KR101869351B1 - 까마귀쪽나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 이용한 진통용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Acetic acid-induced Writhing test, Tail-flick Test 및 Hot-plate Test로 말초성 및 중추성 진통 효과가 확인된 까마귀쪽나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 이용한 진통용 조성물을 개시한다.

Description

까마귀쪽나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 이용한 진통용 조성물{Composition for Pain Relief Using an Extract of Litsea japonica or Compounds Isolated Therefrom}

본 발명은 까마귀쪽나무(Litsea japonica) 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 이용한 진통용 조성물에 관한 것이다.

통증은 실질적인 또는 잠재적인 조직 손상으로 나타나는 감각적이고 정서적인 불유쾌한 경험으로 정의된다(국제통증학회(IASP), 1994).

통증은 신경 생리적 기전에 따라 침해성 통증(nociceptive pain)과 신경병증성 통증(neuropathic pain)으로 구분되고 있다(국제통증학회(IASP), 1994).

침해성 통증은 화상, 부상, 외·내부의 압력(예컨대, 종양) 등 조직의 실제적 또는 잠재적 손상에 의해서 발생하는 통증으로, 신경 말단(nerve endings)이 활성화되면서 척수, 시상, 대뇌와 같은 일반적인 통증 전달 경로를 거쳐 발생하는 통증을 말한다. 침해성 통증은 체성 통증(somatic pain)과 내장통(visceral pain)으로 구분된다. 체성 통증은 다시 표재성 체성 통증과 심부 체성 통증으로 구분되는데, 표재성 체성 통증은 피부나 점막 부위의 기계적, 화학적, 열 자극에 의해 발생하는 통증을 말하며 국소 부위에 한정되어 나타나고, 심부 체성 통증은 관절, 인대, 근육 또는 근막을 자극함으로써 발생되는 것으로 국소적으로 나타나는 경우는 드물고 통증이 심할 경우 다른 부위로 전파되는 경향이 있어 연관통(referred pain)을 일으키는 경우가 많다. 내장통은 내장에 분포된 통각섬유에 의해 몸 속 깊이 느껴지는 둔한 통증을 말하는데, 내장에 대한 통각 섬유의 분포가 적기 때문에 통증 부위가 미만성으로 명확하지 않고 오심, 구토 등 여러 가지 자율신경 증상을 동반한다.

신경병증성 통증은 신경계 손상이나 신경 기능의 이상에 의해 야기되는 통증으로 정의되며(국제통증학회(IASP), 1994), 대표적인 만성 난치성 통증으로 침해성 통증과는 그 기전이 다른 것으로 알려져 있다(Lancet 1999; 353:1959-64).

신경병증성 통증은 자발통(spontaneous pain)(통각 수용 자극이 없는 상태에서도 나타나는 통증), 이질통(allodynia)(정상적으로 통증을 유발하지 않는 자극에 의해 유발되는 통증), 통각과민(hyperalgesia)(유해 자극에 의해 과도한 통증 반응을 보이는 현상) 등의 증상을 특징적으로 나타낸다.

신경병증성 통증은 중추형(central type)과 말초형(peripheral type)으로 구분할 수 있으며, 중추 신경병증성 통증은 뇌종양, 뇌출혈, 척수구멍증(syringomyelia), 후천성면역결핍증후군 등과 같이 중추 신경 조직의 손상으로 척수, 뇌간, 시상, 피질을 자극하여 나타나는 통증을 말하며, 말초 신경병증성 통증은 대상포진 후 신경통, 당뇨 신경병증, 복합 부위 통증 증후군 2형 등과 같은 말초 신경계의 이상에 의한 지속적인 통증을 말한다.

침해성 통증은 일반적인 진통용로 완화시킬 수 있다. 코데인, 모르핀, 펜타닐 등의 마약성 진통용나 해열 작용과 진통 작용을 갖는 아세트아미노펜, 비스테로이드성 소염진통용 등의 미마약성 진통용가 침해성 통증에 사용되고 있다.

그러나 신경병증성 통증에는 일반적인 진통용보다는 gabapentin 등의 항경련제와 venlafaxine 등의 항우울제가 효과적이다.

