KR100663876B1 - 생리활성을 갖는 버섯균사체의 배양물 - Google Patents

생리활성을 갖는 버섯균사체의 배양물 Download PDF

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    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health

Abstract

본 발명은 생리활성을 갖는 버섯균사체의 배양물에 관한 것이다.
본 발명의 버섯균사체 배양용 배지 제조방법은, 손바닥 선인장 열매와 손바닥 선인장 줄기를 준비한 후, 각각 분쇄하여 분쇄한 손바닥 선인장 열매와 분쇄한 손바닥 선인장 줄기를 1 : 1 ~ 1 : 9의 중량비율로 혼합하여 혼합물 1을 제조한 후, 혼합물 1에 중량대비 0.01 ~ 10 중량 %의 가시오가피 추출물을 첨가하여 혼합물 2를 제조한 다음, 혼합물 2를 120 ℃에서 20 분간 멸균하여 버섯균사체 배양용 배지를 제조하는 것으로 구성된다.
본 발명에 의하여, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지가 제공되며, 항산화 활성, 항염 활성, 항암 활성, 미백 효과 등이 우수한 생리활성을 갖는 버섯균사체의 배양물이 제공된다.
손바닥 선인장, 버섯균사체, 생리활성, 항산화, 항염, 항암, 미백

Description

생리활성을 갖는 버섯균사체의 배양물{CULTURE OF MUSHROOM MYCELLIA HAVING PHYSIOLOGICALLY ACTIVE EFFECT}
도 1은 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지 제조공정도
도 2는 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에 함유하고 있는 점질물을 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 측정하여 나타내는 그래프
A : 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지
B : 차가버섯균사체가 배양된 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지
C : 상황버섯균사체가 배양된 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지
도 3은 MEB 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물이 HepG2 세포에 미치는 효과를 나타내는 그래프
MHB : 노루궁뎅이버섯균사체 MIB : 차가버섯균사체
MAB : 신령버섯균사체 MGB : 잎새버섯균사체
MPB : 상황버섯균사체
도 4는 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물이 HepG2 세포에 미치는 효과를 나타내는 그래프
CAB : 신령버섯균사체 CGB : 잎새버섯균사체
CHB : 노루궁뎅이버섯균사체 CIB : 차가버섯균사체
CPB : 상황버섯균사체
도 5는 버섯균사체의 배양물이 HL-60 세포의 생장 저해 효과를 나타내는 그래프
A : MEB 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물
B : 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물
도 6은 버섯균사체의 배양물이 Jurkat 세포의 생장 저해 효과를 나타내는 그래프
A : MEB 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물
B : 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물
도 7은 버섯균사체의 배양물이 세포 티로시네이즈(Cell Tyrosinase)활성을 나타내는 그래프
A : MEB 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물
B : 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물
도 8은 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물의 농도별 세포 티로시네이즈(Cell Tyrosinase) 활성분석을 나타내는 그래프
본 발명은 생리활성을 갖는 버섯균사체의 배양물에 관한 것이다.
선인장은 쌍떡잎식물 선인장목 선인장과에 속하는 식물로서, 변비치료, 이뇨작용, 장운동의 활성화, 해열과 해독작용이 뛰어난 것으로 알려져 있다.
그 중, 손바닥 선인장(Opuntia ficus-indica var. saboten)은 선인장과(Cactaceae)에 속하는 열대성 식물로 우리나라의 제주도 등지에서 자생하고 있는 귀화식물로서, 재배 단가가 적고, 쓸모없는 불모지인 돌밭에서 주로 재배되며 경작시 비료나 농약 등의 처리가 필요하지 않는 장점이 있다.
따라서, 손바닥 선인장을 이용한 기능성 식품 개발 뿐만 아니라 나아가서는 의약품 산업으로도 그 응용성이 크므로 많은 연구가 필요한 실정이다.
한국등록특허공보 특0173167(선인장의 잎으로부터 수용성 다당류를 배양하는방법)에는, 선인장으로 수용성 다당류를 배양하는 방법에 관한 것이 공개되어 있다.
한국등록특허공보 10-0272756(손바닥 선인장배양물을 함유하는 음료의 제조 방법)에는, 손바닥 선인장의 열매 또는 줄기를 선별하여 수세, 절단, 마쇄하고, 코니칼 타입의 스크루 프레스를 이용하여 손바닥 선인장 배양물을 배양한 후, 균질, 가열, 여과공정을 거쳐 얻어진 손바닥 선인장 열매 또는 줄기 배양물을 함유하는 음료 및 그 제조방법에 관한 것이 공개되어 있다.
또, 한국등록특허공보 10-0344098(분말형태의 손바닥 선인장을 함유한 투명비누의 제조방법)에는, 투명비누를 제조하는 방법에 있어서 글루코오스 및 솔비톨 중에서 선택된 단독 또는 혼합물의 당선분을 첨가하여 선인장 특유의 점질성을 제거한 분말형태의 손바닥 선인장을 투명비누 베이스에 첨가하여 투명비누를 제조하는 방법에 관한 것이 공개되어 있다.
그러나, 상기와 같이 선인장 추출물이나 손바닥 선인장 추출물은 오래전부터 많이 이용되었으나, 손바닥 선인장의 점질물로 인해 식품 및 음료 제조시 문제점이 발생하였으나, 이를 해소하기 위한 연구는 미흡한 실정이다.
본 발명의 목적은 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 항산화 활성, 항염 활성, 항암 활성, 미백 효과가 우수한 생리활성을 갖는 버섯균사체의 배양물을 제공하는데 있다.
본 발명은 생리활성을 갖는 버섯균사체의 배양물에 관한 것이다.
본 발명의 버섯균사체 배양용 배지 제조시, 손바닥 선인장 열매와 손바닥 선인장 줄기를 준비한 후, 각각 분쇄하여 분쇄한 손바닥 선인장 열매와 분쇄한 손바닥 선인장 줄기를 1 : 1 ~ 1 : 9의 중량비율로 혼합하여 혼합물 1을 제조한 후, 혼합물 1에 중량대비 0.01 ~ 10 중량 %의 가시오가피 추출물을 첨가하여 혼합물 2를 제조한 다음, 혼합물 2를 120 ℃에서 20 분간 멸균하여 버섯균사체 배양용 배지를 제조하는 것으로 구성된다.
또, 본 발명의 버섯균사체 배양용 배지 제조시, 손바닥 선인장 열매를 재료로 이용하여, 버섯균사체 배양용 배지를 제조하는 것으로 구성된다.
또, 본 발명의 버섯균사체 배양용 배지 제조시, 손바닥 선인장 뿌리를 재료로 이용하여, 버섯균사체 배양용 배지를 제조하는 것으로 구성된다.
