KR20010100218A - 인진의 부탄올 추출물 - Google Patents

Abstract

개시된 발명은 인진의 부탄올 추출물에 관한 것으로, 부탄올 분획물의 간세포보호효과가 분자생물학적인 방법, 즉 MTT 평가, 세포주기(Cell cycle) 평가, DNA 분절화(Fragmentation) 평가, Cpp32 프로테아제(Proease)평가 에서 증명되었다. 부탄올 분획물은 Fas 매개성 어팝토시스(Fas-mediated apoptosis)에 의한 각종 간질환, 특히 바이러스성 간질환에서 특별한 간세포보호효과가 있다.

Description

인진의 부탄올 추출물{Butanol fraction of Injin}

본 발명은 간질환 치료용 생약추출물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 인진의 부탄올 추출물에 관한 것이다.

우리나라에서 간질환의 대부분은 바이러스성 간염이다. 급성 바이러스성 간염의 60%, 만성 간질환 및 간암환자의 60∼70%가 HBsAg 양성이며, 만성 간염, 간경변증, 간암 환자의 antiHCV 발현빈도는 각각 27%, 20%, 17%로 나타난다. 또한 40∼50대의 사망원인중 각종 간질환이 1, 2위를 차지하고 있고 간암으로 인한 사망율은 세계보건통계연감에 발표된 나라중 가장 높은 것으로 나타났다. 따라서 현재 만연하고 있는 바이러스성 간질환에 대한 예방과 치료는 시급히 해결해야 할 사회적인 문제이다.

바이러스에 의한 세포손상은 바이러스의 직접적인 손상보다는 바이러스에 감염되었을 때 발생되는 면역응답의 결과가 주요기전으로 알려져 있다. 특히 HBV에 감염된 간세포에서 세포성 면역반응은 T helper 세포에 의해 항원이 인식되고cytotoxic T 세포에 의한 간세포 괴사로 종결되는 면역반응으로 HBV에 감염된 간세포를 파괴하여 간염이 유발됨과 동시에 세포로부터 HBV를 제거하는 단계이다. 그리고 이와 같은 감염세포의 제거기전은 아직까지 명확하지는 않으나 최근 cytotoxic T 세포가 유도하는 소위 Fas 매개성 apoptosis가 제시되고 있다(Lowin B. 등, Nature, 370: 650-652, 1994, Kagi D. 등 Science, 265: 528-30, 1994, 김창민, The Korean Journal of Hepatology, 2(2): 96-103, 1996. 등)

Apoptosis는 1972년 Kerr 등(Br J cancer, Vol. 26: 239-257, 1972.)에 의하여 정립되었는데 암, 바이러스성 질환, AIDS 등 여러 가지 질병의 진행에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며, 간질환에서도 간세포 증식, 재생, 간비대, 간위축 및 간암의 병리과정에 관계하고 있는 것으로 알려져 있다.(위 김창민 논문) 특히 B형 및 C형 바이러스성 간염에서 acidophilic body, piecemeal necrosis 부위의 병변의 정도는 Fas 매개성 apoptosis의 정도와 부합된다(SL Tsai and SN Huang, Journal of Gastroenterology and Hepatology(Suppl), S227-S235, 1997, Wyllie A. Br. J. Cancer, Vol. 67: 205-208, 1994, Solary E. 등, Eur Respir J, 9(6): 1293-305, 1996.)

실험적으로는 Fas 항체를 복강으로 주입하는 경우 전격성 간염이 발생하며(Ogasawara J.등 Nature, Vol. 364, 806-809, 1993.), HBsAg을 이용하여 만든 유전자변형 백서(transgenic mice) 실험모델에서 CTL(cytotoxic T 임파구)반응을 촉진하는 경우 전격성 간염이 발생하였다.

Apoptosis는 세포 위축, 염색체 압축을 특징으로 하는 새로운 형태의 세포사망으로 세포의 팽창, 세포막의 붕괴, 세포내 물질의 유출 등으로 인해 주위에 염증반응을 일으키는 괴사와는 다르며 손상되거나 불필요해진 세포를 생명체가 자발적으로 제거하여 생명체를 보존하기 위한 현상으로 밝혀지고 있다. 그리고 한때 apoptosis가 세포를 제거하는 역할을 강조하여 자기계획세포사(programmed cell death)라 알려져 왔지만 자기계획세포사 이외의 상황에서도 발생하여 자기계획세포사가 모두 apoptosis에 의해 이루어지는 것은 아니다. 그리고 현재는 스트레스, 바이러스 등 다양한 원인과 조건에서 나타나는 apoptosis에 대한 분자생물학적 분석과 임상양상과의 상호 연관성을 연구하고 있다.

