KR101722472B1 - 까마귀쪽나무 추출물과 이로부터 분리된 Litseakolide D2를 이용한 항염증용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 까마귀쪽나무 추출물과 이로부터 분리된 Litseakolide D2를 이용한 항염증용 조성물을 개시한다.
구체적으로 본 발명은 LPS(lipopolysaccharide)로 자극된 대식세포에서 NO 생성 억제 활성, PGE₂ 생성 억제 활성, 염증성 사이토카인(TNF-α 및 IL-6) 생성 억제 활성 그리고 iNOS 및 COX-2 발현 억제 활성을 보이는 까마귀쪽나무 추출물과 이로부터 분리된 Litseakolide D2를 이용한 항염증용 조성물을 개시한다.

Description

까마귀쪽나무 추출물과 이로부터 분리된 Litseakolide D2를 이용한 항염증용 조성물{Anti-inflammation Composition Using Litsea japonica Extract and Litseakolide D2 Isolated from the Same}

본 발명은 까마귀쪽나무(Litsea japonica) 추출물과 이로부터 분리된 Litseakolide D2를 이용한 항염증용 조성물에 관한 것이다.

염증은 외부의 물리·화학적 자극, 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 생체의 방어 반응이다.

염증 반응은 선천성 면역 반응의 일부이며, 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역 반응은 대식세포가 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 통해 비자기(non-self)로 인식하고 공격함으로써 시작된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다.

이러한 염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하는데, 특히 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)와 다양한 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생합성과 관련되는 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase, COX)가 염증 반응의 중요한 매개체로 알려져 있다.

NOS는 세 가지 이성질체가 존재하는데, 칼슘이나 카모듈린 의존성인 eNOS(내피성 NOS)와 nNOS(신경성 NOS), 그리고 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 세균의 내독소나 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12과 같은 여러 염증성 사이토카인에 의해 유도되는 iNOS(유도성 NOS)가 있으며, L-아르기닌(L-arginine)으로부터 산화질소(NO)를 생성한다.

eNOS나 nNOS에 의해 생성되는 NO는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하지만, iNOS에 의해 생성되는 NO는 관절염, 패혈증, 조직이식거부반응, 자가면역질환, 신경세포의 사멸 등 다양한 염증성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다(Moncade S. et al, Pharmacol. Rev., 1991, 43, 109; Nature Medicine, 2001, 7, 1138; Mu, M. M., J. Endotoxic Res. 7, p341, 2001).

COX 효소는 COX의 기능과 함께 하이드로퍼옥시다제(hydroperoxidase, HOX) 활성을 가지고 아라키돈산으로부터 중간체인 PGG₂와 PGH₂를 합성하며, 이들 화합물로 PGE₂, PGF₂, PGD₂, 프로스타시클린 및 트롬복신A₂(thromboxane A2, TxA2)를 만든다. COX의 기능 중 PGH 합성효소의 기능은 PGE₂의 합성을 통해 통증과 염증 반응에 관여한다.

COX에는 두 가지 아형이 있고 COX-1은 대부분의 조직에 항시 발현되는데 비해, COX-2는 염증성 사이토카인에 의해 신속히 발현이 유도되어 염증 반응에서 중요한 역할을 한다.

따라서 NO, PGE₂, 염증성 사이토카인 등의 억제제나 iNOS 억제제 그리고 COX-2 억제제는 염증질환 치료제로서 활용될 수 있다.

본 발명은 NO 생성 억제 활성, PGE₂의 생성 억제 활성, 염증성 사이토카인의 생성 억제 활성 등을 가지는 까마귀쪽나무 추출물과 이로부터 분리된 유효화합물인 Litseakolide D2을 개시한다.

