CN105943681A - 具有改善胰岛素抵抗作用的荔枝核甾体皂苷提取物 - Google Patents

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Abstract

一种具有改善胰岛素抵抗作用的荔枝核甾体皂苷提取物，其通过如下步骤制得：将荔枝核药材粉碎，加入乙醇进行超声提取，得到提取液；将提取液回收乙醇后，将药液用水饱和正丁醇进行萃取，回收正丁醇，浓缩，得到粗提物；取粗提物加水溶解后，通过非极性大孔树脂柱，先分别以水和乙醇洗脱至洗脱液无色，再以乙醇洗脱至洗脱液无色，收集洗脱液；回收洗脱液中的乙醇，继续浓缩至稠膏，真空干燥得干膏粉；将干膏粉用甲醇溶解后过滤，使其通过交联葡聚糖凝胶柱，然后采用氯仿‑甲醇‑水为洗脱液淋洗凝胶柱，收集洗脱液，真空挥干有机溶剂，继续浓缩至稠膏，真空干燥即得。本发明的荔枝核甾体皂苷提取物活性更有效、准确，针对性更强。

Description

具有改善胰岛素抵抗作用的荔枝核甾体皂苷提取物
技术领域
本发明属于中药及天然药物提取纯化领域，具体涉及一种具有改善胰岛素抵抗作用的荔枝核甾体皂苷提取物。
背景技术
荔枝核(Lychee Seed，Litchi Seed)为无患子科植物荔枝(Litchi Chinensis Sonn)的干燥成熟种子，别名荔仁、荔核、大荔核，收载于《中国药典》2010版一部，性温，味甘、微苦，具有行气散结，祛寒止痛功效。《本草纲目》记载，荔枝核“止渴、益人颜色、食之止烦渴”(烦渴病，现代医学称为糖尿病)。研究表明，荔枝核有降低血糖、调节血脂、提高抗氧化、抑制乙肝病毒表面抗原的作用。荔枝核的主要成分有皂苷、黄酮及花色素类、植物甾醇类、鞣质及多酚类、脂肪酸、氨基酸、蛋白质和多糖等。实验研究和临床治疗显示荔枝核提取物能够显著降低血糖和血脂，有效治疗糖尿病及代谢综合征，但对于荔枝核中各成分的作用尚未完全明确。充分利用本地丰富的荔枝核资源，开发出安全有效、质量可控的治疗糖尿病的药物供临床应用，对改变因生活方式改变而引起的糖尿病患病率居高不下的趋势，具有重要的社会意义和市场价值。
胰岛素抵抗是指外周组织(如肝脏、脂肪、骨骼肌等)对胰岛素敏感性降低，导致对胰岛素介导的葡萄糖摄取和利用功能减退的一种病理状态。胰岛素抵抗参与2型糖尿病发生和发展的全过程，是2型糖尿病的重要病理基础。
中国专利CN102048885公开了一种制备荔枝核提取物的提取工艺，通过该工艺获得的提取物主要成分为荔枝核总皂苷，含量达85％以上。该提取物为中药有效部位，具体成分尚不明确，是否对胰岛素抵抗具有改善作用也未涉及。为此有必要得到成分和疗效明确的荔枝核提取物，用于临床应用。
发明内容
本发明目的在于针对以上要解决的技术问题，提供一种具有改善胰岛素抵抗作用的荔枝核甾体皂苷提取物，其制备方法简单、高效，分离度高，提取物的活性更有效、准确、针对性更强。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
一种具有改善胰岛素抵抗作用的荔枝核甾体皂苷提取物，其特征在于，所述提取物通过如下步骤制得：
(1)将荔枝核药材粉碎，加入乙醇进行超声提取，得到提取液；
(2)将所述提取液回收乙醇后，将药液用水饱和正丁醇进行萃取，回收正丁醇，浓缩，得到粗提物；
(3)取所述粗提物加水溶解后，调节其pH值为4-5，使其通过非极性大孔树脂柱，先分别以水和20v/v％乙醇洗脱至洗脱液无色，再以60v/v％-80v/v％的乙醇洗脱至洗脱液无色，收集最终的洗脱液；
(4)回收最终的洗脱液中的乙醇，然后继续浓缩至稠膏，真空干燥得干膏粉；