현재 간질환에서 발생하는 여러 가지 병적상황은 apoptosis와 밀접한 연관관계가 있는 것으로 알려지고 있는데, B형 및 C형 간염바이러스에 의한 간염에서 acidophilic body, piecemeal necrosis 등의 조직소견은 apoptosis와 부합되는 것이 알려져 있고, piecemeal necrosis 부위에서 Fas발현이 강하게 나타나며 Fas의 발현정도가 간염 정도와 상관관계가 있는 것으로 밝혀지고 있다. 이외에 면역성 간질환으로 primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis 등에서도 apoptotic body 소견이 관찰되며, 간이식후의 거부반응에서도 apoptosis 소견이 관찰된다. 또한 간암에서도 apoptosis가 발견되며 p53과 같은 apoptosis에 관련된 유전자의 비활성화가 간암발생에 관여하는 것으로 알려져 있어, apoptosis는 바이러스성, 면역성 간질환과 간암발생의 병리기전에 깊이 관여하고 있는 것으로 나타난다.

Apotosis는 여러 가지 유전자 산물에 의해 조절되는데 현재 apoptosis 유발유전자, apoptosis 억제유전자, apoptosis 매개유전자들이 밝혀지고 있다. 특히 바이러스성 간질환에서 apoptosis를 유발하여 간세포 사망에 밀접하게 관여하는 유전자는 Fas(Apo1/CD95)이다. Fas는 319개의 아미노산들로 구성된 45 kDa의 I형 세포막 관통 단백질이며 apoptosis 유도신호를 전달하는 수용체분자이고 tumour necrosis factor/nerve growth receptor superfamily의 일원이다(Rouquet N. 등, Bio. and Biophy. Res. COM., Vol. 229, pp. 27-35, 1996). 그리고 간세포에서 Fas에 의한 apoptosis가 수행되는데는 protein kinase inhibitor, translation inhibitor, Interleukin-1β converting enzyme, Cpp32-like cysteine protease의 도움이 필요하다(위 Rouquet N. 등 논문)

바이러스성 간염으로 B형 간염 바이러스에 감염된 세포는 CTL(cytotoxic T 임파구)이 관여하는 면역반응으로 손상되는데(이관식, 연세의대 학위논문집, 242∼243, 1993.), CTL 표면에서 인지되는 FasL(Fas ligand)은 Fas 항원과 부착하면서 apoptosis가 유발된다. 또한 C형 바이러스를 가진 만성활동성 간염환자에서는 Fas 항원이 많이 발견되고(Kondo T. 등, Nat Med, 3(4): 409-13, 1997.), Fas 항체를 투여한 백서에서는 전격성 간염이 발생하였다.

따라서 Fas에 의한 apoptosis는 바이러스성 간염에서 질병의 악화를 결정하는 중요한 인자로 보고 있다. 이외에도 악성 간세포 암종에서도 Fas 항원이 발현되고(이상목, 경희대학교 대학원,1997.), primary biliary cirrhosis에서 손상된 담도의 상피세포에서 Fas가 대량으로 발견되고 있어 Fas는 바이러스성 간염이외의 간질환에서도 질병을 악화하는 주요 인자로 보고 있다. 그리고 Fas를 매개로 이루어지는 apoptosis에는 현재 Bcl-2, Bax, Cpp32 그리고 Cpp32 protease가 관여하는 것으로 알려져 있다.(Lacronique V. 등, Nat Med, 2(1): 80-6, 1996. 등)

Bcl-2는 분자량 26kD으로 Fas 항원과 TNF 수용체를 매개로 하는 apoptosis를 차단하며 apoptosis 과정의 중요 유전자인 Cpp32의 활성을 저지하고 Bcl-2를 과발현시키면 apoptosis를 억제하여 세포수명이 연장되는 것이 알려져 있다.(Tu Y.등 Blood, Vol. 88, No. 5, pp. 1805-1812, 1996.등)

Bax는 종양억제인자로 p53에 의한 apoptosis를 매개하며 항암제에 의해 유발되는 apoptosis 세포에서 그 발현이 증가한다. 그리고 Bax는 Bcl-2와 유전자 염기서열이 비슷하여 Bcl-2 family에 속하는데, Bcl-2 family중 Bcl-2, Bcl-XL은 apoptosis를 억제하고 Bcl-Xs, Bax, Bak, Bad는 이를 증진시키는 것으로 알려져 있다. 그리고 Bcl-2 family는 homodimers와 heterodimers의 두 형태로 존재하며 heterodimers는 Bcl-2/Bax와 같이 apoptosis 억제유전자와 촉진유전자의 결합형태를 나타낸다. 그러므로 만약 Bax가 활성화되면 apoptosis를 촉진하여 세포사가 증가하고 Bcl-2가 활성화되면 apoptosis를 억제하여 세포사가 줄어들게 되므로 Bcl-2와 Bax의 발현은 세포가 apoptosis로 진행될 때 감수성을 결정하게 된다.

