KR100557015B1

KR100557015B1 - 개선된 항 ｂ형 간염바이러스 활성을 갖는 짚신나물추출물을 제조하는 방법 및 그러한 추출물을 함유한약제학적 조성물 또는 식품 조성물

Info

Publication number: KR100557015B1
Application number: KR1020020061482A
Authority: KR
Inventors: 이영성; 안동호; 홍사민; 윤승규; 장은주; 이민경; 권혁윤
Original assignee: 바이오코리아 주식회사
Priority date: 2001-10-09
Filing date: 2002-10-09
Publication date: 2006-03-03
Also published as: CN1466462A; KR20010099494A; KR20030030922A; JP2004521962A; US20040091555A1; WO2003030921A1; CN1264541C

Abstract

본 발명은 약제학적으로 유효한 양의 큰등골짚신나물 추출물을 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 짚신나물속 식물의 분쇄물과 물의 혼합물을 약 55℃ 이상의 온도로 가열하거나 약 20℃ 내지 30℃의 온도로 약 7일 이상 가온함을 특징으로 하여 간 질환에 대한 개선된 예방 또는 치료 효과를 갖는 짚신나물속 식물 수용성 추출물을 제조하는 방법 및 이러한 방법으로 얻은 수용성 추출물을 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 짚신나물속 식물을 유기 용매로 추출하여 수용성 분획을 제거하고 유기 용매 분획을 수득하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 간 질환에 대한 개선된 예방 또는 치료 효과를 갖는 짚신나물속 식물 유기용매 가용성 추출물을 제조하는 방법 및 이러한 방법으로부터 얻은 추출물을 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

짚신나물속 , 큰등골짚신나물, B형 간염바이러스, 표면항원, 외피항원, 전초, 간질환 치료제

Description

개선된 항 Ｂ형 간염바이러스 활성을 갖는 짚신나물 추출물을 제조하는 방법 및 그러한 추출물을 함유한 약제학적 조성물 또는 식품 조성물{Methods for producing Agrimonia extract with improved activity against hepatitis B virus and pharmaceutical and food compositions containing said extract}

도 1은 본 발명에 따라 큰등골짚신나물을 유기 용매로 처리하여 항 B형 간염바이러스 활성을 갖는 유기용매 가용성 추출물을 얻는 방법의 한 양태를 도시한 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 PLC/PRF/5 세포주에서 B형 간염바이러스의 표면항원에 대한 억제능을 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 HepG2 2.2.15 세포주에서 B형 간염바이러스의 외피항원에 대한 억제능을 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명에 따른 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 HepG2 2.2.15 세포주에서 B형 간염바이러스의 복제에 대한 억제능을 보여주는 아가로즈 겔 전기영동 실험결과이다.

도 5는 본 발명에 따른 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 간염 환자의 혈액에 존재하는 바이러스 DNA 폴리머라제에 대한 억제능을 보여주는 아가로즈 겔 전기영 동 실험결과이다.

도 6은 짚신나물속 식물에 속하는 큰등골짚신나물, 짚신나물, 산짚신나물 및 털짚신나물의 각 수용성 추출물이 PLC/PRF/5 세포주에서 B형 간염바이러스의 표면항원에 대한 억제능을 비교한 그래프이다.

도 7은 동일시간(1시간)동안 상이한 온도에서 추출하여 얻은 본 발명에 따른 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 PLC/PRF/5 세포주에서 B형 간염바이러스의 표면항원에 대한 억제능을 비교한 그래프이다.

도 8은 본 발명 추출물을 추출하는 방법에서 동일 온도(25℃)에서 시간에 따른 PLC/PRF/5 세포주에서 B형 간염바이러스의 표면항원에 대한 억제능을 나타낸 그래프이다.

도 9는 본 발명에 따른 큰등골짚신나물의 전초를 건조 분쇄하여 증류수에 혼합한 용액을 동량의 비수용성 유기용매인 헥산, 클로르포름 및 부틸알콜로 추출하여 얻은 각각의 분획이 HepG2 2.2.15 세포주에서 B형 간염바이러스의 표면항원에 대한 억제효과를 나타낸 그래프이다.

도 10은 본 발명에 따른 큰등골짚신나물의 전초를 건조 분쇄하여 증류수에 혼합한 용액을 동량의 비수용성 유기용매인 헥산, 클로르포름 및 부틸알콜로 추출하여 얻은 각각의 분획이 HepG2 2.2.15 세포주에서 B형 간염바이러스의 외피항원에 대한 억제효과를 나타낸 그래프이다.

도 11은 본 발명에 따라 큰등골짚신나물의 전초로부터 항 B형 간염바이러스 활성을 갖는 수용성 추출물을 수득하는 공정의 한 양태를 도시한 것이다.

