金樱根提取物处理P.acnes-LPS肝炎模型小鼠后小鼠肝脏MNCs显著下降同时T淋巴细胞亚群比例趋向正常，提示金樱根调节机体的免疫功能，缓解及改善由免疫紊乱从而导致的肝脏炎症。

表14 金樱根提取物对肝炎模型小鼠肝脏单核淋巴细胞总数及T淋巴细胞亚群的影响(mean±S.D.，n＝7)

注：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01和应激对照组比有统计学差异

实施例12 金樱根提取物对P.acnes-LPS肝炎模型小鼠肝脏NO水平的影响

P.acnes-LPS肝炎模型及给药方案同实施例七。NO测定采用Griess反应法，分别取实施例九述各组适量的肝脏组织放入生理盐水中，配成2％的组织匀浆。在4℃下5000rpm 10min。取40μL加至160μL的Griess试剂中，混匀，静置20min后，550nm波长测定溶液光密度值(OD值)，根据NO标准曲线计算NO含量(μmol·L^-1)。实验结果以t检验做统计学处理，结果如Table 15所示。结论：P.acnes-LPS能引起小鼠肝脏炎症因子NO含量显著增加，而金樱根提取物处理P.acnes-LPS肝炎模型小鼠后小鼠肝脏炎症因子NO含量下降，提示金樱根能缓解及改善由炎症因子增加从而导致的肝损伤等不良反应。

表15  金樱根提取物对P.acnes-LPS肝炎模型小鼠肝脏NO水平的影响(mean±S.D.，n＝7)

注：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01和应激对照组比有统计学差异

实施例13 实施例2所得的样品对拘束应激及P.acnes-LPS肝炎模型小鼠血浆ALT水平的影响

拘束应激模型及P.acnes-LPS肝炎模型的制作及给药方案同实施例四及实施例七，实施例二所得的复合物给药剂量均以金樱根提取物的量计算为125mg·kg^-1。实验结果以t检验做统计学处理，结果如Table 16所示。结论：含金樱根提取物的三种样品均能够不同程度降低拘束应激及P.acnes-LPS诱发小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)的升高，显示有良好的抗肝炎及肝损伤保护作用。

表16 金樱根制剂及复方制剂对小鼠肝损伤的保护作用(mean±S.D.，n＝7)

注：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01和应激对照组比有统计学差异

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1、一种金樱根提取物作为制备肝炎治疗、肝损伤保护或肝功能改善的药物或食品的用途。

2、根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述食品是保健食品或食品添加剂。

3、根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物制剂为片剂、颗粒剂、胶囊剂或复方制剂。

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