KR100768085B1 - 생리활성을 가지는 비쑥추출물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생리활성을 가지는 비쑥추출물에 관한 것이다.
본 발명의 생리활성을 가지는 비쑥추출물은, 비쑥을 음건하고, 마쇄기로 갈아 미세분말로 만든 후, 이 미세분말을 80 % 에탄올에 침적하고, 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출한 다음, 이 추출액의 상층액을 회수하여 감압 농축하고, 이 농축물을 물에 현탁시킨 후, 헥산과 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 추출하여 비쑥추출물을 제조하는 것으로 구성된다.
본 발명에 의해 생리활성이 우수한 비쑥추출물이 제공되며, 비쑥추출물을 활성성분으로 포함하는 항산화 및 항염활성이 뛰어난 조성물이 제공된다.
쑥, 비쑥, 항산화, 항염, 생리활성
Description
도 1은 DPPH 라디칼 소거활성 결과를 나타내는 그래프
A : 본 발명의 비쑥추출물의 DPPH 라디칼 소거활성
B : 인진쑥추출물의 DPPH 라디칼 소거활성
도 2는 크산틴 산화효소 억제활성 결과를 나타내는 그래프
A : 본 발명의 비쑥추출물의 크산틴 산화효소 억제활성
B : 인진쑥추출물의 크산틴 산화효소 억제활성
도 3은 과산화물 라디칼 소거활성 결과를 나타내는 그래프
A : 본 발명의 비쑥추출물의 과산화물 라디칼 소거활성
B : 인진쑥추출물의 과산화물 라디칼 소거활성
도 4는 질소산화물 소거활성 결과를 나타내는 그래프
A : 본 발명의 비쑥추출물의 질소산화물 소거활성
B : 인진쑥추출물의 질소산화물 소거활성
도 5는 본 발명의 비쑥추출물에 대한 RAW264.7 세포에서의 세포독성과 NO 생성량을 나타내는 그래프
도 6은 본 발명의 비쑥추출물과 인진쑥추출물에 대한 RAW264.7 세포에서의 세포독성과 NO 생성량을 나타내는 그래프
도 7은 본 발명의 비쑥추출물에 대한 RAW264.7 세포에서 iNOS의 mRNA 발현 수준에서의 억제효과를 나타내는 그래프 및 웨스턴블랏 결과
도 8은 본 발명의 비쑥추출물에 대한 RAW264.7 세포에서 단백질 수준에서의 iNOS 생성억제 효과를 나타내는 그래프 및 웨스턴블랏 결과
도 9는 본 발명의 비쑥추출물에 대한 RAW264.7 세포에서 단백질 수준에서의 COX-2 생성억제 효과를 나타내는 그래프 및 웨스턴블랏 결과
본 발명은 생리활성을 가지는 비쑥추출물에 관한 것이다.
쑥이라 불리는 식물로는 지구 북반구에 200 여종이 있고, 국내에는 사자발쑥, 사철쑥(인진쑥), 제비쑥, 물쑥, 개사철쑥, 비쑥, 큰비쑥 등 38 종이 보고되고 있다.
쑥에는 사람에 유익한 성분이 다수 포함되어 있어 예로부터 널리 이용되어 왔으며, 쑥에 포함된 유효 성분을 생약학적 방법으로 연구한 결과 쑥에 포함된 다양한 유효성분들이 혈액순환촉진, 이뇨작용, 강장작용, 지혈, 피부질환치료, 건위, 황달치료, 항암작용 등의 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다.
한국공개특허공보 10-2005-0121775(인진쑥 추출물과 그를 함유한 혈당강하용 조성물)에는, 인진쑥을 에탄올, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 등의 용매들을 가한 후 추출한 인진쑥 추출물로써, 혈당강하효과가 뛰어나 당뇨병 유발을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로 이용하거나 기능성 식품의 유효성분으로 이용할 수 있는 추출물에 관한 것이 공개되어 있다.
또, 한국공개특허공보 10-2006-0014534(그늘쑥에서 분리된 플라보노이드 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증억제제)에는, 그늘쑥으로부터 분리된 4'-데메틸유파틸린 또는 시르실리네올을 유효성분으로 함유하는 염증억제제 및 면역반응 억제제에 관한 것이 공개되어 있다.
또, 한국등록특허공보 10-0377262(쑥 추출물을 함유하는 아토피성 피부용 화장료 조성물)에는, 인진쑥을 에틸알코올 : 1,3-부틸렌 클리콜 : 물을 1 : 1 : 1 ~ 1 : 5 : 8의 중량비로 혼합한 혼합 용매를 사용하여 추출한 쑥 추출물을 0.1 ~ 5 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 쑥 추출물을 함유하는 아토피성 피부용 화장료조성물에 관한 것이 공개되어 있다.