Cpp32는 Tersea 등에 의해 처음보고 되었는데, Cpp32의 면역반응은 간세포, 골수, 기관지 상피세포, 집합관, medulla, cartilage의 chondrocyte에서 높게 나타나며, Cpp32가 결여된 쥐의 뇌에서는 apoptosis가 유발되지 않아 apoptosis에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 HCV core 단백질을 표현하는 HepG2 간세포에 cysteine protease Cpp32 차단제를 미리 투여한 경우 apoptosis에 의한apoptosis가 방지된다고 하였다.

이와 같이 Fas가 매개하는 apoptosis는 Bcl-2, Bax, Cpp32, Cpp32 protease의 작용을 받아서 세포질 및 세포핵에서 apoptosis가 이루어진다.

본 발명자는 상술한 점을 감안하여 Fas를 매개로 하는 apoptosis가 간세포손상에서 주요원인이 된다는 점에 주목하여 오래전 부터 한의학에서 간질환 치료에 사용되어 오던 인진의 특정분획물이 apoptosis의 억제를 통해 간세포보호작용이 뛰어나다는 점을 발견하여 본 발명에 이른 것이다.

인진(茵蔯)은 국화과의 여러해살이풀 사철쑥 (Artemisia capillarisTHUNB.)의 어린싹이며, 성미(性味)는 고미한(苦微寒)하고 청열(淸熱), 이습(利濕), 퇴황(退黃)하여, 급성간염, 만성간염, 간경변증, 간암 등에 널리 사용되고 있으며, 눗, 담낭결석 등의 질환에도 사용되고 있다. 약리작용으로는 담즙분비촉진작용, 간 기능 보호작용 특히 간세포의 재생 작용이 탁월하다. 지질의 분해작용, 관상동맥 확장 작용과 혈압 강하 작용이 나타나고, 해열, 이뇨, 항균작용도 보인다.(지형준: 대한약전 및 대한약전외 한약규격주해, 서울, 한국메디칼인덱스사, P638, 1998.)

인진을 주약으로 하는 처방들에 대한 최근의 연구물들을 살펴볼 때, 인진사령산(茵陳四岺散)에 대한 연구로, 우홍정(경희대학교대학원)은 인진오령산(茵陳五岺散)과 인진증량(茵陳增量)한 구성방이 흰쥐 손상간에 미치는 영향을 보고하였다. 인진청간탕(茵陳淸肝湯)에 대한 연구로는, 김영철(경희대학교대학원)이 인진청간탕의 안전성에 관한 연구에서 급성·아급성·만성 경구독성 및 어떠한 부작용도 나타내지 않았다고 보고하였으며, 김진우(경희대학교대학원)는 청간탕이 전격성간염을 일으킨 마우스의 생존율을 높이는 효과가 있었다고 보고하였고, 강경태(경희대학교대학원)은 인진청간탕가미방(茵陳淸肝湯加味方)이 마우스간염바이러스와 수침스트레스로 유발한 마우스의 간경변증에 있어 간기능개선 및 간손상회복에 유의한 효과가 있었다고 보고하였다.

최근에 와서는 한약의 간보호효과에 대한 면역학적·유전학적 접근이 시도되고 있는데, 박용진(경희대학교대학원)은 인진청간탕가미방이 간세포보호작용 및 Bcl-2, Bcl-XL의 활성을 높여 세포사망을 억제하는 효과를 보고하였고, 홍상훈(경희대학교대학원)은 인진청간탕가미방이 etoposide에 손상된 간세포 보호효과 및 Cpp32, Fas, Bcl-2의 발현을 억제하여 apoptosis를 억제하는 효과가 있음을 보고하였다. 또, 강우성은 인진과 인진사령산가미방(茵陳四笭散加減方)이 간세포활성, 세포주기 및 DNA 손상에 의하여 유발되는 apoptosis에 미치는 영향을, 표임정(경희대학교대학원)은 인진사령산이 간세포활성, 세포주기 및 Fas 매개성 apoptosis에 미치는 영향을 연구하여 유의성있는 결과를 얻은 바 있다.

이와 같이 인진을 주재로 한 처방들의 효능에 관한 임상적, 실험적 연구는 계속되어 왔으나 그 처방들의 주약인 인진이라는 개별약물의 어떤 분획물이 간질환의 억제 및 치료에 중요한 활성을 나타내는지에 대해서는 지금까지 밝혀지지 않고 있다.

이에 본 발명자는 인진의 각 분획물이 Fas를 매개로 한 apoptosis에 미치는 영향을 분자생물학적으로 검증하여 그 중 부탄올 분획부위가 간세포보호효과가 뚜렷하다는 것을 발견하였다.

따라서 본 발명의 목적은 간질환치료에 탁월한 효능을 보이는 인진의 부탄올 추출물을 제공함에 있다.