B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)는 DNA 바이러스로서 인체에 감염되면 급성 간염뿐만 아니라 만성 간염을 일으키는 임상적으로 매우 중요한 바이러스이다. 게다가, 지속적인 만성 간염은 결국 간경화와 간암을 유발하는 것으로 알려져 있다(Peter J. Grob. Vaccine, 16: S11-S16(1998)). 대부분 B형 간염 바이러스는 비경구적으로 감염되며, 많은 국가에서 주된 문제가 되는 것은 모자감염이다. 전세계 인구 중 2억명 이상이 감염되어 있고 이중 350만명 이상이 만성간염인 상태로서 간경화와 간암으로 병이 진행됨으로서 치사율이 매우 높음에도 불구하고 현재까지 효과적인 치료제가 개발되어 있지 않다(Davey S. State of the Worlds vaccines and Immunization. Geneva: WHO, 1996:76-82).

따라서 B형 간염의 치료에 많은 연구가 진행되고 있는데 대체로 면역조절제(immunomodulators)와 항바이러스제 그리고 뉴클레오사이드 유도체로 구분된다. 면역조절제로는 인터페론(Interferon)이 대표적인 치료제로 쓰이고 있고, 항바이러스제로 리바비린(ribavirin), 비다라빈(vidarabine), ara-AMP, 아시클로비아(acyclovir), 수라민(suramin) 및 지도부딘(zidovudine) 등이 있으며, 뉴클레오사이드 유도체로는 라미부딘, 최근에 B형 간염치료제로 미국 FDA 승인을 받은 아데포비르(adefovir) 등이 있다.

이 중에서 인터페론(IFN)은 1976년 그린버그 등이 백혈구 IFN이 B형 간염 바 이러스 증식을 억제할 수 있다고 보고한 이래(Greenberg HB. et al. N Engl J Med, 295: 517-522(1976)) 최근까지 B형 간염 바이러스의 만성 간염 환자에서 IFN의 효과에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 초기에는 약물의 공급부족과 규명되지 않은 용량 및 투여기간 등으로 인해 그 임상적 연구가 제한되었으나 재조합 기술의 발전으로 인해 IFN의 사용이 용이하게 되어 현재 만성 B형 간염의 치료약으로 승인 받은 약물이며 상업적으로 입수 가능한 인터페론 알파-2b(이하 'α-인터페론')가 사용되고 있다. 그러나, α-인터페론에 대한 만성 B형 간염 환자의 반응률은 25% 미만인 단점이 있다. β 및 γ-인터페론의 경우에는 바이러스 감염 기간이 4개월 이내인 경우에만 효과를 나타내는 단점이 있다.

스테로이드제제(Corticosteroids)는 초기에 자가면역성 간염에 효과가 입증되어 만성 B형 간염의 치료법으로 연구되었다(Marsha A. Viral Hepatitis. In: Dipiro JT et al., eds. Pharmacotherapy: a pathophysiologic approach. 3rd ed. New York: Elservier, 829-852(1996)). 그러나 스테로이드제제는 대부분의 환자에 있어서 간조직의 염증상태를 감소시키기는 하나 바이러스의 복제력이 급진적으로 증가하며, 약물을 중단함으로써 염증의 활성도를 증가시키는 결과를 초래한다. 또한 스테로이드제제는 간경화 현상이 있는 환자는 더욱 악화시키므로 간경화 환자에는 적용할 수 없다.

항바이러스 제제인 리바비린은 만성 B형 간염에 효과가 있으며 경구로 투여될 수 있다는 장점이 있으나 모든 연구결과에서 투여를 중단하는 경우에 높은 재발율을 나타내고 있다. 비다라빈과 ara-AMP(비다라빈의 유도체)는 지속적인 효과가 나타나지 않으며 심각한 신경근 독성을 나타내므로 사용되지 않고 있다. 그 외 여러 항바이러스제는 B형 간염에 대한 임상실험이 거의 실시되지 않았으며 바이러스 DNA 뿐 아니라 세포의 핵산 DNA 및 미토콘드리아 DNA 모두에게 그 영향이 미칠 수 있으므로 잠재적인 독성이 문제가 된다.