한편, 까마귀쪽나무(Litsea japonica)는 쌍떡잎식물 미나리아재비목 녹나무과의 상록 소교목으로 표고 700 m 이내의 바닷가 및 산기슭에 분포하며, 높이 약 7 m의 나무로서, 7 ~ 10월에 잎겨드랑이에서 겹산형꽃이 차례로 피고, 열매는 핵과로 타원형이며, 다음해 10월에 옅은 자줏빛으로 익는다.

까마귀쪽나무는 여러 종류의 에센셜오일, 지방산, 락톤, 알카로이드, 테르페노이드 등이 발견되었으며(Tanaka 등, 1990; Takeda 등, 1972), 잎으로부터 분리된 플라보노이드 성분인 에피카테친, 아프젤린, 퀘르시트린 및 틸리로사이드 등은 항보체계 활성을 억제한다고 보고되어 있다(Lee 등, 2005). 또한 까마귀쪽나무 잎 추출물은 항암제에 내성을 가지고 있는 세포에서 apoptosis를 유도하여 증식을 억제한다고 보고되어 있으며(Kim et al., Kor. J. Pharmacogn 40(1): 65~69, 2009), 대한민국 공개특허 10-2008-0020738에서는 까마귀쪽나무 잎 추출물이 항염 활성 및 골 대사 관련 인자를 억제한다는 내용이 공개되어 있다.

이처럼 현재까지의 연구는 까마귀쪽나무 잎 추출물에 대한 질환 타겟 연구가 대부분이다.

본 발명은 Acetic acid-induced Writhing test, Tail-flick Test 및 Hot-plate Test로 확인된 까마귀쪽나무 추출물 또는 그로부터 분리된 화합물의 진통 효과를 개시한다.

본 발명의 목적은 까마귀쪽나무 추출물 또는 그로부터 분리된 화합물을 이용한 진통용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 까마귀쪽나무 열매의 에탄올, 헥산, 디클로메탄 등에 의한 추출물, 그 추출물의 디클로로메탄 등에 의한 분획물 및 이로부터 분리된 화합물인 하마비와락톤 A(Hamabiwalactone A)와 하마비와락톤 B(Hamabiwalactone B)가 Acetic acid-induced Writhing test, Tail-flick Test 및 Hot-plate Test로 통해 진통 효과를 가짐을 확인함으로써 완성된 것이다. 여기서 Acetic acid-induced Writhing test는 통증이 침해성 통증이든 신경병성 통증인지를 불문하고 말초성 통증 억제 물질을 스크리닝에 사용되는 방법이고, Tail-flick Test 및 Hot-plate Test는 통증이 침해성 통증이든 신경병성 통증인지를 불문하고 중추성 통증 억제 물질의 스크리닝에 사용되는 방법이다(Journal of Ethnopharmacology 120:56-62, 2008; European Journal of Pharmacology 587:104-111, 2008; J. of Oriental Neuropsychiatry 19(2):223-230, 2008; 대한침구학회지 28(2):57-67, 2011).

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 진통용 조성물은 까마귀쪽나무 열매 추출물, 아래의 [화학식 1]의 하마비와락톤 A 또는 아래의 [화학식 2]의 하마비와락톤 B를 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