도 1은 인진 각 분획물의 DNA 분절화 평가에서의 FACscan 그래프.

인진의 부탄올 추출물이 간세포보호에 뛰어난 활성을 나타낸다는 것은 다음의 실험예에 의해 확연히 나타난다.

* 재료 및 방법 *

(1) 재료

약재

본 실험에 사용한 약재는 대한약전 및 대한약전외 한약규격주해(지형준, 서울, 한국메디칼인덱스사, P638, 1998.)에 근거하여 경희의료원 한방병원 약제과에서 엄선한 것을 구입하여 사용하였으며 처방의 내용과 용량은 다음 표 1 과 같다.

표 1

약물	생 약 명	학 명	용량
인진	Artemisiae Capillaris Herba	Artemisia capillarisTHUNB.	615g

검액의 조제

실험에 사용한 검액의 조제는 총 시료 615g을 3차증류수 4.8ℓ로 2시간 동안2회 환류추출한 후 면으로 여과하여 그 남은 액을 80℃ 물 중탕 위에서 감압 농축하고, 동결건조기(Christ LDC-1, Alpha/4, 독일)를 이용하여 70.6g의 건조추출물을 얻어 11.48%의 수율을 보였다.

(2) 방법

유기용매를 이용한 인진성분의 추출

위에서 얻은 인진 중 30g을 이용하여, 1차 추출용매인 hexane, chloroform, ethylacetate, butanol, H₂O의 5가지 용매에 녹였다. 그 방법은 우선 인진 30g을 증류수 300ml에 녹인다. 그 후 hexane 200ml를 넣어, 섞고 분리한다. 상층액을 모아 hexane을 날린다. 남은 부분을 동결건조하여 hexane fraction을 얻는다. 물층에 chloroform 200ml을 넣고 분리한다. 하층을 모아 chlorofrom을 날린다. 남은 부분을 동결건조하여 chloroform fraction을 얻는다. 다시 물층에 ethylacetate 200ml를 넣어 분리한다. 상층액을 모아 ethylacetate를 날린다. 남은 부분을 모아 동결건조하여 ethylacetate fraction을 얻는다. 다시 물층에 butanol 200ml를 넣어 분리한다. 상층액을 모아 butanol을 날린다. 남은 부분을 동결건조하여 butanol fraction을 얻는다.(표2)

표 2

1차 추출용매	수득량(g)
Hexane	0.11
Chloroform	2.84
Ethylacetate	2.01
Butanol	1.25
H2O	20.64

위에서 얻은 각각의 약물을 2차 추출용매인 DMSO(디메틸술폭시드), chloroform, butanol, H₂O를 이용하여 다시 녹여서 100㎎/㎖의 농도로 완충용액(stock solution)을 제작하였다.(표 3)

표 3

1차 추출용매	2차추출용매	Stock solution의 농도
Hexane 동결건조 추출성분	DMSO	100㎎/1㎖
Chloroform 동결건조추출성분	Chloroform	100㎎/1㎖
Ethylacetate 동결건조 추출성분	DMSO	100㎎/1㎖
Butanol 동결건조 추출성분	Butanol	100㎎/1㎖
H2O 동결건조 추출성분	H2O	100㎎/1㎖

세포배양

인체의 간암세포주인 HepG2를 American Type Culture Collection (ATCC, Rockvelle, MD)에서 구입하여 DMEM 배지 90%와 fetal bovine serum 10% 혼합배지에서 배양하였다. 세포들은 5%의 CO₂상태가 유지되는 37℃ incubator에서 배양하였다.

간세포에 대한 약물처리

동결건조된 약제 100㎎을 1㎖의 용매(hexane, chloroform, ethylacetate,butanol, H₂O)에 녹여, 멸균된 약물을 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖의 농도로 투여하고 각각 6시간, 12시간, 24시간, 48시간이 경과한 후 0.1% trypsin으로 세포를 회수하여 protein, DNA, RNA를 추출하였다.

간세포에 대한 약물 손상의 유발은 DNA 손상유발물질인 etoposide를 10μM의 농도로 12시간 자극한 후 한약제제에 의한 효능검사를 시행하였다.

Etoposide는 VP-16이라고도 불리우며, podophyllum계통의 podophyllo-toxin의 유도체로서 DNA fragmentation을 일으켜서 활발한 apoptosis를 유도한다. 백혈병, 방광암, 고환종양, 폐소세포암, 비호치킨림프종 등 각종 암질환의 복합화학료법으로 응용되고 있다(곽영임, 중등도 또는 고도의 비호지킨 림프종에 대한 VACOP-B(Etoposide/Doxorubicin/Cyclophosphamide/Vincristine/Prednisolone/Bleomycin) 복합화학요법의 제 2상 연구, 서울, 이화여자대학교 대학원, 1996.)

