TWI630914B - 調節ＣＤ３６、ＡｐｏＡ１以及ＳＲＢ１之金櫻子萃取物的製備方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種調節CD36、ApoA1以及SRB1之金櫻子萃取物的製備方法，係以水、醇類、或醇水混合物為溶劑對金櫻子進行萃取。本發明亦提供依此法所得金櫻子萃取物用於製備降低肝臟脂肪累積之組合物之用途。該金櫻子萃取物透過抑制肝臟細胞中CD36的基因表現量，及提升肝臟細胞中ApoA1及SRB1的基因表現量，達到調節脂肪代謝、降低肝臟脂肪累積及降低血中脂肪含量的功效。
Description
本發明係關於一種金櫻子萃取物的製備方法及用途，特別係關於一種調節CD36、ApoA1以及SRB1之金櫻子萃取物的製備方法，及該金櫻子萃取物用於製備調節脂肪代謝、降低肝臟脂肪累積及降低血中脂肪含量之組合物之用途。
高油脂與高糖分的飲食方式及運動量不足使現代人容易遭遇肥胖問題，並且因為肥胖有較高機率罹患代謝相關疾病，例如糖尿病、高血脂症、心血管疾病、脂肪肝等，最終令身體健康受到嚴重威脅。有鑑於此，近年來許多醫學研究皆著重於尋求調節糖分與脂肪代謝的方法，試圖以此方式減少前述代謝疾病的發生。
在上述代謝疾病中，高血脂症是血液中脂肪濃度高於正常值的病症。血中脂肪包括三酸甘油脂(triglyceride)與膽固醇(cholesterol)，其中，膽固醇又依其所在脂蛋白(lipoprotein)的種類分為高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)與低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。高密度脂蛋白(HDL)可將血液中過多的膽固醇移除並運送至肝臟代謝，因此，高密度脂蛋白膽固醇俗稱為「好的膽固醇」。相對地，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)被稱為「壞的膽固醇」，因為低密度脂蛋白(LDL)容易滲透血管壁並積聚於動脈內壁，一方面造成動脈阻塞，甚至可能引起血管發炎，導致動脈粥狀硬化。因此，避免動脈粥狀硬化的首要策略便是降低血中脂肪含量，特別是減少三酸甘油脂與低密度脂蛋白膽固醇，以及適度增加高密度脂蛋白。
脂肪肝的臨床判斷依據是肝臟脂肪含量超過肝臟重量的5%。由於成因不同，脂肪肝又分為酒精性脂肪肝與非酒精性脂肪肝。依據脂肪代謝相關研究報告，非酒精性脂肪肝與心血管疾病或動脈粥狀硬化的發生，皆有高度關聯性。基於非酒精性脂肪肝的高全球盛行率(約20%)及其與動脈粥狀硬化密切相關，避免動脈粥狀硬化的另一關鍵是抑制脂肪肝的形成。
綜上所述，為降低前述多種代謝疾病乃至具有高致死率的動脈粥狀硬化的發生率，開發一種可調節脂肪代謝與抑制肝臟脂肪累積的組成物，實有其必要。
緣此，本發明之一目的在提供一種金櫻子(Rosa laevigata)萃取物用於製備調節游離脂肪酸受器CD36、載脂蛋白A1(Apolipoprotein A1，ApoA1)、以及清除者受體B1(Scavenger receptor class B member 1，SRB1)之組合物之用途，其中該金櫻子萃取物係以一溶劑萃取一金櫻子所獲得，該溶劑為水、醇、或醇水混合物，該溶劑與該金櫻子之液固比為5~20：1~5，且該萃取步驟係在50℃~100℃進行。
在本發明之一實施例中，前述用途係透過降抑制臟細胞中CD36的基因表現量、及提升肝臟細胞中ApoA1與SRB1的基因表現量達成，因此導致調節脂肪代謝的效果，且金櫻子萃取物的濃度為至少0.5mg/ml。
本發明之另一目的在提供一種金櫻子萃取物用於製備降低肝臟脂肪累積之組合物之用途。
在本發明之一實施例中，前述用途係透過抑制肝臟細胞中CD36的基因表現量、及提升肝臟細胞中ApoA1與SRB1的基因表現量達成，且金櫻子萃取物的濃度為至少0.5mg/ml。
本發明之又一目的在提供一種調節CD36、ApoA1、以及SRB1的金櫻子萃取物的製備方法，包含一萃取步驟，係以一溶劑萃取一金櫻子以獲得一金櫻子萃取物，其中，該溶劑為水、醇、或醇水混合物，該溶劑與該金櫻子之液固比為5~20：1~5，且該萃取步驟係在50℃~100℃進行。