또한, 버섯균사체 배양용 배지 제조시, 손바닥 선인장 열매와 손바닥 선인장이 1 : 1 ~ 1 : 9의 중량비율로 혼합된 분말을 구입하여 준비한 후, 준비한 분말에 중량대비 90 ~ 99 중량 %의 물을 첨가하여 혼합물 3을 제조한 다음, 혼합물 3에 중량대비 0.01 ~ 10 중량 %의 가시오가피 추출물을 첨가하는 혼합물 4를 제조한 후, 혼합물 4를 120 ℃에서 20 분간 멸균하여 버섯균사체 배양용 배지를 제조하는 것으로 구성된다.
또한, 상기의 가시오가피 추출물은, 가시오가피 줄기와 가시오가피 뿌리를 준비한 후, 각각 동결건조한 후 각각 분쇄하여 혼합하여 혼합물을 제조한 후, 혼합물에 중량대비 10 배 중량의 에탄올 용액을 첨가하여 6 시간 동안 추출한 후, 감압 농축하여 수득한 농축액을 동결건조한 후, 분쇄하여 농축액을 분말화한 가시오가피 추출물을 제조하여, 버섯균사체 배양용 배지 제조시 이용한다.
또, 가시오가피 추출시, 가시오가피 줄기를 재료로 이용하여, 추출한 후, 버섯균사체 배양용 배지 제조시 이용한다.
또한, 또, 가시오가피 추출시, 가시오가피 뿌리를 재료로 이용하여, 추출한 후, 버섯균사체 배양용 배지 제조시 이용한다.
본 발명의 버섯균사체 배양방법은 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 버섯균사체를 접종하여 25 ℃에서 10 일간 배양한다.
또한, 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물을 그대로 또는 진공건조 후, 잔여 수분을 동결건조시켜 분말로 제조한 후, 이를 이용하여 식품첨가제를 제조한다.
또, 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물을 그대로 또는 희석하여 제조한 후, 이를 이용하여 음료조성물을 제조한다.
본 발명의 주 재료인 손바닥 선인장(Opuntia ficus-indica var. saboten)은 제주도 지정 기념물 제35로서, 제주도 해안에 착생되어 제한적으로 분포하는 지역 고유종으로 분포지 내에서 자연상태 그대로 생육하고 있다.
손바닥 선인장은 자원 식물학적으로는 열매와 줄기에 저장 전분을 많이 함유하고 있으며, 재배단가가 매우 적어서 앞으로 자원식물로서 활용 가능성이 높은 식물로 알려져 있다.
또한, 가시오가피는 두릅나무과에 속하는 낙엽활엽관목으로서, 특히 가시오가피의 뿌리부분은 방사능을 비롯한 갖가지 화학물질의 독을 풀어 주고, 혈액 속의 콜레스테롤을 낮추며, 혈당치를 낮추고, 신경장애를 치료할 뿐만 아니라, 지구력과 집중력을 키워주고, 뇌의 피로를 풀어주며, 눈과 귀를 밝게 하고 성기능을 높이며, 모든 신체의 기능에 활력을 주고 온갖 질병을 예방하는 등의 효능이 있다고 알려져 있습니다.
본 발명에서 이용한 버섯균사체의 균주로는 신령버섯(Agaricus blazei M.), 영지버섯(Ganoderma lucidum), 장수버섯(Formitella fraxinea), 잎새버섯(Grifola frondosa), 노루궁뎅이버섯(Hericium erinacium), 표고버섯(Lentinula edodes), 상황버섯(Phellinus linteus), 낙옆송충버섯(Phellinus pini), 차가버섯(Inonotus obliquus), 목이버섯(Auricularia auricula-judae), 흰목이버섯(Fremella fuciformis), 큰갓버섯(Lepiota procera), 뽕나무버섯(Armillariella mellea), 운지버섯(Coriolus versicolor)등 이다.
본 발명은 손바닥 선인장을 이용하여 버섯균사체 배양용 배지를 제조한 후, 제조된 배지에 상기의 버섯균사체를 배양하는데 목적을 두고 연구를 하였다.
또한, 상기의 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물을 제조하여, 제조된 배양물이 식품용, 음료용, 건강기능성 식품의 원료용 또는 첨가물용 조성물로서의 이용가능성을 모색하는데 목적을 두고 연구를 하였다.
손바닥 선인장 열매 및 줄기를 분쇄하여 분쇄액을 제조하거나 분말화 된 손바닥 선인장 열매 및 줄기를 가수하여 제조한 후, 가시오가피 추출물을 첨가한 다 음, 멸균하여 버섯균사체 배양용 배지를 제조한 후, 제조된 배지에 버섯균사체를 배양하여 버섯균사체 생장량의 변화를 측정하였다.
그 결과, 손바닥 선인장을 이용하여 버섯균사체 배양용 배지 제조시, 손바닥 선인장으로 인해 발생하는 점질물을 버섯균사체가 상기의 배지에서 배양되면서 제거해 주었다.
또한, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지가 버섯균사체 배양 기질로서 매우 우수한 자원으로 이용가능함을 보여주었다.
상기의 배양한 버섯균사체의 배양물을 극성이 다른 2가지 용매(물, 에틸아세테이트)로 분획하여 물 분획층과 에틸아세테리트 분획층으로 분리한 후, 분리된 분획물의 폴리페놀 화합물 함량, DPPH에 의한 수소공여능 측정과 수퍼옥사이드 유리기의 소거활성, 크산틴산화효소 활성억제 효과 및 세포독성 등의 생리활성을 측정하였다.
그 결과, 상기의 분리된 분획물들 중 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물의 분획물에서 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다.
또, 배양한 버섯균사체의 배양물의 분획물을 사람의 간암세포주의 일종인 HepG2 세포주에 처리하여 세포의 생존능을 조사하였는데, 그 결과 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물의 분획물이 H2O2에 의해 유도되는 세포사멸 현상을 억제함을 나타내었다(도 3,4).
또, 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포로부터의 LPS 자극에 의한 NO의 형성억제효과를 알아본 결과, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물의 분획물에서 NO의 생성량이 현저히 저해함을 나타냈다.
또, 백혈병 환자에서 유래한 HL-60과 Jurkat 세포의 대사활성을 측정한 결과, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물의 분획물에서 비교적 높은 세포증식 억제 효과를 나타냈다(도 5,6).
또한, 쥐(Mus musculus)의 melanoma cell line 중 B16/F10 cell을 이용하여 세포내 티로시네이즈 활성을 분석한 결과, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물의 분획물에서 높은 티로시네이즈 활성 저하 효과를 나타냈다(도 7,8).