본 발명의 목적은 까마귀쪽나무 추출물과 이로부터 분리된 유효화합물인 Litseakolide D2을 이용한 항염증용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 까마귀쪽나무 과육과 종자 각각의 70% 에탄올 추출물과 초임계 추출물 그리고 까마귀쪽나무 열매의 70% 에탄올 추출물에서 분리한 유효화합물인 Litseakolide D2이 LPS(lipopolysaccharide)로 자극된 대식세포에서 NO 생성 억제 활성, PGE₂ 생성 억제 활성, 염증성 사이토카인(TNF-α 및 IL-6) 생성 억제 활성 그리고 iNOS 및 COX-2 생성 억제 활성을 보임을 확인함으로써 완성된 것이다. 여기서 그람음성균의 외막성분인 LPS는 대식세포를 자극하여 NO, PGE₂, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6) 등의 염증 매개 물질의 분비를 유발하는 것으로 알려져 있고 이를 억제할 수 있는 물질을 항염증의 후보물질이 될 수 있음이 제안되어 있다(Proc Soc Exp Biol Med. 1996；211 : 32-24; Kor J Herbol. 2009；24 : 47-39).

전술한 바를 고려할 때, 본 발명의 항염증용 조성물은 까마귀쪽나무 과육 추출물, 까마귀쪽나무 종자 추출물 또는 아래 [화학식 1]의 Litseakolide D2을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

[화학식 1]

본 명세서에서, "추출물"이란 추출 대상을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방식을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 상기 조추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물을 포함하고, 상기 조추출물을 상기 용매들을 극성이 증가 또는 감소하는 순으로 사용하여 순차적으로 분획하여 얻어진 분획물을 포함하며, 나아가 크기, 전하, 소수성, 친화성 등의 성질을 이용한 크로마토그래피에 의하여 얻어진 분획물을 포함한다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 아래의 실시예를 참조할 때, 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물(특히 물과 에탄올의 혼합 용매) 또는 이산화탄소를 용매로 사용하여 초임계 추출하여 얻어진 추출물을 의미한다.

또 본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "항염증"은 염증 반응의 차단, 억제, 지연을 의미하며, 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선, 치료, 예방, 그러한 질환의 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등)의 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE₂의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염(아토피성 피부염 포함), 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 염증성 질환의 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 염증성 질환의 개선, 치료, 또는 이러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등) 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 아토피성 피부염 조성물처럼 경우에 따라서는 국소적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

또한 향미나 기호성을 향상시키고 다른 기능성을 추가하기 위하여 한약재가 추가될 수 있는데, 추가될 수 있는 한약재로서는 두충 추출물, 속단 추출물, 녹용 추출물, 홍화인 추출물, 토사자 추출물, 숙지황 추출물, 별갑 추출물, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 감초 추출물, 당귀 추출물, 갈근 추출물, 강진향 추출물, 합환피 추출물, 산두근 추출물, 괴화 추출물, 고삼 추출물 등이 예시될 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 화장품 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장품 조성물로서 파악될 경우, 그 화장품 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩 또는 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분 이외에 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다.

여기서 "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 독성 이상의 독성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다.

그러나 상기 비율은 화장품의 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다.

상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 까마귀쪽나무 과육과 종자의 각 추출물 또는 상기 [화학식 1]의 화합물을 이용한 항염증용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 항염증용 조성물은 약제학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장품 조성물로 제품화될 수 있다.

도 1은 까마귀쪽나무 열매 70% 추출물로부터 상기 [화학식 1]의 화합물(LFC)을 분리하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2 및 도 3은 LPS로 자극된 대식세포에서 까마귀쪽나무 과육과 종자의 각 추출물 그리고 상기 [화학식 1]의 화합물의 NO 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 4 및 도 5는 LPS로 자극된 대식세포에서 까마귀쪽나무 과육과 종자의 각 추출물 그리고 상기 [화학식 1]의 화합물의 PGE₂ 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 6 내지 도 9는 LPS로 자극된 대식세포에서 까마귀쪽나무 과육과 종자의 각 추출물 그리고 상기 [화학식 1]의 화합물의 염증성 사이토카인(TNF-α 및 IL-6)의 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 10 및 도 11은 LPS로 자극된 대식세포에서 까마귀쪽나무 과육과 종자의 각 추출물 그리고 상기 [화학식 1]의 화합물의 iNOS 와 COX-2 발현 억제 활성을 나타낸 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 까마귀쪽나무 추출물의 제조 및 유효화합물의 분리

