KR100840558B1

KR100840558B1 - 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 케나프 추출물

Info

Publication number: KR100840558B1
Application number: KR1020070022768A
Authority: KR
Inventors: 조동하; 조재열; 이용규; 김주영; 변세은; 박형재; 유창연; 이한신; 김성무
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2007-03-08
Filing date: 2007-03-08
Publication date: 2008-06-23

Abstract

본 발명은 항염증 활성 및 면역조절 활성을 나타내는 케나프 추출물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 염증반응인자로서의 종양괴사인자 (TNF)-α 생성 억제, 인터류킨(IL)-3 및 인터류킨-12의 mRNA 발현 억제, 산화질소(nitric oxide, NO) 및 프로스타글란딘 (PGE₂), 활성산소종(ROS)의 생성을 억제하여 면역조절에 관여하는 대식세포(macrophage)의 기능을 조절하는 효과를 가지고 있어 면역반응에 의한 질환의 예방 및 치료에 유용한 케나프(Hibiscus cannabinus L., Malvoceae) 추출물에 관한 것이다.

항염증활성, 케나프 추출물, 대식세포, 산화질소, 사이토카인

Description

항염증 및 면역조절 활성을 가지는 케나프 추출물{Hibiscus cannabinus L. extract for antiinflammatory and immunecontrol activity}

도 1은 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포에서 전염증성 사이토카인의 발현 및 생성에 있어 케나프 추출물의 효과를 나타낸 것으로,

(A) TNF-α 생성 : RAW264.7 세포 (1×10⁶ cells/ml)는 18시간 동안 전배양하고 LPS (2.5 μg/ml) 존재 하에서 케나프 에탄올 추출물(0부터 400 μg/ml까지)을 처리한 후 6시간 동안 배양시켰다. 생성된 TNF-α의 양은 TNF-α ELISA 키트로 측정하였다. 데이터는 세 번의 측정값의 평균값을 ±SEM으로 나타내었다.

(B, C) mRNA 발현 : RAW264.7 cells (1×10⁷cells/ml)로부터 전염증성 사이토카인의 mRNA 수준은 반정량적 RT-PCR로 측정하였다. 상대적인 세기(RI)는 GAPDH 밴드세기의 비율로 계산하였다. p<0.05, **: p<0.01.

도 2는 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포에서 프로스타글란딘 (PGE₂) 생성 및 시클로옥시게나제(COX)-II 발현에 있어 케나프 추출물의 효과를 나타낸 것으로,

(A) 프로스타글란딘 (PGE₂)의 생성 : RAW264.7 세포 (1×10⁶ cells/ml)는 LPS (2.5 μg/ml)를 처리하여 자극하고 케나프 에탄올 추출물 (0부터 400 μg/ml까지)을 처리하고 24시간 동안 배양시켰다. 상등액을 분리하고, ELISA 방법을 이용하여 상등액으로부터 PGE₂ 생성농도를 측정하였다. 데이터는 세 번의 측정값의 평균값을 ±SEM으로 나타내었다.

(B) COX-II 발현 : RAW264.7 세포 (1×10⁷ cells/ml)로부터 COX-II의 mRNA 수준은 반정량적 RT-PCR에 의해 측정하였다. 상대적인 세기(RI)는 GAPDH 밴드세기의 비율로 계산하였다. p<0.05, **: p<0.01.

도 3은 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포에서 산화질소의 생성, iNOS의 발현 및 SNP-처리된 세포에서 ROS의 생성에 있어 케나프 추출물의 효과를 나타낸 것으로,

(A) 산화질소(NO)의 생성 : LPS (2.5 μg/ml)에 의해 자극시킨 RAW264.7 세포 (1×10⁶ cells/ml)는 다양한 추출물 (0부터 400 μg/ml까지)을 처리하고 24시간 동안 배양시켰다. 배양된 세포액에서 상등액을 분리하고, Griess시약을 이용하여 상등액의 산화질소(NO) 농도를 측정하였다.

(B) iONS 발현 : RAW264.7 세포(1×10⁷ cells/ml)로부터 iNOS의 mRNA 수준은 반정량적 RT-PCR을 이용하여 측정하였다.

(C) 활성산소종(ROS) 발생 : RAW264.7 세포 (2×10⁶ cells/ml)는 케나프 추출물 (0부터 100 μg/ml까지)로 전처리하고 DHR123 (10 μM)은 SNP (125 μM)로 15시간 동 안 처리하였다. ROS 발생은 유세포분석기를 이용하여 측정하였다.