이하, 본 발명의 생리활성을 갖는 버섯균사체의 배양물에 대하여 실시예와 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 가시오가피 추출물 제조
가시오가피 줄기와 뿌리를 제주 지역 농장에서 수확하였다.
가시오가피 줄기 500 g과 뿌리 500 g을 각각 동결건조 한 후, 각각 분쇄기를 이용하여 30 mesh 크기로 분쇄하였다.
가시오가피 줄기 분쇄물 250 g과 가시오가피 뿌리 분쇄물 250 g을 혼합하였다.
혼합물에 70 % 에탄올 5 ℓ를 넣어 6 시간동안 침적하였다.
에탄올 침적물을 여과기를 이용하여 잔사를 제거한 후, 여액 4 ℓ를 회수하였다.
회수된 여액을 감압농축하여 농축액을 제조하였다.
농축액을 동결건조한 후 30 mesh 크기로 분쇄하여, 본 발명에 이용되는 가시오가피 추출물 500 g을 제조하였다.
<실시예 2> 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지 제조 1
북제주군 한림읍 월령리 해안에서 생육하고 있는 손바닥 선인장 열매와 줄기 를 수확하였다.
손바닥 선인장 열매 1 kg과 손바닥 선인장 줄기 3 kg을 각각 분쇄기를 이용하여 30 mesh 크기로 분쇄한 후, 혼합하여 혼합물 1을 제조하였다.
1 ℓ의 혼합물 1에 실시예 1에서 제조된 가시오가피 추출물 10 g을 넣어 혼합물 2를 제조하였다.
혼합물 2를 120 ℃에서 20 분간 멸균한 후, 상온에서 식혀서 버섯균사체 배양용 배지를 제조하였다.
<실시예 3> 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지 제조 2
본 발명의 실시예 2와 동일한 방법으로 버섯균사체 배양용 배지를 제조하되, 손바닥 선인장 열매 1 kg과 손바닥 선인장 줄기 7 kg을 각각 분쇄하여 이용하고, 가시오가피추출물 20 g을 사용하여 제조하였다.
<실시예 4> 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지 제조 3
본 발명의 실시예 2와 동일한 방법으로 버섯균사체 배양용 배지를 제조하되, 손바닥 선인장 열매 1 kg과 손바닥 선인장 줄기 8 kg을 각각 분쇄하여 이용하고, 가시오가피추출물 30 g을 사용하여 제조하였다.
<실시예 5> 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지 제조 4
북제주군 한림읍 월령리에서 손바닥 선인장 열매분말 과 손바닥 선인장 줄기분말이 1 : 5 비율로 섞인 분말을 구입하여 준비하였다.
분말 100 g에 물 1 ℓ를 혼합하여 혼합물 3을 제조하였다..
혼합물 3에 실시예 1에서 제조된 가시오가피 추출물 5 g을 넣어 혼합물 4를 제조하였다.
혼합물 4를 120 ℃에서 20 분간 멸균한 후, 상온에서 식혀서 버섯균사체 배양용 배지를 제조하였다.
<실시예 6> 손바닥 선인장를 이용한 버섯균사체 배양용 배지를 이용한 버섯균사체 배양
본 발명의 실시예 2에 의해 제조된 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지 20 개를 준비하였다.
버섯균사체로는 신령버섯(Agaricus blazei), 잎새버섯(Grifola frondosa), 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum), 차가버섯(Innonotus obliquus), 상황버섯(Pellinus linteus)을 준비하였다.
준비된 배지에 상기의 버섯균사체를 각각 3 %(v/v)를 접종하여 25 ℃에서 10 일간 버섯균사체를 배양하였다.
<비교예 1> 기본배지를 이용한 버섯균사체 배양
본 발명의 실시예 6와 동일한 방법으로 버섯균사체의 배양물을 제조하되, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지 대신 기본배지(MEB ; Malt Extract Broth)를 이용하여 제조하였다.
<실시예 7> 본 발명의 배양된 버섯균사체의 배양물을 이용한 식품첨가제 제조
본 발명의 실시예 6에서 제조한 버섯균사체의 배양물을 준비하였다.
준비한 버섯균사체의 배양물 100 ㎖를 진공건조한 후, 남은 잔여 수분 제거를 위해 동결건조시켜 분말화하여 식품첨가제인 버섯균사체의 배양물 5 g을 제조하였다.
<실험예 1> 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지의 버섯균사체 배양기질로서의 평가
실시예 5에 의해 제조된 버섯균사체 배양용 배지에 상황버섯(Pellinus linteus)균사체를 배양하여, 생장량(건조중량)의 경시적 변화를 아래의 표 2에 나타내었다.
표 2. 배지종류에 따라 생장한 상황버섯균사체의 건조중량
배양일(일) 0 1 2 3 4 5 6 7 8
실시예 3의 배지에서 생장한 버섯균사체 건조중량(g/100 ㎖) 0 0.18 0.40 0.71 1.20 1.90 2.1 2.4 2.4
비교예 1의 배지에서 생장한 버섯균사체 건조중량 (g/100 ㎖) 0 0.09 0.12 0.15 0.30 0.71 0.92 1.25 1.30
실시예 5에 의해 제조된 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 상황버섯균사체의 생장이 표 2에 나타나와 있는 것과 같이 비교예 1에 의해 제조된 기본배지에서 배양한 상황버섯균사체보다 월등한 촉진적인 효과를 나타내었다.
따라서, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지는 버섯균사체 배양기질로서 매우 우수한 자원으로 활용가능함을 나타내었다.
<실험예 2> 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물의 점질물 분해실험
1. 실험방법
실시예 5에 의해 제조된 버섯균사체 배양용 배지 4 개를 준비하였다.
준비된 배지에 상황버섯(Pellinus linteus)과 차가버섯(Innonotus obliquus) 균사체를 각각 접종한 후 8 일간 25 ℃에서 배양하였다.
대조구로 버섯균사체를 접종하지 않고 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지를 준비하였다.
배양된 버섯균사체의 배양물과 대조구로 준비한 버섯균사체 배양용 배지를 각각 원심분리법에 의해 여과하여 제거하고, 상등액을 에탄올을 이용하여 점질물을 각각 추출하였다.
버섯균사체의 배양물 1 ℓ에 함유된 점질물의 농도는 6.1 g/ℓ 이었다.
버섯균사체 배양용 배지 1 ℓ에 함유된 점질물의 농도는 20 g/ℓ이었다.
추출된 점질물의 함유량을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 자세히 분석하였다.
2. 실험결과
자세히 분석한 결과를 도 2에 나타내었다.
점질물의 RT는 시료별로 다소의 차이는 있었으나 버섯균사체 배양용 배지에서는 6.2333 min, 상황버섯균사체 처리구에서는 6.083 min, 차가버섯균사체 처리구에서는 6.133 min으로 나타났다.