한편, 비쑥(Artemisia scoparia)은 갖가지 염증과 소변이 잘 안 나오는 데·요도염·신경쇠약·두통 등에 좋은 효과가 있다고 알려져 있다.
특히, 비쑥의 전초에 0.08 ∼ 1.1 % 쯤 들어 있는 피넨, 마르젠, 캄펜, 보르네올, 류욘 등의 정유 성분으로 인해 신장과 방광의 결석을 용해하는 데 매우 효과가 뛰어난데, 한방에서는 거의 쓰지 않고 잘 알려지지 않은 극히 드문 희귀한 풀이다.
상기와 같이 종래에 인진쑥(사철쑥), 큰비쑥 등과 같은 종류의 쑥의 생리활성이 잘 알려져 있고 그 쓰임도 다양하나, 비쑥에 대한 연구는 이루어지지 않고 있는 실정이다.
본 발명은 생리활성이 우수한 비쑥추출물을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 비쑥추출물을 활성성분으로 포함하는 항산화 및 항염활성이 뛰어난 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
본 발명은 생리활성을 가지는 비쑥추출물에 관한 것이다.
본 발명의 생리활성을 가지는 비쑥추출물은, 비쑥(Artemisia scoparia)을 미세분말로 만들어 80 % 에탄올에 침적하고, 이 에탄올 침적물을 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출한 다음, 추출액의 상층액을 회수하여 감압 농축하고, 농축물을 물에 현탁시킨 후, 현탁액을 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 추출하여 비쑥추출물을 제조하는 것으로 구성된다.
본 발명의 주 재료인 비쑥(Artemisia scoparia)은 국화과(Compositae)의 쑥속(Artemisia)에 속하는 다년초 식물로서, 전초와 뿌리에 정유가 있다.
특히, 비쑥의 전초에 0.08 ∼ 1.1 % 쯤 들어 있는 피넨, 마르젠, 캄펜, 보르네올, 류욘 등의 정유 성분으로 인해 신장과 방광의 결석을 용해하는 데 매우 효과 가 뛰어난데, 한방에서는 거의 쓰지 않고 잘 알려지지 않은 극히 드문 희귀한 풀이다.
본 발명의 주 재료인 비쑥(Artemisia scoparia)은 인진쑥(Artemisia capillaris)과는 외형상 비슷하지만, 인진쑥이 육지에 서식하는 반면 비쑥은 해안가에 서식하는 점이 다르다.
특히 인진쑥이 갖가지 생리활성이 우수하다는 사실이 입증되어 있지만, 본 발명에서는 비쑥의 생리활성이 더욱 우수함을 밝히고 이를 이용하기 위해 많은 연구를 하였다.
즉, 본 발명은 비쑥을 이용하여 생리활성이 큰 추출물을 제조하고, 그 생리활성을 가진 비쑥추출물을 활성성분으로 하는 치료용 및 예방용 조성물로서의 가능성을 모색하는 데 목적을 두고 연구를 하였다.
비쑥을 80 % 에탄올로 추출하고 극성이 다른 4가지 용매(에탄올, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올)로 분획하여 DPPH 라디칼 소거활성, 크산틴 산화효소 억제활성, 과산화물 라디칼소거활성, NO 생성 저해 활성의 항산화 활성을 측정하였다(도 1, 2, 3, 4).
그 결과, DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)의 자유라디칼 소거활성은 조추출물과 에틸아세테이트, 부탄올 분획물에서 다른 용매 분획물에 비해 대단히 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈다(도 1).
그 중 에틸아세테이트 분획물에서 제일 높은 라디칼 소거 활성을 보여주었 고, DPPH의 자유라디칼 소거활성이 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물의 IC50 값은 9.27 ㎍/㎖로 나타났다(표 1).
또, 본 발명의 비쑥추출물의 크산틴산화효소(xanthine oxidase) 활성 억제 실험은 디클로로메탄 분획물이 가장 높은 크산틴산화효소 억제활성을 나타냈으며, 에틸아세테이트 분획물에서도 비교적 높은 활성억제률을 보여주었다.
즉, 크산틴산화효소 억제활성이 가장 좋았던 디클로로메탄 분획물의 IC50 값은 93.01 ㎍/㎖로 나타났으며(표 1), 크산틴산화효소 억제활성에 대한 이들의 활성 순서는 DPPH radical 소거 활성 순서와는 달리 디클로로메탄 > 에틸아세테이트 > 에탄올 > 헥산 > 부탄올 분획물 순이었다(도 2).