최근에 B형 간염에 대한 새로운 치료법으로 팜시클로비아(famcyclovir), 라미부딘(lamivudine), 로부카비아(lobucavir) 및 아데포비아 디피복실(adefovir dipivoxil)과 같은 핵산 유도체 약물이 개발되었다(Erik De Clercq, Int J Antimicrob Agent, 12 : 81-95 (1999)). 이들 약물은 HIV 치료제에서 유래한 역전사 효소의 억제효과가 있는 디데옥시뉴클레오사이드(ddNs) 계열과 일부의 헤르페스(herpes) 감염증 치료제이며 초기에는 다른 바이러스 감염치료제로 개발되었으나 이후 B형 간염 바이러스에 유효하다는 것이 밝혀졌다. 팜시클로비아와 라미부딘은 매우 광범위하게 연구되어 왔으며 두 약물 모두 경구투여가 가능하며, 몇몇 환자에게서 혈청 HBV-DNA 수치를 급격하게 감소시키며, HBeAg(B형 간염 바이러스의 외피항원)을 소멸시키고, 간 효소 수치를 정상화시키는 것으로 보고되었다. 라미부딘은 1년 복용시 치료의 기준으로 삼고 있는 HBeAg의 소실과 HBeAb의 생성으로 표현되는 혈청전환(seroconversion) 비율이 22%로 낮은 편이고 복용중에는 ALT(alanine transaminase)와 AST(aspartate transaminase)수치가 정상을 유지하나 대부분의 경우 라미부딘 치료 중단 수개월 내에 염증이 재발하여 간수치가 올라가고 많은 경우에 있어서 내성변이주가 생성된다. 최근 1년간의 임상보고에서는 약 14%가, 2년이 지난 후에는 약 30%가 내성변이의 발현을 보고하고 있고(Alen MI, Hepatology, 27 : 1670-1677(1998)) 특히 간이식환자에서 이러한 변이의 발현이 계속해서 보고되고 있다( Yao FY, Liver Transplant Surgery, 5 : 491-496(1999)). 지금까지 보고된 이러한 내성변이는 대부분이 B형 간염 바이러스의 폴리머라제를 합성하는 부위의 아미노산 하나가 바뀌는 일명 YMDD 돌연변이가 생기는 것이며 이러한 변이는 결국 바이러스가 복제는 가능하되 라미부딘에는 내성을 가지게 되는 현상을 나타나게 한다. 또 다른 B형 간염의 치료방법으로는 간 이식수술이 시행되고 있으나, 재발율이 높은 단점이 있다.

천연식물에서 간염바이러스 억제효능을 가지는 성분들로는 글리시리진(glycyrrhizin), 카테친(catechin), 실리마린(silymarin) 등이 알려져 있는데, 간염 바이러스 복제를 억제하고 간보호 기능이 우수하다는 결과가 보고되어 있으나(Altern Med Rev 1999 Aug;4(4):220-38, Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi 1992 Aug;12(8):480-2) 간염치료제로 개발되지는 못하였다.

많은 화학요법제가 임상적으로 여러 종류의 암에 대하여 유용할 지라도 간암에 대해서는 불활성인 것으로 알려져 있다. 대표적인 예로서, 주목나무의 껍질로부터 분리되어 여러 악성 종양 세포에 대해 효과적인 것으로 알려져 온 파클리탁셀(paclitaxel)은 이의 간암 환자(hepatocellular carcinoma patients)에 대한 II상 임상 시험 결과 유의적인 효과가 없는 것으로 밝혀진 바 있다(British Journal of Cancer, 78(1), 34-39, 1998). 이러한 상황하에서, 간암에 대해서 활성을 나타내는 물질들이 문헌을 통해 소개되고 있다. 예를 들면, 미국특허 제5411943호는 소마토스타틴의 옥타펩타이드 유사체가 감암 치료 효과가 있음을 기술하고 있 다. 미국특허 제5981774호에는 Formosan tripterospermun 식물의 뿌리 껍질로부터 분리된 γ-파이론 화합물, 사이클로모르루신, 사이클로아르토뮤닌, 디하이드로사이클로-아르토뮤닌, 아르토뮤노크산트-오트리온 에폭사이드, 디하이드로이소사이클로아르토뮤닌, 아르토뮤노크산톤, 사이클로코뮤놀, 사이클로-뮬베린 및 사이클로코뮤닌이 간암에 대하여 활성을 나타낸다고 기술되어 있다. 유럽특허 제0654269A1호는 사이타라빈 옥포스페이트(Cytarabine Ocfosfate)가 간암의 치료에 효과적임을 기술하고 있다. 국제특허 제WO 01/15675호에는 도세탁셀(docetaxel)이 간 세포 암종의 치료에 효과적임이 기술되어 있다. 대한민국특허등록 제10-0187881호는 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)를 유효성분으로 하는 간염 또는 간암치료제를 개시한다. 대한민국특허공개 제2000-0046779호에는 오르티카풀(Urtica dioca L.) 추출물을 유효성분으로 포함하는 간염 또는 간암 치료용 조성물이 개시되어 있다.