(D) 세포보호효과 : LPS (2.5 μg/ml)에 의해 자극된 RAW264.7 세포 (1×10⁶ cells/ml)에 케나프 에탄올 추출물 (0부터 400 μg/ml까지)을 처리하고 24시간 동안 배양시켰다. 세포독성은 MTT 분석을 통하여 측정하였다.

(E) HO-1 발현 : RAW264.7 세포(1×10⁷ cells/ml)로부터 HO-1의 mRNA 수준은 반정량적 RT-PCR을 이용하여 측정하였다.

도 4는 RAW264.7 세포의 식세포탐식 및 LPS 처리 하에서 공동자극분자 수준에 있어 케나프 추출물의 효과를 나타낸 것으로,

(A) 식세포탐식 : RAW264.7 세포 (2×10⁶ cells/ml)는 케나프 에탄올 추출물 (0부터 400 μg/ml까지)처리하고, LPS (2.5 μg/ml)를 처리하거나 처리하지 않은 조건에서 6시간 동안 FITC-덱스트란 (1 mg/ml)을 처리하였다. 식세포탐식 정도는 유세포분석기를 이용하여 측정하였다. 왼쪽 패널: MFI 값, 오른쪽 패널: 히스토그램을 나타낸다.

(B) 공동자극분자 (CD40, CD80 및 CD86) 수준 : RAW264.7 세포 (2×10⁶ cells/ml)는 케나프 에탄올 추출물 (200 μg/ml)로 전처리하고 LPS (2.5 μg/ml)를 처리하거나 처리하지 않은 조건에서 6시간 동안 자극시켰다. 공동자극분자 (CD40, CD80 및 CD86)의 표면수준은 유세포분석기를 이용하여 측정하였다.

도 5는 세포-세포에 의해 부착분자의 기능적 활성, 세포-피브로넥틴 부착 분석 및 LPS-상향조절된 CD29의 표면수준에 있어 케나프 추출물의 효과를 나타낸 것으로,

(A) 세포-세포 부착 : U937 세포 (1×10⁶ cells/ml)는 케나프 에탄올 추출물 (0 부터 400 μg/ml까지)로 전처리하고, 전응집성 항체가 존재하거나 존재하지 않는 조건 [CD29 (MEM 101A) 및 CD43 (161-46) 항체 (1 μg/ml 각각)]에서 3시간 동안 배양시켰다. 배양시 세포의 이미지는 비디오 카메라가 장착된 도립위상차현미경을 사용하여 얻었다.

(B) 세포-피브로넥틴 부착 : 케나프 에탄올 추출물 (0 부터 400 μg/ml까지)로 전처리한 U937 세포 (1×10⁶ cells/ml)는 피브로넥틴 (50 μg/ml)-도포된 플레이트에서 3시간동안 더 배양시켰다. 부착된 세포는 크리스탈 바이올렛 분석을 통해 결정하였다.

(C) CD29의 표면 수준 : 케나프 에탄올 추출물 (200 μg/ml)로 전처리한 U937 세포 (1×10⁶ cells/ml)는 LPS (2.5 μg/ml)를 처리하거나 처리하지 않은 조건에서 24시간 동안 배양시켰다. CD29 표면 수준은 유세포분석기를 이용하여 측정하였다. A 및 C의 결과는 3회의 평균 실험 결과를 보여준다. *: p<0.05

본 발명은 항염증 및 면역조절 활성을 나타내는 케나프 추출물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 염증반응인자로서의 종양괴사인자 (TNF)-α 생성 억제, 인터류킨(IL)-3 및 인터류킨-12의 mRNA 발현 억제, 산화질소(nitric oxide, NO), 프로스타글란딘 (PGE₂), 활성산소종 (ROS)의 생성을 억제하여 면역조절에 관여하는 대식세포(macrophage)의 기능을 조절하는 효과를 가지고 있어 면역반응에 의한 질환의 예방 및 치료에 유용한 케나프(Hibiscus cannabinus L., Malvoceae) 추출물에 관한 것이다.

염증반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등 외적 증상이 나타난다. 정상인경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성질환, 만성 염증)이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 산화질소(nitric Oxide; NO)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제 (nitric oxide synthase; NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 COX(시클로옥시게나제)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 목표가 되고 있다.