또, 과산화물 라디칼(Superoxide radical) 소거활성 실험은 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물에서 가장 높은 과산화물 라디칼 소거활성을 나타냈으며, 헥산 분획물에서도 비교적 높은 과산화물 라디칼 소거활성을 보여주었다.
즉, 과산화물 라디칼 소거활성이 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물의 IC50 값은 16.97 ㎍/㎖로 나타났으며(표 1), 이들의 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성 결과와 유사한 패턴을 보여주었다. 그러나 조추출물에서는 과산화물 라디칼 소거활성이 아주 낮게 나타났다(도 3).
또, 질소산화물(nitric oxide) 생성 저해 활성 실험은 디클로로메탄 분획물에서 가장 높은 질소산화물 생성 저해 활성을 나타냈으며, 에틸아세테이트 분획물에서도 비교적 높은 활성을 보여주었다(도 4).
즉, 질소산화물 생성 저해 활성이 가장 높게 나타난 디클로로메탄 분획물의 IC50 값은 232.26 ㎍/㎖로 나타났다(표 1).
또한, 본 발명의 비쑥추출물에 대해 항염활성을 실험하였고, 그 결과 LPS 단독 처리군에서는 NO가 과량 생성되는 것을 확인할 수 있었으며, 비쑥추출물을 같이 처리시 농도 의존적으로 그 생성량이 감소됨을 확인할 수 있었다. 특히 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트 분획물에서 NO의 생성량이 현저히 저해됨을 볼 수 있었다(도 5, 6).
또, LPS (1 ㎍/㎖)를 사용하여 RAW264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 생성을 유도한 후 비쑥추출물에 의한 저해 정도를 RT-PCR과 웨스턴블랏(Western blot)을 통해 알아보았다.
그 결과 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트 분획물의 50 ㎍/㎖ 농도에서 iNOS의 단백질 생성이 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었으며(도 7, 8), iNOS의 단백질 생성억제 결과와 마찬가지로 현저히 COX-2의 단백질 생성도 억제됨을 확인할 수 있었다(도 9).
특히, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트 분획물에서 그 억제 효과가 가장 강하게 나타났으며, 헥산 분획물에서는 NO의 생성억제 효과 결과처럼 iNOS와 COX-2의 생성억제 효과 또한 독성효과에 기인된 것으로 사료된다.
또한, 본 발명의 비쑥추출물은 종래에 생리활성이 뛰어나다고 알려져 있는 인진쑥추출물과 항산화활성 및 항염활성을 비교한 결과 본 발명의 비쑥추출물의 생 리활성이 월등히 뛰어나다는 사실을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명의 생리활성을 가지는 비쑥추출물은 식품첨가제, 사료첨가제, 음료조성물 등 다양하게 활용할 수 있으며, 다양한 질병에 대한 예방 및 치료용 조성물로 활용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 비쑥추출물을 활성성분으로 포함하는 항산화 및 항염활성을 가지는 조성물을 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 비쑥추출물에 대하여 실시예와 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 생리활성을 가지는 비쑥추출물의 제조
제주도 해안가에 자생하고 있는 비쑥(Artemisia scoparia)을 2005 년 10월 경에 채집하여 준비하였다.
준비한 비쑥 1 ㎏을 세척한 다음, 음건한 후 마쇄기로 갈아 미세분말로 만들었다.
준비한 비쑥 미세분말을 80 % 에탄올에 침적하고, 초음파를 이용하여 1 시간씩 3회 추출하였다.
이 추출액의 상층액을 회수하여 감압 농축하였다.
농축한 에탄올 추출물을 물에 현탁시킨 후에 헥산(1ℓ×3), 디클로로메탄(1ℓ×3), 에틸아세테이트(1ℓ×3), 부탄올(1ℓ×3)로 순차적으로 추출하여 본 발명의 비쑥추출물을 제조하였다.
<비교예 1> 인진쑥 추출물의 비교제조
본 발명의 실시예 1과 동일한 방법으로 인진쑥 추출물을 제조하였다.
<실험예 1> 항산화활성 실험
본 발명의 실시예 1에서 제조한 비쑥추출물을 준비하여 실험에 사용하였다.
대조군으로는 비교예 1에서 제조한 인진쑥 추출물, 아스코르빈산(ascorbic acid), BHA(butylated hydroxy anisole), 트롤록스(trolox)를 사용하였다.
1. DPPH 라디칼 소거활성에 의한 항산화활성 검색
항산화 물질의 가장 특징적인 기작은 유리기와 반응하는 것으로 유리기 소거 작용은 활성라디칼(free radical)에 전자를 공여하여 식물 중의 항산화 효과나 인체에서 노화를 억제하는 척도로 사용된다.