본 명세서에서, "추출물"은 추출 대상인 까마귀쪽나무 열매를 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 알콜, 아세톤, 에틸아세테이트, 부탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, 물(증류수), 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 조추출물과 그 추출물에서 상기 열거된 용매로 분획하여 얻어진 추출물을 포함하는 의미로서 이해된다. 여기서 추출 방법은 추출 대상인 까마귀쪽나무 열매를 추출 용매에 침지시키는 방법과 추출 대상을 추출 용매로 증류시키는 방법을 포함한다. 침지를 통한 추출 방법에는 냉침, 가온, 초음파, 환류 등 임의의 방식이 적용될 수 있다. 분획된 추출물의 경우 상기 조추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매로 순차적으로 분획하여 얻어진 추출물, 또 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 그럼에도 상기 "추출물"은 바람직하게는 그 추출 대상을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매, 특히 60% 내지 90%의 에탄올 수용액으로 추출(침지 또는 증류)하여 얻어진 것을 의미한다. 더 바람직하게는 상기 60% 내지 90%의 에탄올 수용액 추출물을 물에 현탁시키고 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻어지는 어느 한 분획 용매층의 분획물을 의미한다. 가장 바람직하게는 상기 순차적 분획물 중 아래의 실험예에서 높은 진통 효과를 보이는 것으로 확인된 디클로로메탄층의 분획물을 의미한다. 여기서 "순차적 분획한다"의 의미는 분획 후의 잔여 물층을 계속 사용하여 상기 열거된 순서의 용매로 분획한다는 것이며, 또 여기서 %는 부피 백분율에 의한 농도(v/v) 표현으로서, 당업계에 알려진 바와 같이 일정 부피의 용액 중에 녹아 있는 일정 부피의 용질을 의미한다. 예컨대 30%(v/v)는 용액 100㎖에 용질 30㎖가 용해되어 있다는 것이 된다. 본 명세서의 "추출물"의 의미에는 여과 등을 통하여 정제된 형태의 추출물, 추출 용매가 일부 제거된 액상의 농축된 추출물 그리고 추출 용매가 완전히 제거된 고형상의 추출물이 포함된다.

또 본 명세서에서, "유효성분"은 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "진통"은 침해성 통증과 신경병증성 통증의 개선 효과를 의미한다. 여기서 "개선"이란 통증의 제거, 완화, 예방을 포함하는 의미이다.

본 발명의 진통용 조성물은 그 유효성분을 제형, 배합 목적 등에 따라 진통 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.999 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 진통 활성을 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 유효성분인 넓미역 추출물을 제약상 허용가능한 담체, 부형제, 첨가제 등과 혼합하여 경구투여용 또는 비경구투여용으로 제제화하게 된다.

제약상 허용되는 담체 또는 부형제의 예는 락토스, 스테아린산 마그네슘, 전분, 탈크, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아라비아고무, 올리브유, 참기름, 카카오버터, 에틸렌글리콜, 기타 상용되는 것을 포함한다.

경구투여용 고체 조성물의 예는 정제, 환제, 캡슐제, 분말제, 과립제 등을 포함한다. 이와 같은 고체 조성물에서는 유효성분인 식물 추출물이 적어도 하나의 불활성 희석제, 예를 들면, 락토스, 만니톨, 포도당, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 미결정성 셀룰로오스, 전분, 폴리비닐 피롤리돈, 마그네슘 알루미노메타실리케이트 등과 혼합된다. 고체 조성물은, 통상적인 방법에 따라 불활성 희석제 이외의 첨가물, 예를들면, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 섬유소 글리콜산 칼슘과 같은 붕해제, 글루타민산 또는 아스파라긴산과 같은 용해보조제를 함유할 수 있다. 정제 또는 환제는, 필요에 따라 슈크로스, 젤라틴, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트 등의 물질로 이루어진 필름으로 피복될 수 있고, 경우에 따라서는 2개 이상의 층으로 피복될 수 있다.

경구투여용 액체조성물은, 약제학적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 엘릭서제 등을 포함하고, 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면, 정제수, 에탄올 등을 포함할 수 있다. 이 조성물은, 불활성 희석제 이외에 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제 등을 포함할 수 있다.

비경구투여용 주사제로는, 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 에멀젼화제가 포함된다. 수성의 용액제·현탁제로는, 예를 들면 주사용 물 및 주사용 생리식염수가 포함된다. 비수성의 용액제·현탁제로는, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물성유, 에탄올과 같은 알코올류, 폴리솔베이트 80® 등이 포함된다. 이와 같은 조성물은, 다시 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제(예를 들면, 유당), 용해보조제(예를 들면, 글루타민산, 아스파르트산)와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 이들은, 예를 들면, 정밀여과막에 의한 여과멸균, 고압증기멸균과 같은 가열멸균, 또는 살균제 배합 등의 통상적인 멸균 방법으로 무균화될 수 있다. 주사제는 용액제제, 또는 사용 시에 용해시켜 사용할 수 있는 동결-건조 제제일 수 있다. 동결-건조를 위한 부형제로는 예를 들면, 만니톨, 글루코스 등의 당알콜이나 당류를 사용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구투여방법 또는 비경구 투여방법으로 투여된다.