최근의 연구 결과에 따르면, NOS는 몇 가지 종류가 존재하는데 뇌에 존재하는 bNOS (brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는데 반하여, 각종 사이토카인(cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 유도되는 iNOS(inducible NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와 관련 있다는 연구가 있다(Miller M. J. et al., Mediators of inflammation, 4, pp387-396, 1995 : Appleton L. et al., Adv. Pharmacol., 35 , pp27-28, 1996).

또한, 시클로옥시게나제도 2종류의 이소형태가 존재하는데, 시클로옥시게나제- 1(cyclooxygenase-1, COX-1)은 세포내에 항상 존재하여 세포보호작용에 필요한 프로스타글란딘(PGs)을 합성하는 작용을 나타내는 것에 반하여, COX-2는 염증반응시 세포내에서 급격히 증가되어 염증 반응을 일으키는 데 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다(Weisz A., Biochem. J., 316, pp209-215, 1996). NO와 PGs의 정도를 향상시키는 iNOS 및 COX-2를 포함하는 전사 염증 인자는 다양한 경화(sclerosis), 파킨슨병(parkinson's disease), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease) 및 결장암(colon cancer)을 포함하는 만성 질환의 병인에 관련한다.

TNF-α와 같은 다 기능성 사이토카인(cytokine)은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변 과정에서 그 발현 정도가 증가되며, 특히 암촉진 과정에서 일어나는 피부염증에 중요한 역할을 한다. TNF-α가 인간의 염증성 피부질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고되고 있다(Verhoef, J. et al., J. Antimicrob. Chemother., 35, 1996). 여러 염증질환과 알러지 현상에 TNF-α에 대한 항체를 처리하였을 때 증상이 완화되었고, TNF-α는 호중성 백혈구를 활성화 시켜 과산화수소 생성을 증가시킴으로써 내인성 암촉진제로서의 기능도 하고 있다. 따라서, 발암촉진 단계와 밀접한 관계가 있는 염증단계에 중추적 역할을 하고 있는 사이토카인인 TNF-α의 발현을 저해시키거나 COX-2 활성저해에 기인하는 프로스타글란딘 PGE₂의 생성 억제를 통해 초기염증성 분자(proinflammatory molecule)의 증가를 수반하는 병변 과정을 조절할 수 있을 가능성이 높다. 세균감염 하에서 항생제로 치료 시, 박테리아를 죽이 면서 세포외막으로부터 방출되는 LPS는 엔도톡신 쇽(endotoxin shock)을 일으키며, 이러한 과정에 의해 심하게 파괴될 경우, 계속해서 생성되는 LPS를 중화시키지 못하게 된다 (Dunn, D. L., Surg. Clin. North. Am.,74, 1994 : Giroir, B. P., Crit. Care Med.,21, 1993 : Yamaguchi, Y. et al., J. Reticuloendothel. Soc.,409 , 1982). 그러므로 약물 처리를 하여 LPS의 작용을 줄임으로서 효과를 볼 수 있을 것이다.

한편, 대식세포(macrophage)는 혈액의 단핵세포(백혈구)에서 유래한 것으로 특수한 조직세포의 한 종류이다. 대식세포는 세포 파편을 제거하거나 병원성 미생물을 죽이고 림프구 세포로 모아져서 항원작용 (Kinne et al., 2000)을 한다. 그러므로 대식세포의 활성은 효과적인 내적 면역체계에서 중요한 역할을 수행하게 된다. 신체가 병원성 자극이나 손상을 받게 되면 대식세포는 다양한 전염증성 사이토카인(종양괴사인자(TNF)-α, 인터류킨-1, -2), 세포 사이의 신호 전달을 담당하는 케모카인(chemokines), 염증성 분자 (산화질소 (NO), 활성산소종(ROS) 및 PGE₂)를 방출하고, 또한 당단백질 (공동자극분자인 CD80 및 CD86, 부착분자)의 표면 수준을 상향조절한다 (Bresnihan, 1999; Burmester et al., 1997; Gracie et al., 1999).

그러나 이러한 대식세포들의 이점들은 숙주의 면역성 반응의 크기에 의존한다. 염증 매개물질에서 유래한 대식세포는 혈액 내에서 양이 많아져 셉틱 쇽이나 류머티 즘성 관절염, 동맥경화증과 같은 염증성 질병(Gracie et al., 1999; Michaelsson et al., 1995; Stuhlmuller et al., 2000)과 관련된 손상을 막을 수 있다. 그렇기 때문에 어떠한 병이 심한 상태에서 회복이 되느냐하는 것은 대식세포 기능 조절에 달려있다.