DPPH는 안정한 유리기로 시스테인(cysteine), 글루타티온(glutathione)과 같은 함유황 아미노산과 아스코르빈산(ascorbic acid), 아로마틴 아민(aromatic amine;ρ-phenylenediamine, ρ-aminophenol) 등에 의해 환원되어 탈색되므로 항산화 물질의 항산화능 측정에 많이 이용되고 있다(Blois, M. S. 1958. Antioxidant determination by the use a stable free radical. Nature 26: 1199-1200 ).
DPPH 라디칼 소거활성 실험을 통하여 활성산소의 인체 내 독성작용을 저지하는 활성물질 분리는 항산화제가 될 가능성이 있다.
항산화제는 각종 유리 라디칼 또는 유지의 페록시 라디칼(peroxy radical)에 수소나 전자의 공여체로 작용하여 비 라디칼 화합물을 상쇄시킴으로써 산패를 억제하는 라디칼 소거제(radical scavenger)가 대표적이며, 그 외의 기능상 금속제거제, 과산화물 분해제와 상승제 등으로 나눌 수 있다.
지난 수십 년 간 널리 사용되어오던 BHA(butylated hydroxy toluene), BHT(butylated hydroxy anisole) 등의 합성 항산화제들은 항산화력은 뛰어나나 그들의 안전성에 관한 우려로 미국, 일본 등 선진 각국에서는 그 사용량이 법적으로 규제되어 천연 항산화제로 대체하는 추세에 있다(지옥화, 양차범, 1996, 방아 추출물의 항산화 효과, 한국식품과학회지, 28 : 1157-1163.).
전자공여능(electron donating ability) 측정은 Blosis 방법 (Blois, M. S. 1958. Antioxidant determination by the use a stable free radical. Nature 26: 1199-1200)에 의한 DPPH 자유라디칼 소거법에 따라 측정하였다.
에탄올에 녹인 시료의 각각의 농도를 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하고 0.4 mM DPPH용액을 동량 첨가하여 실온에서 10 분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
DPPH 라디칼 소거활성은 아래식으로부터 산출하였고 DPPH의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였으며, 각 시료는 3 회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
DPPH radical 소거활성 (%) = (Acontrol - Asample)/ Acontrol × 100
Asample = 시료를 첨가한 반응액의 흡광도
Acontrol = 시료대신 메탄올을 첨가한 반응액의 흡광도
DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)의 자유라디칼 소거활성으로 본 발명의 비쑥추출물의 항산화 활성을 측정한 결과, 조추출물과 에틸아세테이트, 부탄올 분획물에서 다른 용매 분획물에 비해 대단히 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈다(도 1).
그 중 에틸아세테이트 분획물에서 제일 높은 라디칼 소거 활성을 보여주었고, DPPH의 자유라디칼 소거활성이 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물의 IC50 값은 9.27 ㎍/㎖로 나타났다(표 1).
이 값은 대조군으로 사용된 아스코르빈산(ascorbic acid), BHA(butylated hydroxy anisole), 트롤록스(trolox) 값에 비해 조금도 뒤떨어지지 않는 활성이라 할 수 있다.
또한, 본 발명의 비쑥추출물이 비교예의 인진쑥추출물에 비해 DPPH의 자유라디칼 소거활성이 월등히 높게 나타난 것을 확인하였다(도 1A, 도 1B).
2. 크산틴 산화효소 억제활성 실험
크산틴 산화효소(Xanthine oxidase)는 산화적 환경에서 크산틴 탈수소효소(xanthine dehydrogenase)로부터 생성된다.
크산틴 산화효소는 하이포크산틴(hypoxanthine)을 산화시켜 최종적으로 요산(uric acid)과 산소를 생성하며, 산소유리기와 수소과산화기가 이 산소로부터 발생하게 된다.
요산의 축적은 고요산혈증과 통풍을 유발하는 것으로 알려져 있으므로 요산 형성의 억제제가 이들 질환을 위한 치료 물질로서 유용할 것이다.
게다가 크산틴 산화효소에 의해 생성된 산소유리기는 세포의 손상을 초래한다고 알려져 있다(Cheng, Z. J., S. C. Kuo, S. C. Chan, F. N. Ko, and C. M. Teng. 1998. Antioxidant properties of butein isolated from Dalbergia odorifera. Biochim . Biophys. Acta, 1392: 291-299).
따라서 산소 유리기의 자유기를 소거할 수 있는 물질 또한 산화적 손상의 예방에 유용할 것이다.