바람직하기는 비경구 투여방법, 예를 들면, 주사에 의한 투여(피하주사, 정맥주사, 근육주사, 복강 내에의 주사 등으로 투여), 경피투여, 경점막투여(경직장투여 등), 경폐투여 등이다. 물론 경구투여방법도 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분의 투여량은 질환의 중증도, 환자의 연령 등에 따라 결정할 수 있지만, 일반적으로는 0.005 ㎍/kg ~ l00 mg/kg의 범위이고, 바람직하기는 0.02㎍/kg ~ 5mg/kg의 범위이다. 그러나 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 항염증용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 항염증용 조성물은 까마귀쪽나무 열매의 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물을 물에 현탁시키고 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하였을 때 얻어지는 디클로로메탄층의 분획물을 그 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 발명의 항염증용 조성물에 있어서, "순차적"의 의미, 유효량 등과 관련해서는 본 발명의 진통용 조성물과 관련하여 설명한 바가 적용될 수 있는 한 그대로 유효하다.

본 발명의 항염증용 조성물은 구체적으로 약제학적 조성물로 파악할 수 있다. 본 발명의 항염증용 조성물이 약제학적 조성물로 파악될 경우 전술한 본 발명의 진통용 조성물과 관련하여 설명한 바가 그대로 유효하다.

본 발명의 항염증용 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등의 형태의 것들이 이용될 수 있다.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. "극미량"이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 향미나 기호성을 향상시키고 다른 기능성(예컨대 관절염 또는 골다공증 예방)을 부가하여 가지도록 한약재가 추가될 수 있는데, 추가될 수 있는 한약재로서는 두충 추출물, 속단 추출물, 녹용 추출물, 홍화인 추출물, 토사자 추출물, 숙지황 추출물, 별갑 추출물, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 감초 추출물, 당귀 추출물, 갈근 추출물, 강진향 추출물, 합환피 추출물, 산두근 추출물, 괴화 추출물, 고삼 추출물 등이 예시될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어서 화장료 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 항염증용 조성물이 화장료 조성물로서 파악될 경우, 그 화장료 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다.

여기서 "화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장료 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다.

그러나 상기 비율은 화장료의 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다.

상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에 알려진 피부 보습 활성 물질, 항아토피 활성 물질, 항여드름 활성 물질, 미백 활성 물질 등 기능성 물질을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 항염증용 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어 비누 조성물로서 파악될 수 있다.

본 발명의 조성물이 비누 조성물로서 파악될 경우에, 본 발명의 비누 조성물은 비누 기재에 유효성분을 포함하여 제조될 수 있다.

상기 비누 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유, 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등이 사용될 수 있고, 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜, 이소프로필미리스테이트, 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 비누 조성물은 또한 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속이온 봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 비누 조성물에 있어서, 비누 기재나 첨가제는 당업계에 일반적으로 사용되고 있는 함량으로 포함될 수 있는데, 비누 기재는 일반적으로 비누 조성물의 전체 중량을 기준으로 하였을 때 99.999 중량 % 내지 50 중량 %로 첨가될 수 있으며, 첨가제는 1 중량 % 내지 20 중량 %로 첨가될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 까마귀쪽나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 이용한 진통용 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명에 따르면 까마귀쪽나무 추출물의 디클로로메탄 분획물을 이용한 항염증제 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 진통용 조성물은 약품으로, 본 발명의 항염증제 조성물은 약품, 식품, 화장품 또는 비누로 제품화될 수 있다.