(5)将所述干膏粉用甲醇溶解后过滤，使其通过交联葡聚糖凝胶柱，然后采用氯仿-甲醇-水为洗脱液淋洗凝胶柱，收集洗脱液，真空挥干有机溶剂，继续浓缩至稠膏，真空干燥即得。
优选地，所述步骤(1)具体包括：将荔枝核药材粉碎成粗粉，按照料液比为1g:8ml至1g:10ml的比例加入70v/v％乙醇，浸泡0.5-1小时，再进行超声提取1小时，然后过滤得到乙醇提取液。
更优选地，所述步骤(1)具体包括：重复提取至少两次，然后合并全部的乙醇提取液；
优选地，所述步骤(2)具体包括：将所述提取液减压回收乙醇至无醇味，然后将药液用水饱和正丁醇萃取至少3次，回收正丁醇后浓缩至干，得到粗提物；
优选地，所述步骤(3)具体包括：取所述粗提物用水稀释至以生药量计浓度为0.6g/ml，调节其pH值为4-5，静置过夜，过滤，滤液以每小时2倍柱床体积的流速通过AB-8非极性大孔树脂柱，然后先用2倍树脂量的纯水以每小时2倍柱床体积的流速进行洗脱，弃去水洗液，再用2倍树脂量的20v/v％乙醇以每小时2倍柱床体积的流速进行洗脱，最后以5倍药材量的60v/v％-80v/v％乙醇以每小时2倍柱床体积的流速洗脱树脂上的有效物质，至洗脱液无色，并收集此部分最终的乙醇洗脱液；
优选地，所述步骤(5)具体包括：将所述干膏粉用甲醇溶解后过滤，滤液湿法上样通过已预先用甲醇充分溶胀的交联葡聚糖凝胶柱，然后用3倍凝胶体积的氯仿-甲醇-水为洗脱液淋洗凝胶柱，收集洗脱液，真空挥干有机溶剂，继续浓缩至稠膏，真空干燥，即得到荔枝核甾体皂苷提取物。
更优选地，所述交联葡聚糖凝胶柱为Sephadex LH20凝胶柱。
更优选地，所述氯仿-甲醇-水中氯仿、甲醇与水的体积比为65:25:5或60:20:10。
本发明还提供了所述荔枝核甾体皂苷提取物在制备用于改善胰岛素抵抗作用的药物的用途。
本发明的具有改善胰岛素抵抗作用的荔枝核甾体皂苷提取物能够有效提供改善胰岛素抵抗作用，从而可用于防治2型糖尿病和制备用于防治2型糖尿病的药物。本发明的荔枝核甾体皂苷提取物制备方法简单、高效，分离度高，提取物的活性更有效、准确，针对性更强，使其有益的活性效果更加明确，从而对产品的质量控制和用药安全得到保证。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述。但应理解，本发明的保护范围并不限于以下实施例。如未特别指出，以下实施例中所用的材料和仪器均为本领域技术人员已知。
实施例1
将荔枝核粉碎成粗粉。取500g荔枝核粉，第一次加入5000ml的70v/v％乙醇，浸泡0.5小时后超声提取1小时，倾出提取液至容器备用；药渣继续加入4000ml的70v/v％乙醇，超声提取1小时，倾出提取液与第一次的提取液合并；提取液减压回收乙醇至无醇味，然后将药液用水饱和正丁醇萃取3次，萃取液回收正丁醇后浓缩至干，浸膏用蒸馏水稀释，调节pH值为4，定容至300ml，静置过夜；滤过，滤液首先以每小时2倍柱床体积的流速通过已处理的AB-8大孔树脂柱，然后用2倍树脂量的纯水以每小时2倍柱床体积的流速进行洗脱，弃去水洗液，再用2倍树脂量的20％乙醇以每小时2倍柱床体积的流速进行洗脱，最后以5倍药材量的80v/v％乙醇以每小时2倍柱床体积的流速进行洗脱树脂上的有效物质并收集此部分乙醇洗脱液；将醇洗液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至相对密度为1.05的稠膏；将稠膏水浴蒸干，放入真空干燥箱真空干燥得干膏粉；将干膏粉50g加入100ml甲醇溶解，过滤，湿法上样加入凝胶柱(30g商品葡聚糖凝胶Sephadex LH20预先用200ml甲醇浸泡过夜，装入树脂柱，反复加入甲醇冲去气泡后备用)，然后用3倍凝胶体积的氯仿-甲醇-水(体积比为65:25:5)为洗脱液淋洗凝胶柱，收集洗脱液，真空挥干有机溶剂，继续浓缩至稠膏，放入真空干燥箱真空干燥，即得到荔枝核甾体皂苷提取物。
