CN104906212A - 具有保肝作用的枳椇子提取物及其提取分离方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有保肝作用的枳椇子提取物及其提取分离方法和用途，该提取物含有10-99％(质量百分数)的总黄酮碳苷；所述的总黄酮碳苷包括牡荆素2″-O-β-D-葡萄糖苷、斯皮诺素、根皮素-3′,5′-二-C-β-D-葡萄糖苷、6”'-乙酰基斯皮诺素、6”'-对羟基肉桂酰基斯皮诺素和6”'-芥子酰基斯皮诺素6种黄酮碳苷。本发明从枳椇子中提取出总黄酮碳苷用于预防和治疗急慢性肝炎、酒精性肝病，有效部位成分明确，毒性小，药理作用强，具有良好的药用前景。本发明的提取物可与药学上可接受的赋型剂一起，采用本领域的常规方法制备成各种剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂等。给药剂量为200-800mg/人/天。

Description

具有保肝作用的枳椇子提取物及其提取分离方法和用途

技术领域

本发明属于天然药物领域，具体涉及具有保肝作用的枳椇子提取物及其提取分离方法和用途。

背景技术

肝病是一种常见的严重威胁人类健康的疾病，根据病因可分为病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝炎、药物中毒性肝炎、遗传代谢性肝病和其他感染因子引起的肝炎。

酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)是由于长期过量饮酒，通过乙醇及其代谢产物乙醛使肝细胞发生脂肪变性、坏死和再生导致的一种肝脏疾病，包括酒精性脂肪肝(Alcoholic fatty liver)、酒精性肝炎(Alcoholic hepatitis)、肝纤维化(Alcoholic fibrosis)、肝硬化(Alcoholic cirrhosis)等多种。

根据流行病学统计，我国一般人群饮酒率为59.5％，酒精性肝病发病率约占饮酒者的20％，估计该病患者已过1000万，且有逐年上升趋势，而重度饮酒者中35％发展成为酒精性肝炎。在酗酒严重的西方国家，酒精性肝硬化占肝硬化患者的50-75％，酒精性肝病是西方国家导致肝硬化的最主要病因，也是十大常见死因之一。

肝炎中以病毒性肝炎对人类危害最大，其中又以乙肝和丙肝尤为突出。乙型肝炎是世界性疾病，我国是乙肝大国，约有1.2亿为乙肝病毒携带者。近年来，国际医药界对防治肝炎药物研究工作比较活跃，主要针对抑制肝炎病毒复制、改善肝功能障碍、抗肝细胞脂质过氧化、免疫调节等方面进行研究。

目前，临床上常用的肝炎药物包括保肝的水飞蓟素、联苯双酯，抗病毒类的干扰素、阿昔洛韦，免疫抑制剂环磷酰胺等；治疗酒精性肝病的药物包括抗炎药物糖皮质激素，保肝药物丙基硫氧嘧啶、S-腺苷甲硫氨酸以及抗氧化剂等。

目前，化学药物对于病毒性肝炎，尤其是慢性肝炎的防治尚无明确的疗效， 并且存在着毒副作用等弊端。我国有着丰富的天然药物资源，在防治肝炎的临床应用等许多方面有着丰富的经验，并成功开发出水飞蓟素、甘草酸二铵、茯芩多糖、联苯双酯等天然药物，并用于临床治疗，但由于肝炎发病机制较为复杂，多数药物疗效有限，对肝炎不能有效根治，故研究和开发出新一代的肝炎治疗药物是非常必要的。

鼠李科枳椇属植物全世界有3种，2个变种，分别为枳椇(Hovenia acerba Lindl.)、北枳椇(Hovenia dulcis Thunb.)和毛果枳椇(Hovenia trichocarpa Chun et Tsiang)以及它们的变种，主要分布在中国、朝鲜、日本和印度。我国华南和西南各省均有分布。

枳椇子是枳椇、北枳椇和毛果枳椇以及它们的变种的成熟种子或具有花序轴的果实，具有解酒止呕、止渴除烦、通利二便的功效。枳椇子解酒保肝作用显著，现有醪立清口服液，解酒保肝口服液、防醉胶囊等中成药制剂应用于临床。