* 실험 *

(1) MTT 반응실험

1) MTT 용액제작 및 처리

MTT 5㎎/㎖을 PBS(phosphate buffer saline)에 녹여 pH 7.5로 맞춘 후 0.22㎛의 filter로 여과하여 stock solution을 만들었다. 그 후 104개의 세포를 포함하고 있는 100㎕의 cell suspension에 10㎕ 의 MTT stock solution을 첨가하였다.

2) 효소반응과 면역형광측정

MTT 원액에 cell suspension을 첨가한 상태로 37℃에서 3시간 보존한 후 100㎕의 0.04M HCl in absolute isopropanol을 각각의 well에 넣고 잘 혼합하여 blue formazan crystals을 완전히 용해시켰다. 효소의 용해가 끝난 뒤 570nm에서 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) reader로 OD(영상밀도계: optical density, 이하 OD로 기재한다.)를 측정하였다.

(2) 세포주기분석

5x106개의 세포를 0.2ml PBS에 현탁시킨 후 2ml of ice-cold 75% ethanol/25% PBS를 첨가하여 고정시킨다. PBS에 강력하게 재현탁시킨 후 100㎍/㎖ RNase 와 40㎍/㎖ Propidium iodide(PI)가 포함된 PBS에서 37℃로 30분간 배양한다. FACScan을 이용하여 DNA의 양을 정량한다.

(3) DNA 분절분석

약물을 처리하여 각 시기별로 세포를 회수한 후 PBS로 2회 세척한다. 2ml of ice-cold 75% ethanol/25% PBS를 넣어 세포를 1시간동안 4℃에서 고정한다. PBS로 다시 2회 세척한 후 100㎍/㎖ RNase 와 40㎍/㎖ propidium iodide의 PBS에서 37℃로 30분간 배양한다. FACScan을 이용하여 절편입자를 정량한다.

(4) Cpp32 protease 활성 분석

100㎕의 lysis buffer(0.5%NP-40, 0.5mM EDTA, 150mM NaCl and 50mM Tris, pH7.5)에 세포(7x105 cells)를 용해시킨후 15000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 20㎕의 cell lysate와 180㎕의 반응액(100mM, pH 7.5 HEPES, 20% Glycerol, 5mM DTT, 5mM EDTA, and 100μM Peptide substrate)에서 37℃에서 배양한다. 405nm에서 ELISA reader를 이용하여 OD값의 변화곡선을 얻는다.

(5) 정량적 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)

1) RNA의 추출

① GSS 용액의 제작

250g의 guanidine isothiocyanate을 293ml의 3차 증류수에 넣은 후 여기에 다시 0.75M sodium citrate 17.6ml와 10% sarkosyl 26.4ml를 넣어 65℃에서 섞은 후 여과하여 멸균하였다.

② 용액 D의 제작

GSS solution에 2-mercaptoethanol을 0.1M의 농도로 넣어 제작하였다.

③ 107개의 세포에 용액 D 500㎕, 2M sodium acetate, pH 4.0 50㎕ 를 넣어 잘 혼합한 후 water-saturated phenol 500㎕, chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) 100㎕를 넣어 10초간 와류(vortexing)혼합하여 얼음에 15분간 방치하였다.

④ 혼합용액을 15000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액의 4/5를 회수하여 동량의 cold isopropanol 1000㎕를 넣어 -70℃에서 24시간 침전시켰다.

⑤ 15000rpm에서 20분간 원심분리하여 용액을 제거한 후 RNA pellete을 100% ethanol과 70% ethanol로 세척한 후 30㎕의 RNase가 없는 물에 녹여 흡광분석지를 이용하여 RNA의 양을 측정하였다.

2) cDNA의 제작

① 다음과 같은 조성으로 시료를 혼합하였다.

Reverse transcriptase buffer 2㎕

Random hexamer (10 pM) 1㎕

AMV-RT (10U/㎕) 1㎕

dNTP (10 pM) 1㎕

RNase inhibitor 0.5㎕

RNA 1㎍

② 혼합용액이 20㎕가 되도록 멸균수(sterile water)를 첨가한 후 42℃에서 15분간 방치하였다.

③ 각 시료에 80㎕의 물을 넣어 혼합한 후 PCR 반응에 이용하였다.

3) Primer의 제작

① 대조군 유전자

GAPDH : Glyceraldehyde-3-Phosphate-Dehydrogenase

② Apoptosis 관련 유전자

Fas

Bcl-2

Bax

Cpp32

4) Quantitative PCR

① 각 cDNA를 대상으로 다음과 같이 시료를 혼합하였다.

10x amplification buffer 10㎕

Mixture of dNTP (10 pM) 5㎕

GAPDH primer 1 (10 pM) 2㎕

GAPDH primer 2 (10 pM) 2㎕

Template cDNA 4㎕

H₂O 77㎕

② GAPDH primer를 이용하여 다음의 조건으로 36 cycles PCR반응을 시행하였다.

