CN102552325A - 一种熊胆提取物、制备方法及其在制备治疗脂肪肝药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从中药熊胆粉中得到的提取物及其在制备治疗脂肪肝药物中的应用。本发明采用提取溶剂对熊胆粉进行提取，将提取溶液干燥后依次进行大孔树脂柱分离和硅胶柱层析，制得熊胆提取物，其中牛磺熊去氧胆酸的含量达到65％以上；本发明制备的熊胆提取物能够有效地降低高脂饮食脂肪肝大鼠肝匀浆中甘油三酯和胆固醇的含量，在治疗脂肪肝方面具有良好的应用前景。本发明熊胆提取物制备方法简单，成本低廉，为治疗脂肪肝提供了一种新的药物来源。

Description

一种熊胆提取物、制备方法及其在制备治疗脂肪肝药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种胆酸类成分的提取组合物、制备方法及其在预防和治疗脂肪肝的应用，特别涉及一种熊胆的提取物、制备方法及其在制备预防、治疗脂肪肝药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

脂肪肝是由多种疾病和病因引起的肝脏脂肪病变，为肝细胞内脂质蓄积超过肝湿重的5％或组织学上每单位面积见1/3的肝细胞脂变，成为脂肪肝。据统计，我国脂肪肝病人约有1.4亿，在我国大中城市，脂肪肝发病率达到人口总数的8-10％以上。

近年来，随着人们生活水平的提高及生活方式的改变，脂肪肝发病率逐渐增高，尤其是在肥胖人群与II型糖尿病患者中的发病率高达50％；在嗜酒和酗酒者的发病率高达58％；在经常失眠、疲劳、不思茶饭、胃肠功能失调的亚健康人群中发病率高达60％。脂肪性肝病成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，被公认为是隐蔽性肝硬化的常见原因，正严重威胁国人的健康。

脂肪肝的发病原理按依照自身体素质、饮食习惯等因素的不同而不同，一般可分为肥胖、过食性脂肪肝，肝炎后脂肪肝，酒精性脂肪肝，营养缺乏性脂肪肝，药物性脂肪肝，糖尿病性脂肪肝，妊娠性脂肪肝和不明原因的隐源性脂肪肝等。脂肪肝按轻重程度不同又分为轻度脂肪肝、中度脂肪肝和重度脂肪肝。轻度脂肪肝，已成为现代人的普遍问题。

脂肪肝的一般治疗首先应该找出病因，有的放矢地采取相应的措施，其次调整饮食结构和适当地进行运动锻炼，同时采取药物进行辅助治疗。目前，西药常选用保护肝细胞、去脂药物及抗氧化剂，如维生素B、C、E、卵磷脂、水飞蓟素、肌苷、辅酶A、还原型谷胱甘肽、牛磺酸、肉毒碱乳清酸盐、肝泰乐、肝旨清等，然而西药并不能够真正有效地防治脂肪肝。脂肪肝的药物治疗通常还是以中药长期调理性治疗为好，如中药何首乌和山楂能降低血脂，防止胆固醇在肝内沉积。

熊胆为熊科动物黑熊Selenaretosthibetanus Cuvier或棕熊Ursusarctoslinnaeus的胆囊，囊内有干燥胆汁。熊胆是我国传统珍贵中药，入药已有几千年历史，素有“药中黄金”之美誉。熊胆粉是采用导管活体引流熊胆汁干燥而成，其化学成分与天然熊胆基本一致，主要含有结合型熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸、蛋白质、肽、微量游离氨基酸、微量胆色素、胆固醇、脂肪酸和无机元素，其胆汁酸通常与牛磺酸、甘氨酸结合，并形成钠或钙盐。熊胆粉具有稳定细胞、增加肝血流量、增加免疫机能、增加胆汁分泌、改善胆汁脂质构成等作用，在综合降脂保肝治疗中具有一定的优势。