在本發明之一實施例中，上述方法進一步包含將該金櫻子萃取物離心以獲得一上清液，並將該上清液過濾以獲得一濾液；將該濾液在45℃~70℃減壓濃縮以獲得一濃縮產物；以及將該濃縮產物噴霧乾燥。
依本發明製備方法所得的金櫻子萃取物能抑制肝臟細胞中CD36的基因表現量，並提升肝臟細胞中ApoA1及SRB1的基因表現量，因此達到調節脂肪代謝、降低肝臟脂肪累積及降低血中脂肪含量的功效，並且具備預防或抑制脂肪肝形成的潛力。故，本發明金櫻子萃取物可用於製備調節CD36、ApoA1、以及SRB1及降低肝臟脂肪累積之組合物。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1A-1B分別顯示未經金櫻子萃取物處理及經金櫻子萃取物處理的HepG2細胞在油紅O染色後的顯微鏡影像(放大倍率400x)。
圖1C顯示經金櫻子萃取物處理的HepG2細胞在油紅O染色後的油紅O相對含量。
圖2顯示經金櫻子萃取物處理的HepG2細胞中CD36的相對基因表現量。
圖3顯示經金櫻子萃取物處理的HepG2細胞中ApoA1的相對基因表現量。
圖4顯示經金櫻子萃取物處理的HepG2細胞中SRB1的相對基因表現量。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
本發明提供一種調節CD36、ApoA1、以及SRB1之金櫻子萃取物的製備方法，包含一萃取步驟，係以一溶劑萃取一金櫻子以獲得一金櫻子萃取物，其中，該溶劑為水、醇、或醇水混合物，該溶劑與該金櫻子之液固比為5~20：1~5，且該萃取步驟係在50℃~100℃進行。本發明亦證實該金櫻子萃取物透過
調節與脂肪代謝相關的基因表現，包含抑制肝臟細胞中CD36的基因表現量及提升肝臟細胞中ApoA1及SRB1的基因表現量，造成降低肝臟脂肪累積乃至降低血中脂肪含量的效果，並且具備預防或抑制脂肪肝形成的潛力。因此，本發明金櫻子萃取物可用於製備調節CD36、ApoA1、以及SRB1及降低肝臟脂肪累積之組合物。
自Gibco購買DMEM培養基(Dulbecco's modified Eagle’s medium)，商品編號12100-038；胎牛血清(fetal bovine serum)，商品編號10438-026；青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin)，商品編號15140-122；及磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline)，商品編號14200-075。自Sigma購買油紅O(oil reod O)，商品編號#O0625；及油酸(oleic acid)，商品編號#O1008。自Echo chemical購買甲醛(fomaldehyde)，商品編號TG1794-4-0000-72NI；及異丙醇(isopropanol)，商品編號PH-3101。自Bio Basic Inc.購買牛血清白蛋白(bovine serum albumin)，商品編號AD0023。
以下實施例使用人類肝癌細胞株HepG2(ATCC HB-8065)進行實驗。HepG2細胞在37℃、5% CO2下培養於添加10%胎牛血清(簡稱FBS)及1%青黴素/鏈黴素之DMEM培養基。
首先，配製0.34mM牛血清白蛋白的PBS溶液及0.2mM油酸的PBS溶液，其中，油酸先溶於100%乙醇再與PBS溶液混合。其次，在37℃下將前述二種溶液依體積比1：1混合至少1小時，當混合液澄清即得油酸-牛血清白蛋白接合物溶液。
本發明以油紅O染色測定細胞中的脂肪含量變化。染色前，使用磷酸緩衝鹽溶液(簡稱PBS溶液)清洗細胞2次，再以10%甲醛固定細胞30分鐘。該固定的細胞經PBS溶液清洗2次後，以50%異丙醇潤洗15秒。其次，以溶於60%異丙醇之油紅O染劑對細胞染色1小時，再以去離子水洗去多餘染劑。染色後細
胞可直接以顯微鏡(ZEISS Axio Vert.A1)觀察，或以100%異丙醇溶解細胞內染劑以進行定量分析。定量分析係以Excel軟體之學生t檢定進行統計分析。