도 1은 까마귀쪽 열매 추출물로부터 Hamabiwalactone A 및 Hamabiwalactone B을 분리하는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 Hamabiwalactone A의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 3은 Hamabiwalactone A의 13C-NMR 스펙트럼이다.
도 4는 Hamabiwalactone B의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 5는 Hamabiwalactone B의 13C-NMR 스펙트럼이다.
도 6은 까마귀쪽나무 열매 추출물과 그 디클로로메탄 분획물, 그로부터 분리된 유효성분인 Hamabiwalactone A와 Hamabiwalactone B의 말초성 진통 억제 효과를 확인하기 위한 Acetic acid-induced writhing test의 결과이다.
도 7은 까마귀쪽나무 열매 추출물과 그 디클로로메탄 분획물, 그로부터 분리된 유효성분인 Hamabiwalactone A와 Hamabiwalactone B의 중추성 진통 억제 효과를 확인하기 위한 Tail-flick test의 결과이다.
도 8은 까마귀쪽나무 열매 추출물과 그 디클로로메탄 분획물, 그로부터 분리된 유효성분인 Hamabiwalactone A와 Hamabiwalactone B의 중추성 진통 억제 효과를 확인하기 위한 Hot plate test의 결과이다.
도 9는 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물이 농도 의존적으로 NO 생성을 억제함과 특별한 세포독성을 보이지 않음을 보여주는 결과이다.
도 10은 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물이 농도 의존적으로 PGE₂의 생성을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 11은 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물이 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제함을 보여주는 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 까마귀쪽나무 열매 추출물의 제조 및 그로부터 Hamabiwalactone A와 Hamabiwalactone B의 분리 및 동정

<실시예 1> 까마귀쪽나무 열매 추출물의 제조

제주도 일대의 국내산 까마귀쪽나무 열매를 입수하여 건조시키고, 그 건조된 까마귀쪽 열매 1 kg을 에탄올 70% 10 ~ 20L로 실온에서 2~5회 반복 추출하고 여과한 후 그 여과액을 감압농축하고 동결건조하여 고형상의 추출물을 얻었다.

<실시예 2> 까마귀쪽나무 열매 70% 에탄올 추출물의 분획물 제조

상기 <실시예 1>에서 얻어진 고형상의 추출물 50g을 증류수 2L에 현탁한 후, 각각 동량의 노르말 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 노르말 부탄올로 순차적으로 분획한 다음, 감압 농축하여 디클로로메탄 분획물을 얻었다.

<실시예 3> 디클로로메탄 분획물로부터 Hamabiwalactone A와 Hamabiwalactone B의 분리 및 동정

상기 <실시예 2>에서 얻어진 디클로로메탄 분획물을 셀라이트(Celite545)가 충진된 Glass Column(5 × 50 cm)에서 컬럼 크로마토그래피(이동상: 노르말 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 메탄올)를 수행하여 4개의 분획으로 나누었다. 다음 각각의 얻어진 분획 중 진통효능이 우수한 노르말 헥산 분획을 농축하여 완전 건조 후 실리카겔(silica gel)이 충진된 Glass Column(10 ×3 cm)에서 VLC(Vacuum liquid chromatography)(이동상: 노르말 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 메탄올; 이동상 이동속도 = 60mL/min)를 실시하여 총 18개의 분획으로 나누었다. 그 중 진통효능이 우수한 5번과 7번 분획을 농축하여 완전 건조 후 실리카겔(silica gel)이 충진된 Glass Column(2.5 ×50 cm)에서 컬럼 크로마토그래피(노르말 헥산 : 에틸아세테이트=5:1)를 수행하여 compound 1, 2를 분리하였으며, NMR을 이용하여 구조를 동정하였다.

Compound 1에 대한 NMR 구조 동정 결과는 다음과 같다: 무색, 오일상; 1H-NMR (500MHz, CDCl₃) : 7.00 (1H, br s, H-3), 6.79 (1H, td, J =15.0, 7.0 Hz, H-7), 6.07 (1H, d, J =15.5 Hz, H-6), 5.01 (1H, br q, J =6.5Hz H-4), 2.16 (2H, td, J =7.0, 2.5Hz, H-15), 2.13(2H, q, J =7.0Hz, H-8), 1.91 (1H, t, J =2.5Hz, H-17), 1.40 (3H, d, J =6.5Hz, H-5), 1.27 (2H, br s, H-9); 13C-NMR (125 MHz, CDCl₃) 172.2 (C-1), 147.0 (C-3), 138.9 (C-7), 129.6 (C-2), 118.5 (C-6), 84.9 (C-16), 77.1 (C-4), 68.2 (C-17), 33.5 (C-8), 29.4 (C-9), 29.3 (C-10), 29.1 (C-11), 28.9 (C-12, 13), 28.6 (C-14), 19.3 (C-5), 18.5 (C-15)