在进行降脂保肝治疗中，熊胆粉一般与其它中药进行配伍应用，如专利号为ZL200510041996.1的中国发明专利公开了一种由熊胆粉、海藻、丹参、桃仁、茜草、山楂、决明子、郁李仁、泽泻、地龙等十味中药组成的复方制剂治疗非酒精性单纯性脂肪肝；专利号为ZL 02132917.6的中国发明专利公开了一种用于治疗各型肝炎、脂肪肝等肝胆疾病的熊胆益肝丸，由熊胆粉、鳖甲、红参、三七、当归、柴胡、山楂、郁金、姜黄、五味子、虎杖、板蓝根、白花蛇草、凤尾草、溪黄草、夏枯草、龙胆草、枸杞子、五加皮、重楼组成，其药物成分复杂，配比严苛，药物的制备工艺繁琐；公开号为CN 1338261A的中国发明专利公开了一种由70％熊胆粉和30％青叶胆浸膏组成的熊胆丸，用于治疗胆囊炎、急慢性肝炎、脂肪肝等；公开号为CN 101632829A的发明公开了一种由熊胆粉、丹参、姜黄和黄芪组成的中药组合物，用于治疗肝纤维化、肝炎、脂肪肝、肝硬化等。虽然这些中药组合物对脂肪肝的治疗具有一定的疗效，但其疗效不确切，作用不可靠；副作用大，不能长期服用；有多种名贵中药材制备而成，药物价格昂贵。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的问题提供一种熊胆提取物、其制备方法及其在制备预防和治疗脂肪肝药物中的应用，熊胆提取物制备方法简单，成本低廉，对脂肪肝的治疗作用稳定，疗效确切，对高脂性脂肪肝的预防和治疗效果明显。

为了达到上述目的，本发明一方面提供一种熊胆提取物的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)采用甲醇或乙醇对熊胆粉进行提取，制得熊胆醇提物；

2)将熊胆醇提物依次进行大孔树脂柱分离、硅胶柱层析，即得。

其中，步骤1)中所述的甲醇或乙醇的体积与所述熊胆粉的重量比为5-20∶1，即当熊胆粉的重量(干重)为1kg时，甲醇或乙醇的体积为5-20L；当熊胆粉的重量(干重)为1g时，甲醇或乙醇的体积为5-20ml；优选为7-10∶1。

特别是，所述步骤1)中所述熊胆醇提物按照如下步骤制得：首先将熊胆粉加入到第一批甲醇或乙醇中，搅拌均匀后过滤，收集滤液；接着用第二批甲醇或乙醇洗涤滤渣，合并洗涤液与滤液；然后将合并后的洗涤液与滤液干燥。

特别是，第一批甲醇或乙醇的体积与熊胆粉的重量之比为5-10∶1，即当熊胆粉的重量(干重)为1kg时，甲醇或乙醇的体积为5-10L；当熊胆粉的重量(干重)为1g时，甲醇或乙醇的体积为5-10ml；优选为7.5∶1。

特别是，第二批甲醇或乙醇的体积与熊胆粉的重量之比为2-5∶1，即当熊胆粉的重量(干重)为1kg时，甲醇或乙醇的体积为2-5L；当熊胆粉的重量(干重)为1g时，甲醇或乙醇的体积为2-5ml；优选为2.5∶1。

其中，步骤2)中所述大孔树脂柱分离包括如下步骤：

A)向熊胆醇提物中加入蒸馏水，溶解，制成熊胆水溶液；

B)将熊胆水溶液上大孔树脂柱，进行梯度洗脱，分离，其中流动相依次为蒸馏水、质量百分比浓度为95％的乙醇溶液，分别收集洗脱液；

C)将流动相为质量百分比浓度为95％的乙醇溶液的洗脱液蒸干，得到熊胆树脂柱分离物。

其中，步骤A)中熊胆醇提物与蒸馏水的重量体积比为1∶2-10，优选为1∶6-7。

其中，所述步骤B)中大孔树脂为极性或非极性大孔树脂。

特别是，所述大孔树脂为D101、HPD100、D-201、AB-8或HP-20型大孔吸附树脂中的一种。

其中，步骤B)中大孔树脂柱内的大孔吸附树脂与熊胆醇提物的重量之比为10-20∶1，优选为14-20∶1。

特别是，所述大孔树脂柱的柱直径与柱高之比为1∶2-3。

特别是，步骤B)中所述流动相的体积与熊胆醇提物的重量之比分别为60-90∶1，即当熊胆醇提物重量(干重)为1kg时，流动相的体积为60-90L，当熊胆醇提物重量(干重)为1g时，流动相的体积为60-90ml，优选为65-70∶1。