First cycle

Denaturation	5 min at 94℃
Annealing	1 min at 59℃
Polymerization	1 min at 72℃

Subsequent cycle(34 cycle)

Denaturation	1 min at 94℃
Annealing	1 min at 59℃
Polymerization	1 min at 72℃

Last cycle

Denaturation	1 min at 94℃
Annealing	1 min at 59℃
Polymerization	10 min at 72℃

③ PCR 산물을 2% agarose gel에서 100V, 10분간 전기영동한 후 densitometer를 이용하여 각 band의 밝기를 정량화하였다.

④ 1차 PCR반응의 결과를 토대로 RNA의 양을 증감하여 모든 GAPDH PCR 산물의 양을 ±20%내로 정량화 하였다.

⑤ 위의 결과를 바탕으로 연구대상 유전자에 대한 PCR반응을 시행하여 상대적인정량화를 시행하였다. 연구대상 유전자의 PCR조건은 다음과 같다.

연구대상 유전자

Cycle Denaturation Annealing Polymerization

---------------------------------------------------------------------

First 5 min at 94℃ 1 min at 59℃ 1 min at 72℃

Subsequent 1 min at 94℃ 1 min at 59℃ 1 min at 72℃

Last 1 min at 94℃ 1 min at 59℃ 10 min at 72℃

* 평 가 *

(1) MTT 분석

인진 각 분획물의 세포독성을 확인하기 위하여, 시료들을 6시간, 12시간, 24시간, 48시간의 4가지로 나누어 처리한 후, MTT 분석을 시행하였다. ELISA를 이용한 측정결과는 표 4 에 작성하였다. 각각 2회에 걸쳐 실험하였으며, 평균과 표준편차를 표시하였다.

표 4 (인진 분획물; 100㎍/㎖)

OD	6hrs	12hrs	24hrs	48hrs
Normal control	0.6500±0.028	0.695±0.007	0.650±0.000	0.700±0.028
Hexane	0.715±0.035	0.700±0.014	0.705±0.007	0.685±0.063
Chloroform	0.645±0.049	0.720±0.042	0.690±0.042	0.705±0.035
Ethylacetate	0.695±0.063	0.695±0.007	0.660±0.660	0.705±0.007
Butanol	0.715±0.021	0.780±0.014	0.785±0.007	0.765±0.021
H2O	0.650±0.014	0.705±0.007	0.675±0.049	0.635±0.021

정상 대조군(normal control)과 5가지 용매군을 관찰한 결과, 100㎍/㎖의 농도에서는 세포독성을 일으키지 않는다는 것이 확인되었으며, 위의 표 4에서 보듯이 MTT 분석에서는 인진의 butanol 분획물에서 세포활성의 증가효과가 관찰되었다.

본 실험에서 사용한 MTT 검사방법은 세포의 활성(Cell viability)를 측정하는 방법으로 1983년 Mosmann에 의해 처음 시도되었으며(Journal of immunologic methods, Vol. 65, No. 1-2, pp.55-63, 1983.), 1986년 Cole과 1988년 Alley 등에 의해 사용되기 시작하여 최근 널리 보급되었다(Cancer chemother Pharmacology, Vol. 17, No. 3, pp.259-263,1986.). MTT는 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazdium bromide; Thiazolyl blue이며, 100mg, 250mg, 500mg 등 다양한 용량의 수용성 tetrazolium 염색으로 세포의 활성도에 따라 MTT-formazan의 양이 달라지며 이를 적절한 용매에 작용시킨 후 spectrophotometer로 읽어내어 세포의 생존능력을 측정한다.

본 실험에서는 MTT 분석 결과 위의 표 4에서 보듯이 인진의 부탄올 분획물 투여군은 뚜렷한 활성증가를 보였다. 또한, etoposide 처리군과의 비교에서도butanol, H₂O, chloroform fraction 에서 활성증가를 보였으나, butanol 분획물에서의 증가가 특히 현저하였다. 이는 butanol 분획물의 간세포보호 효과가 뚜렷함을 나타낸다. 하지만, 세포주기분석 결과에서는 아래에서 보듯이 인진의 각 분획물들이 세포주기에 별 영향을 미치지 않았다.

표 5 (Etoposide; 10μM, 인진분획물; 100㎍/㎖).