本發明以定量聚合酶鏈鎖反應(quantitative polymerase chain reaction，簡稱Q-PCR)測定細胞中脂肪代謝相關基因的表現量，其步驟簡述如下。依據廠商使用說明，利用RNA萃取套組(RNA Extraction Kit，Geneaid)自細胞分離出RNA後，於37℃下以反轉錄酶SuperScript® III Reverse Transcriptase(Invitrogen)將RNA反轉錄為cDNA。其次，利用Q-PCR套組(KAPA CYBR FAST qPCR Kit(2X)，KAPA Biosystems)及特定引子組(SIRT1、CLOCK、BMAL1、PER2)對該cDNA進行PCR，使用儀器為StepOnePlusTM Real-Time PCR Systems。
首先，將金櫻子洗淨晾乾，以均質機將直徑2-6公分的金櫻子磨碎。其次，以水、醇類、或醇水混合物為溶劑對金櫻子均質物進行萃取，該溶劑與金櫻子均質物之液固比為5~20：1~5。萃取溫度界於50℃~100℃，較佳為70℃~90℃。本實施例中萃取時間為0.5~3小時。
經上述萃取步驟所得金櫻子萃取物冷卻至室溫後，可進一步以800~1300rpm之轉速在15℃~25℃下離心5~10分鐘而獲得一上清液，該上清液可以400目(mesh)之濾網過濾，以移除殘餘固體物。該過濾後的金櫻子萃取物可進一步在45℃~70℃進行減壓濃縮而獲得一濃縮產物。為獲得固態的金櫻子萃取物，可將前述經減壓濃縮的金櫻子萃取物以噴霧乾燥方式去除溶劑，因此獲得金櫻子萃取物粉末。
為檢驗本發明金櫻子萃取物對肝臟脂肪含量的影響，本實施例以油紅O染色分析人類HepG2細胞經金櫻子萃取物處理後，其脂肪含量的變化。首先，將HepG2細胞依5×105個細胞/孔接種於6孔培養盤，置於37℃下培養。其次，以含有0.5mg/ml金櫻子萃取物及2%FBS之DMEM培養基處理細胞。24小時後，移除該培養基，置換以含有油酸-牛血清白蛋白接合物、2%FBS、及1%青黴素/
鏈黴素之DMEM培養基，再以0.5mg/ml金櫻子萃取物處理細胞24小時。最終，移除該培養基，以PBS溶液清洗細胞後進行油紅O染色。作為對照組的HepG2細胞係經不含金櫻子萃取物之前述試劑處理。
圖1A及圖1B分別顯示對照組及經金櫻子萃取物處理的HepG2細胞在油紅O染色後的顯微鏡影像(放大倍率400x)。比較圖1A與圖1B，可觀察到對照組細胞帶有大量被染成紅色的油滴。相對地，HepG2細胞經金櫻子萃取物處理後，其所呈現紅色部分明顯減少。將上述油紅O染色後的細胞進一步用於細胞內染劑之定量分析，所得結果如圖1C所示，圖中縱座標之油紅O相對含量表示相對於對照組細胞之油紅O含量的百分比，*表示p<0.01。依據圖1C，經金櫻子萃取物處理的HepG2細胞含有明顯較少量的油紅O染劑。此結果顯示本發明金櫻子萃取物能減少脂肪累積於肝臟細胞，且具備抑制脂肪肝形成的潛力。
為進一步探討本發明金櫻子萃取物對脂肪代謝相關基因的調節作用，本實施例以Q-PCR測定HepG2細胞經金櫻子萃取物處理後，其脂肪代謝相關基因之表現量變化。首先，將HepG2細胞依1.5×105個細胞/孔接種於6孔培養盤，置於37℃下培養。其次，以0.5mg/ml或1mg/ml金櫻子萃取物處理細胞6小時、24小時、或48小時，再收集經處理細胞以進行Q-PCR。作為對照組的HepG2細胞係經同於金櫻子萃取物之萃取溶劑處理。
上述HepG2細胞中游離脂肪酸受器CD36的相對基因表現量如圖2所示，圖中縱座標之相對基因表現量表示相對於對照組細胞之CD36基因表現量的倍數，*表示p<0.01。CD36是一種脂肪酸移位酶，先前研究發現其表現量增加與肝臟脂肪累積及血中脂肪含量成正相關。依據圖2，經金櫻子萃取物處理的HepG2細胞有較低的CD36基因表現，大約是對照組細胞之CD36基因表現量的25%，且當金櫻子萃取物的濃度由0.5mg/ml增加至1mg/ml，該降幅更為明顯。此結果說明本發明金櫻子萃取物能透過抑制肝臟細胞中CD36的基因表現量，減少肝臟乃至血液中的脂肪累積。