也即是，当熊胆醇提物重量(干重)为1kg时，蒸馏水、质量百分比浓度为95％的乙醇溶液的体积分别为60-90L，当熊胆醇提物重量(干重)为1g时，蒸馏水、质量百分比浓度为95％的乙醇溶液的体积分别为60-90ml。

尤其是，步骤B)中洗脱剂的流速为20-30ml/min。

其中，步骤2)中所述硅胶柱层析包括如下步骤：

A)将经过大孔树脂柱分离后得到的熊胆树脂柱分离物，拌入硅胶，干燥得到硅胶层析样品；

B)将硅胶层析样品置于硅胶柱顶部，以体积之比为99∶1-0∶1的氯仿-甲醇溶液为洗脱剂，进行硅胶柱梯度洗脱，收集洗脱液；

C)收集体积比为4∶1的氯仿-甲醇混合溶液为洗脱剂的洗脱液，蒸干，即得。

其中，步骤A)中所述熊胆树脂柱分离物与硅胶的重量比为1∶1-3；所述硅胶为200-300目硅胶粉。

其中，步骤B)中所述硅胶柱中吸附剂硅胶与熊胆树脂柱分离物的重量之比为10-30∶1，优选为15-20∶1；所述硅胶柱中的吸附剂硅胶的粒度为100-200目；硅胶柱的柱直径与柱高之比为1∶2-10。

其中，步骤B)中所述的洗脱剂为体积之比依次为99∶1、98∶2、97∶3、95∶5、4∶1的氯仿-甲醇混合液。

特别是，步骤B)中所述的洗脱剂为体积之比依次为99∶1、98∶2、97∶3、95∶5、4∶1、0∶1的氯仿-甲醇混合液洗脱流速为2-20ml/min。

特别是，每个洗脱梯度的洗脱剂体积与熊胆树脂柱分离物的重量之比为30-50∶1，即当熊胆树脂柱分离物重量(干重)为1kg时，流动相的体积为30-50L，当熊胆树脂柱分离物重量(干重)为1g时，流动相的体积为30-50ml，优选为40∶1。

尤其是，还包括在流动相是体积之比为4∶1的氯仿-甲醇混合液洗脱之后，再以流动相为甲醇进行洗脱，即以体积之比为0∶1的氯仿-甲醇体系进行洗脱。

尤其是，硅胶柱层析过程中洗脱剂的流速为2-20ml/min，优选为15ml/min。

本发明另一方面提供一种按照上述方法制备而成的熊胆提取物。

其中，制备的所述熊胆提取物中牛磺熊去氧胆酸的含量为65％-80％。

本发明的熊胆提取物可以和药剂学上可接受的辅料按传统或现代生产工艺制备成临床上可以接受的剂型，如片剂、颗粒剂、冲剂或口服液，优选的剂型为片剂、颗粒剂。所用的药物辅料可以是淀粉、糊精、羧甲基纤维素钠、乳糖、微晶纤维素、蔗糖、硬脂酸镁等。

本发明再一方面提供一种如上述方法制备而成的熊胆提取物在制备预防、治疗脂肪肝药物中的应用。

特别是，所述熊胆提取物在制备预防、治疗高脂性、肥胖性脂肪肝及酒精性脂肪肝药物中的应用。

本发明具有以下优点：

(1)本发明采用甲醇或乙醇对熊胆粉进行提取，将提取溶液干燥后进行大孔树脂柱分离和硅胶柱层析，制备方法简单，成本低廉，为治疗脂肪肝提供了一种新的药物来源。

(2)本发明制备方法可以有效地将熊胆粉中的有效成分牛磺熊去氧胆酸提取出来，提取物中牛磺熊去氧胆酸含量可高达65％，从而可以降低制剂中有效成分的添加量，节约成本。

(3)相对于提取原料熊胆粉，本发明制备的熊胆提取物在降低脂肪肝大鼠肝匀浆中甘油三酯和胆固醇含量方面的效果显著，说明本发明制备的熊胆提取物在治疗脂肪肝方面具有更好的应用前景。