Compound 2에 대한 NMR 구조 동정 결과는 다음과 같다: 무색, 오일상; 1H-NMR (500MHz, CDCl₃) : 7.00 (1H, br s, H-3), 6.79 (1H, td, J =14.5, 7.0 Hz, H-7), 6.07 (1H, d, J =16.0 Hz, H-6), 5.80 (1H, ddt, J =17.0, 10.0, 7.0Hz H-16)5.01 (1H, br q, J =7.0Hz H-4), 4.88~4.98 (2H, m, H-17), 2.15(2H, q, J =7.5Hz, H-8), 2.03(2H, q, J =7.0Hz, H-15), 1.40 (3H, d, J =6.5Hz, H-5), 1.25 (2H, br s, H-9); 13C-NMR (125 MHz, CDCl₃) 172.2 (C-1), 147.0 (C-3), 139.4 (C-16)139.0 (C-7), 129.6 (C-2), 118.5 (C-6), 114.3 (C-17), 77.1 (C-4), 33.9 (C-15), 33.6 (C-8)29.5 (C-9, 10), 29.4 (C-11), 29.2 (C-12), 29.1 (C-13), 28.9 (C-14), 19.3 (C-5)

상기 NMR 데이타와 문헌[Phytochemistry. 29(3):857-859, 1990]을 비교 검토 결과, 까마귀쪽나무 열매의 유효 분획인 디클로로메탄 분획물의 compound 1은 상기 [화학식 1]의 Hamabiwalactone A로 확인되었고, compound 2는 상기 [화학식 2]의 Hamabiwalactone B로 확인되었다.

< 실험예 > 진통 억제 활성 실험 및 항염증 실험

<실험예 1> 진통 억제 활성 실험

<실험예 1-1> 말초성 진통 억제 동물실험( Acetic acid - induced writhing test )

본 실험은 까마귀쪽나무 열매 추출물의 진통효과를 알아보기 위한 방법의 하나로 복부 수축 반응을 지표로 하며, 말초신경계의 진통 효력 시험에 주로 사용되는 시험방법이다(J Pharmacol Exp Ther. 2008 Apr;325(1):10-6; J Ethnopharmarcol. 2007 May 22;111(3):476-82; J Pharmacol Exp Ther. 2005 Feb;312(2):726-32).

실험은 생약(한약) 제제 효력시험 가이드라인의 '통증성 질환에 대한 일반적인 효력 시험'(식품의약품안전청, 2009년 5월)에 기재된 방법을 따랐다. 구체적으로는 다음과 같다.

실험동물은 5주령 ICR mouse (중앙실험동물, 서울)를 구입하여 1주간 습도 50%, 온도 24~26℃로 유지되는 사육장에서 순화시켰으며, 사료 및 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 공급하였다.

자극물(초산 0.75% 함유 생리 식염수)을 0.1mL/10g body wt의 용량으로 실험 전 12시간 동안 절식시킨 마우스의 복강에 주사로 주입하였으며, 자극물의 주입 60분 전 시료(즉 까마귀쪽나무 열매 추출물, 디클로로메탄 분획물 및 Hamabiwalactone A와 B)를 경구투여하였다. 자극물이 투입되면 복강 내에서 통증을 유발하여 몸을 뒤틀거나, 뒷다리를 쭉 뻗는 동작 등의 writhing syndrome 반응을 보이게 된다. 총 10분 동안 writhing(몸을 뒤튼 상태로 2초 이상 지속) 횟수를 측정한 결과를 [도 6]에 나타내었다. [도 6]에서 각 색깔·도형별 포인트는 실험동물의 writhing의 숫자이며, 직선(-)은 그 평균값이다.

[도 6]를 참조하여 보면, 시료 비투여군인 대조군의 writhing number에 까마귀쪽나무 열매 추출물과 그 디클로로메탄 분획물, 그로부터 분리된 유효성분인 Hamabiwalactone A와 Hamabiwalactone B의 writhing number가 작은 것을 알 수 있다.