효과적이고 개선된 간염 및 간암치료제의 개발은 계속 이루어져야 하며 본 발명의 목적 또한 여기에 있다. 본 발명자들은 다닥냉이(Lepidium apetalum W.) 및 짚신나물(Agrimonia pilosa L.)의 각 추출물이 B형 간염바이러스 표면항원 생성 억제능이 있음을 밝히고 그들 추출물을 유효성분으로 함유한 간질환 치료제를 각각 대한민국특허등록 제10-0351755호 및 대한민국특허등록 제10-0327762호를 통해 이미 특허를 받은 바 있다.

본 발명자들은 짚신나물속에 속하는 각종의 식물로부터 각각 분리한 추출물 의 간질환 치료 효과를 끊임없이 연구하여 왔다. 그 결과로서 본 발명자들은 짚신나물속 식물가운데 큰등골짚신나물(Agrimonia eupatoria L.) 추출물이 B형 간염 바이러스 유효성을 평가 할 수 있는 세포에 투여하였을 때 현저히 증가된 정도로 B형 간염바이러스 표면항원 및 외피항원을 억제하고 바이러스 자체의 복제도 억제하며 바이러스 복제에 관여하는 바이러스 DNA 폴리머라제의 활성을 억제하여 간질환 치료제로서 매우 높은 유효성을 갖고 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 짚신나물속에 속하는 각종 식물의 전초를 물과 혼합하고 이 혼합물을 가열하여 수용성 추출물을 수득한 후 상기와 같은 간 질환 치료 효과를 측정한 결과 약 55℃ 이상의 온도로 가열하여 얻은 수용성 추출물이 현저히 증가된 효능을 나타낸다는 사실을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 짚신나물속에 속하는 각종 식물의 전초를 물과 혼합하고 이 혼합물을 약 20℃ 내지 30℃의 온도로 약 7일 이상 가온하여 얻은 수용성 추출물이 현저히 증가된 효능을 나타낸다는 사실을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 짚신나물속에 속하는 각종 식물의 전초를 유기 용매로 추출하여 얻은 유기 용매 가용성 추출물이 수용성 추출물에 비하여 현저히 증가된 효능을 나타낸다는 사실을 발견하였다.

따라서, 본 발명은, 한 가지 관점으로서, 약제학적으로 유효한 양의 큰등골짚신나물 추출물을 포함함을 특징으로 하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

다른 관점으로서, 본 발명은 큰등골짚신나물 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 하는 간질환에 대한 식품 조성물을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 큰등골짚신나물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물과 혼합하며, 혼합물을 가열하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 간 질환에 대한 개선된 예방 또는 치료 효과를 갖는 큰등골짚신나물 수용성 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물과 혼합하며, 혼합물을 약 55℃ 이상의 온도로 가열하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 간 질환에 대한 개선된 예방 또는 치료 효과를 갖는 짚신나물속 식물 수용성 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물과 혼합하며, 혼합물을 약 55℃ 이상의 온도로 가열하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하여 제조된 짚신나물속 식물 수용성 추출물을 포함함을 특징으로 하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물과 혼합하며, 혼합물을 약 55℃ 이상의 온도로 가열하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하여 제조된 짚신나물속 식물 수용성 추출물을 포함함을 특징으로 하는 간 질환에 대한 식품 조성물.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물 과 혼합하며, 혼합물을 약 20℃ 내지 30℃의 온도로 약 7일 이상 가온하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 간 질환에 대한 개선된 예방 또는 치료 효과를 갖는 짚신나물속 식물 수용성 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물과 혼합하며, 혼합물을 약 20℃ 내지 30℃의 온도로 약 7일 이상 가온하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하여 제조된 짚신나물속 식물 수용성 추출물을 포함함을 특징으로 하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물과 혼합하며, 혼합물을 약 20℃ 내지 30℃의 온도로 약 7일 이상 가온하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하여 제조된 짚신나물속 식물 수용성 추출물을 포함함을 특징으로 하는 간 질환에 대한 식품 조성물.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 유기 용매로 추출하여 수용성 분획을 제거하고 유기 용매 분획을 수득하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 간 질환에 대한 개선된 예방 또는 치료 효과를 갖는 짚신나물속 식물 유기용매 가용성 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 유기 용매로 추출하여 수용성 분획을 제거하고 유기 용매 분획을 수득하여 제조된 짚신나물속 식물 유기용 매 가용성 추출물을 포함함을 특징으로 하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 유기 용매로 추출하여 수용성 분획을 제거하고 유기 용매 분획을 수득하여 제조된 짚신나물속 식물 유기용매 가용성 추출물을 포함함을 특징으로 하는 간 질환에 대한 식품 조성물을 제공한다.