附图说明

图1为脂肪肝模型大鼠造模及给药治疗流程图；

图2为空白对照组大鼠肝脏组织病理学切片的光电显微镜观察图；

图3为高脂性脂肪肝模型大鼠的肝脏组织病理学切片的光电显微镜观察图；

图4为洛伐他汀治疗组大鼠的肝脏组织病理学切片的光电显微镜观察图；

图5为熊胆粉治疗组大鼠肝脏组织病理学切片的光电显微镜观察图；

图6为本发明熊胆提取物低剂量治疗组大鼠肝脏组织病理学切片的光电显微镜观察图；

图7为本发明熊胆提取物高剂量治疗组大鼠肝脏组织病理学切片的光电显微镜观察图；

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：熊胆提取物的制备

1、制备熊胆粉醇提物

向200g熊胆粉中加入1.5L甲醇，搅拌溶解后，过滤，滤渣用500ml甲醇洗涤两次，将2次的洗涤液合并到滤液中，制得熊胆甲醇溶液；

将熊胆甲醇溶液蒸干，制得180g熊胆醇提物。

本发明中提取熊胆粉的溶液除了甲醇之外，还可以是乙醇。

2、大孔树脂柱分离

1)用乙醇和蒸馏水交替洗涤D101型大孔树脂，直至洗涤液澄清，然后用蒸馏水洗涤至无乙醇，装柱，备用；

2)取150g熊胆醇提物加入蒸馏水溶解，制得熊胆水溶液，其中加入是蒸馏水的重量为1kg，与熊胆醇提物的重量之比为6.67∶1；

3)将熊胆水溶液通过大孔树脂柱，熊胆水溶液通过大孔树脂柱的流速为10ml/min，待熊胆水溶液完全流入树脂后，依次以蒸馏水、质量百分比浓度为95％的乙醇溶液为流动相进行梯度洗脱，将流动相为蒸馏水、乙醇溶液的洗脱液分别收集，即共收集2个流份，其中，大孔树脂的重量为2100g，与熊胆醇提物的重量之比为14∶1，大孔树脂柱的柱直径与柱高之比为1∶2；各个流动相的用量为10L，洗脱流速为30ml/min；

4)将流动相为质量百分比浓度为95％的乙醇溶液的洗脱液蒸干，得到140g熊胆树脂柱分离物。

3、硅胶柱层析

1)取130g熊胆树脂柱分离物用质量百分比浓度为95％的乙醇溶解后加入150g层析用硅胶粉(200-300目)，搅拌均匀，干燥，磨碎，得到硅胶层析样品；

2)将硅胶层析样品置于硅胶柱顶部，以氯仿-甲醇混合溶剂体系为流动相进行梯度洗脱，其中，氯仿-甲醇混合溶剂体系中氯仿与甲醇的体积比依次为99∶1、98∶2、97∶3、95∶5、4∶1、0∶1；硅胶柱内的吸附剂硅胶的粒度为100-200目，硅胶柱的柱直径与柱高之比为1∶10；吸附剂硅胶与硅胶层析样品中熊胆树脂柱分离物的重量之比为15∶1，流速为15ml/min，每个洗脱梯度的流动相的用量分别为5200mL，分别按照洗脱梯度收集洗脱液，得到A、B、C、D、E、F6个流份，即流动相为体积比为99∶1的氯仿-甲醇混合体系洗脱时的洗脱液收集为A流份，体积比为98∶2的氯仿-甲醇混合体系洗脱时的洗脱液收集为B流份，体积比为97∶3的氯仿-甲醇混合体系洗脱时的洗脱液收集为C流份，体积比为95∶5的氯仿-甲醇混合体系洗脱时的洗脱液收集为D流份，体积比为4∶1的氯仿-甲醇混合体系洗脱时的洗脱液收集为E流份，甲醇(体积比为0∶1的氯仿-甲醇混合体系)洗脱时的洗脱液收集为F流份，其中将E流份蒸干即得。