OD	12hrs	24hrs
Etoposide only	0.595±0.021	0.605±0.035
Hexane	0.625±0.007	0.600±0.014
Chloroform	0.710±0.056	0.695±0.035
Ethylacetate	0.650±0.007	0.610±0.056
Butanol	0.715±0.021	0.735±0.035
H2O	0.695±0.035	0.715±0.021

정상 대조군(normal control)과 etoposide처리군의 경우 시간대별로 OD의 차이가 두드러져 etoposide 처리군에서 세포독성에 의한 생존능력의 저하가 관찰되었다. Etoposide만 처리한 군과 100㎍/㎖의 인진 각 분획물 처리군을 12시간, 24시간의 2가지의 시간별로 관찰하였다. 그 결과, 위의 표 5에서 보듯이 butanol, H₂O 및 chloroform fraction에서 시간대별로 OD의 상승을 보였고, 특히 butanol 분획물에서의 상승이 두드러졌다. 이는 etoposide로 유발되는 apoptosis에 대한 인진 부탄올 분획물의 억제효과를 시사한다.

(2) 세포주기분석

정상 대조군(normal control)과 인진의 각 분획물을 FACScan으로 세포주기를 해석하였다. G1기, S기, G2기, M기에서 정상대조군과 인진의 5가지 분획물 처리군들과는 차이가 없었다. 즉, 위의 MTT 분석에서 나타난 인진 부탄올 분획물 처리군의 세포활성의 증가는 세포분열의 활성화에 의한 것은 아닌 것으로 생각된다.

표 6

	G1(%)	S(%)
Normal control(Untreated)	48.975±1.605	16.430±0.777
Hexan	53.525±11.221	16.840±1.159
Chloroform	50.260±0.537	16.300 ±0.961
Ethylacetate	47.360±0.424	16.495±0.869
Butanol	47.785±1.732	16.640±0.565
H2O	50.545±0.756	16.525±0.346

(3) DNA 분절분석

Fas에 의해 유발되는 apoptosis에 대한 약물의 효과를 알아보기 위하여, 인진 각 분획물과 Fas 항체를 동시에 투여한 후 DNA 분절분석을 시행하였다. 먼저 Fas 항체를 200ng/㎖의 농도로 12시간 처리한 후, 인진 각 분획물을 100㎍/㎖의 농도로 24시간 및 36시간 처리한 후, FACscan을 시행하였다(표 6, 도 1). 도 1에서 A: 정상대조군, B: Fas 항체 처리군, C: Fas 항체 및 Butanol 분획물 처리군, D: Fas 항체 및 H₂O 분획물 처리군 이다.

그 결과, 아래 표 7 과 도 1 에서 나타나듯이, apoptosis의 유발을 의미하는 sub-G1 세포의 양이 Fas 항체만 처리한 군에서는 24시간에 28.4%, 36시간에 39.9%였는데, butanol 분획물을 함께 처리한 군에서는 24시간에 15.0%, 36시간에 15.9%로 현저한 감소를 보였다. 이는 인진의 butanol 분획물의 현저한 apoptosis 억제효과를 나타내는 것이다.

표 7

	24hrs	36hrs
Control(No Fas-antibody)	4.90 %	7.80 %
Untreated(Fas-antibody only)	28.4 %	39.9 %
Hexane	29.1 %	37.1 %
Chloroform	22.6 %	32.1 %
Ethylacetate	31.4 %	36.8 %
Butanol	15.0 %	15.9 %
H2O	17.0 %	17.9 %

(4) Cpp32 protease 활성 분석

Apoptosis와 연관성이 있는 유전자 산물인 Cpp32의 활성도를 ELISA를 이용하여 측정하였다. 200㎍/㎖의 Fas 항체를 24시간 처리한 후, 인진의 각 분획물들을 100㎍/㎖의 농도로 처리하고 30분, 60분 등 2가지의 시간별로 관찰하였다(표 8)

표 8

OD(Optical Density)	30mins	60mins
Fas-antibody only	0.690±0.070	0.660±0.028
Hexane	0.685±0.007	0.695±0.007
Chloroform	0.690±0.042	0.655±0.007
Ethylacetate	0.680±0.042	0.680±0.014
Butanol	0.456±0.049	0.450±0.084
H2O	0.560±0.056	0.595±0.007

그 결과 위의 표8 에서 보듯이 인진의 각 분획물 중 butanol 분획물과 H₂O 분획물에서 Cpp32 protease 활성의 저하를 보였으며, 특히 butanol 분획물에서의 저하가 현저하였다. 이는 butanol 분획물에 의해 Cpp32 protease 활성이 저하되는 것은 분명하지만, Cpp32의 활성화를 유발하는 Fas 유전자의 발현 억제에 기인한 것일 가능성도 가지고 있다. 따라서 이후의 실험에서, 정량(quantitive)RT-PCR을 시행하여 이를 확인하였다.

(5) 정량적 RT-PCR

지금까지의 결과를 토대로 인진의 butanol 분획물로부터 지속적인 apoptosis 억제효과가 관찰됨에 따라, butanol 분획물의 유전자 조절효과를 정량적 RT-PCR을 통하여 분석하였다.