짚신나물속에 속하는 식물중 일부 종은 기존에 항암 및 면역 조절 작용의 용도로 사용되고 있다. 짚신나물(Agrimonia) 속 식물의 성분가운데 하나인 아그리모닌(Agrimoniin)은 면역조절 작용을 하는 탄닌 성분으로 알려져 있으며, 인터루킨-1을 유도하여 항암 작용을 하는 것으로도 알려져 있다. 또한 큰등골짚신나물의 추출액은 당뇨병을 치료하는데 효과적으로 쓰이고 있다. 하지만 짚신나물 속에 속하는 각종 식물에 대해 B형 간염 바이러스의 억제 효과를 제시해준 결과는 본 발명자들의 대한민국특허등록 제10-0327762호에 기술된 짚신나물 종(Agrimonia pilosa L.)의 수용성 추출물이 나타내는 B형 간염바이러스 표면항원 생성 억제 효과 외에는 아직까지 밝혀진 바가 없다.

간염치료제를 개발함에 있어 유효성을 평가함이 매우 중요한데 생체내(in vivo)와 시험관내(in vitro)에서 유효성을 평가 할 수 있다. 생체내 모델은 침팬지나 우드척을 이용하며(Raymond F Schinazi, Antiviral Chem & Chemother, 10 : 99- 114 (1999)), 시험관내 실험에서는 인간의 간암세포에서 분리된 세포주를 이용하고 있다. 간암세포 HepG2로부터 유래된 HepG2 2.2.15과 간암조직에서 유래된 Hep3B, PLC/PRF/5 등의 세포주가 있다. HepG2 세포는 B형 간염바이러스 유전체를 갖고 있지 않은 반면, PLC/PRF/5와 HepG2 2.2.15 세포는 자체의 DNA에 B형 간염바이러스 유전체를 포함하고 있다. 이들 B형 간염바이러스 유전체를 포함하고 있는 세포주 PLC/PRF/5와 HepG2 2.2.15(Mary A. Sells, P.N.A.S. 84 : 1005-1009(1987))는 바이러스에 감염된 간세포와 마찬가지로 배양액에 B형 간염 바이러스의 표면항원, 외피항원과 복제된 바이러스를 생산하므로 이 두 가지 세포주들은 간염치료제의 유효성을 평가함에 있어 중요한 세포주가 된다.

본 발명에서 사용된 짚신나물 속의 식물 종으로는 다음의 것이 포함된다:

큰등골짚신나물(Agrimonia eupatoria L.);

짚신나물(Agrimonia pilosa L.);

산짚신나물(Agrimonia coreana N.);

털짚신나물(Agrimonia coreana N. for. pilosella Satake);

아그리모니아 글리포세팔라(Agrimonia gryposepala);

아그리모니아 로스텔라타(Agrimonia rostellata);

아그리모니아 푸베센스(Agrimonia pubescens);

아그리모니아 파비폴로라(Agrimonia parviflora);

아그리모니아 스트리아타(Agrimonia striata);

아그리모니아 오도라타(Agrimonia ordorata);

아그리모니아 인시사(Agrimonia incisa);

아그리모니아 폴리필라(Agrimonia polyphylla);

아그리모니아 미크로카파(Agrimonia microcarpa);

아그리모니아 브락티아타(Agrimonia bracteata);

아그리모니아 레펜스(Agrimonia repens);

아그리모니아 프라티카파(Agrimonia platycarpa);

아그리모니아 푸밀라(Agrimonia pumila); 및

아그리모니아 아시아티카(Agrimonia asiatica).