文献报道黄酮类化合物是枳椇子中的有效成分，韩国学者报道枳椇子提取物及枳椇子中的hovenodulinol(二氢黄酮醇类化合物)具有解酒毒的作用(Park YS,kim HS,Lee HY,et al.Method for preparation of Hovenodulinol,an active ingredient of fruit Hovenia dulcis and alcoholysis or hang-over inhibitor containing thereof[P].KR：KR 2002086963,2002-11-21.)。

日本学者报道枳椇子中的hovenitinⅠ(二氢黄酮醇类化合物)、二氢杨梅素(二氢黄酮醇类化合物)具有保肝的活性(Hase K,Ohsugi M,Xiong Q,et al.Hepatoprotective effect of Hovenia dulcis THUNB.on experimental liver injuries induced by carbon tetrachioride or D-galactosamine/lipopolys-accharide[J].Biol.Pharm.Bull.,1997,20(4):381-385)。

到目前为止，国内外均未明确提出枳椇子治疗肝炎的药效物质基础。

发明内容

为了寻找传统中药枳椇子的治疗肝炎的药效活性成分，本发明在对枳椇和毛果枳椇进行系统的化学成分研究基础上，结合与治疗肝炎相关的药效活性筛选，提供了具有保肝作用的枳椇子提取物，该提取物的主要成分是黄酮碳苷类 化合物。

本发明的另一目的在于提供上述的枳椇子提取物的提取分离方法。

本发明的再一目的在于提供上述的枳椇子提取物的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种具有保肝作用的枳椇子提取物，其中总黄酮碳苷所占质量百分数为10-99％，优选40-90％；在本领域，一般用总黄酮碳苷指代多种黄酮碳苷的混合物；

所述的总黄酮碳苷包括牡荆素2″-O-β-D-葡萄糖苷(vitexin2″O-β-D-glucopyranoside,ZJ-1)、斯皮诺素(spinosin,ZJ-2)、根皮素-3′,5′-二-C-β-D-葡萄糖苷(phloretin 3′,5′-di-C-β-D-glucopyranoside,ZJ-3)、6”'-乙酰基斯皮诺素(6”'-acetyl-spinosin，ZJ-4)、6”'-对羟基肉桂酰基斯皮诺素(6”'-p-hydroxy-cinnamoyl-spinosin，ZJ-5)和6”'-芥子酰基斯皮诺素(6”'-sinapoyl-spinosin，ZJ-6)等6种黄酮碳苷，其中6”'-乙酰基斯皮诺素(6”'-acetyl-spinosin，ZJ-4)为新化合物；

在本发明的枳椇子提取物中，上述6种黄酮碳苷占总黄酮碳苷质量的20-80％；

更具体地，本发明的枳椇子提取物中含有20-32％的ZJ-1、8-19％的ZJ-2、8-19％的ZJ-3、20-32％的ZJ-4、8-19％的ZJ-5、11-23％的ZJ-6；所述百分比为质量百分比。

化合物ZJ-1～ZJ-6的化学结构如下所示：

上述的枳椇子提取物的提取分离方法，包括以下步骤：

以水、乙醇或任意浓度的乙醇水溶液作为提取溶剂，加入中药枳椇子，回流提取2-3次，得到提取液；将提取液浓缩后过滤或者离心，滤液或上清液上样于大孔吸附树脂或聚酰胺树脂层析柱，先用2-3倍柱体积的水洗脱；然后用30～60％(V/V)乙醇洗脱，洗脱至流出液无色；收集30～60％乙醇洗脱液，减压蒸干，即得到含有黄酮碳苷的枳椇子提取物；