먼저, 완충용액을 제작하고 시료를 반응시킨 후 전기영동을 거쳐 결과를 확인하였다. 아울러 RNA를 추출하여 cDNA 및 primer를 제작한 후 PCR반응을 시행하고 전기영동을 거쳐 모든 PCR 산물을 영상밀도계(densitometer)로 정량화하였다. 동일한 과정을 2회 반복실시하여 재현가능성 높은 일정한 결과를 얻었다(표9; 2회 실험)

표 9

Gene/GAPDH	12hrs	24hrs	48hrs
Fas	1.500±0.254	0.785±0.106	0.600±0.028
Bax	1.500±0.056	0.980±0.155	0.915±0.148
Bcl-2	1.145±0.134	1.515±0.190	1.715±0.077
Cpp32	1.210±0.212	1.255±0.205	1.175±0.304

위의 표9 에 나타난 결과를 요약하면 butanol 분획물은 Fas 및 Bax 유전자의 발현을 억제하며, Bcl-2 발현은 증가시킨다. 또한 Cpp32 발현에는 아무런 영향을 미치지 않는다. 결국, 앞의 Cpp32 protease 활성 분석에서는 활성억제효과가 나타났으나, RT-PCR에서는 유전자 발현억제가 나타나지 않았다. 이는 인진의 butanol 분획물이 Cpp32 유전자 자체의 발현을 억제하지는 못하지만, 그 닫백질 산물의 활성억제는 하고 있다는 의미이다.

이상을 종합해보면, 인진의 butanol 분획물이 HepG2 세포의 apoptosis 관련 유전자에 대한 조절을 통해 억제하고 있다는 것을 말한다.

2회의 실험 중 두 번째 실험에서 얻은 사진(정량 RT-PCR, 부탄올분획물 100㎍/㎖)은 아래와 같다.

(사진1) Fas 발현

12hrs(=1.32) 24hrs(=0.71) 48hrs(=0.58)

(사진 2) Bax 유전자 발현

12hrs(=1.46) 24hrs(=0.87) 48hrs(=0.81)

(사진 3) Bcl-2 유전자 발현

12hrs(=1.05) 24hrs(=1.38) 48hrs(=1.66)

(사진 4) Cpp32 발현

12hrs(=1.05) 24hrs(=1.38) 48hrs(=1.66)

이상의 실험결과에서 DNA 분절 분석의 결과 인진의 butanol 및 H₂O 분획물이 유의성있게 apoptosis를 억제하는 효과를 보였으며, Cpp32 protease 활성분석 결과 인진의 butanol 및 H₂O 분획물이 Cpp32 protease의 활성화를 저하시켰으며, 특히 butanol 분획물에서 이러한 효과가 두드러졌다. 정량적 RT-PCR 분석 결과, 유전자 차원에서 butanol 분획물이 Fas 및 Bax 유전자의 발현을 억제하고, Bcl-2는 증가시켰다. 하지만, Cpp32에는 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 이는 인진의 butanol 분획물이 간암세포의 apoptosis를 유전자 발현에 대한 직접적인 조절을 통해 억제하고 있다는 것을 말한다.

따라서 인진의 butanol과 H₂O 분획물, 특히 butanol 분획물은 간세포의 활성을 높이고, 세포주기 및 apoptosis에 관여하는 유전자의 조절을 통해 세포의 손상을 억제하는 탁월한 간세포보호 효과가 인정되었다. 이는 인진 분획을 임상에서 각종 간질환에 다양하게 사용할 수 있는 근거를 제시하고 있으며, 뛰어난 간세포보호효과를 가진 신약 개발 가능성을 제시한 것으로 평가된다.

Claims (7)

1. 인진의 부탄올 추출물
2. 1항에 있어서, 대한약전 및 대한약전외 한약규격주해에 따른 인진의 부탄올 추출물.
3. 2항에 있어서, 상기 인진을 증류수로 환류추출한 후 여과하고 그 여액을 중탕에서 감압농축하고 이를 동결건조시켜 건조추출물을 얻은 후 부탄올로 추출하는 것을 포함하는 인진의 부탄올 추출물.
4. 1항에 있어서, 상기 추출물은 간질환치료에 사용되는 인진의 부탄올 추출물.
5. 4항에 있어서, 바이러스성간염 특히 B형 바이러스성 간염치료에 사용되는 것을 포함하는 인진의 부탄올 추출물.
6. 4항에 있어서, 상기 인진의 부탄올 추출물은 Fas 매개성 apoptosis 과정에서 Fas 및 Bax 유전자의 발현을 억제하고, Bcl-2 유전자 발현은 증가시키는 것을 포함하는 인진의 부탄올추출물.
7. 제 4항에 있어서, 상기 인진의 부탄올 추출물은 인체의 간세포주 HepG2에 효과가 있음을 특징으로 하는 인진의 부탄올 추출물.