통풍은 요산의 수치가 높아지면서 일어나며 이들이 결정체를 이루어 관절에 흡착하여 염증이 생기며, 심한 경우 신장이나 심장 등에 합병증을 유발하는 것으로 알려져 있다.
크산틴 산화효소 저해제는 통풍, 신장결적, 허혈, 심근증을 일으키는 요산혈증에 대한 치료제로 사용되어 왔으며, 통풍치료에 사용되는 물질로는 알로푸리놀(allopurinol), 알로크산틴(alloxanthine) 등이 알려져 있다.
따라서, 본 실험에서는 비쑥추출물의 크산틴 산화효소 억제활성을 알아보았다.
크산틴/크산틴 산화효소(Xanthine/xanthine oxidase)에 의한 요산(uric acid) 생성은 290 nm에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였다.
반응액은 각 시료의 여러 농도와 0.5 mM 크산틴과 1 mM EDTA를 200 mM 인산버퍼(phosphate buffer, pH 7.5) 100 ㎕에서 준비하였고, 50 mU/ml 크산틴 산화효소를 첨가하여 요산의 생성을 유도하였다.
크산틴 산화효소 억제 활성은 생성된 요산의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였다.
본 발명의 비쑥추출물 시료의 농도별 크산틴산화효소(xanthine oxidase) 활성 억제에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
즉, 디클로로메탄 분획물이 가장 높은 크산틴산화효소 억제활성을 나타냈으며, 에틸아세테이트 분획물에서도 비교적 높은 활성억제률을 보여주었다.
크산틴산화효소 억제활성이 가장 좋았던 디클로로메탄 분획물의 IC50 값은 93.01 ㎍/㎖로 나타났으며(표 1), 크산틴산화효소 억제활성에 대한 이들의 활성 순서는 DPPH radical 소거 활성 순서와는 달리 디클로로메탄 > 에틸아세테이트 > 에탄올 > 헥산 > 부탄올 분획물 순이었다.
또한, 본 발명의 비쑥추출물이 비교예의 인진쑥추출물에 비해 크산틴산화효소 억제활성이 월등히 크다는 사실을 확인하였다(도 2A, B).
3. 과산화물(superoxide) 소거활성 실험
정상적인 산화성 인산화(oxidative phosphorylation)의 과정 동안 소모되는 전체 산소의 0.4 ~ 4 % 정도는 자유라디칼 과산화물로 전환되며, 생성된 과산화물은 다른 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)으로 전환되어 직접적 또는 간접적으로 세포손상을 유발하는 것으로 알려져 있다.
정상적으로는 과산화물을 내인성 항산화 방어기전에 의해 과산화억제효소 (superoxide dismutase, SOD)에 의해 빠르게 과산화수소로 전환된다.
그러나, 이 내인성 항산화 방어체계가 세포내 산화-환원 균형을 유지하는데에 문제가 생길 경우 결과적으로 산화스트레스가 일어나게 되며 이 산화스트레스는 직접적으로 세포내 거대분자의 손상을 일으키거나 세포손상을 일으키는데 중요한 역할을 한다.
따라서, 본 실험에서는 비쑥추출물의 과산화물 소거활성을 알아보았다.
과산화물(superoxide)의 양은 NBT(nitroblue tetrazolium) 환원방법에 의해 측정하였다.
과산화물(Superoxide) 소거활성은 위 반응액에 0.5 mM NBT를 첨가하여 반응 시켰다.
과산화물 소거 활성은 과산화물의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였다.
과산화물 라디칼(Superoxide radical) 소거활성에 대한 결과를 도 3에 나타 내었다.
에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물에서 가장 높은 과산화물 라디칼 소거활성을 나타냈으며, 헥산 분획물에서도 비교적 높은 과산화물 라디칼 소거활성을 보여주었다.
과산화물 라디칼 소거활성이 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물의 IC50 값은 16.97 ㎍/㎖로 나타났으며(표 1), 이들의 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성 결과와 유사한 패턴을 보여주었다. 그러나 조추출물에서는 과산화물 라디칼 소거활성이 아주 낮게 나타났다(도 3).
또한, 본 발명의 비쑥추출물이 비교예의 인진쑥추출물에 비해 과산화물 라디칼 소거활성이 월등히 크다는 사실을 확인하였다(도 3A, B).
4. 질소산화물(Nitric oxide) 소거활성 실험
질소산화물(Nitric oxide: NO)은 활성종으로서 세포독성이 강하며 다량의 NO가 생성되면 니트로소화(nitrosation), 니트로화(nitration)와 같은 간접적 효과 및 산화반응을 야기하여 유해한 효과를 나타내게 된다.