所述的过滤是用棉花过滤；

所述的离心是2000rpm离心15分钟；

所述的大孔吸附树脂为聚苯乙烯骨架的极性或非极性大孔吸附树脂，可选自D101型、AB-8型、HPD100型、HPD200型；

所述的聚酰胺树脂层析柱的孔径为30目以上。

正如背景技术所记载，中药枳椇子是鼠李科枳椇属枳椇(Hovenia acerba Lindl.)、北枳椇(Hovenia dulcis Thunb.)和毛果枳椇(Hovenia trichocarpa Chun et Tsiang)以及它们的变种的成熟种子或具有花序轴的果实。作为本发明提取分离方法所述原料的枳椇子优选枳椇的成熟种子或具有花序轴的果实。

药理学试验表明，本发明的枳椇子提取物具有显著的保肝等功效，可以用于制备预防和治疗急慢性肝炎、酒精性肝病及其相关疾病的药物；

所述的药物以枳椇子提取物为活性成分，还可以包含可接受的辅料和其他 起配伍协同作用的有效成分；

所述的药物可以为各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、缓释剂、口服液、注射剂等。

本发明的枳椇子提取物用于临床治疗时，建议剂量范围200～800mg/天，也可根据剂型的不同和疾病严重程度，使用剂量超出该范围。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明从枳椇子中提取出总黄酮碳苷用于预防和治疗急慢性肝炎、酒精性肝病，有效部位成分明确，毒性小，药理作用强，具有良好的药用前景。

2、本发明的原料枳椇子资源广泛、价廉，制备工艺简单、易于大规模生产，所得提取物中总黄酮碳苷含量高达50％以上。

3、本发明中的含有牡荆素2″-O-β-D-葡萄糖苷、斯皮诺素、根皮素-3′,5′-二-C-β-D-葡萄糖苷、6”'-p-hydroxy-cinnamoyl-spinosin、6”'-sinapoyl-spinosin，及新化合物6”'-acetyl-spinosin等六种成分的、总含量为10-90％的有效部位可与药学上可接受的赋型剂一起，采用本领域的常规方法制备成各种剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂等。给药剂量为200-800mg/人/天。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1、枳椇子总黄酮碳苷提取物的制备

取枳椇子药材1Kg，加70％乙醇回流提取2次，合并醇提液，减压回收至无醇味，离心(2000转/分钟，15分钟)，上清液上样于已处理好的D101大孔吸附树脂柱吸附后，依次用3升水，5升50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压蒸干，即得枳椇子提取物17g。经测定，总黄酮碳苷的质量含量为73％。

实施例2、枳椇子总黄酮碳苷提取物的制备

枳椇子药材1Kg，加80％乙醇回流提取3次，合并醇提液，减压回收至无醇味，加水混悬，离心(2000转/分钟，15分钟)，上清液上样于已处理好的聚酰胺柱，依次用3升水、5升50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压蒸干， 即得枳椇子提取物22g。经测定，总黄酮碳苷的质量含量为56％。

实施例3、枳椇子总黄酮碳苷提取物的制备

取枳椇子药材1Kg，加水回流提取2次，离心(2000转/分钟，15分钟)，上清液上样于D101大孔吸附树脂柱吸附后，依次用2升水，2升20％乙醇、5升50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压蒸干，所得提取物加入10倍量的95％乙醇，加热回流提取1h，趁热抽滤，滤液回收乙醇后真空干燥，即得枳椇子提取物21g。经测定，总黄酮碳苷的质量含量为58％。

实施例4、六种黄酮碳苷的分离和结构鉴定

实施例1中的枳椇子总黄酮碳苷提取物(15g)经硅胶柱层析，氯仿/甲醇(100:0-0:100)梯度洗脱，经TLC分析合并，最后得到5个流分。流分2-4经反复硅胶柱色谱、ODS、Sephadex LH-20柱色谱、以及高效液相(HPLC)等现代分离手段进行分离纯化，分离得到化合物ZJ-1～ZJ-6。分别测定它们的理化和光谱数据，通过与文献数据对比，鉴定化合物ZJ-1～ZJ-3、ZJ-5、ZJ-6为已知化合物，分别为：牡荆素2″-O-β-D-葡萄糖苷(vitexin 2″O-β-D-glucopyranoside,ZJ-1)、斯皮诺素(spinosin,ZJ-2)、根皮素-3′,5′-二-C-β-D-葡萄糖苷(phloretin3′,5′-di-C-β-D-glucopyranoside,ZJ-3)、6”'-p-hydroxy-cinnamoyl-spinosin((6”'-对羟基肉桂酰基斯皮诺素，ZJ-5)和6”'-sinapoyl-spinosin((6”'-芥子酰基斯皮诺素，ZJ-6)。化合物ZJ-4未见文献报道，为一新化合物，其数据见实施例5。