<실험예 1-2> 중추성 진통 억제 동물시험( Tail - flick test )

본 실험에서는 꼬리 회피 반응 시험법을 이용하여 중추성 진통 억제 효과를 확인하였다. 급성 통증 모델 중 중추신경계에 작용하는 진통제를 검색할 때 많이 사용하는 방법이다(Peptides. 2005, 26(4):615-9).

실험은 생약(한약) 제제 효력시험 가이드라인의 '통증성 질환에 대한 일반적인 효력 시험'(식품의약품안전청, 2009년 5월)에 기재된 방법을 따랐다. 구체적으로는 다음과 같다.

5주령 ICR 마우스를 1주일간 순화시킨 후 각각 무게를 재고 식별이 가능하도록 꼬리에 매직으로 표시를 하였다. 쥐 꼬리의 1/3지점 을 측정해 표시하고, 반응에 영향을 미치지 않도록 빛이 닿지 않는 쪽에 표시를 하였다. 반응시간이 3~4 sec이 되도록 강도를 맞추며, cut off time은 10초 정도로 정하였다(마우스 꼬리의 조직손상 방지). 약물주입은 복강주사로 하였다. 동물의 꼬리 끝을 열판에 올려 놓고 꼬리치기가 일어나기까지의 시간을 측정하여 시료 무처리군과 비교하여 꼬리치기가 일어나기까지의 시간 증가율(TFL change)을 구하였다.

시료(즉 까마귀쪽나무 열매 추출물, 디클로로메탄 분획물 및 Hamabiwalactone A와 B)는 실험 시작 60분 전에 경구투여하였다. 시료(즉 까마귀쪽나무 열매 추출물, 디클로로메탄 분획물 및 Hamabiwalactone A와 B)는 실험 시작 60분 전에 경구투여하였다.

결과를 [도 7]에 나타내었다. [도 7]을 참조하여 보면 대체로 모든 시료가 농도 의존적으로 진통 억제 효과가 있음을 보여준다.

<실험예 1-3> 중추성 진통억제 동물시험( Hot plate test )

본 실험에서는 Hot plate test를 이용하여 중추성 진통 억제 효과를 확인하였다. Hot plate test는 중추신경계에 작용하는 진통제를 검색할 때 사용하는 방법으로(Anthony W. Bannon, Model of pain :Hot-plate and formalin test in rodents, Current protocol. 1998 March), mouse의 발바닥이 열에 매우 민감하여, 참을 수 없을 정도의 열이 감지되면 뛰거나, 발바닥을 움츠리거나, 핥는 행위를 하는데, hot plate에 접촉할 때부터 뒷발을 털거나 핥을 때까지의 시간(sec)을 측정하는 방법이다.

실험은 생약(한약) 제제 효력시험 가이드라인의 '통증성 질환에 대한 일반적인 효력 시험'(식품의약품안전청, 2009년 5월)에 기재된 방법을 따랐다. 구체적으로는 다음과 같다.

5주령 ICR 마우스를 구입하여 1주간 순화시킨 후 실험동물의 몸무게를 측정하고, 실험동물을 실험환경에 적응시키기 위하여 15-30 분 정도 두었다. 전열기를 55℃ 혹은 적당한 온도로 미리 조절하였다. 각각의 시험물질(즉 까마귀쪽나무 열매 추출물, 디클로로메탄 분획물 및 Hamabiwalactone A와 B)을 경구투여하고, 시료 경구 투여 60 분 경과 후에, 테스트를 시작하여 뒷발을 털거나 핥을 때까지의 시간을 초(sec) 단위로 측정하였다.

결과를 [도 8]에 나타내었다. [도 8]을 참조하여 보면, 모든 시료 농도 의존적으로 진통 억제 효과를 보임을 알 수 있다.

< 실험예 2> 항염증 실험

<실험예 2-1> LDH 세포독성 시험

젖산탈수소효소 (Lactate dehydrogenase, LDH)는 대부분의 세포에 존재하는 안정형 세포질 효소로서 원형질막의 손상을 입으면 세포 배양액으로 방출된다. 이에 RAW264.7 세포를 48 well plate에서 24시간 배양 후, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물을 농도별로 처리하여 LDH 세포독성검색 키트 (LDH cytotoxicity detection kit, Promega)를 이용해 492 nm에서 효소 활성을 측정하였다.