특히, 대식세포가 활성화 되면서 생성되는 NO는 주위조직에 세포독성을 나타내는 것으로 유명한데, NO의 반감기는 6 ~ 10 초로 대단히 짧아 실질적으로 직접 검출하여 연구하는데 어려움이 많으므로 대부분의 NO 연구는 NOS 발현 유무나 NO의 안정화된 부산물인 아질산염(nitrite), 질산염(nitrate)을 측정하여 간접적으로 이 루어지고 있다.
본 실험에서는 자연적으로 질소산화물(nitric oxide)을 생성하는 물질인 sodium nitroprusside (SNP)를 사용하여 아질산염 (nitrite)의 양으로 질소산화물(nitric oxide) 소거활성을 산출하였다.
즉, 자연적으로 질소산화물(nitric oxide)을 생성하는 물질인 니트로프루시드 나트륨(sodium nitroprusside, SNP)을 사용하여 시료의 질소산화물 소거 활성을 검색하였다.
10 mM SNP 용액 200 ㎕에 시료를 농도별로 첨가하고 25 ℃에서 3 시간 동안 반응시켰다.
반응이 끝난 후 반응액과 동일한 양의 Griess시약 [2.5 % (v/v) 인산(phosphoric acid)에서 1 % (w/v) sulfanilamide)와 0.1 % (w/v) naphylethylenediamine]을 첨가하였다.
실온에서 10 분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염(nitrite)의 양으로 질소산화물 소거활성을 산출하였다.
질소산화물 소거활성은 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도 (IC50)로 표시하였다.
그 결과, 각 시료의 농도별 질소산화물(nitric oxide) 생성 저해 활성 결과를 도 4에 나타내었다.
즉, 도 4에 나타낸 바와 같이 디클로로메탄 분획물에서 가장 높은 질소산화 물 생성 저해 활성을 나타냈으며, 에틸아세테이트 분획물에서도 비교적 높은 활성을 보여주었다.
질소산화물 생성 저해 활성이 가장 높게 나타난 디클로로메탄 분획물의 IC50 값은 232.26 ㎍/㎖로 나타났다(표 1).
또한, 본 발명의 비쑥추출물이 비교예 1의 인진쑥추출물에 비해 질소산화물 생성 저해활성이 월등히 크다는 사실을 확인하였다(도 4A, B).
<표 1> 본 발명의 비쑥추출물에 대한 항산화실험 결과
| 처리 | IC50(㎍/㎖)a) | |||
| DPPH 라디칼 소거활성 | 크산틴 산화효소 억제활성 | 과산화물 라디칼 소거활성 | 질소산화물 소거활성 | |
| 에탄올추출물 | 48.38 ± 1.68 | 311.81 ± 2.49 | > 1000 | 425.71 ± 2.62 |
| 헥산분획물 | > 1000 | 320.34 ± 2.50 | 192.57 ± 2.28 | > 1000 |
| 디클로로메탄 분획물 | 149.67 ± 2.17 | 93.01 ± 1.96 | 419.46 ± 2.62 | 232.26 ± 2.36 |
| 에틸아세테이트 분획물 | 9.27 ± 0.96 | 147.02 ± 2.16 | 16.97 ± 1.22 | 365.35 ± 2.56 |
| 부탄올분획물 | 40.53 ± 1.60 | > 1000 | 17.88 ± 1.25 | 425.71 ± 2.62 |
| 물 분획물 | 342.76 ± 2.53 | 381.67 ± 2.58 | 34.48 ± 1.53 | > 1000 |
| BHAb ) | 22.70 ± 0.61 | NAc ) | NAc ) | - |
| 아스코르빈산 | 3.90 ± 3.22 | - | - | - |
| 트롤록스 | 8.62 ± 2.20 | 288.60 ± 4.4 | 189.9 ± 2.03 | > 1000 |
| 알로푸리놀 | NAc ) | 3.12 ± 0.17 | 22.65 ± 0.35 | - |
* a) IC50 값은 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도로써 3 회 반복 실험하여 계산된 값임.
* b) BHA : 부틸하이드록시 아니솔(Butylated hydroxy anisole)
* c) NA : 적용되지 않음
<실험예 2> 항염활성 실험
내독소로 잘 알려진 LPS는 그람음성균의 세포외막에 존재하며, RAW264.7와 같은 macrophage 또는 monocyte에서 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 pro-inflammatory cytokine을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
또한, 이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파제 A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)이 프로스타글라딘(prostagladin)으로 바뀌는 과정 및 질소산화물(NO)형성 과정으로 이어지게된다.