점질물 피크의 면적을 이용하여 상대적인 함량을 보면, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 차가버섯균사체 처리구시 35.7 %, 상황버섯균사체 처리구시 65.5 %의 점질물이 감소되었다.
선인장 용액 중 함유된 점질물은 외관적으로 끈끈한 상태에 있으나, 버섯균사체 처리에 의해 상당한 부분까지 분해되어 차가버섯균사체 처리구에서도 외관적 으로는 끈끈한 정도가 거의 소멸된 상태에 도달하였다.
따라서, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지 제조시, 손바닥 선인장으로 인해 발생하는 점질물을 버섯균사체가 상기의 배지에서 배양되면서 점질물을 분해해 줌을 나타내었다.
<실험예 3> 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물이 함유하고 있는 폴리페놀 화합물의 함량분석
페놀성물질은 식물계에서 널리 분포되어 있는 2 차 대사산물의 하나로 다양한 구조와 분자량을 가진다.
이들은 페놀 하이드록시(phenolic hydroxyl)기를 가지기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들고 결합하는 성질을 가지며, 항산화 효과 등의 생리활성 기능도 가진다(Yinrong Lu and L. Yeap Foo (2001) Antidxidant activity of polyphenols from sage(Salvia officinalis). Food chemistry. 75, 197-202).
따라서, 다음과 같이 배양한 버섯균사체의 배양물이 함유하고 있는 폴리페놀 화합물의 함량을 측정하였다.
1. 실험재료준비
실시예 6과 비교예 1에 의해 배양된 버섯균사체의 배양물 60 ℓ를 물(1 ℓ × 3)과 에틸아세테이트(1 ℓ × 3)로 각각 추출하여 각각의 분획물을 얻어 실험에 사용하였다.
각각의 시료들은 사용한 배지종류와 버섯균사체 종류에 따라 임의로 코드화 하여 아래의 표 1에 나타내었다.
표 1. 사용한 배지종류와 버섯균사체 종류에 따른 코드화
Code names samlpes
medium mushroom mycellium fermented extacts
CAA CAB CGA CGB CHA CHB CIA CIB CPA CPB Cactus broth(실시예2) Cactus broth(실시예2) Cactus broth(실시예2) Cactus broth(실시예2) Cactus broth(실시예2) Cactus broth(실시예2) Cactus broth(실시예2) Cactus broth(실시예2) Cactus broth(실시예2) Cactus broth(실시예2) 신령버섯(Agaricus blazei) 신령버섯(Agaricus blazei) 잎새버섯(Grifola frondosa) 잎새버섯(Grifola frondosa) 노루궁뎅이버섯(hericium erinaceum) 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum) 차가버섯(Innonotus obliquus) 차가버섯(Innonotus obliquus) 상황버섯(Pellinus linteus) 상황버섯(Pellinus linteus) 물 에틸아세테이트 물 에틸아세테이트 물 에틸아세테이트 물 에틸아세테이트 물 에틸아세테이트
MAA MAB MGA MGB MHA MHB MIA MIB MPA MPB ME broth(비교예1) ME broth(비교예1) ME broth(비교예1) ME broth(비교예1) ME broth(비교예1) ME broth(비교예1) ME broth(비교예1) ME broth(비교예1) ME broth(비교예1) ME broth(비교예1) 신령버섯(Agaricus blazei) 신령버섯(Agaricus blazei) 잎새버섯(Grifola frondosa) 잎새버섯(Grifola frondosa) 노루궁뎅이버섯(hericium erinaceum) 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum) 차가버섯(Innonotus obliquus) 차가버섯(Innonotus obliquus) 상황버섯(Pellinus linteus) 상황버섯(Pellinus linteus) 물 에틸아세테이트 물 에틸아세테이트 물 에틸아세테이트 물 에틸아세테이트 물 에틸아세테이트
2. 실험방법
폴리페놀 화합물의 함량은 Folin-Denois 법(Gutfinger, T : Polyphenols in olive olis. J. Am, Oil Chem. Soc., 58, 966 - 968(1981))을 약간 변형시켜 측정하였다.
즉, 배양된 버섯균사체의 배양물을 각각 1 mg/㎖로 녹인 다음 0.2 ㎖를 시험관에 취하고 증류수를 가하여 2 ㎖로 만든 후, 여기에 0.2 ㎖ Folin-ciocalteu's phenol reagent (Sigma)를 첨가하여 잘 혼합한 후 3 분간 실온에 방치하였다.
3 분 후 2 M Na2CO3용액 0.4 ㎖를 가하여 혼합하고 증류수를 첨가하여 4 ㎖ 로 만든 후, 실온에서 1 시간 방치하여 상징액을 725 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Tannic acid 표준곡선을 이용하여 배양된 버섯균사체의 배양물이 함유하는 총 폴리페놀 함량을 측정하였다.
3. 실험 결과
배양된 버섯균사체의 배양물이 함유하는 폴리페놀 화합물 함량을 분석한 결과, 총 폴리테놀 함량이 높게 검출된 시료로는 CAB 11.70 %, CGB 22.75 %, CHB 11.14%, CIB 14.85 %, CPB 17.67 %이었으며, 그 중 가장 높은 폴리페놀 함량을 보인 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물은 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 상황버섯균사체의 배양물의 분획물이었다.
배지별로 비교해 보면 기본배지인 MEB배지에서 배양했을 때보다 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물에서 특이적으로 폴리페놀 함량이 3 ~ 4배 정도 증가되었다.
또한, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물 중 물 분획물에서보다 에틸아세테이트 분획물에서 높은 폴리페놀함량이 검출되었다.
<실험예 4> 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물에 대한 항산화 활성 실험
항산화 물질의 가장 특징적인 기작은 유리기와 반응하는 것으로 유리기 소거 작용은 자유 유리기(free radical)에 전자를 공여하여 식물 중의 항산화 효과나 인체에서 노화를 억제하는 척도로 사용된다.
DPPH는 안정한 유리기로 cysteine, glutathione과 같은 함유황 아미노산과 ascorbic acid, aromatic amine(ρ-phenylenediamine, ρ-aminophenol)등에 의해 환원되어 탈색되므로 항산화 물질의 항산화능 측정에 많이 이용되고 있다 (Blois, M.S. 1958, Antioxidant determination by the use a stable free radical, Nature 26 : 1199 - 1200).
따라서, 다음과 같이 배양된 버섯균사체의 배양물에 대한 항산화 활성실험을 하였다.