提取物经采用高效液相色谱法进行检测，色谱柱为C18，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，以豆甾醇-β-D葡萄糖苷为对照品，以经蒸发光散射检测，含量为35％(以提取物质量为基准)。
实施例2
将荔枝核粉碎成粗粉。取200g荔枝核粉，第一次加入1600ml的60v/v％乙醇，浸泡1小时后超声提取1小时，倾出提取液至容器备用；药渣继续加入1600ml的60v/v％乙醇，超声提取1小时，倾出提取液与第一次的提取液合并；提取液减压回收乙醇至无醇味，然后将药液用水饱和正丁醇萃取3次，萃取液回收正丁醇后浓缩至干，浸膏用蒸馏水稀释，调节pH值为5，定容至120ml，静置过夜；滤过，滤液首先以每小时2倍柱床体积的流速通过已处理的AB-8大孔树脂柱，然后用2倍树脂量的纯水以每小时2倍柱床体积的流速进行洗脱，弃去水洗液，再用2倍树脂量的20％乙醇以每小时2倍柱床体积的流速进行洗脱，最后以5倍药材量的60v/v％乙醇以每小时2倍柱床体积的流速进行洗脱树脂上的有效物质并收集此部分乙醇洗脱液；将醇洗液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至相对密度为1.05的稠膏；将稠膏水浴蒸干，放入真空干燥箱真空干燥得干膏粉；将干膏粉60g加入100ml甲醇溶解，过滤，湿法上样加入凝胶柱(30g商品葡聚糖凝胶Sephadex LH20预先用200ml甲醇浸泡过夜，装入树脂柱，反复加入甲醇冲去气泡后备用)，然后用3倍凝胶体积的氯仿-甲醇-水(体积比为60:20:10)为洗脱液淋洗凝胶柱，收集洗脱液，真空挥干有机溶剂，继续浓缩至稠膏，放入真空干燥箱真空干燥，即得到荔枝核甾体皂苷提取物。提取物经采用高效液相色谱法进行检测，色谱柱为C18，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，以豆甾醇-β-D葡萄糖苷为对照品，以经蒸发光散射检测，含量为30％(以提取物质量为基准)。
对于实施例1和实施例2中得到的荔枝核提取物，采用高效液相色谱法-蒸发光散射检测方法检测，所述提取物均富含甾体皂苷成分，以豆甾醇-β-D葡萄糖苷为指标，以提取物质量为基准，含量为30-35％。
动物实验结果
将根据本发明实施例1和实施例2获得的提取物进行模型动物实验，以研究提取物的改善胰岛素抵抗作用。
实验动物：SPF级SD大鼠，适应性饲养7天，按体重随机分为空白对照组和造模组，空白对照组8只，造模组42只。空白对照组用基础饲料饲养，造模组用高脂饲料饲养，连续饲养10周，造模成功。
给药实验和结果：
将造模成功的大鼠随机分为模型组、甾体皂苷提取物高、低剂量组和粗提物组，每组8只，提取物高剂量组给药量为2g/kg，低剂量组给药量为0.5g/kg，粗提物组给药量为3g/kg，均灌胃给药，每天1次，连续给药4周，空白对照组及模型组大鼠灌服等体积量的生理盐水。给药期间空白对照组给予基础饲料饲养，所有胰岛素抵抗大鼠继续给予高脂饲料饲养，每周末次给药后，大鼠禁食16h，尾静脉采血，检测空腹血糖(FBG)，分离血清，放免法测定血清胰岛素水平FINS，并计算胰岛素敏感指数ISI[＝1/(空腹血糖×胰岛素)]，稳态胰岛抵抗指数HOMA-IR[＝(FBG×FINS/22.5)]。结果见以下表1和表2：
表1 模型动物血糖值
注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比，﹟P＜0.05，﹟﹟P＜0.01