采用HPLC法测定制得的熊胆提取物中牛磺熊去氧胆酸的含量：

液相分析条件：岛津ODS柱150*4.6，流动相33％乙腈-15mmol/LNaH2PO4水溶液，柱温30℃，流速1ml/min；

HPLC法测得熊胆提取物中牛磺熊去氧胆酸的含量为65.0％。

实施例2：

制备熊胆粉醇提物步骤，除了提取溶剂为乙醇，制得185g熊胆醇提物之外，其余与实施例1相同；

大孔树脂分离步骤，除了选用3000g HPD100型树脂，HPD100型树脂与熊胆醇提物的重量之比为20∶1，大孔树脂柱的柱直径与柱高之比为1∶3之外，其余与实施例1相同；

硅胶柱层析步骤除了吸附剂硅胶与硅胶层析样品中熊胆树脂柱分离物的重量之比为20∶1，其余与实施例1相同；

采用HPLC法测定制得的熊胆提取物中牛磺熊去氧胆酸的含量为80％。

实施例3：制备熊胆提取物片剂

处方：共制成1000片，各组分及含量如下：

熊胆提取物              100g

淀粉                    100g

微晶纤维素              45.5g

硬脂酸镁                1.5g

羧甲基纤维素钠           3.0g

将实施例2制备的熊胆提取物粉碎成细粉后，与淀粉、微晶纤维素搅拌混匀，再加入羧甲基纤维素钠进行制粒、干燥、整粒后，加入硬脂酸镁，混合均匀，压片，即制得熊胆提取物片剂，片剂规格为250mg/片，每片中牛磺熊去氧胆酸80mg。

实施例4：制备熊胆提取物颗粒

处方：共制成1000袋，各组分及含量如下：

熊胆提取物                  500g

蔗糖                        1500g

糊精                        1500g

将实施例1制备的熊胆提取物粉碎成细粉后，与糊精、蔗糖粉充分混合均匀，用蒸馏水制成软材，用18目尼龙筛网制粒，在温度40℃以下干燥，并过12目筛，即制得熊胆提取物颗粒，颗粒规格为3.5g/袋，每袋含牛磺熊去氧胆酸325mg。

试验例1：熊胆提取物对大鼠高脂性脂肪肝的影响

1、材料与方法

试验动物：180-220g，雌雄各半，大鼠48只，购自厦门大学实验动物中心。

试验药物：

熊胆粉(XD阳性对照药，，福建归真堂药业股份有限公司，1g/盒)；

洛伐他汀片(LFTD阳性对照药，浙江瑞邦药业有限公司，40mg/片)；

本发明实施例1制备的熊胆提取物。

2、试验方法

将实验大鼠随机分成6组，分别为空白对照组、模型对照组、阳性药物(LFTD)对照组(4mg·kg^-1·d^-1)、阳性药物(XD)对照组(1000mg·kg^-1·d^-1)、本发明熊胆提取物低剂量组(LU，500mg·kg^-1·d^-1)和高剂量组(HU，1000mg·kg^-1·d^-1)，每组8只，除了空白对照组灌胃蒸馏水，其余各组每天下午16点灌胃高脂乳剂(制法：25g猪油加热到100度，加入10g胆固醇，溶化后再加1g丙赛优(上海复星朝晖药业有限公司，50mg/片)，搅匀后加入25ml聚山梨脂80，制成油相；在另一烧杯中加入30ml蒸馏水和1，2-丙二醇20ml，加热至60度，加入2g脱氧胆酸钠，完全溶解，即为水相。然后将水相加入油相，即成脂肪乳剂)造模，灌胃容积10ml/kg，连续2周，制得脂肪肝大鼠模型。