1. 실험재료준비
실시예 6과 비교예 1에 의해 배양된 버섯균사체의 배양물 60 ℓ를 물(1 ℓ × 3)과 에틸아세테이트(1 ℓ × 3)로 각각 추출하여 각각의 분획물을 얻어 실험에 사용하였다.
2. 전자공여능 측정
전자공여능(electron donating ability) 측정은 Blosis 방법(Blois, M. S. 1958. Antioxidant determination by the use a stable free radical. Nature 26 : 1199 - 1200)에 의한 DPPH 유리기 소거법에 따라 측정하였다.
즉, 메탄올에 녹인 시료의 각각의 농도를 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하 고 0.4 mM DPPH용액을 동량 첨가하여 실온에서 10 분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
DPPH 유리기 소거활성은 아래의 식으로부터 산출하였고, DPPH의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였으며, 각 시료는 3 회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
[DPPH radical 소거활성(%) = (Acontrol - Asample)/Acontrol × 100]
* Acontrol 는 시료를 첨가한 반응액의 흡광도임.
* Asample 는 시료 대신 메탄올을 첨가한 반응액의 흡광도임.
상기의 방법으로, DPPH의 자유 유리기(free radical) 소거활성으로 배양된 버섯균사체의 배양물에 대한 항산화 활성을 측정한 결과, 기본배지인 MEB배지에서 배양했을 때보다 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물에서 비교적 높은 radical 소거 활성을 나타냈으며, 그 중 배양된 신령버섯균사체의 배양물의 분획물에서 IC50 값이 362.9 ㎍/㎖로 제일 높은 radical 소거활성을 보여주었다.
3. 크산틴산화효소 억제 및 수퍼옥사이드 유리기 소거활성 측정실험
크산틴산화효소(Xanthine oxidase)는 산화적 환경에서 xanthine dehydrogenase로부터 생성된다.
Xanthine oxidase는 hypoxanthine을 산화시켜 최종적으로 요산(uric acid)과 산소를 생성하며 산소유리기와 수소과산화기가 이 산소로부터 발생하게 된다.
요산의 축적은 고요산혈증과 통풍을 유발하는 것으로 알려져 있으므로 요산형성의 억제제가 이들 질환을 위한 치료 물질로서 유용할 것이다.
게다가, 크산틴산화효소에 의해 생성된 산소유리기는 세포의 손상을 초래한다고 알려져 있다.
그러므로, 산소 유리기를 소거할 수 있는 물질 또는 산화적 손상의 예방에 유용할 것이다.
따라서, 버섯균사체의 배양물의 분획물에 대한 크산틴산화효소(Xanthine oxidase) 저해효과를 알아보았다.
Xanthine/xanthime oxidase에 의한 요산 생성은 290 nm에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였고, 수퍼옥사이드의 양은 nitroblue tetrazolium (NBT) 환원방법에 의해 측정하였다(Cheng, Z. J., S. C. Kuo, S. C. Chan, F. N. Ko, and C. M. Teng. 1998. Antioxidant properties of butein isolated from Dalbergia odorifera. Biochim. Biophys. Acta, 1392 : 291-299).
반응액은 각 시료의 여러농도와 0.5 mM xanthine와 1 mM EDTA를 200 mM phosphate buffer (pH 7.5) 100 ㎕에서 준비하였고, 50 mU/㎖ xanthine oxidase를 첨가하여 uricacid의 생성을 유도하였다.
크산틴산화효소(Xanthine oxidase) 억제활성은 각각 생성된 요산(uric acid)의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였다.
배양된 버섯균사체의 배양물에 대한 크산틴산화효소 활성억제 효과를 측정한 결과, 기본배지인 MEB배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물보다 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물에서 비교적 높은 크산틴산화효소(Xanthine oxidase) 활성억제를 나타났다.
특히, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 에틸아세테이트 분획물에서 그 효과가 두드러지게 나타났다.
배양된 신령버섯균사체, 잎새버섯균사체, 노루궁뎅이버섯균사체, 차가버섯균사체, 상황버섯균사체의 배양물의 분획물 중에서는 배양된 상황버섯균사체의 배양물의 분획물에서 IC50 값이 590.2 ㎍/㎖로 제일 높은 크산틴산화효소 활성억제를 보여주었다.
또한, 버섯균사체의 배양물의 분획물에 대하여 수퍼옥사이드 유리기 소거활성을 측정을 하였다.
정상적인 oxidative phosphylation의 과정동안 소모되는 전체 산소의 0.4 ~ 4 % 정도의 자유라디칼 수퍼옥사이드(free radical superoxide (·O2 -)로 전환되며 생성된 ·O2 -는 다른 활성산소물질(reactive oxygen species : ROS)로 전환되어 직 접적 또는 간접적으로 세포손상을 유발하는 것으로 알려져 있다.
정상적으로 ·O2 -는 내인성 항산화 방어기전에 의해 superoxide dismutase (SOD)에 의해 빠르게 과산화수소로 전환된다(Korycka-Dahl M, Richardson T, Hicks CL. Superoxide dismutase activity in bovine milk serum. J. Food Prot. 42 : 867 - 871(1979)).
그러나, 이 내인성 항산화 방어체계가 세포내 산화-환원 균형을 유지하는데에 문제가 생길 경우 결과적으로 산화스트레스가 일어나게 되며, 이 산화스트레스는 직접적으로 세포내 거대분자의 손상을 일으키거나 세포손상을 일으키는데 중요한 역할을 한다.
수퍼옥사이드(Superoxide) 소거활성은 위 반응액에 0.5 nm NBT를 첨가하여 반응 시켰다.
수퍼옥사이드(Superoxide)유리기 소거활성은 생성된 수퍼옥사이드의 흡광도 가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였다.
배양된 버섯균사체의 배양물에 대한 수퍼옥사이드 라디칼 소거 활성 효과를 측정한 결과, 기본배지인 MEB배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물보다 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물에서 비교적 높은 수퍼옥사이드 라디칼(Superoxide radical) 소거활성을 나타났다.
특히, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 에틸아세테이트 분획물에서 그 효과가 두드러지게 나타났다.
배양된 신령버섯균사체, 잎새버섯균사체, 노루궁뎅이균사체, 차가버섯균사체, 상황버섯균사체의 배양물의 분획물들 중에서는 배양된 차가버섯균사체의 배양물의 분획물에서 IC50 값이 18.52 ㎍/㎖로 제일 높은 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성을 보여주었으며, 크산틴산화효소 활성 억제 효과가 가장 높았던 상황버섯균사체의 배양물은 IC50값이 21.09 ㎍/㎖로 나타났다.
<실험예 5> 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양한 버섯균사체의 배양물이 HepG2 세포의 생존능에 미치는 효과실험
배양된 버섯균사체 배양물이 HepG2 세포의 생존능에 미치는 효과를 실험하기 위해 사람의 간암세포주의 일종인 HepG2 세포주에 처리하여 세포의 생존능을 조사하였다.