질소산화물(Nitric oxide, NO)은 산화질소 합성효소(NOS)에 의해 L-arginine으로부터 생성되는 무기유리체로 면역반응, 세포독성, 신경전달계 및 혈관이완 등 여러 가지 생물학적인 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 농도에 따라 세포 기능유지에 중요한 작용을 하기도 하고 세포독성을 일으키기도 한다.
NO를 생산하는 NOS는 세포내에 존재하여 칼슘이나 칼모듈린(calmodulin)에 의존적인 형태인 비유발성 NOS(constitutive NOS, cNOS)와 칼슘에 비의존적으로 대식세포나 혈관내피세포가 활성화되거나, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 세균의 내독소나 여러 가지 사이토킨(cytokine)에 의해 유도되는 형태인 유발성 NOS(inducible NOS, iNOS)의 형태가 있다.
LPS 자극에 의해 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성하게 되며 이에 의한 세포독성은 염증반응, 세포의 돌연변이 및 종양 발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 염증반응과 관련된 조직 손상에서 NO와 iNOS의 생성이 증가되어 있음이 보고되어 있다.
또한, 다수의 함염증제 약물들의 작용기전은 프로스타글라딘(prostagladin) 합성 억제를 나타내며 이는 COX-2의 생성 및 활성저해에 의한 것이다.
COX는 COX-1과 COX-2로 나뉘어 지는데 다양한 세포에서 각각 다른 발현 경향을 나타낸다. COX-1은 위 및 신장기능의 유지, 혈소판의 형성에 필요한 프로스타글라딘(prostagladin)의 합성에 작용한다.
상대적으로 COX-2는 동물이나 인간의 염증반응 부위에서 발현되므로, COX-2에 의한 prostagladin의 합성은 염증반응을 매개하는 것으로 여겨진다.
이에 본 실험은 비쑥의 뮤린 마크로파지 세포(murine macrophage cell line RAW264.7)로부터의 LPS 자극에 의한 NO의 형성억제 효과 및 iNOS의 발현, COX-2의 생성 및 활성저해 정도를 실험하였다.
1. 세포 배양
마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국유전자은행(Korean Cell Line Bank)로 부터 분양 받아 100 units/㎖ 페니시린-스트렙토마이신(penicillin- streptomycin)과 10 % 우태혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3 ~ 4 일에 한번씩 시행하였다.
지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS. E. coli serotype 0111:B4)는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
2. LDH 세포독성 검색
젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH)는 대부분의 세포에 존재하는 안정적인 세포질효소(stable cytoplasmic enzyme)로서 원형질막이 손상을 입으면 세포배양액으로 방출된다.
따라서, 손상을 입은 세포가 방출하는 LDH 활성을 측정하는 간편하고 간단한 비색분석법(colorimetric assay)이다.
본 실험에서는 RAW264.7 세포를 1.0×105 cells/㎖의 농도로 48 well plate의 각 well에 넣고 24 시간 동안 배양 후, 시료를 농도별로 첨가하여 세포배양이 끝난 후 LDH의 유출을 측정하여 세포의 손상정도를 조사하였다.
LDH 세포독성 검색키트(LDH cytotocixity detection kit,Promega)를 사용하여 492 ㎚에서 활성을 측정하였다.
3. NO 생성 억제률 검색
RAW264.7 세포를 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.0× 105 cells/㎖로 조절한 후 48 well plate 에 접종하고, 시험물질과 LPS(1 ㎍/㎖)를 동시에 처리하여 24 시간 배양하였다.
생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다.
세포배양 상등액 100㎕와 Griess시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid] 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10 분동안 반응시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정하였다.
생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO2)를 standard로 비교하였다.
4. RNA 분리 및 RT-PCR
세포로부터의 총 RNA 추출은 TRI-reagent (MRC)를 이용하였으며, RNase-free한 조건하에서 이루어졌다.
1 ㎍의 총 RNA를 oligo(dT)18 primer, dNTP(0.5 μM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 M-MuLV reverse transcriptase(2U)로 70 ℃ 5 min, 37 ℃ 5 min, 37 ℃ 60 min, 그리고 70 ℃에서 10 min 동안 가열시킴으로서 반응을 중지시켰다.
PCR은 합성된 cDNA로부터 iNOS 및 β-Actin를 증폭시키기 위하여 2 ㎕ cDNA, 4μM의 5'과 3' primer, 10X buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250 μM dNTP, 25 mM MgCl2, 1 unit Taq polymerase (Promega)를 섞고 증류수로 전체를 25 ㎕로 맞춘 다음 Perkin-Elmer사의 Thermal Cycler를 이용하여 PCR을 실시하였다.
