KR101141182B1

KR101141182B1 - 항염증성 조성물

Info

Publication number: KR101141182B1
Application number: KR1020090041384A
Authority: KR
Inventors: 박수영; 함영민; 윤원종; 김길남; 송관필; 양원혁
Original assignee: 재단법인 제주테크노파크
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2012-05-02
Also published as: KR20100122376A

Abstract

본 발명은 항염증성 조성물을 개시한다. 구체적으로 본 발명은 참다래 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물을 개시한다.

참다래, 염증

Description

항염증성 조성물{Composition for Anti-inflammation}

본 발명은 항염증성 조성물에 관한 것으로 구체적으로 참다래 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물에 관한 것이다.

염증은 외부의 물리?화학적 자극, 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 생체의 방어 반응이다.

염증 반응은 선천성 면역 반응의 일부이며, 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역 반응은 대식세포가 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 통해 비자기(non-self)로 인식하고 공격함으로써 시작된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다.

이러한 염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하는데, 특히 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)와 다양한 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생합성과 관련되는 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase, COX)가 염증 반응의 중 요한 매개체로 알려져 있다.

NOS는 세 가지 이성질체가 존재하는데, 칼슘이나 카모듈린 의존성인 eNOS(내피성 NOS)와 nNOS(신경성 NOS), 그리고 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 세균의 내독소나 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12과 같은 여러 염증성 사이토카인에 의해 유도되는 iNOS(유도성 NOS)가 있으며, L-아르기닌(L-arginine)으로부터 산화질소(NO)를 생성한다.

eNOS나 nNOS에 의해 생성되는 NO는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하지만, iNOS에 의해 생성되는 NO는 관절염, 패혈증, 조직이식거부반응, 자가면역질환, 신경세포의 사멸 등 다양한 염증성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다(Moncade S. et al, Pharmacol. Rev., 1991, 43, 109; Nature Medicine, 2001, 7, 1138; Mu, M. M., J. Endotoxic Res. 7, p341, 2001).

COX 효소는 COX의 기능과 함께 하이드로퍼옥시다제(hydroperoxidase, HOX) 활성을 가지고 아라키돈산으로부터 중간체인 PGG₂와 PGH₂를 합성하며, 이들 화합물로 PGE₂, PGF₂, PGD₂, 프로스타시클린 및 트롬복신A₂(thromboxane A2, TxA2)를 만든다. COX의 기능 중 PGH 합성효소의 기능은 PGE₂의 합성을 통해 통증과 염증 반응에 관여한다.

COX에는 두 가지 아형이 있고 COX-1은 대부분의 조직에 항시 발현되는데 비해, COX-2는 염증성 사이토카인에 의해 신속히 발현이 유도되어 염증 반응에서 중 요한 역할을 한다.

따라서 iNOX 억제제와 COX-2 억제제는 염증질환 치료제로서 활용될 수 있다.

본 발명은 염증성 사이토카인의 생성 억제 활성, iNOS 생성 억제 활성, COX-2 생성 억제활성 등을 가지는 참다래 추출물을 이용한 항염증성 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 양태 등은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 추출 대상으로 참다래(키위) 품종 중 한라골드, 제시골드, 제시스위트 및 화북94의 잎, 과실전체, 과육 및 과피를 사용하고 추출 용매로서 80% 에탄올을 사용하여 총 16 가지 추출물을 만들고, NO(Nitric Oxide) 생성 억제 활성, iNOS(inducible NOS) 생성 억제 활성, COX-2 생성 억제활성 및 프로스타글라딘 E₂ (PGE₂) 생성 억제 활성을 살펴보았는데, 잎 추출물의 경우 추출 대상으로서 사용된 품종을 불문하고 전반적으로 높은 항염증 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 항염증 조성물을 제공한다.

따라서 본 발명의 항염증 조성물은 유효성분으로서 참다래 잎 추추출물을 유 효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 명세서에서 "참다래"란 쌍떡잎식물 측막태좌목 다래나무과의 낙엽 덩굴식물(Actinidia chinensis)을 말한다. 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 사용된 한라골드(제주 소재 농촌진흥청 난지농업연구소가 2007년 개발한 신품종), 제시골드(제주 소재 농촌진흥청난지농업연구소가 개발한 신품종, [난지농업시험연구사업연보,2006 /농촌진흥청 난지농업연구소] 참조), 제시스위트(제주 소재 농촌진흥청난지농업연구소가 개발한 신품종, [학술지 난지농업연구 제2권 제1호 통권 제5호 (2004. 봄) pp.35-37] 참조) 또는 화북94(1994년도에 첫 결실된 것을 제주농업시험장에서 발견하여 98년도에 화북 94로 명명한 참다래 신품종임)을 의미한다.