实施例5、新化合物6”'-acetyl-spinosin(ZJ-4)的理化和光谱数据

白色粉末(甲醇)，AlCl₃反应阳性，mp 185-187℃，-43.61(c 0.75, MeOH)。UV(logε):334(3.77),272(3.70),214(3.93)nm。IR3395,2920,1729,1654,1606,1488,1204cm^-1。HRESI-MS m/z 673.1725[M+Na]⁺(calcd for C₃₀H₃₄NaO₁₆,673.1739)。¹H-NMR(DMSO-d6,400MHz,298K)δ：6.78(1H,s,H-3),6.82(1H,s,H-8),7.94(2H,d,J＝9.2Hz,H-2′,6′),6.94(2H,d,J＝9.2Hz,H-3′,5′),13.59(1H,Br s,5-OH),3.89(3H,s,7-OCH₃),4.68(1H,d,J＝9.9Hz,H-1″),4.45(1H,m,H-2″),3.44(1H,m,H-3″),3.17(1H,m,H-4″),3.18(1H,m,H-5″),3.68(1H,m,H-6″a),3.47(1H,m,H-6″b),4.23(1H,d,J＝7.2Hz,H-1″′),2.89(1H,m,H-2″′),3.06(1H,m,H-3″′),3.00(1H,m,H-4″′),3.08(1H,m,H-5″′),3.89(1H,m,H-6″′a),(1H,m,H-2″′),3.72(1H,m,H-6″′b),1.75(3H,s,OCOCH ₃ )；¹³C-NMR(DMSO-d6,100MHz,298K)δ:163.7(C-2)，103.1(C-3)，182.0(C-4)，159.6(C-5)，108.9(C-6)，165.2(C-7)，90.8(C-8)，157.1(C-9)，104.1(C-10)，56.2(7-OCH₃)，121.2(C-1′)，128.7(C-2′,6′)，116.0(C-3′,5′)，161.4(C-4′)，70.8(C-glc 1″)，81.7(C-glc 2″)，78.6(C-glc 3″)，70.4(C-glc 4″)，81.7(C-glc 5″)，61.6(C-glc 6″)，105.0(C-glc 1″′)，74.5(C-glc 2″′)，76.2(C-glc 3″′)，68.8(C-glc 4″′)，73.2(C-glc 5″′)，62.8(C-glc 6″′)，170.0(COCH₃)，20.3(COCH ₃ )。根据以上数据，鉴定化合物ZJ-4为6”'-acetyl-spinosin，为一新化合物。

实施例6、枳椇子总黄酮碳苷提取物对酒精性大鼠肝损伤的保护作用

试验方法：SD大鼠(4周龄清洁级，由广东省医学实验动物中心提供(许可证号:SCXK(粤)2008-0002))，全部雄性，体重180～220g，随机分为5组，每组动物10只,分为正常对照组，模型对照组，枳椇子总黄酮碳苷提取物(ZJ Ext，实施例1)低剂量组(80mg/kg,ig)、高剂量组(200mg/kg,ig)，阳性药东宝肝泰胶囊(600mg/kg，ig)。正常对照组动物给予普通饲料，其余4组动物每天上午灌胃56度红星二锅头0.5ml/100g,每天下午灌胃3％胆固醇高脂乳剂1ml/100g(高脂乳剂配制:将3g胆固醇溶于熔化的6g猪油中；将0.6g胆酸钠、0.3g甲基硫氧嘧啶溶于约40ml蒸馏水中再加1.2ml丙二醇。将两液混匀，加1.2ml吐温80搅拌成乳剂，最后加蒸馏水定溶至100ml)；另每隔5d皮下注射40％CCl₄橄榄油溶液0.15ml/100g,共5次。各药物组每日灌胃造模后3h按上述剂量灌胃给药1次。造模和给药时间为20d，期间全部动物每周测定体重1次， 根据体重调整给药量。最后1次皮下注射40％CCl₄橄榄油溶液后16h，全部动物股动脉取血，取肝制备10％(丙二醇-丙酮，1：1)肝匀浆，离心，检测肝匀浆上清液中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)，检测血清中ALT和AST。另取部分肝脏福尔马林固定后进行组织病理学检查。