1. 실험재료준비
실시예 6과 비교예 1에 의해 배양된 버섯균사체의 배양물 60 ℓ를 물(1 ℓ × 3)과 에틸아세테이트(1 ℓ × 3)로 각각 추출하여 각각의 분획물을 얻어 실험에 사용하였다.
2. 세포배양
본 실험에서는 HepG2 세포를 영양결피배지(serum-free midium)에서 24 시간동안 배양한 후에 준비한 시료들을 농도군(0, 16, 32, 62, 125 ㎍/㎖)에 따라 1 시간동안 전처리 하고 그 다음으로 H2O2 (1 mM)를 24 시간 처리한 후에 세포 생존능의 변화를 조사하였다.
세포는 100 U/㎖ 페니실린(penicillin), 100 ㎍/㎖ 스트랩토마이신(streptomyci 10 % 우태아혈청(fetal bovine serum)이 포함된 Dulbecco's minimal essential medium(D-MEM)을 사용하여 5 % CO2와 37 ℃가 유지되는 배양기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3 ~ 4일에 한번씩 시행하였다.
3. MTT assay
MTT assaysms는 세포의 mitochondria의 활성을 측정하여 간접적으로 세포의 생존여부를 측정하는 방법으로서, 세포 배양 후 배양액을 제거하고 200 ㎕의 MTT reagent(Sigma)를 섞어 37 ℃에서 30 분 내지 1 시간 정도 반응시킨 후 반응액을 제거하고 200 ㎕의 이소프로파놀(isopropanol)을 첨가하여 발색반응을 유도하고 흡광도는 570 nm에서 측정하였다.
4. 실험결과
본 실험의 결과, 기본배지인 MEB배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분 획물과 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물 모두가 H2O2에 의해 증가한 세포독성을 대체적으로 완화시키는 경향을 나타내었다(도 3,4).
특히, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물들은 거의 대조구만큰 세포사멸을 보호하는 것처럼 나타났다.
이러한 결과는 각각의 버섯균사체의 배양물들이 H2O2에 의해 유도되는 세포사멸 현상을 농도 의존적으로 억제함으로서 세포보호 효과도 증대 시킬 수 있음을 나타내었다.
<실험예 6> 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물에 대한 항염활성 실험
내독소로 잘 알려진 LPS는 그람음성균의 세포외막에 존재하며, RAW264.7와 같은 마크로파지(macrophage) 또는 모노사이트(monocyte)에서 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 염증매개성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 증가시키는 것으로 알려져 있다
또한, 이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파아제(phospholipase) A2의 활성으로 인해 아라키도산(arachidonic acid)이 프로스타글라딘(prostagladin)으로 바뀌는 과정 및 NO형성 과정으로 이어지게 된다고 알려져 있다.
NO는 산화질소합성효소(NO synthase ; NOS)에 의해 엘아르기닌(L-arginine) 으로부터 생성되는 무기유리체로 면역반응, 세포독성, 신경전달계 및 혈관이완 등 여러 가지 생물학적인 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며 농도에 따라 세포 기능유지에 중요한 작용을 하기도 하고 세포독성을 일으키기도 한다고 알려져 있다.
NO를 생성하는 NOS는 세포내에 존재하여 칼슘(calcium)이나 칼모둘린(calmodulin)에 의존적인 구성형 산화질소합성효소(constitutive NOS ; cNOS)와 칼슘에 비의존적으로 대식세포나 혈관내피세포가 활성화되거나 지질다당류(lipopolysaccharide ; LPS)와 같은 세균의 내독소나 여러 가지 사이토킨(cytokine)에 의해 유도되는 형태인 유도형 산화질소합성효소(inducible NOS ; iNOS)의 두가지 형태가 있다
LPS 자극에 의해 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성하게 되며 이에 의한 세포독성은 염증반응, 세포의 돌연변이 및 종양 발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
염증반응과 관련된 조직 손상에서 NO와 iNOS의 발현이 증가되어 있음이 보고되어 있다.
이에 본 실험에서는 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포로부터의 LPS 자극에 의한 NO의 형성을 배양한 버섯균사체 배양물이 억제하는 효과를 나타내는 것에 대하여 알아보았다.
1. 실험재료준비
실시예 6과 비교예 1에 의해 배양된 버섯균사체의 배양물 60 ℓ를 물(1 ℓ × 3)과 에틸아세테이트(1 ℓ × 3)로 각각 추출하여 각각의 분획물을 얻어 실험에 사용하였다.
2. 세포배양
마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포는 KCLB(Korean Cell Line Bank)로 부터 분양 받아 100 units/㎖ 페니실린-스트랩토마이신과 10 % 우태혈청(fetal bovine serum ; FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3 ~ 4일에 한번씩 시행하였다.
지질다당류(LPS. E. coli serotype 0111 : B4)는 Sigma로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
3. 세포독성 실험
1) MTT ASSAY
RAW264.7 세포를 1.0 × 105 cells/㎖의 농도로 48 well plate의 각 well에 넣고 24 시간 배양 후, 시료를 농도별로 첨가하였다.
이를 24 시간 배양한 다음, MTT(3-(4,5-dimehtylthiaxol)-2,5-diphenyltetrazolium bomide, Sigma) 100 ㎍을 첨가하고 3 시간 동안 더 배양하였다.
배지를 제거한 다음, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide ; DMSO, Sigma) 150 ㎕를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 포마즌(formazan) 침전물을 용해시킨 후 분광광도계(microplate reader)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도값과 비교하여 성장억제정도를 조사하였다.
4. NO 생성 억제률 측정
RAW264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.0 × 105 cells/㎖로 조절한 후 48 well plate 에 접종하고, 시험물질과 LPS (100 ㎍/㎖)를 동시에 처리하여 24 시간 배양하였다.
생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다.
세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess시약 [1 % (w/v) sulfanilamide, 0.1 % (w/v) naphylethylenediamine in 2.5 % (v/v) phosphoric acid] 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10 분 동안 반응시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정하였다.
생성된 NO의 양은 sodium nitrite(NaNO2)를 standard로 비교하였다.
5. 실험결과
본 발명의 배양된 버섯균사체의 배양물에 대한 항염활성을 측정한 결과, RAW264.7 에서의 세포독성에 대하여 기본배지인 MEB배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물들 중 본 실험에 사용된 농도에서는 거의 세포독성을 나타내지 않았으며, NO의 형성억제 효과도 거의 나타나지 않았다.
그러나, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물은 고농도로 처리시에는 다소 독성을 나타내었다.