<실시예 1> 까마귀쪽나무 과육의 70% 에탄올 추출물의 제조

건조된 까마귀쪽나무 과육(제주도 우도 해역 국내산 까마귀쪽나무 열매를 입수하여 건조시키고, 종자를 분리하여 얻었음) 분쇄물에 20배 중량의 70% 에탄올을 가해 실온에서 24시간 방치하여 3회 반복 추출하고 여과한 후 그 여과액을 감압농축하고 동결건조하여 고형상의 까마귀쪽나무 과육 추출물을 얻었다.

<실시예 2> 까마귀쪽나무 종자의 70% 에탄올 추출물의 제조

까마귀쪽나무 종자 분쇄물에 20배 중량의 70% 에탄올을 가해 실온에서 24시간 방치하여 3회 반복 추출하고 여과한 후 그 여과액을 감압농축하고 동결건조하여 고형상의 까마귀쪽나무 종자 추출물을 얻었다.

<실시예 3> 까마귀쪽나무 과육의 초임계 추출물의 제조

까마귀쪽나무 과육의 초임계 추출물은 초임계추출장치(SFE500R1, EYESEL CO, Ltd.)를 이용하여 제조하였다.

구체적으로 까마귀쪽나무 과육 100g을 초임계 추출조에 투입하고 추출조에 이산화탄소를 공급하면서 승온시켜 300bar 압력과 60℃의 온도를 유지하여 초임계 상태를 만든 후 3시간 동안 추출과정을 진행하여 초임계 추출물을 얻었다.

<실시예 4> 까마귀쪽나무 종자의 초임계 추출물의 제조

추출 대상으로 까마귀쪽나무 종자를 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 3>과 동일한 방식으로 까마귀쪽나무 종자 초임계 추출물을 제조하였다.

<실시예 5> 까마귀쪽나무 열매 추출물로부터의 유효화합물의 분리

유효화합물의 분리를 위하여 먼저, 건조된 까마귀쪽나무 열매 6kg에 70% 에탄올 120L를 가해 실온에서 24시간 3회 반복 추출하고 여과한 후 그 여과액을 감압농축하고 동결건조하여 고형상의 까마귀쪽나무 열매 추출물을 얻었다.

이렇게 얻어진 까마귀쪽나무 열매 고형상의 추출물 50g을 20% 메탄올 10L에 현탁한 후, 각각 동량의 노르말 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 노르말 부탄올로 순차적으로 분획한 다음, 감압 농축하여 디클로로메탄 분획물을 얻었다. 디클로로메탄 분획물에 대하여, 셀라이트(Celite545)가 충진된 Glass Column(5 × 50 cm)에서 컬럼 크로마토그래피(이동상: 노르말 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 메탄올)를 수행하여 4개의 분획으로 나누었다. 다음 각각의 얻어진 분획 중 항염 활성이 우수한 노르말헥산 분획을 농축하여 완전 건조 후 실리카겔(silica gel)이 충진된 Glass Column(10 × 3cm)에서 VLC(Vacuum liquid chromatography)(이동상: 노르말헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 메탄올; 이동상 이동속도 = 60mL/min)를 실시하여 총 18개의 분획으로 나누었다. 그 중 항염 활성이 우수한 13번 분획에 대하여 노르말헥산:에틸아세테이트:메탄올 3:1:0.1 이동상을 사용하여 실리카겔크로마토그래피(40 × 3.0cm, 20~40㎛, 이동상 속도 = 3ml/min)를 실시해 compound 1을 분리하였으며(도 1 참조), NMR을 이용하여 구조를 동정하였다.