自造模第二周开始，每天上午8点，空白对照组和模型对照组灌胃蒸馏水，其它各组分别灌胃相应的药物，连续给药3周，实验流程如图1所示。

实验动物给药3周后最后一晚禁食，不禁水。次日将各组大鼠麻醉后，取肝脏右叶制备10％肝匀浆，3000r/min，离心10min后取上清液，全自动生化分析仪测定肝匀浆的总胆固醇(total cholesterols，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)，检测结果如表1所示。

同时取肝脏左叶，OCT包埋冰冻切片，油红染色，在光学显微镜下观察肝脏脂肪变性程度，观察结果如图2-7所示。

3、试验结果

A)肝匀浆检测结果

表1  各试验组肝匀浆中甘油三酯和胆固醇的变化

	甘油三酯(TG，mmol/g)	总胆固醇(TC，mmol/g)
			空白对照组	1.28±0.18	0.99±0.06
模型组	2.59±0.34	2.26±0.09
			洛伐他汀对照组	2.01±0.12**	2.19±0.07
熊胆粉对照组	2.03±0.27**	1.90±0.14*
			本发明低剂量组	2.26±0.28*	1.82±0.16**
本发明高剂量组	1.65±0.22**#	1.54±0.07**#

注：相对于模型组，^*p＜0.05，^**p＜0.01；相对于熊胆粉组，^#p＜0.05

由表1结果可知：

1)甘油三酯的测试结果显示：阳性药洛伐他丁组，熊胆粉组以及本发明的低剂量组与模型对照组相比，对肝匀浆组织中的甘油三酯有显著的降低作用(p＜0.05)；阳性药洛伐他丁组、熊胆粉组以及本发明高剂量组具有极显著的降低肝匀浆组织中的甘油三酯作用(p＜0.01)。

2)总胆固醇的测试结果表明：熊胆粉组可以显著降低肝匀浆组织中的总胆固醇含量(p＜0.05)；本发明的低剂量组和高剂量组均可以极显著地降低肝匀浆组织中的总胆固醇含量(p＜0.01)。

3)与熊胆粉组相比，本发明高剂量组对降低肝匀浆组织中的甘油三酯和总胆固醇含量具有显著性差异(p＜0.05)，表明本发明制备的熊胆提取物在治疗脂肪肝方面具有良好的应用前景。。

B)大鼠肝脏组织病理学切片的光电显微镜观察结果：

图2显示，正常的肝组织切片中，几乎看不到红色的脂肪滴的存在；

图3显示，经过造模后的肝组织切片中，大量存在红色的脂肪油滴，证明造模成功；

图4显示，经过阳性药物洛伐他汀的治疗，红色的脂肪油滴与模型组比较有了明显的减少，肝脏的脂肪化程度减轻；

图5显示，经过熊胆粉治疗的肝脏，其切片中红色的脂肪油滴与模型组比较有了明显的减少，肝脏的脂肪化程度减轻；

图6显示，在低剂量熊胆提取物的治疗情况下，与模型组相比，肝脏中的脂肪油滴减少；

图7显示，在高剂量熊胆提取物的治疗情况下，肝脏中的脂肪油滴显著减少，在染色后的切片中几乎看不到脂肪油滴的存在，脂肪变性的肝脏明显好转，脂肪肝的治疗效果显著。

试验例2：熊胆提取物对小鼠酒精性脂肪肝的影响

1、材料与方法

实验动物：SPF级雄性昆明种小鼠50只，3周龄，体重18～22g，厦门大学实验动物中心。

药物及试剂：

熊胆粉(XD阳性对照药，福建归真堂药业股份有限公司，1g/盒)；

本发明实施例1制备的熊胆提取物；

食用乙醇(厦门科展化波有限公司)。

2、实验方法与结果

将实验小鼠随机均分为5组：空白对照组、模型对照组，熊胆粉组1280mg·kg^-1·d^-1)，熊胆提取物低剂量组(640mg·kg^-1·d^-1)和熊胆提取物高剂量组(1280mg·kg^-1·d^-1)。各组均于每日下午给予50％食用乙醇(12ml/kg)灌胃，空白对照组给予等体积的蒸馏水，每日1次。同时，每日上午灌胃相应药液(20ml/kg)，空白对照组、模型对照组则给予等体积的0.5％CMCNa。连续12天，于第1天给药后禁食不禁水24h，第12天给药后1h小鼠脱颈椎处死，剖腹迅速摘取肝脏。在各组小鼠同一部位取0.1g肝组织，剪碎，肝匀浆，3000r/min，离心10min后取上清液，全自动生化分析仪测定肝匀浆的甘油三酯(TG)，检测结果如表2所示。