이때 PCR cycle은 94 ℃/45 초, 55 ~ 60 ℃/45 초, 72 ℃/60 초, 35 회 이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.5 % 아가로스겔에서 전기영동을 실시하고 에 티듐 브롬화물(ethidium bromide)로 염색하여 특정 밴드를 확인하였다.
<표 2> 프라이머 및 DNA단편의 염기서열
| 유전자 | 프라이머 염기서열 | 서열번호 | |
| iNOS | F | 5'-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3' | 1 |
| R | 5'-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3' | 2 | |
| β-Actin | F | 5'-GTGGGCCGCCCTAGGCACCAG-3' | 3 |
| R | 5'-GGAGGAAGAGGATGCGGCAGT-3' | 4 | |
5. Western blot analysis
세포에 본 발명의 비쑥추출물을 100 ㎍/㎖의 농도로 각각 처리 후 세포를 수집하였다.
세포를 2 ~ 3 회 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척 후 1 ㎖l의 lysis buffer을 첨가, 30 분 ~ 1 시간동안 lysis 시킨 후 12,000 rpm에서 20 분간 원심하여 세포막 성분 등을 제거하였다.
단백질 농도는 BSA(Bovine serum albumin)을 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다.
30 ~ 50 ㎍의 lysate를 8 ~ 12 % mini gel SDS-PAGE(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 PVDF membrane (BIO-RAD)에 200 mA로 2시간 동안 transfer하였다.
그리고 Membrane의 blocking은 5 % skim milk가 함유된 TTBS (TBS + 0.1% Tween 20) 용액에서 상온에서 2시간동안 실시하였다.
iNOS의 생성 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS (1: 1000) (Santa-Cruz) 을 COX-2의 생성 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2 (1: 1000) (Cell Signaling)을 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3 회 세정하였다.
2차 항체로는 HRP (Horse Radish Peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG (Amersham Co.)를 1 : 5000으로 희석하여 상온에서 30 분 간 반응시킨 후, TTBS로 3 회 세정하여 ECL 기질 (Amersham Co.)과 1 ~ 3분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.
6. 항염활성 실험결과
본 발명의 비쑥추출물의 농도에 따른 RAW264.7 세포에서의 세포독성 실험 결과 50 ㎍/㎖ 농도에서는 거의 세포독성을 나타나지 않았다.
이에 질소산화물(NO) 생성 억제 효과를 100 ㎍/㎖의 농도로 각각 처리하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 - 의 형태로 측정하였다.
그 결과, LPS 단독 처리군에서는 NO가 과량 생성되는 것을 확인할 수 있었으며, 비쑥추출물을 같이 처리시 농도 의존적으로 그 생성량이 감소됨을 확인할 수 있었다. 특히 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트 분획물에서 NO의 생성량이 현저히 저해됨을 볼 수 있었다(도 5).
그러나, LDH assay에 의한 비쑥추출물에서의 세포독성은 거의 나타내지 않았지만, 헥산 분획물에서는 세포독성이 강하게 나타난 결과로 볼 때 헥산 분획물에서의 NO의 형성억제 효과는 독성효과에 기인된 것으로 사료된다(도 5).
또한, 본 발명의 비쑥추출물과 비교예 1의 인진쑥추출물의 세포독성 실험결과 본 발명의 비쑥추출물에 비해 인진쑥추출물의 NO 생성량이 컸음을 확인할 수 있었다(도 6).
LPS (1 ㎍/㎖)를 사용하여 RAW264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 생성을 유도한 후 비쑥추출물 및 분획물에 의한 저해 정도를 RT-PCR과 Western blot을 통해 알아 보았다.
그 결과 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트 분획물의 50 ㎍/㎖ 농도에서 iNOS의 단백질 생성이 현저히 저해되는 것을 확인할 수 있었으며(도 7, 8), iNOS의 단백질 생성 억제 결과와 마찬가지로 현저히 COX-2의 단백질 생성도 저해됨을 확인할 수 있었다(도 9).
특히, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트 분획물에서 그 억제 효과가 가장 강하게 나타났으며, 헥산 분획물에서는 NO의 생성억제 효과 결과처럼 iNOS와 COX-2의 생성저해 효과 또한 독성효과에 기인된 것으로 사료된다.
본 발명에 의해 생리활성이 우수한 비쑥추출물이 제공된다.
또한, 본 발명에 의해 비쑥추출물을 활성성분으로 포함하는 항산화 및 항염활성이 뛰어난 조성물이 제공된다.
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- 비쑥을 에탄올로 추출하고, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 제조한, 에탄올추출물과 각 분획물 중 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 개선 및 예방용 조성물.
- 비쑥을 에탄올로 추출하고, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 제조한, 에탄올추출물과 각 분획물 중 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물.
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