한편, 케나프 (Hibiscus cannabinus L., Malvoceae)는 탄닌, 사포닌, 폴리페놀, 알칼로이드, 스테로이드 화합물을 과량 함유하고 있으며 인후염 장애, 타박상, 담즙분리 과다조절, 열과 산복의 치료(Duke, 1983; Lawton, 2004) 를 위해 인도와 아프리카에서 민간요법에 사용되어지는 것으로 알려져 있다 (Agbor et al., 2005; Kobaisy et al., 2001); Agbor et al., 2004).

현재까지의 비스테로이드성 항염증 약물(nonsteroidal antiinflammatory drug, NSAID)의 사용으로 인한 염증의 감소는 흔히 상당한 기간 동안 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제(아스피린 등)의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급하다고 할 수 있다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 최근에는 민간에서 사용되어지는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.

이에 본 발명자들은 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 천연물을 연구하던 중, 케나프 잎 추출물이 대식세포에서 면역반응을 조절하며 항염증 활성이 있는 것을 밝히고, 본 발명을 완성하게 되었다

따라서, 본 발명의 목적은 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 케나프 추출물 및 그 분획물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 케나프 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 케나프 추출물의 종양괴사인자(TNF)-α 발현억제, 산화질소(NO), 활성산소종(ROS), 시클로옥시게나아제(COX)-II의 발현 및 억제활성을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 케나프 에탄올 추출물 및 그 분획물을 제공한다.

본 발명의 케나프 추출물은 물, C1 ∼C4 의 저급알코올, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸 에테르 및 디클로로메탄으로 이루어진 그룹 중에서 단일 또는 2종 이상의 혼합 용매를 혼합하여 침지시 킨 후 추출하여 추출원액을 여과 및 농축하여 제조한다. 바람직하게는 메탄올 또는 메탄올과 물의 혼합 용매를 사용하여 케나프 추출물을 제조한다.

또한 본 발명은 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6), 산화질소(nitric oxide, NO), 활성산소종(ROS), 프로스타글란딘 (PGE₂)의 발현 및 생성을 억제하는 케나프 에탄올 추출물을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

재료 및 방법

케나프 잎은 James S. Han (USDA Madison, WI. USA)로부터 감정을 받은 것으로 2005년 10월 대한민국 전라북도 부안군 계화면의 농지에서 채취하여 사용하였다 (No. KT-34).

<1. 기구 및 시약>

프레디솔론 (Prednisolone), 펜톡시필린 (pentoxifylline), N-모노메칠-L-아르기닌 (N-MMA), 인도메타신 (indomethacin), 소듐 니트로프루시드 (sodium nitroprusside (SNP)), FITC-덱스트란 및 리포폴리사카라이드 (LPS, E. coli 0111:B4)는 시그마사로부터 구입하였다 (St. Louis, MO). Bay11-7082 및 U0126는 캘바이오켐으로부터 획득하였다 (La Jolla, CA). CD40, CD80 및 CD86에 PE-컨쥬게이션된 항체는 pharMingen (San Diego, CA)으로부터 구입하였으며, TNF-a 및 PGE₂를측정하기 위한ELISA 키트는 Amersham (Little Chalfont, Buckinghamshire, UK), 페탈 보닌 시럼 및 RPMI1640은 GIBCO (Grand Island, NY)사, RAW264.7 및 U937 세포는 ATCC (Rockville, MD)사로부터 구입하였다. 본 발명에 사용된 다른 시약은 시그마 등급을 사용하였으며 CD29 (MEM101A) 및 CD43 (161-46)에 응집되어진 항체는 기존에 보고된 방법을 사용하였다 (Cho et al., 2001; Cho et al., 2003).