实验结果：与对照组相比，酒精性大鼠肝损伤模型组大鼠表现为血清TC、TG、ALT和AST水平显著增高(均为P<0.01)。阳性药东宝肝泰胶囊(600mg/kg)及测试药物组枳椇子总黄酮碳苷提取物(ZJ Ext，实施例1)80、200mg/kg二个剂量组均可显著降低酒精等综合因素所致大鼠的TC、TG、ALT和AST活力升高，呈剂量相关性。结果见表1。

病理切片检查结果表明，酒精性肝损伤造模大鼠肝与正常组比较有明显的组织学变化，肝细胞呈弥漫性轻至重度脂肪变性，可见明显脂滴，并有少量炎细胞浸润。阳性药东宝肝泰、测试药物枳椇子总黄酮碳苷提取物二个剂量组与模型组比较，均有明显的组织学改善，肝细胞脂肪变性显著改善，肝组织的脂肪变性和脂滴空泡均明显减少。

表1.枳椇子总黄酮碳苷(实施例1)对酒精性大鼠肝损伤的影响(n＝10,)

*P<0.05，**P<0.01vs正常组；^#P<0.05，^##P<0.01vs模型组

实施例7、枳椇子总黄酮碳苷提取物对卡介苗加脂多糖所致小鼠免疫性肝损伤的保护作用

试验方法：ICR种小白鼠(7周龄雄性ICR小鼠，购自广东省医学实验动物中心(合格证号SCXK(粤)2003-2002))，雌雄各半，初始体重18-22g，随机分为6组，每组动物10只,分为正常对照组，模型对照组，枳椇子总黄酮碳苷提取物(ZJ Ext，实施例1)低剂量组(50mg/kg,ig)、中剂量组(100mg/kg,ig)和高剂量组(200mg/kg,ig)，阳性药甘草酸二铵盐(25mg/kg，iv)。正常组小 鼠尾静脉注射生理盐水10ml/kg外，其余各组小鼠尾静脉注射卡介苗(BCG)0.2ml(含1×10^-7活菌)。次日起，各药物组按上述剂量给药。正常对照组和模型组均尾静脉注射等体积的生理盐水，连续9d。9d后，除正常对照组以生理盐水0.2ml/只尾静脉注射外，其余各组以脂多糖(LPS)10μg/0.2ml/只尾静脉注射，10h后每组动物摘眼球取血，分离血清，测定ALT、AST。

试验结果：造模10h后，与正常对照组相比，模型组血清ALT活力和AST活力显著升高(P<0.01)。阳性药甘草酸二铵盐(25mg/kg,iv)和测试药物枳椇子总黄酮碳苷提取物(ZJ Ext，实施例1)50、100、200mg/kg三个剂量组均可显著降低卡介苗联合LPS引起的ALT和AST活力升高。结果见表2。

表2.枳椇子总黄酮碳苷(实施例1)对小鼠免疫性肝损伤的影响(n＝10)

*P<0.05，**P<0.01vs模型组；^#P<0.05，^##P<0.01vs正常组.