이에 NO 생성 억제 효과를 세포독성이 나타나지 않는 농도로 처리하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 - 의 형태로 측정하였다.
그 결과, LPS단독 처리군에서는 NO가 과량 생성되는 것을 확인할 수 있었으며, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물을 동시에 처리한 시험구에서는 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소됨을 확인할 수 있었다.
특히, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 에틸아세테이트 분획물이 저농도로 처리시에도 NO의 생성량이 현저히 저해됨을 볼 수 있었다.
손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 에틸아세테이트 분획물의 IC50 값은 CAB(IC50 = 99.9 ㎍/㎖), CGB(IC50 = 43.8 ㎍/㎖), CHB(IC50 = 77.1 ㎍/㎖), CIB(IC50 = 72.2 ㎍/㎖), CPB(IC50 = 49.2 ㎍/㎖)로 나타났다.
또한, 이들의 therapeutic index를 구해 보았는데, 대부분의 6.9 ~ 14.6으로 거의 비슷한 값을 나타냈으나 그 중 CPB가 14.6로 가장 높게 나타났으며, 전반적으로 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물에서 항염증 효과가 기본 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물보다 우수하게 나타났다.
<실험예 7> 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물에 대한 항암활성 실험
1. 실험재료준비
실시예 6과 비교예 1에 의해 배양된 버섯균사체의 배양물 60 ℓ를 물(1 ℓ × 3)과 에틸아세테이트(1 ℓ × 3)로 각각 추출하여 각각의 분획물을 얻어 실험에 사용하였다.
2. 세포배양
급성 전골수성 백혈병 환자에서 유래한 HL-60 세포주와 Jurkat를 한국 세포주은행(KCLB)으로부터 분양받아 각각 100 units/㎖ 의 penicillin-streptomycin(GIBCO)과 10 % fetal bovine serum(FBS, GIBCO)가 함유된 RPMI 1640 배지(GIBCO)를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3 ~ 4일에 한번씩 시행하였다.
3. 세포의 대사활성 측정
손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 HL-60과 Jurkat 세포 대사활성을 측정하여 세포의 증식억제성을 알아보았다.
HL-60 세포(2.5 × 105/㎖)와 Jurkat 세포(2.5 × 105/㎖)를 각각 96 well plate의 각 well에 넣고, 시료를 농도별로 첨가하였다.
이를 4 일간 배양한 다음, 3-(4,5-dimehtylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma) 100 ㎍을 첨가하고 4 시간 동안 더 배양하였다.
Plate를 1000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 조심스럽게 배지를 제거한 다음, dimethylsulfoxide(DMSO, Sigma) 150 ㎕를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시킨 후 microplate reader(BIO-TEK INSTRUMENIS. INC)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 성장억제정도를 조사하였다.
4. Analysis for DNA fragmentation
HL-60 세포(2.5 × 105/㎖)와 Jurkat 세포(2.5 × 105/㎖)에 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물을 처 리한 다음 48 시간 동안 배양하였다.
세포를 수집한 후 Promega Wizard® Genomic DNA Purification Kit를 사용하여 DNA를 분리하였다.
분리한 DNA를 1.5 % agarose gel에서 30 분(100 V)동안 전기영동을 한 다음 ehidium bromide로 염색하고 UV transilluminator하에서 DNA단편화 현상을 관찰하였다.
5. 핵의 형태학적 변화(Morphological changes)측정
세포사멸의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위해 DNA 특이적으로 결합하는 형광 염색액인 DAPI를 사용하여 DNA를 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다.
즉, HL-60 세포(2.5 × 105/㎖)와 Jurkat 세포(2.5 × 105/㎖)에 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물을 처리한 다음, 48 시간 동안 배양하였다.
세포를 수집하고 PBS(phosphate-buffered saline) 용액으로 2 회 세척한 후에, 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 1 ㎖를 가하여 실온에서 1 시간 동안 고정하였다.
세포를 고정시킨 다음, PBS로 2 회 세척하고 2.5 ㎍/㎖의 DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole, Sigma) 용액을 가하여 상온에서 30 분간 염색하였다.
이를 다시 PBS로 2 회 세척한 후, 형광현미경으로 관찰하였다.
6. 세포주기 분석(Cell cycle analysis)
HL-60 세포(2.5 × 105/㎖)와 Jurkat 세포(2.5 × 105/㎖)에 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물을 각각 처리한 다음, 48 시간 동안 배양한 후, HL-60 세포와 Jurkat 세포를 수획하여 PBS로 각각 세척하였다.
HL-60 세포와 Jurkat 세포를 -20 ℃에서 70 % 에탄올로 30 분동안 고정시킨 후, PBS로 세척하고, RNase A를 처리한 다음에 propidium iodide (PI, Sigma)로 염색하고, Flow Cytometer (FACS Calibur. BD Bioscience. USA)로 세포주기를 분석하였다.
7. 실험결과
도 5, 6에서 보듯이 기본배지인 MEB배지에서 버섯균사체 배양했을 때보다 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물이 비교적 높은 세포증식 억제효과를 보였다.
또한, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 물 분획물보다는 에틸아세테이트 분획물에서가 세포 증식 억제 효과가 두드러지게 나타났다.
그 중 세포 증식억제 효과가 가장 좋은 균사체로는 잎새버섯균사체와 상황버섯균사체로 나타났으며, 이들의 세포 증식 억제률이 80 % 이상 나타났다.
<실시예 8> 본 발명의 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물에 대한 미백효과 실험
1. 실험재료준비
실시예 6과 비교예 1에 의해 배양된 버섯균사체의 배양물 60 ℓ를 물(1 ℓ × 3)과 에틸아세테이트(1 ℓ × 3)로 각각 추출하여 각각의 분획물을 얻어 실험에 사용하였다.
2. 세포내 티로시네이즈 활성분석
쥐(Mus musculus)의 melanoma cell line중 B16/F10 cell을 6 well plate에 well당 5 × 104 cells/㎖이 되게 준비한 후, 배양된 버섯균사체의 배양물을 각각 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다.
72 시간 동안 37 ℃ CO2 항온기에서 배양하였으며 36 시간이 지난 후, 배지교체와 동시에 시료를 다시 처리하였다.
세포를 트립신(trypsin)-EDTA를 이용하여 수확했다.
이렇게 수확된 세포에 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)와 1 % Triton X-100을 함유한 50 mM Sodium phosphate buffer(pH 6.8)를 500 ㎕ 처리하고 sonication하였으며, 이 상태로 1 시간동안 얼음에서 보관하였다.
1 시간 후, 4 ℃ 원심분리기에서 15,000 rpm으로 20 분간 원심분리하였으며 상층액을 취하여 세포내 tyrosinase 활성분석에 사용했다.