본 발명에 따른 짚신나물 속 식물 종으로부터의 추출물은 세 가지 방식을 통해 얻을 수 있다. 첫째는 식물을 물과 혼합하여 혼합물을 가열함으로써 수용성 추출물을 얻는 것이다. 둘째는 도 11에 도시된 바와 같이 식물을 유기 용매로 추출하여 유기 용매 가용성 분획을 제거하고 수용성 분획을 수득하는 것이며, 셋째는 도 1에 도시된 바와 같이 유기 용매로부터 추출하여 수용성 분획을 제거하고 유기 용매 가용성 분획을 수득하는 것이다. 본 발명에 따르면 상기 추출물 모두는 B형 간염 바이러스 유효성을 평가 할 수 있는 상기 세포에 투여하였을 때 B형 간염바이러스 표면항원 및 외피항원을 억제하고 바이러스 자체의 복제도 억제하며 바이러스 복제에 관여하는 바이러스 DNA 폴리머라제의 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 그러나, 본 발명에 이르러, B형 간염바이러스 표면항원 및 외피항원의 억제, 바이러스 자체의 복제 억제 및 바이러스 DNA 폴리머라제의 활성 억제에 있어서, 상기 짚 신나물속의 식물 종 가운데 큰등골짚신나물의 추출물이 짚신나물의 다른 종으로부터 얻은 추출물에 비하여 적게는 약 1.6배 많게는 2배 이상의 높은 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 약제학적으로 유효한 양의 큰등골짚신나물 추출물을 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 다른 관점으로서, 본 발명은 큰등골짚신나물 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 질환에 대한 식품 조성물에 관한 것이다. 또 다른 관점으로서, 본 발명은 큰등골짚신나물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물과 혼합하며, 혼합물을 가열하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하는 단계를 포함하여, 간 질환에 대한 개선된 예방 또는 치료 효과를 갖는 큰등골짚신나물 수용성 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라 짚신나물 속의 식물 종으로부터 수용성 추출물을 얻는 공정은 구체적으로는 식물의 전초를 건조시킨 후 분쇄하여 분쇄물을 증류수에 넣어 현탁시키고, 현탁액을 가열한 다음, 원심분리하여 불용 성분을 제거하여 수용성 추출액을 얻는 것을 포함하며, 이 추출액은 건조시키거나 액상태로 그대로 사용할 수 있다. 본 발명에 이르러 현탁액의 가열 온도 및 시간이 최종 수용성 추출물의 효능에 중대한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌으며 약 55℃ 이상의 온도로 가열하여 얻은 수용성 추출물이 현저히 증가된 효능을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 짚신나물 속 식물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물과 혼합하며, 혼합물을 약 55℃ 이상의 온도로 가열하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하는 단계를 포함하여, 간 질환에 대한 개선된 예방 또는 치료 효과를 갖는 짚 신나물속 식물 수용성 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물과 혼합하며, 혼합물을 약 55℃ 이상의 온도로 가열하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하여 제조된 짚신나물속 식물 수용성 추출물을 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또 다른 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물과 혼합하며, 혼합물을 약 55℃ 이상의 온도로 가열하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하여 제조된 짚신나물속 식물 수용성 추출물을 포함하는 간질환에 대한 식품 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 이르러 약 20℃ 내지 30℃의 온도로 7일 이상 가온하여 얻은 수용성 추출물이 현저히 증가된 효능을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 추가의 관점으로, 본 발명은 짚신나물 속 식물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물과 혼합하며, 혼합물을 20℃ 내지 30℃의 온도로 7일 이상 가온하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하는 단계를 포함하여, 간 질환에 대한 개선된 예방 또는 치료 효과를 갖는 짚신나물속 식물 수용성 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 추가의 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물과 혼합하며, 혼합물을 20℃ 내지 30℃의 온도로 7일 이상 가온하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하여 제조된 짚신나물속 식물 수용성 추출물을 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또 다른 추가의 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 분쇄시키고, 분쇄물을 물과 혼합하며, 혼합물을 20℃ 내지 30℃의 온도로 7일 이상 가온하여 추출액을 생성하고, 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하여 제조된 짚신나물속 식물 수용성 추출물을 포함하는 간질환에 대한 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따라 짚신나물 속의 식물 종으로부터 추출물을 얻는 다른 공정은 구체적으로는 식물의 전초를 메틸알콜과 같은 유기 용매로 추출한 후 비수용성 유기용매로 처리하여 유기용매 분획과 수용성 분획으로 분리하고, 계속해서 수용성 분획을 비수용성 유기용매로 처리하여 각각의 유기용매 분획과 수용성 분획을 얻는 것을 포함한다. 본 발명에 이르러, B형 간염바이러스 표면항원 및 외피항원의 억제, 바이러스 자체의 복제 억제 및 바이러스 DNA 폴리머라제의 활성 억제에 있어서, 짚신나물 속의 식물 종의 각 유기용매 분획이 수용성 분획에 비하여 적게는 약 1.5배 많게는 3배 이상의 현저히 높은 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 짚신나물 속 식물을 유기용매로 추출하여 수용성 분획을 제거하고 유기 용매 분획을 수득하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 간 질환에 대한 개선된 예방 또는 치료 효과를 갖는 짚신나물 속 식물 유기용매 가용성 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 다른 관점으로서, 본 발명은 짚신나물 속 식물을 유기 용매로 추출하여 수용성 분획을 제거하고 유기용매 분획을 수득하여 제조된 짚신나물속 식물 유기용매 가용성 추출물을 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또 다른 관점으로서, 본 발명은 짚신나물속 식물을 유기 용매로 추출하여 유기용매 분획을 수득하여 제조된 짚신나물속 식물 유기용매 가용 성 추출물을 포함하는 간 질환에 대한 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 사용되는 유기용매로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 에탄올, 메탄올, 부틸알콜, 이소프로판올 및 에틸렌글리콜과 같은 알콜, 염화메틸렌, 클로르포름 및 사염화탄소와 같은 할로겐 원자로 치환된 탄화수소류, 기타 테트라히드로푸란, 헥산, DMF(N,N-디메틸포름아미드), DMSO(디메틸설폭사이드), 에틸아세테이트 등이 포함된다.