<2. 케나프 잎으로부터 추출물 제조 및 용매 분획>

농가에서 채취한 케나프 (Hibiscus cannabinus L., Malvoceae)를 건조하고 분쇄한 케나프 175 g을 80℃에서 80% 에탄올 1.5L로 3회 추출하고, 얻은 추출액은 회전식 감압증발기를 이용하여 농축한 다음 동결건조하여 추출물 65 g을 얻었다. 상기 추출물에 물 500 mL을 넣고 현탁시킨 후 헥산(n-hexane) 500 mL를 가하여 헥산층을 분리한 다음 이를 반복하여 얻은 헥산층을 농축하여 헥산 분획물 5.8 g을 얻었다. 남은 수용액 층에 연이어 에틸아세테이트(ethyl acetate)와 부탄올(n-butanol)을 상기한 바와 같은 동일한 방법으로 분획한 후 농축하여 에틸아세테이트 분획물 8.1 g, 부탄올 분획물 23.3 g, 물 분획물 32.0 g을 각각 얻었다.

<3. 세포배양>

RAW264.7과 U937 세포는 100 U/ml의 페니실린, 100 μg/ml의 스트렙토마이신, 10% 페탈 보닌 시럼(우태혈청)을 첨가한 RPMI1640 배지에서 보존하였다. 세포는 37^oC 온도에서, 5% CO₂를 유지한 습한 조건에서 키웠다.

<4. 사이토카인 ( TNF -a, IL -1β 및 IL -6)의 생성 또는 발현측정>

케나프 에탄올 추출물 (100 mg/ml 에탄올)은 처리하기 전에 RPMI1640에 희석하여 사용하였다. LPS를 처리한 RAW264.7 세포에서 TNF-α의 생성에 있어 케나프 추출물의 억제효과는 기존에 Cho등이 보고한 방법으로 실시하였다 (Cho et al., 2000). 케나프 에탄올 추출물을 처리한 다음, 상등액을 회수하여, ELISA 방법으로 TNF-α를 분석하였다.

사이토카인 mRNA 발현을 측정하기 위해서, LPS를 처리한 RAW264.7 세포에(제조사의 protocol에 따라) TRIzol 시약을 첨가하여 RNA를 준비하고, 총 RNA 용액은 사용할 때까지는 -70℃에 보관하였다.

반정량적 RT 반응은 MuLV 역전사효소를 사용하여 실험하였다. 전체 RNA (1 μg)은 올리고-dT15와 함께 70℃에서 5분 동안 배양하고, 5х 단일가닥 완충용액을 혼합하 였다. 10 mM dNTP과 0.1 M DTT를 첨가한 다음 37℃ 에서 5분간 방치시켰다. 그리고 MuLV 역전사효소 (2 U)를 첨가하고 60분을 방치시켰다. 반응은 70℃에서 10분간 더 방치한 다음 종결하고 전체 RNA RNase H를 첨가하여 소모시켰다. PCR 반응은 혼합물[cDNA 2 μl, 4 mM 5’ 및 3’ 프라이머, 10x 완충용액 (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1 % Triton X-100), 250 μM dNTP, 25 mM 염화마그네슘 및 Taq polymerase (Promega, USA)] 1 unit를 사용하였고, PCR 조건은 94℃에서 45초간 변성시킨 후, 55~60℃에서 45초간 어닐링하고, 72℃에서 60초간 확장시킨 다음 30회간 반복하고 마지막 단계에서 72 ℃에서 7분간 더 확장하였다. 본 발명에 사용된 프라이머(Bioneer, Seoul, Korea)는 표 1에 나타내었다.

표 1. RT-PCR 분석에 사용된 프라이머 서열

F: 정방향, R: 역방향을 나타낸다.

<5. 산화질소 ( nitric oxide , NO )의 생성 측정>

대식세포 RAW264.7 (1×10⁶cells/ml)에 LPS (1 μg/ml)를 처리하여 18시간 동안 활성화를 유도한 다음, 각각의 용매 분획물 (100 μg/ml)을 이전에 보고된 것(Cho et al., 2000)과 같은 동일한 방법으로 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 그런 다음 배지를 원심분리하고, 얻은 상등액에 생성된 안정한 산화 생성물인 질산이온 (NO₃-)의 생성을 측정하였다. 상등액 100 μl에 그리스 시약 (Griess reagent: 1% 설파닐아미드, 5% 인산에 녹인 0.1% N-(1-나프틸)에틸렌디아민디하이드로클로라이드) 100 μl을 첨가하여 측정하였다.

<6. 프로스타글란딘 ( PGE ₂ )의 생성 측정>

대식세포 RAW264.7 세포(1×10⁶cells/ml)에 LPS (1 μg/ml)를 무처리하거나 처리하여 18 시간동안 전배양하고, 각각 용매 분획물 (100 μg/ml)을 처리하여 24시간 동안 배양시켰다. 그런 다음 배양액을 원심분리하여 상등액을 분리하고 상등액의 프로스타글란딘의 생성을 ELISA 키트 (Lee et al., 2006)를 사용하여 측정하였다.