Compound 1에 대한 NMR 구조 동정 결과는 다음과 같다: 무색, 오일상; ₁H-NMR (500MHz, CDCl₃) 4.51 (1H, br s, H-3), 4.49 (1H, qd, J =6.5, 2.0 Hz, H-4), 1.32 (3H, d, J =7.0 Hz, H-5), 6.97 (1H, td, J =8.5, 2.0 Hz H-6), 2.32-2.42 (2H, m, H-7), 1.46-1.50 (2H, m, H-8), 1.25 (16H, br s, H-9-16), 1.99-2.03 (2H, m, H-17), 5.82 (1H, ddt, J =16.5, 10.0, 6.5 Hz, H-18), 4.98 (1H, ddt, J =17.0, 3.5, 2.0 Hz H-19), 4.91(1H, ddt, J =10.0, 2.0, 1.5 Hz H-19); 13C-NMR (125 MHz, CDCl₃) 169.9 (C-1), 129.4 (C-2), 72.2 (C-3), 82.8 (C-4), 19.8 (C-5), 149.0 (C-6), 29.9 (C-7), 28.6 (C-8), 29.6 (C-9-16), 29.5 (C-9-16)), 29.2 (C-9-16), 29.0 (C-9-16), 33.9 (C-17), 139.3 (C-18), 114.3 (C-19)

상기 NMR 데이타와 문헌[Su-Yen Chang, Ming-Jen Cheng, Yueh-Hsiung Kuo, Shiow-Ju Lee, Hsun-Shuo Chang and Ih-Sheng Chen, Secondary Metabolites from the Stem Bark of Litsea akoensis and Their Cytotoxic Activity, helvetica Chemica Acta , Vol 91, 1156-1165, 2008]을 비교 검토 결과, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 유효 분획인 디클로로메탄 분획물의 compound 1은 상기 [화학식 1]의 Litseakolide D2로 확인되었다.

< 실험예 > 항염증 활성 실험

<실험예 1> 세포 배양

American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 생쥐(murine) 대식세포주인 RAW 264.7을 구입하여, 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 units/mL), 및 streptomycin (100 g/mL)을 첨가하여 Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM; GIBCO Inc.)에서 보관하였다. 이들 세포들은 37℃ 에서 95% air, 5% CO₂ 가습 공기 조건 하 포화 상태(subconfluence)에서 배양하였으며, 3일마다 계대배양하였다.

<실험예 2> NO ( Nitric oxide ) 생성 억제 효능 평가

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 실시예의 시료와 LPS (1 ㎍/mL)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO^{2 -}의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 L와 Griess 시약 100 L를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO₂)를 standard로 비교하였다.

결과를 [도 2] 및 [도 3]에 나타내었다.

[도 2]는 상기 실시예의 과육과 종자 각각의 70% 에탄올 추출물과 초임계 추출물을 10, 20 및 40 ㎍/㎖로 처리하였을 때의 결과이고, [도 3]은 [화학식 1]의 유효화합물(LFC)을 5, 10 및 20 uM로 처리하였을 때의 결과이다. 결과는 3번의 독립된 실험의 평균±SD를 나타내었다.

[도 2] 및 [도 3]을 참조하여 보면, 각 추출물 및 유효화합물 모두 농도 의존적으로 NO 생성을 억제함을 알 수 있다.

<실험예 3> 세포독성 평가 - LDH assay

RAW 264.7 세포 (1.5×10⁵cells/mL)를 DMEM 배지에 실시예의 시료와 LPS (1 ㎍/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후 배양 배지를 얻어 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. LDH (lactate dehydrogenase) assay는 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50 L와 reconstituted substrate mix를 50 L를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 L의 stop solution을 넣은 후 microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군 (LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다. 결과는 3번의 독립된 실험의 평균±SD를 나타내었다.

결과를 [도 2] 및 [도 3]에 함께 나타내었는데, 각 추출물 및 유효화합물 모두 특별한 세포독성을 보이지 않았다.