B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)는 DNA 바이러스로서 인체에 감염되면 급성 간염뿐만 아니라 만성 간염을 일으키는 임상적으로 매우 중요한 바이러스이다. 게다가, 지속적인 만성 간염은 결국 간경화와 간암을 유발하는 것으로 알려져 있다(Peter J. Grob. Vaccine, 16: S11-S16(1998)). 따라서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 짚신나물 속 식물의 추출물은 간염바이러스 표면항원 및 외피항원의 억제, 바이러스 자체의 복제 억제 및 바이러스 DNA 폴리머라제의 활성 억제에 있어서 고도의 효과를 나타내므로 B형 간염의 예방 및 치료는 물론 간경화 및 간암의 예방 및 치료에 유용하다.

본 발명에 따른 짚신나물 속 식물의 추출물은 약제학적으로 유효한 양으로 단독으로 사용하거나 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 배합하여 함유하는 약제학적 조성물로서 투여할 수 있다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 예방에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 추출물의 양을 의미한다. 그러나, 본 발명의 짚신나물 속 식물의 추출물 및 이를 포함한 조성물의 총 일일 용량은 합리적인 의학 적 판단하에 의사에 의해 결정된다는 것은 누구나 이해할 것이다. 특정 환자에 대한 특정 유효 용량 수준은 질환 및 이의 중증도; 사용된 추출물의 활성; 사용된 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 건강, 성별 및 규정식; 사용된 특정 추출물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율; 치료 기간; 사용된 특정 추출물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 것이다. 예를 들면, 당업자는 목적하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 수준보다 낮은 수준에서 추출물의 용량을 정한 후 목적하는 효과가 달성될 때까지 서서히 증가시키는 것을 잘 알고 있다.

본 발명에 따른 짚신나물 속 식물의 추출물의 일일 약제학적 유효량은 최소 12주 동안에 60kg의 성인을 기준으로 하여 액상인 경우 추출액 10ml을 3회 복용하고, 정제나 캡슐인 경우 건조중량 20mg을 3회 복용하여 사용하며, 필요한 경우 위와 동량을 반복 사용하는 것이 바람직하다. 용량 수준은 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이, 투여시간, 배설율 및 투여 경로 등에 의해 적절히 변화될 수 있다.

본 발명의 짚신나물 추출물은 통상의 경로로 투여할 수 있으며 예를 들면 정제, 캡슐, 당의정 또는 필름 피막 정제, 액제 또는 현탁제의 경구 형태, 좌제의 직장 투여 형태, 근육내, 정맥내 및/또는 척수강내 및/또는 척수내 주사 또는 주입의 비경구 형태로 투여할 수 있다.

본 발명의 짚신나물 추출물은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합되어 특정 용량형의 약제학적 조성물로 제공된다. 약제학적 조성물은 보통 통상적인 방법에 따라 제형하고 약제학적으로 적합한 형태로 투여한다. 예를 들면, 경구용 고형제는 활성 화합물과 함께 희석제(예, 락토즈, 덱스트로즈, 자당, 셀룰로즈, 옥수수 전분 또는 감자 전분), 활탁제(예, 실리카, 탈크, 스테아린산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트 및/또는 폴리에틸렌 글리콜), 결합제(예, 전분, 아라빅 검, 젤라틴 메틸셀룰로즈, 카르복시메틸셀룰로즈 또는 폴리비닐 피롤리돈), 붕해제(예, 전분, 알긴산, 알기네이트 또는 나트륨 전분 글리콜레이트), 포르말 혼합물, 염료, 감미제, 습윤제(예, 레시틴, 폴리솔베이트, 라우릴설페이트) 및 일반적으로 약제에 사용되는 약물학적 불활성 물질을 함유할 수 있다. 이들 약제는 공지된 방법, 예를 들면 혼합, 과립화, 타정, 당의 또는 필름-피복 공정의 수단에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 짚신나물 추출물을 경구 투여하기 위한 다른 방식으로서, 액체 분산액을 예로 들 수 있으며 전형적으로는 시럽, 유화액 또는 현탁액일 수 있다. 현탁액 및 유화액은 담체로서 예를 들면 천연 검, 한천, 나트륨 알기네이트, 펙틴, 메틸셀룰로즈, 카르복시메틸셀룰로즈 또는 폴리비닐 알코올을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 짚신나물 속 식물의 추출물의 근육내 주사를 위한 현탁액 또는 용액은 활성성분과 함께 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면 멸균수, 올리브유, 에틸 올레에이트, 글리콜(예, 프로필렌 글리콜) 및 필요한 경우 적합한 양의 리도카인 하이드로클로라이드를 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 짚신나물 속 식물의 추출물의 정맥내 주사 또는 주입용 용액은 담체로서 예를 들면 멸균수를 함유하거나 바람직하게는 멸균, 수성, 등장성 염수 용액의 형태일 수 있거나 담체 프로필 렌 글리콜을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 짚신나물 속 식물의 추출물을 투여하기 위해 이용될 수 있는 좌제는 활성성분과 함께 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르 계면활성제 또는 레시틴을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 유효성분으로서 본 발명에 따른 짚신나물 속 식물의 추출물을 포함하여 간 질환을 예방 및 치료에 보조적인 역할을 하는 식품을 제공한다. 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 영양제(nutrient), 파머푸드(pharmafood), 건강 식품(health food), 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드(designer food), 식품 첨가제(food addtives) 등의 모든 형태에 해당한다. 당업자는 상기 유형의 식품 조성물과 관련하여 통상의 방식에 따라 다양한 형태로 만들 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 건강 식품은 주로 차, 쥬스, 젤리 및 드링크의 형태로 음용되는 것으로 민간 요법에서 흔히 이용되는 형태이다. 또한, 기능성 식품은 캔디, 요구르트, 비스켓, 버터, 마가린 등의 형태일 수 있다. 또한, 식품 첨가제는 분말 또는 농축액의 형태일 수 있다. 본 발명의 식품중에 본 발명에 따른 짚신나물 속 식물의 추출물의 적합한 농도는 예를 들면 식품 100 g 당 약 1 mg 내지 약 5 mg이다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 실시예를 통하여 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 짚신나물속 식물들의 추출물 제조