表2  各试验组肝匀浆中甘油三酯的变化

	甘油三酯(TG，μmol/g)
		空白对照组	0.14±0.02
模型组	0.38±0.07
		熊胆粉对照组	0.30±0.05*
本发明低剂量组	0.2524±0.03**#
		本发明高剂量组	0.1819±0.02**##

注：相对于模型组，^*p＜0.05，^**p＜0.01；相对于熊胆粉组，^#p＜0.05，^##p＜0.01

由表2结果可知：

1)熊胆粉组，本发明低剂量组及本发明高剂量组均可以显著降低小鼠酒精性脂肪肝匀浆组织中的甘油三酯的含量。其中，熊胆粉组与模型组比较有显著性差异(p＜0.05)；本发明的低剂量和高剂量组与模型组比较有极显著差异(p＜0.01)；

2)与熊胆粉组相比，本发明低剂量组对降低酒精性脂肪肝小鼠肝匀浆组织中的甘油三酯含量也具有显著性差异(p＜0.05)；本发明高剂量组对降低酒精性脂肪肝小鼠肝匀浆组织中的甘油三酯含量具有极显著差异(p＜0.01)

本发明制备的熊胆提取物中有效成分含量高，利于减少制剂中有效成分的添加量，对降低高脂饮食脂肪肝大鼠肝匀浆中甘油三酯和胆固醇含量以及酒精性脂肪肝小鼠肝匀浆中甘油三酯含量的效果更加显著，说明本发明制备的熊胆提取物在治疗脂肪肝方面具有良好的应用前景。

Claims (10)

1.一种熊胆提取物的制备方法，其特征是包括如下顺序进行的步骤：

1)采用甲醇或乙醇对熊胆粉进行提取，制得熊胆醇提物；

2)将熊胆醇提物依次进行大孔树脂柱分离、硅胶柱层析，即得。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤1)中所述的甲醇或乙醇的体积与熊胆粉的重量之比为5-20∶1。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是步骤2)中所述大孔树脂柱分离包括如下步骤：

A)向熊胆醇提物中加入蒸馏水，溶解，制成熊胆水溶液；

B)将熊胆水溶液上大孔树脂柱，进行梯度洗脱，分离，其中流动相依次为蒸馏水、质量百分比浓度为95％的乙醇溶液，分别收集洗脱液；

C)将流动相为质量百分比浓度为95％的乙醇溶液的洗脱液蒸干，得到熊胆树脂柱分离物。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是步骤B)中所述大孔树脂为极性或非极性大孔树脂。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征是步骤B)中所述大孔树脂柱内的大孔吸附树脂与熊胆醇提物的重量之比为10-20∶1。

6.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是步骤2)中所述硅胶柱层析包括如下步骤：

A)将经过大孔树脂柱分离后的熊胆树脂柱分离物，拌入硅胶，干燥得到硅胶层析样品；

B)将硅胶层析样品置于硅胶柱顶部，以体积比为99∶1-0∶1的氯仿-甲醇混合溶液为洗脱剂，进行硅胶柱梯度洗脱，收集洗脱液；

C)收集体积比为4∶1的氯仿-甲醇混合溶液为洗脱剂的洗脱液，蒸干，即得。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征是步骤B)中所述硅胶柱内的吸附剂硅胶与熊胆树脂柱分离物的重量之比为10-30∶1。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征是步骤B)中所述的洗脱剂为体积之比依次为99∶1、98∶2、97∶3、95∶5、4∶1的氯仿-甲醇混合溶液。

9.一种熊胆提取物，其特征是按照如权利要求1-8任一所述方法制备而成。

10.如权利要求9所述的熊胆提取物在制备预防、治疗脂肪肝药物中的应用。

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