实施例8、枳椇子提取物的片剂的制备

把本发明枳椇子提取物(实施例1)200g和微粉硅胶30g、羟丙纤维素120g混合均匀，用10％预胶化淀粉浆作为粘合剂，湿法造粒，烘干，加入适量的硬脂酸镁混合，压制成2000片片剂。

实施例9、枳椇子提取物的胶囊剂的制备

把本发明枳椇子提取物(实施例1)100g和微粉硅胶200g充分混合均匀，过筛，加入适量的硬脂酸镁，混匀，用干法造粒机制粒，过筛，筛取40-80目之间的颗粒，装入胶囊，每粒装0.3g。

实施例10、枳椇子提取物中黄酮碳苷的HPLC检测方法

牡荆素2″-O-β-D-葡萄糖苷(vitexin 2″O-β-D-glucopyranoside,ZJ-1)、斯皮诺素(spinosin,ZJ-2)、根皮素-3′,5′-二-C-β-D-葡萄糖苷(phloretin3′,5′-di-C-β-D-glucopyranoside,ZJ-3)、6”'-acetyl-spinosin(ZJ-4)、6”'-p-hydroxy-cinnamoyl-spinosin(ZJ-5)和6”'-sinapoyl-spinosin(ZJ-6)等6个黄酮碳苷为本发明枳椇子总黄酮碳苷的主要有效成分，可以作为质量控制的指标成分。按重量百分比计，本发明的枳椇子黄酮有效部位提取物的总黄酮碳苷含量40～90％。

采用HPLC-UV法，色谱柱为Kromasil 100-5C₁₈column(4.6X 250mm,5μm).，流动相为乙腈-0.2％甲酸水梯度洗脱，检测波长为340nm，以分离得到的6种黄酮碳苷为对照，对本发明的总黄酮碳苷提取物进行多成分定量分析，结果表明，该提取物中ZJ-1～ZJ-6的含量分别为20-32％、8-19％、8-19％、20-32％、8-19％、11-23％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有保肝作用的枳椇子提取物，其特征在于：该提取物含有10-99％(质量百分数)的总黄酮碳苷。

2.根据权利要求1所述的枳椇子提取物，其特征在于：所述的总黄酮碳苷包括牡荆素2″-O-β-D-葡萄糖苷、斯皮诺素、根皮素-3′,5′-二-C-β-D-葡萄糖苷、6”'-乙酰基斯皮诺素、6”'-对羟基肉桂酰基斯皮诺素和6”'-芥子酰基斯皮诺素6种黄酮碳苷。

3.根据权利要求2所述的枳椇子提取物，其特征在于：所述6种黄酮碳苷占总黄酮碳苷质量的20-80％。

4.根据权利要求2所述的枳椇子提取物，其特征在于：所述的枳椇子提取物中含有20-32％的ZJ-1、8-19％的ZJ-2、8-19％的ZJ-3、20-32％的ZJ-4、8-19％的ZJ-5、11-23％的ZJ-6；所述百分比为质量百分比。

5.权利要求1-4任一项所述的枳椇子提取物的提取分离方法，其特征在于包括以下步骤：

以水、乙醇或任意浓度的乙醇水溶液作为提取溶剂，加入中药枳椇子，回流提取2-3次，得到提取液；将提取液浓缩后过滤或者离心，滤液或上清液上样于大孔吸附树脂或聚酰胺树脂层析柱，先用2-3倍柱体积的水洗脱；然后用30～60％(V/V)乙醇洗脱，洗脱至流出液无色；收集30～60％乙醇洗脱液，减压蒸干，即得到含有黄酮碳苷的枳椇子提取物。

6.根据权利要求5所述的枳椇子提取物的提取分离方法，其特征在于：所述的过滤是用棉花过滤。

7.根据权利要求5所述的枳椇子提取物的提取分离方法，其特征在于：所述的离心是2000rpm离心15分钟。

8.根据权利要求5所述的枳椇子提取物的提取分离方法，其特征在于：所述的大孔吸附树脂为D101型、AB-8型、HPD100型或HPD200型。

9.权利要求1-4任一项所述的枳椇子提取物用于制备预防和治疗急慢性肝炎、酒精性肝病及其相关疾病的药物。

10.根据权利要求9所述的枳椇子提取物用于制备预防和治疗急慢性肝炎、酒精性肝病及其相关疾病的药物，其特征在于：所述的药物以枳椇子提取物为活性成分，或者还包含可接受的辅料和其他起配伍协同作用的有效成分。