承上述實驗，圖3及圖4分別顯示HepG2細胞中ApoA1及SRB1的相對基因表現量，圖中縱座標之相對基因表現量分別表示相對於對照組細胞之ApoA1及SRB1基因表現量的倍數，*表示p<0.01。先前研究指出ApoA1是高密度脂蛋白的主要構成蛋白質，其表現量上升能增加高密度脂蛋白在肝臟的合成，進而有助於清除血中脂肪，如膽固醇；SRB1則能協助肝臟吸收高密度脂蛋白中來自身體其他組織的膽固醇，因此促進體內膽固醇在肝臟代謝。依據圖3及圖4，以0.5mg/ml金櫻子萃取物處理HepG2細胞能顯著增加其ApoA1及SRB1的基因表現量分別達2.37倍與6.87倍。此結果說明本發明金櫻子萃取物能藉由提升肝臟細胞中ApoA1及SRB1的基因表現量，促進高密度脂蛋白在肝臟的合成與膽固醇在肝臟的代謝，進而調節身體脂肪代謝、減少血中脂肪含量、及降低肝臟脂肪累積。
綜上所述，本發明以水、醇類、或醇水混合物為溶劑所萃取得之金櫻子萃取物能透過抑制肝臟細胞中CD36的基因表現量，及提升肝臟細胞中ApoA1及SRB1的基因表現量，達到調節脂肪代謝、降低肝臟脂肪累積及降低血中脂肪含量的功效，亦具備預防或抑制脂肪肝形成的潛力。因此，本發明金櫻子萃取物可用於製備調節CD36、ApoA1、以及SRB1及降低肝臟脂肪累積之組合物。
Claims (15)
- 一種金櫻子萃取物用於製備調節CD36、ApoA1以及SRB1之組合物之用途，其中該金櫻子萃取物係以一溶劑萃取一金櫻子所獲得，該溶劑為水、醇、或醇水混合物，該溶劑與該金櫻子之液固比為5~20：1~5，且該萃取步驟係在50℃~100℃進行。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該金櫻子萃取物抑制肝臟細胞中CD36的基因表現量。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該金櫻子萃取物提升肝臟細胞中ApoA1的基因表現量。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該金櫻子萃取物提升肝臟細胞中SRB1的基因表現量。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該金櫻子萃取物的濃度為至少0.5mg/ml。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該金櫻子萃取物係調節脂肪代謝。
- 一種金櫻子萃取物用於製備降低肝臟脂肪累積之組合物之用途，其中該金櫻子萃取物係以一溶劑萃取一金櫻子所獲得，該溶劑為水、醇、或醇水混合物，該溶劑與該金櫻子之液固比為5~20：1~5，且該萃取步驟係在50℃~100℃進行。
- 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該金櫻子萃取物抑制肝臟細胞中CD36的基因表現量。
- 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該金櫻子萃取物提升肝臟細胞中ApoA1的基因表現量。
- 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該金櫻子萃取物提升肝臟細胞中SRB1的基因表現量。
- 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該金櫻子萃取物的濃度為至少0.5mg/ml。
- 一種調節CD36、ApoA1以及SRB1之金櫻子萃取物的製備方法，包含一萃取步驟，係以一溶劑萃取一金櫻子以獲得一金櫻子萃取物，其中，該溶劑為水、醇、或醇水混合物，該溶劑與該金櫻子之液固比為5~20：1~5，且該萃取步驟係在50℃~100℃進行。
- 如申請專利範圍第12項所述之製備方法，進一步包含將該金櫻子萃取物離心以獲得一上清液，以及將該上清液過濾以獲得一濾液。
- 如申請專利範圍第13項所述之製備方法，進一步包含將該濾液在45℃~70℃減壓濃縮以獲得一濃縮產物。
- 如申請專利範圍第14項所述之製備方法，進一步包含將該濃縮產物噴霧乾燥。
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