<7. 세포 분열 증식을 측정하기 위한 MTT ( colorimetric assay ) 분석>

케나프 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물의 세포독성 실험은 MTT 분석법으로 측정하였다. 세포독성 실험 배양액은 배양실험 종료 3시간 전에 MTT 용액 (인산완충용액-살린 속에 10 mg/ml, pH 7.4) 10 μl을 첨가하고, 세포는 반응 종료까지 계속 배양시켰다. 배양은 포르마잔의 용해성을 증가시키기 위해 15% 소듐 도데실 설페이트를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 570 nm에서 광학 밀도(OD)는 스펙트라맥스 250 마이크로플레이트 리더 (Spectramax 250 microplate reader)를 사용하여 측정 하였다.

<8. 세포-세포 또는 세포- 세포외기질 단백질( 피브로넥틴 ) 부착 분석>

U937 세포-세포 부착분석은 기존에 보고된 방법 (Cho et al., 2001; Cho et al., 2003)으로 수행하였다. 간단히 설명하면, U937 세포는 케나프 에탄올 추출물을 가지고 37℃에서 1시간 동안 전배양하고 96-well 플레이트에서 아고니스틱 항체 (1 μg/ml)를 처리하여 더 배양시킨다. 2시간 동안 배양한 후, 배양액은 COHU 고성능 CCD 비디오 카메라가 장착된 위상차현미경을 사용하여 측정하였다. 각각 well에서 임의로 4개를 선택하고 클러스터의 평균크기를 계산하기위해 NIH 이미지 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

세포-피브로넥틴 부착 분석을 위해, U937 세포 (5×10⁵cells/well)는 프브로넥틴 (50 μg/ml)-도포된 판에 뿌리고 3시간 동안 배양시켰다 (Larrucea et al., 1998). PBS에 풀어지는 세포를 제거한 다음, 크리스탈 바이올렛 (0.1%)을 15분 동안 흡착된 세포에 처리하였다. 570 nm에서 OD값은 스펙트라맥스 250 마이크로플레이트 리더 (Spectramax 250 microplate reader)를 사용하여 측정하였다.

<9. ROS 측정>

ROS의 생성은 형광성 프로브인 디하이드로로다민을 사용하는데, 세포내 산화제에 의해 산화된 형광성 삽입물질인 로다닌에 의해 특히 슈페록사이드 라디칼이 측정되 어진다 (Lopez-Ongil et al., 1998). RAW264.7 세포 (2×10⁶ cells/ml)는 먼저 불완전한 RPMI 1640 배양액에서 10 μM DHR123 존재하에서 30분 동안 배양시키고 SNP (0.125 mM) 조건에서 15분간 더 배양시킨다. ROS 생성은 플로우사이토메트리를 사용하여 측정하였다.

< 실시예 1: 케나프 추출물의 LPS 처리에 의해 유도된 전염증성 사이토카인의 발현억제 활성>

사이토카인 및 케모카인 (IL-1β, IL-6, TNF-α, MCP-1)은 정상적인 방어응답과 셉틱 쇽, 류머티즘성 관절염, 자동면역질병과 같은 악성 염증성 질환의 면역질환과 연결된 다양한 생물학적 활성을 가지는 전염증성 사이토카인으로 알려져 있다 (Pharoah et al., 2006; Szekanecz et al., 2006). 그래서 본 발명에서는 처음으로 케나프 추출을 이용하여 쥐의 대식세포 (RAW264.7)에서 사이토카인생성을 효과적으로 조절하는 것을 ELISA 및 반정량적 RT-PCR 방법을 이용하여 밝혔다.

도 1에서 알 수 있듯이, 케나프 에탄올 추출물(50에서 400 μg/ml까지)은 RAW264.7 세포에서 TNF-α의 생성을 최대 70%이상 억제하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 억제효과는 전사수준에서는 확인할 수 없었는데, 이것은 TNF-α mRNA의 발현을 약하게 저해하는 것으로 여겨진다 (도 1B 참조).