또 본 명세서에서, "항염증"은 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선, 치료 및 그러한 질환의 발병 억제/지연을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, "추출물"은 추출 대상으로서 참다래 잎을 사용하고 추출 용매로서 물, 증류수, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 것을 의미한다. 추출 용매를 사용하여 상기 추출물을 얻을 때 열수, 가온, 냉침, 초음파 방사, 교반, 이들을 혼합한 방법 등의 임의의 방법이 사용될 수 있다. 본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예로 개시되어 있지 않지만 상기 추출 용매를 사용할 경우 어떠한 추출 방법을 사용하더라도 활성의 차이는 있지만 모두 항염증 활성을 가짐을 확인한 바 있다.

또 본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리?화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE₂의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염(아토피성 피부염 포함), 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.

다만 바람직하게는 상기 염증성 질환은 아토피성 피부염을 의미한다. 본 발명의 아래의 실시예 및 실험예는 참다래의 잎 추출물이 인터페론-γ로 자극된 인간 피부각질세포주인 HaCaT세포에서 아토피성 피부염과 관련된 케모카인인 TARC(thymus and activation-regulation chemokine) 및 MDC(macrophage-derived chemokine)의 생성을 억제함을 보여주고 있다. TARC 및 MDC는 아토피성 피부염이 발생하면 CC 케모카인 수용체-4 (CCR4)에 특이적으로 결합하는데, 이 중 TARC가 Th2세포의 이주를 선택적으로 조절하고, MDC는 단핵구, 단핵구 유래 수지상 세포, 자연 살해 세포 등의 이주를 조절하는 것으로 알려져 있다. 시험관내 실험으로 인간피부각질세포주인 HaCaT세포를 인터페론감마, 종양괴사인자로 자극하면 MDC 및 TARC가 다량 발현되며 이 발현량을 억제할 수 있는 물질은 아토피성 피부염 질환 치료제로 사용될 수 있음이 제시되어 있다 (Horikawa et. al., Int. Immunol., 14(7) 767-773, 2002).

아래의 실시예 및 실험예를 참조할 때, 참다래 과피 추출물의 경우도 MDC 및 TARC 생성 억제 활성이 뛰어남을 알 수 있다. 특히 참다래 품종 중 제시스위트 과피 추출물 처리시 MDC 생성을 50% 이상 억제하였으며, TARC 생성 억제 또한 화북94 과피, 한라골드 과피, 및 제시스위트 과피 추출물의 경우 50% 이상 억제하는 결과를 확인할 수 있다.

따라서 본 발명의 염증성 조성물이 아토피성 피부염 개선용 조성물로 파악될 때 그 유효성분은 참다래 잎 추출물 이외에 참다래 과피 추출물이 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명은 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 추출물을 유효성분으로 포함하는 iNOS 억제제 조성물에 관한 것이다.

전술하였지만, iNOS의 억제는 NO의 생성을 억제시켜 염증성 질환의 개선을 가져올 수 있다.

본 발명의 아래의 실험예는 본 발명의 참다래 잎 추출물이 NO의 생성을 억제하고 iNOS의 발현을 유전자 및 단백질 수준에서 억제함으로 보여주고 있으며, iNOS의 발현을 유도하는 것으로 알려진 사이토카인의 생성을 억제함을 보여주고 있다.

본 명세서에서, "iNOS 억제"의 의미는 iNOS 유전자의 발현 억제 및 iNOS 생성 억제를 포함하는 의미이며, 중간 기작이 어떻든 NO의 생성의 억제 및/또는 감소를 포함하는 의미이다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 추출물을 유효성분으로 포함하는 COX-2 억제제 조성물에 관한 것이다.

전술하였지만, COX의 억제는 PGE₂의 생성을 억제시켜 염증성 질환의 개선을 가져올 수 있다.

본 발명의 아래의 실시예는 본 발명의 참다래 잎 추출물이 PGE₂의 생성을 억제하고 COX-2의 발현을 유전자 및 단백질 수준에서 억제함으로 보여주고 있으며, COX-2의 발현을 유도하는 것으로 알려진 사이토카인의 생성을 억제함을 보여주고 있다.

본 명세서에서, "COX-2 억제"의 의미는 COX-2 유전자의 발현 억제 및 COX-2 생성 억제를 포함하는 의미이며, 중간 기작이 어떻든 PGE₂의 생성의 억제 및/또는 감소를 포함하는 의미이다.