세포내 티로시네이즈(tyrosinase) 활성분석은 세포내에 존재하는 티로시네이즈의 작용결과 생성되는 DOPA chrome을 잴 수 있는 미색법에 의해 측정했다.
120 ㎕의 67 mM Sodium phosphate buffer(pH 6.8)에 기질로서 5 ㎕의 1.5 mM L-tyrosine과 40 ㎕의 25 mM L-DOPA를 혼합한 후 위에서 얻은 상층액 100 ㎕를 처리하여 37 ℃ 항온기에서 30 분간 반응시켰다.
반응액 중에 생성된 L-DOPA와 DOPA chrome을 475 nm와 490 nm에서 측정하여 대조구를 기준으로 상대적인 활성을 나타내었다.
3. 실험결과
도 7, 8에서 보듯이 세포내 티로시네이즈 활성을 분석한 결과, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지에서 배양된 버섯균사체의 배양물의 분획물 중 에틸아세테이트 분획물이 세포내 티로시네이즈 활성저하 양상이 나타났음을 알 수 있었고, 이를 바탕으로 하여 에틸아세테이트 분획물에 대해서 25 ~ 100 ㎍/㎖의 시료 농도 영역에서 농도의존적 세포내 티로시네이즈 활성저하 양상을 관찰하였다(도 7,8).
시료농도 100 ㎍/㎖에서 지표물질인 Arbutin보다 더 많은 활성저하양상을 보인 배양물은 CGB와 CHB였으며, 이 둘의 DPPH 라디칼 제거능과 폴리페놀함량 측정치 를 비교해보면 CGB의 IC50이 362.9 ㎍/㎖로 DPPH 라디칼 제거능이 CHB보다 좋은 것으로 나왔고, 폴리페놀함량도 CGB가 22.75%로 CHB보다 더 많이 함유되어 있는 것으로 나타났다.
따라서 CGB 배양물의 세포내 티로시네이즈 활성저하 효과는 폴리페놀 화합물에 의한 항산화 효과에 의한 것으로 생각되며, CHB 배양액의 세포내 티로시네이즈 활성저하 효과는 항산화효과에 의한 것이라기 보다는 세포내 티로시네이즈 자체 또는 그 보다 상위의 전사요소인 MITF 또는 USF-1에 대한 억제작용 또는 더 상위에 존재하는 MAP kinase인 ERK1/2 또는 p38의 발현조절 가능성이 보였다.
본 발명에 의하여, 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체 배양용 배지가 제공된다.
또한, 본 발명에 의하여 항산화 활성, 항염 활성, 항암 활성, 미백 효과가 우수한 생리활성을 갖는 버섯균사체의 배양물이 제공된다.

Claims (9)

  1. 버섯균사체 배양용 배지의 제조방법에 있어서,
    손바닥 선인장 열매와 손바닥 선인장 줄기를 준비한 후,
    각각 분쇄하여 분쇄한 손바닥 선인장 열매와 분쇄한 손바닥 선인장 줄기를 1 : 1 ~ 1 : 9의 중량비율로 혼합하여 혼합물 1을 제조한 후,
    가시오가피 분쇄물에 에탄올을 첨가하여 추출한 후, 이를 농축한 다음, 분말화하여 가시오가피 추출물을 제조한 다음,
    제조된 혼합물 1에 상기 제조된 가시오가피 추출물을 혼합물 1의 중량대비 0.01 ~ 10 중량 %로 첨가하여 혼합물 2를 제조한 다음,
    혼합물 2를 120 ℃에서 20 분간 멸균하여 버섯균사체 배양용 배지를 제조하는 것으로 구성된,
    버섯균사체 배양용 배지의 제조방법.
  2. 버섯균사체 배양용 배지의 제조방법에 있어서,
    손바닥 선인장 열매 분말과 손바닥 선인장 줄기 분말을 1 : 1 ~ 1 : 9의 중량비율로 혼합한 다음,
    혼합한 분말에 분말의 중량대비 90 ~ 99 중량 %의 물을 첨가하여 혼합물 3을 제조한 다음,
    가시오가피 분쇄물에 에탄올을 첨가하여 추출한 후, 이를 농축한 다음, 분말화하여 가시오가피 추출물을 제조한 다음,
    제조된 혼합물 3에 상기 가시오가피 추출물을 혼합물 3의 중량대비 0.01 ~ 10 중량 %로 첨가하는 혼합물 4를 제조한 후,
    혼합물 4를 120 ℃에서 20 분간 멸균하여 버섯균사체 배양용 배지를 제조하는 것으로 구성된,
    버섯균사체 배양용 배지의 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    첨가하는 가시오가피 추출물은,
    가시오가피 줄기와 가시오가피 뿌리를 준비한 후,
    각각 동결건조한 후 분쇄하여 중량대비 1 : 1의 비율로 혼합하여 혼합물을 제조한 후,
    혼합물에 혼합물의 중량대비 10 배 중량의 에탄올 용액을 첨가하여 6 시간 동안 추출한 후,
    감압농축하여 수득한 농축액을 동결건조한 후, 분쇄하여 분말화한 가시오가피 추출물인 것이 특징인,
    버섯균사체 배양용 배지의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 제1항 내지 제3항 중 선택된 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 버섯균사체 배양용 배지를 이용하여 배양한,
    버섯균사체의 배양물.
  6. 제5항에 있어서,
    배양물 내의 손바닥 선인장 점질물이 감소된 것이 특징인,
    버섯균사체의 배양물.
  7. 제5항에 있어서,
    항산화 활성, 항염 활성, 항암 활성, 미백 효과를 나타내는 것이 특징인,
    생리활성을 갖는 버섯균사체의 배양물.
  8. 제5항에 있어서,
    식품첨가제, 음료조성물 중 선택된 1종에 사용되는 것이 특징인,
    생리활성을 갖는 버섯균사체의 배양물.
  9. 제5항에 있어서, 배양되는 버섯균사체는,
    신령버섯(Agaricus blazei M.), 영지버섯(Ganoderma lucidum), 장수버섯(Formitella fraxinea), 잎새버섯(Grifola frondosa), 노루궁뎅이버섯(Hericium erinacium), 표고버섯(Lentinula edodes), 상황버섯(Phellinus linteus), 낙옆송충버섯(Phellinus pini), 차가버섯(Inonotus obliquus), 목이버섯(Auricularia auricula-judae), 흰목이버섯(Fremella fuciformis), 큰갓버섯(Lepiota procera), 뽕나무버섯(Armillariella mellea), 운지버섯(Coriolus versicolor), 중에서 선택된 1종인 것이 특징인,
    버섯균사체의 배양물.
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