다른 사이토카인 및 케모카인의 mRNA 발현에 있어 에탄올 추출물 (200 μg/ml)의 조절기능을 확인한 결과, 도 1C에서 보면 IL-3 및 IL-12의 발현이 현저하게 저해되어지는 반면에 다른 발현은 약하게 감소되어지는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에서 확인한 바에 의하면 케나프 추출물은 번역 및 전사수준에서 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-3, IL-12)의 생성을 음성적으로 조절한다는 것을 알 수 있었다.

표준약물로 알려진 펜톡시필린(비선택적 포스포다이에스테라제 저해제) 및 프레드니솔론(스테로이드 화합물)은 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포에서 TNF-α의 생성을 현저하게 저해시키며 U0126 및 Bay11-7082 또한 IL-1β, IL-6, IL-12의 발현을 현저하게 억제하였다 (여기서 데이터는 나타내지 않았다).

< 실시예 2: 케나프 추출물의 프로스타글란딘 ( PGE ₂ ) 생성 및 사이클로옥시게나제 ( COX )- II 저해 활성>

본 발명에서는 많은 다른 악성 및 만성 염증질병(Guzik et al., 2003)에서 잘 알려진 전염증성 중재자인 프로스타글란딘 (PGE₂)의 생성에 있어 케나프 추출물의 저해활성을 측정하였다. 도 2A에서 알 수 있듯이, 케나프 에탄올 추출물 (0부터 400 μg/ml)이 LPS에 의해 활성화된 대식세포에서 프로스타글란딘의 생성을 95%이상 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 도 3B에서 보면, 에탄올 추출물 (200부터 400 μg/ml까지)은 COX-II mRNA 발현을 단지 25~65%만이 저해되어지는 것을 관찰할 수 있었다.

< 실시예 3: 케나프 추출물의 LPS 처리에 의해 유도된 산화질소( NO )의 생성억제 활성>

산화질소(NO)는 정상적인 방어작용 뿐만 아니라 만성 및 악성염증질환에서 독성을 가지며 전염증성 매개자로서 잘 알려져 있다 (Guzik et al., 2003). 본 발명에서는 케나프 추출물을 가지고 LPS에 의해 활성화된 대식세포로부터 생성되어지는 산화질소를 억제시키는 효과에 대해 관찰하였다. 아질산 분석에 따르면 에탄올 추출물이 산화질소의 생성을 45% 이상 투여양에 의존해서 저해하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3A 참조). 특히 에탄올 추출물의 저해활성은 헥산 및 에틸아세테이트 분획물이 가지는 활성으로 여겨진다. 따라서 상기 분획물은 다른 분획들(부탄올, 물)보다 세포독성 없이 산화질소의 생성을 강력하게 저해하는 것을 알 수 있었다 (도 3A 참조). 하지만 RT-PCR을 이용한 iNOS 발현분석에서는 에탄올 추출물이 iNOS의 mRNA 수준을 약하게 차단하는 것을 확인하였다 (도 3B 참조). 본 발명에서는 흥미롭게도 에탄올 추출물이 ROS 활성을 강력하게 제거시키는 것을 관찰할 수 있었다. 에탄올 분획 (50부터 100 μg/ml)이 SNP (125 μM)-유도된 ROS의 생성을 거의 완전하게 제거시키는 것을 확인하였다 (도 3C 참조). 이러한 산화질소(NO) 및 활성산소종 (ROS)이 강력한 저해활성을 가지기 때문에, 본 발명에서는 LPS에 의해 유도된 세포독성에서 케나프 추출물의 세포보호 효과를 측정하였다 (도 3D 참조). 케나프 추출물은 400 μM 이상까지 세포독성을 유도하지 않았으며 더 높은 농도(200부터 400 μM)에서 또한 NO 및 ROS 에 의한 세포독성을 현저하게 저해시켰다 (Guzik et al., 2003). 또한 항산화 효과는 항산화 단백질로 항산화제-반응단백질인 헴옥시게나아제(HO-1)에서 발현효과의 분석을 통해 확인하였다 (Calo et al., 2006; Ryter and Choi, 2005). 항산화 활성 분석결과 에탄올 추출물이 HO-1의 발현을 47% 이상 향상시키는 것을 알 수 있었다. 표준화합물인 N-MMA (IC₅₀ = 201.4 mM)는 상대적으로 산화질소의 생성을 현저하게 저해하는 활성을 보여주었다.