한편 본 발명의 조성물(즉 염증성 질환 개선제 조성물, iNOS 억제제 조성물 및 COX-2 억제제 조성물을 말함; 이하 같음)은 그 유효성분인 상기 정의된 참다래 잎 추출물을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 염증성 질환의 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 염증성 질환의 개선, 치료, 또는 이러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효물질인 참다래 잎 추출물을 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등) 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 아토피성 피부염 조성물처럼 경우에 따라서는 국소적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물 특히 본 발명의 아토피성 피부염 개선제 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 화장품 조성물로서 파악될 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 조성물이 화장품 조성물로서 파악될 경우, 그 화장품 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩 또는 분말 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 화장품 조성물은 참다래 잎/과피 추출물 이외에 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다.

여기서 "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 피부 미백용 화장품 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다.

그러나 상기 비율은 본 발명의 화장품의 제조되는 전술한 바의 형태에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다.

상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 항염증성 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 항염증성 조성물은 아토피성 피부염 등에 유용하게 적용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 참다래 추출물의 제조

추출 대상으로 사용한 참다래 품종은 참다래 한라골드[A. chinensis(Golden Yellow) × A. deliciosa(Songongu)], 제시골드[A. chinensis(Golden Yellow) × A. chinensis(Songongu)], 제시스위트[A. chinensis(apple) × A. deliciosa(Tomuri)] 그리고 화북94이다.

추출물은 상기 각 참다래의 과육, 과피, 과실전체, 잎을 80% 에탄올(EtOH) 이용하여(80% 에탄올에 7~10일간 동안 침지시킴) 침출시킨 후 와트만종이여과지(Whatman No. 2)로 여과하여 그 여액을 감압?농축하고 분말화하여 총 16개의 추출물을 제조하였다. 각 분말 시료는 실험하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.

<실시예 2> 참다래 추출물의 항염 활성의 평가

<실시예 2-1> 세포 배양

대식세포 계열 (Murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포는 Korean Cell Line Bank (KCLB)로부터 분양 받아 penicillin-streptomycin 100 units/mL과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양을 시행하였다.

<실시예 2-2> NO 생성 억제 활성 평가

RAW264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5× 10⁵ cells/mL로 조절한 후 48 well plate 에 접종하고, 추출물 시료와 LPS (1 μg/mL) 를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 μL와 Griess시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid] 100 μL를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO₂)를 standard로 비교하였다.

결과를 아래의 <표 1>에 나타내었다.

상기 실험 결과는 사용된 참다래 모든 품종에 대해서 잎 추출물의 경우는 농도 의존적으로 높은 NO 억제 활성을 보여준다.

<실시예 2-3> iNOS 및 COX 발현 억제 활성 평가

배양이 끝난 세포를 수집하여 2~3회 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척 한 후 1 mL의 lysis buffer을 첨가하여 30분간 lysis 시킨 후 12,000 rpm에서 20분간 원심하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BSA (Bovine serum albumin)을 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다. 30~50 μg의 lysate를 8~12% mini gel SDS-PAGE (Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 PVDF membrane (BIO-RAD)에 200mA로 2시간 동안 transfer하였다. 그리고 Membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TTBS (TBS + 0.1% Tween 20) 용액에서 상온에서 2시간동안 실시하였다. iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS (1: 1000) (Cell Signaling) 을 COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2 (1: 1000) (Cell Signaling)을 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (Horse Radish Peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG (Amersham Co.)를 1: 5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질 (Amersham Co.)과 1~3분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.

결과를 <도 1> 및 <도 2>에 나타내었다. <도 1>의 iNOS의 발현 정도를 보여주는 결과이고, <도 2>는 COX-2 발현 정도를 보여주는 결과이다.

이 경우도 상기 NO 생성 억제 효과와 비슷하게 참다래 품종을 불문하고 잎 추출물이 강한 iNOS 및 COX-2 생성 억제 효과를 보였다.

또한 한라골드 과육과 화북94 과피, 한라골드 과피 추출물에서도 다른 과실 부위보다 iNOS 생성에 대한 억제 효과가 높게 나타났으며, COX-2 생성 억제 효과의 경우 모든 참다래 품종에 대해서 잎 추출물 이외에 과육 및 과피 추출물이 효과가 있는 것으로 나타났다.

<실시예 2-4> Prostaglandin E ₂ (PGE ₂ ) 생성 억제 활성 평가

Murine macrophage cell line 인 RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵ cells/mL로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2 항온기에서 18시간 전배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 10배 농도 (1 mg/mL)로 조제된 시험물질 25 μL와 450 μL의 LPS 최종농도 (1 μg/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 Prostaglandin E₂ (PGE₂)를 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다. PGE₂의 정량은 PGE₂ ELISA kit (R&D Systemes, Inc, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.99 이상이었다.