결과를 [도 9]에 나타내었다. [도 9]를 참조하여 보면, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물은 거의 세포독성을 보이지 않음을 보여준다.

<실험예 2-2> NO 생성 억제 시험

항염증 효능을 알아보기 위해 RAW264.7 세포를 48 well plate에서 24시간 배양 후, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물과 LPS (1㎍/ml)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 세포배양 상등액 100㎕와 Griess시약 100㎕를 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO₂)를 표준으로 하여 비교하였다.

결과를 시료 비처리군과 비교하여 [도 9]에 나타내었다. [도 9]를 참조하여 보면, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물은 농도 의존적으로 NO 생성 억제 활성을 보임을 알 수 있다(시료 처리 농도 단위: ㎍/ml, 이하 같음). 또한 상기 <실험예 2-1>의 세포독성 결과를 함께 고려할 경우, 상기 NO 생성 억제 활성이 세포독성에 의한 결과가 아님을 알 수 있다.

<실험예 2-3> Prostaglandin E2 ( PGE2 ) 생성 억제 시험

항염증 효능을 알아보기 위해 RAW264.7 세포를 24 well plate에서 18시간 배양 후, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물과 LPS (1㎍/ml)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였으며, 세포배양 상등액 분리 후 PGE2 ELISA kit (R&D Systems, Inc, USA)를 이용하여 PGE2를 정량하였다.

이와 같이 측정한 결과는 다음 [도 10]에 나타내었다.

[도 10]을 참조하여 보면, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물은 농도 의존적으로 PGE2 생성 억제 활성을 보임을 알 수 있다.

<실시예 2-4> iNOS 및 COX -2 발현 억제 시험

RAW264.7 세포를 6 well plate에서 24시간 배양 후, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물과 LPS (1㎍/ml)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 수집한 세포를 PBS로 세척 후 1ml의 lysis buffer를 첨가하여 lysis시킨 후 12,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 단백질 부분을 분리하였다. 30 ~ 50㎍의 lysate를 8 ~ 12% SDS-PAGE로 분리하였으며, PVDF membrane (BIO-RAD)에 200 mA로 2시간 동안 transfer하였다. Membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TTBS (TBS + 0.1% Tween 20) 용액으로 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 항체 anti-mouse iNOS (1:1000, Santa-Cruz)과 COX-2의 항체 anti-mouse COX-2 (1:1000, Cell signaling)를 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세척하였다. 2차 항체로는 HRP(Horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG (Amersham Co.)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세척하여 ECL 기질 (Amersham Co.)과 1~3분간 반응시켰으며, 그 후 X-ray 필름에 감광하였다.

결과를 [도 11]에 나타내었다. [도 11]을 참조하여 보면 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물은 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제함을 보여준다.

Claims (8)

1. 아래의 [화학식 1]의 하마비와락톤 A 또는 아래의 [화학식 2]의 하마비와락톤 B를 유효성분으로 포함하는 진통용 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   [화학식 2]
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 진통은 침해성 통증 또는 신경병증성 통증의 개선 활성인 것을 특징으로 하는 진통용 조성물.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 진통용 조성물.
   
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 진통용 조성물.
   
5. 아래의 (I)의 추출물 또는 아래의 (II) 분획물을 유효성분으로 포함하는 진통용 조성물:
   (Ⅰ) 까마귀쪽나무 열매를 물과 에탄올의 혼합용매로 추출하여 얻어진 추출물; 및
   (II) 까마귀쪽나무 열매의 물과 에탄올의 혼합용매 추출물을 물에 현탁시키고 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하였을 때 얻어지는 디클로로메탄층의 분획물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 진통은 침해성 통증 또는 신경병증성 통증의 개선 활성인 것을 특징으로 하는 진통용 조성물.
   
7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
   상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 진통용 조성물.
   
8. 제5항 또는 제6항에 있어서,
   상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 진통용 조성물.
   
   

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