< 실시예 4 : 케나프 추출물의 LPS 무처리 또는 처리한 RAW264 . 7세포에서 식세포탐식 조절기능>

대식세포의 식세포 탐식은 외부물질의 제거, CD80 및 CD86과 같은 공동자극분자의 고수준 발현에서 항원으로 표시되는 세포전환, 세포소거와 같은 중요한 역할을 담당하고 있으며 T-세포와 대식세포 사이의 상호작용을 매개해준다 (Hoebe et al., 2003). 흥미롭게도 케나프 추출물은 FITC-덱스트란 그 자체로의 식세포 탐식 능력을 감소시키지는 않았지만 LPS에 의해 유도된 덱스트란 흡수의 상향조절은 차단하였다 (도 4A 참조). 특히 대식세포의 활성상태는 CD40, CD80, CD86 (Hoebe et al., 2003)과 같은 T-세포 공동자극분자의 상향조절을 나타낸다. 사실상 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포는 이들 분자의 표면수준을 자극시키며 케나프 추출물은 강력하게 이러한 현상을 조정해준다 (도 4B 참조). 이러한 결과는 케나프가 내적 면역체계와 연결된 식세포 탐식활성 뿐만 아니라 항원으로 표시되는 세포로서 대식세포의 기능을 조절하는 능력을 가진다는 것을 뒷받침해준다.

< 실시예 5 : 케나프 추출물의 β1- 인티그린 ( CD29 ) 및 그들의 표면수준의 기능저해 활성>

부착분자의 활성은 내재적으로 부합되는 면역체계를 조절하며 염증조직이나 세포사이에서 헤테로성 세포-세포 부착으로의 면역세포 이동을 중재하는 중요한 역할을 수행한다 (Arnaout et al., 2005). 이러한 상황에서 효과적인 차단은 치료적 타깃으로 접근되고 있는 만성 염증증상을 감소시키는 것이다 (Chaudhuri, 2006). 결과적으로, 부착분자의 기능적 저해는 특이적인 차단항체의 개발이나 세포내 신호를 차단 (Cho et al., 2004)하는 작은 분자를 찾는 것으로 시도되어지고 있다. 본 발명에서는 케나프 추출물을 이용하여 U937 세포 및 기능-활성화된 항체로 β1-인티그린(CD29), CD43 (Cho et al., 2004) 으로 알려진 정량적 세포-세포 부착분석, 세포-피브로넥틴 (세포외기질 단백질) 부착분석 (Larrucea et al., 1998)을 통해 부착분자의 기능적 활성조절을 조사하였다.

도 5에서 알 수 있듯이, CD29 아고니스틱 항체 (CD29 연결)의 처리로 CD29의 기능적 활성 매개로 의해 세포클러스터가 생성되어졌다. 흥미롭게도 본 발명에서는 CD29에 의해 유도된 세포-세포 클러스터는 케나프 에탄올 추출물에 의해 강력하게 차단되어졌다 (도 5A 참조). 하지만 CD29의 활성은 세포-세포 부착현상에 제한되어지는데 이것은 다른 CD29-매개된 부착분자인 세포-피브로넥틴의 공격현상이 저해되지 않기 때문으로 여겨진다 (도 5B 참조). 또한 LPS에 의해 유도된 CD29 (Roman et al., 2004)의 발현은 에탄올 추출물에 의해 현저하게 감소되어지는 것을 확인할 수 있었다 (도 5C 참조). 이러한 결과는 케나프 추출물이 CD29의 발현 및 기능적 조절에도 관여한다는 것을 뒷받침해준다

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 케나프 추출물 및 용매 분획물은 다양한 전염증성 사이토카인의 활성화, 생성 및 발현을 억제하여 항염증 활성을 나타내므로 염증질환, 염증반응과 관련된 동맥경화 및 이로 인한 순환기 질환의 예방 및 치료용도의 의약품 또는 식품첨가제로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

케나프 추출물을 유효성분으로 함유하는, 염증의 예방 및 치료용 약학조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1∼C4 의 저급알코올, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸 에테르 및 디클로로메탄으로 이루어진 그룹 중에서 단일 또는 2종 이상의 혼합 용매를 혼합하여 침지시킨 후 추출하여 추출원액을 여과 및 농축시켜 얻어진 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 추출 용매가 메탄올 또는 메탄올과 물의 혼합 용매인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 전염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α, MCP-1 또는 MIP-1α의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 산화질소 (NO) 및 활성산소종(ROS)의 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 프로스타글란딘(PGE₂) 생성 및 시클로옥시게나제(COX)-2 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.