결과를 <도 3>에 나타내었는데, COX-2의 생성 억제 효과와 유사한 경향을 보였으며, 특히 잎 추출물에서는 제시골드 품종이 과실 추출물에서는 한라골드 품종이 다른 품종별 부위 추출물에 비해 높은 억제 효과를 나타내었다

<실시예 2-5> 피부세포 면역시험

세포 및 시약

Cheju National University, Korea로부터 변형된 각질형성세포주인 HaCaT 세포를 분양 받아 100 units/㎖ penicillin-streptomycin과 10 % fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂항온기에서 배양하였으며, 3~4일에 한번씩 계대 배양을 시행하였다. Human interferon-γ (hIFN-γ, recombinant E. coli)는 Roche로부터. human MDC & TARC ELISA kit는 R&D (Germany) 제품을 구입하여 실험에 사용하였다.

피부 세포배양 및 세포독성 평가

HaCaT 세포 (3.0×10⁵cells/㎖)를 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 시험 약물과 IFN-γ(10 ng/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후 배양 배지를 얻어 3,000 rpm에서 5분 원심분리 하였다. LDH 활성은 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit (promega, USA)를 이용하여 측정하였으며, 96 well plate에 원심분리하여 얻은 배양 배지 50 ㎕와 reconstituted substrate mix를 50 ㎕를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 ㎕의 stop solution을 넣어 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.

MDC 및 TARC 생성 및 정량

Human keratinocyte cell line 인 HaCaT 세포를 DMEM 배지를 이용하여 3 × 10⁵ cells/㎖로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 5% CO₂ 항온기에서 18시간 전배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 10배 농도로 조제된 시험물질 50 ㎕를 hIFN-γ (최종농도 10 ng/㎖)를 포함하는 새로운 배지 (FBS(-)) 450 ㎕에 가하여 전 배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 min)하여 얻어진 상층액의 MDC 및 TARC 함량을 각각 human MDC immunoassay, human TARC immunoassay kit (R&D, Germany)를 이용하여 정량 하였으며, standard에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.99 이상이었다.

결과를 <도 4>에 세포 독성 효과와 함께 나타내었다.

변형된 각질형성 세포인 HaCaT 세포에 IFN-γ (10 ng/mL)로 케모카인을 유도하고, 참다래 천연추출물을 처리한 결과, 잎추출물에서는 화북94와 제시스위트 품종이 과실 부위별 추출물에서는 화북94와 제시스위트 과피 추출물 처리시 MDC 생성을 50% 이상 억제하였으며, TARC 생성억제 또한 화북94 잎, 화북94 과피, 한라골드 과피, 제시스위트 과피 추출물처리시 50% 이상 억제하는 결과를 확인할 수 있었다.

도 1은 참다래 각 부위별 추출물이 iNOS의 발현에 미치는 영향을 보여주는 결과이고, 도 2는 참다래 각 부위별 추출물이 COX-2 발현에 미치는 영향을 보여주는 결과이다.

도 3은 참다래 각 부위별 추출물이 PGE₂의 생성 억제에 미치는 영향에 대한 결과이다.

도 4는 참다래 각 부위별 추출물이 케모카인인 MDC 및 TARC의 생성 억제에 미치는 영향에 대한 결과이다. 도 4에서 1 내지 4는 화북94 잎 추출물, 한라골드 잎 추출물, 제시스위트 잎 추출물 및 제시골드 잎 추출물이고, 5 내지 7은 화북94의 과실, 과육 및 과피 추출물이고, 8 내지 10은 한라골드의 과실, 과육 및 과피 추출물이며, 11 내지 13은 제시스위트의 과실, 과육 및 과피 추출물이며, 14 내지 16은 제시골드의 과실, 과육 및 과피 추출물이다.

Claims

유효성분으로서 아래의 (Ⅰ) 내지 (Ⅳ)의 추출물 중 어느 하나의 추출물을 포함하는 항염증성 약제학적 조성물.

(Ⅰ) 한라골드 잎의 에탄올과 물의 혼합용매 추출물;

(Ⅱ) 제시골드 잎의 에탄올과 물의 혼합용매 추출물;

(Ⅲ) 제시스위트 잎의 에탄올과 물의 혼합용매 추출물; 및

(Ⅳ) 화북94 잎의 에탄올과 물의 혼합용매 추출물
삭제
제1항에 있어서,

상기 항염증성은 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 아토피성 피부염 습진 및 다발성 경화증으로 구성된 군에서 선택된 염증성 질환의 개선용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 항염증성 약제학적 조성물.
삭제
삭제
삭제
유효성분으로서 화북94 잎의 에탄올과 물의 혼합용매 추출물을 포함하는 아토피성 피부염 개선제 약제학적 조성물.
삭제
삭제
유효성분으로서 화북94 잎의 에탄올과 물의 혼합용매 추출물을 포함하는 아토피성 피부염 개선제 화장품 조성물.