<실험예 4> PGE ₂ ( Prostaglandin E ₂ )생성 억제 효능 평가

RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵cells/mL로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO₂항온기에서 18시간 전 배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 실시예의 시료와 LPS (1 ㎍/mL)를 동시 함유한 새로운 배지를 처리하여 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 PGE₂를 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다. PGE₂의 측정은 PGE₂ ELISA kit(R&DSystemsInc.,Minneapolis,MN,USA)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r²값은 0.99 이상이었다. 결과는 3번의 독립된 실험의 평균±SD를 나타내었다.

상기 실시예의 과육과 종자 각각의 70% 에탄올 추출물과 초임계 추출물을 10, 20 및 40 ㎍/㎖로 처리하였을 때의 결과를 [도 4]에 나타내었고, [화학식 1]의 유효화합물을 5, 10 및 20 uM로 처리하였을 때의 결과를 [도 5]에 나타내었다.

[도 4] 및 [도 5]는 상기 각 추출물 및 유효화합물 모두 농도 의존적으로 PGE₂ 생성 억제 활성을 보임을 보여준다.

<실험예 5> 사이토카인( TNF -α 및 IL -6) 생성 억제 효능 평가

RAW 264.7 세포 (1.5×10⁵cells/mL)를 DMEM 배지를 이용하여 24 well plate 에 접종하고, 5% CO₂ 항온기에서 18 시간 전 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 실시예 시료와 LPS (1 ㎍/mL)를 동시 함유한 새로운 배지를 처리하여 전 배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24 시간 후 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 분)하여 얻어진 상층액의 pro-inflammatory cytokines 생성 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 -20℃ 이하에 보관하였다. pro-inflammatory cytokines 정량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다. 결과는 3번의 독립된 실험의 평균±SD를 나타내었다.

상기 실시예의 과육과 종자 각각의 70% 에탄올 추출물과 초임계 추출물을 10, 20 및 40 ㎍/㎖로 처리하였을 때의 결과를 [도 6] 및 [도 7]에 나타내었고, [화학식 1]의 유효화합물을 5, 10 및 20 uM로 처리하였을 때의 결과를 [도 8] 및 [도 9]에 나타내었다. [도 6] 내지 [도 9]를 참조하여 보면, 상기 각 추출물 및 유효화합물 모두 농도 의존적으로 염증성 사이토카인의 생성 억제 활성을 보임을 알 수 있다.

<실험예 6> iNOS 및 COX -2 발현 억제 효능 평가( western - blotting )

배양이 끝난 세포를 수집하여 2~3회 phosphate buffered saline (PBS)로 세척 한 후 세포 용해 버퍼 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO₃, 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 25 ㎍/mL aprotinin, 25 ㎍/mL leupeptin]를 첨가하여 30분간 4℃에서 용해시킨 후 4, 15,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin (BSA)를 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다. 분리된 단백질 20~30 ㎍를 4~12% NuPAGE Tris-Acetate mini gel 분리하여, 이를 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane iBlot gel transfer(Invitrogen, La Jolla, CA, USA)를 이용하여 7분 동안 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TTBS (0.1% Tween 20 + TBS) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-rabbit iNOS (Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2 (BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA)를 TTBS 용액에서 1:2000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA), anti-mouse IgG (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세척하여 West-Zol Plus(iNtRON, Gyeong, Seongnam, Kora)과 1~3분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.

상기 실시예의 과육과 종자 각각의 70% 에탄올 추출물과 초임계 추출물을 10, 20 및 40 ㎍/㎖로 처리하였을 때의 결과를 [도 10]에 나타내었고, [화학식 1]의 유효화합물을 5, 10 및 20 uM로 처리하였을 때의 결과를 [도 11]에 나타내었다. 상기 각 추출물 및 유효화합물 모두 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2 발현을 억제함을 알 수 있다.

Claims (5)

1. 아래 [화학식 1]의 Litseakolide D2을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약제학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 아래 [화학식 1]의 Litseakolide D2을 유효성분으로 포함하는 항염증용 식품 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
3. 아래 [화학식 1]의 Litseakolide D2을 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
   
4. 삭제
5. 삭제

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