表2 提取物对胰岛素抵抗大鼠ISI和HOMA-IR的影响
注：与空白对照组比，**P＜0.01；与模型组比，##P＜0.01，#P＜0.05
由上述药效实验验证结果可见，本发明的提取物具有改善胰岛素抵抗作用，甾体皂苷提取物低剂量组与粗提物高剂量效果相当。

Claims (9)

1.一种具有改善胰岛素抵抗作用的荔枝核甾体皂苷提取物，其特征在于，所述提取物通过如下步骤制得：
(1)将荔枝核药材粉碎，加入乙醇进行超声提取，得到提取液；
(2)将所述提取液回收乙醇后，将药液用水饱和正丁醇进行萃取，回收正丁醇，浓缩，得到粗提物；
(3)取所述粗提物加水溶解后，调节其pH值为4-5，使其通过非极性大孔树脂柱，先分别以水和20v/v％乙醇洗脱至洗脱液无色，再以60v/v％-80v/v％的乙醇洗脱至洗脱液无色，收集最终的洗脱液；
(4)回收最终的洗脱液中的乙醇，然后继续浓缩至稠膏，真空干燥得干膏粉；
(5)将所述干膏粉用甲醇溶解后过滤，使其通过交联葡聚糖凝胶柱，然后采用氯仿-甲醇-水为洗脱液淋洗凝胶柱，收集洗脱液，真空挥干有机溶剂，继续浓缩至稠膏，真空干燥即得。
2.根据权利要求1所述的荔枝核甾体皂苷提取物，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：将荔枝核药材粉碎成粗粉，按照料液比为1g:8ml至1g:10ml的比例加入70v/v％乙醇，浸泡0.5-1小时，再进行超声提取1小时，然后过滤得到乙醇提取液。
3.根据权利要求2所述的荔枝核甾体皂苷提取物，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：重复提取至少两次，然后合并全部的乙醇提取液。
4.根据权利要求1所述的荔枝核甾体皂苷提取物，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：将所述提取液减压回收乙醇至无醇味，然后将药液用水饱和正丁醇萃取至少3次，回收正丁醇后浓缩至干，得到粗提物。
5.根据权利要求1所述的荔枝核甾体皂苷提取物，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：取所述粗提物用水稀释至以生药量计浓度为0.6g/ml，调节其pH值为4-5，静置过夜，过滤，滤液以每小时2倍柱床体积的流速通过AB-8非极性大孔树脂柱，然后先用2倍树脂量的纯水以每小时2倍柱床体积的流速进行洗脱，弃去水洗液，再用2倍树脂量的20v/v％乙醇以每小时2倍柱床体积的流速进行洗脱，最后以5倍药材量的60v/v％-80v/v％乙醇以每小时2倍柱床体积的流速洗脱树脂上的有效物质，至洗脱液无色，并收集此部分最终的乙醇洗脱液。
6.根据权利要求1所述的荔枝核甾体皂苷提取物，其特征在于，所述步骤(5)具体包括：将所述干膏粉用甲醇溶解后过滤，滤液湿法上样通过已预先用甲醇充分溶胀的交联葡聚糖凝 胶柱，然后用3倍凝胶体积的氯仿-甲醇-水为洗脱液淋洗凝胶柱，收集洗脱液，真空挥干有机溶剂，继续浓缩至稠膏，真空干燥，即得到荔枝核甾体皂苷提取物。
7.根据权利要求1或6所述的荔枝核甾体皂苷提取物，其特征在于，所述交联葡聚糖凝胶柱为Sephadex LH20凝胶柱。
8.根据权利要求1或6所述的荔枝核甾体皂苷提取物，其特征在于，所述氯仿-甲醇-水中氯仿、甲醇与水的体积比为65:25:5或60:20:10。
9.根据权利要求1至8任一项所述的荔枝核甾体皂苷提取物在制备用于改善胰岛素抵抗作用的药物的用途。
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