큰등골짚신나물(Agrimonia eupatoria L.), 짚신나물(Agrimonia pilosa L.), 산짚신나물(Agrimonia coreana N.) 및 털짚신나물(Agrimonia coreana N. for. pilosella Satake)의 전초를 각각 건조시킨 후 분쇄하여 분쇄물 1g 당 증류수 40ml을 가하고 60℃에서 1시간동안 추출반응을 시킨 다음, 그 추출액을 고속원심분리하고 상등액을 0.2um의 여과막을 통과시켜 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 획득하였다. 이 추출물을 건조시켰을 때 추출 상등액 1ml 당 건조무게는 각각 2.2mg이었다.

실시예 2: 짚신나물속 식물들로부터 추출한 추출물의 B형 간염바이러스 표면항원 억제 효과 측정

실험예 1: 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 B형 간염바이러스 표면항원 억제 효과 측정

실시예 1로부터 얻은 큰등골짚신나물 수용성 추출액(2.2mg/ml) 2ul, 4ul, 6ul을 간암 세포주 PLC/PRF/5가 배양되어 있는 96 플레이트의 각 웰에 총 부피가 100ul가 되도록 처리하였다. 48시간 후에 배양액 100ul를 B형 간염바이러스 표면항원에 대한 항체가 부착되어 있는 96 웰 플레이트에 옮기고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 퍼옥시데이스 효소가 결합되어 있는 표면항체 용액 25ul을 각 웰에 첨가하고 30분 반응시킨 후, 인산완충용액으로 마이크로플레이트를 5회 세척하고 퍼옥시데이스에 대한 기질용액을 첨가하여 발색시켰다. 발색된 용액은 효소면역측정기로 450nm에서 흡광계수를 측정하였다.

대조군은 추출용액을 가하지 않은 웰의 배양액으로 하였으며 비교군으로 환자의 HBV 양성 혈액(P.S)과 HBV 음성 혈액(N.S)을 사용하였다.

이의 결과는 도 2에 나타나 있다. 이 결과로부터 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 투여농도에 비례하여 간암 세포주 PLC/PRF/5의 배양액 내에서 B형 간염바이러스 표면항원이 감소하였음을 알 수 있다.

실험예 2: 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 B형 간염바이러스 외피항원 억제 효과 측정

실시예 1로부터 얻은 큰등골짚신나물 수용성 추출액(2.2mg/ml) 2.2ul, 4.4ul, 8.7ul을 HepG2 2.2.15 세포가 배양되어 있는 96 플레이트의 각 웰에 총 부피가 100ul가 되도록 처리하였다. 48시간 후에 배양액 100ul를 B형 간염바이러스 외피항원에 대한 항체가 부착되어 있는 96 웰 플레이트에 옮기고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 퍼옥시데이스 효소가 결합되어 있는 표면항체 용액 25ul을 각 웰에 첨가하고 30분 반응시킨 후, 인산완충용액으로 마이크로플레이트를 5회 세척하고 퍼옥시데이스에 대한 기질용액을 첨가하여 발색시켰다. 발색된 용액은 효소면역측정기로 450nm에서 흡광계수를 측정하였다.

대조군은 추출용액을 가하지 않은 웰의 배양액으로 하였으며 비교군으로 환 자의 HBV 양성 혈액(P.S)과 HBV 음성 혈액(N.S)을 사용하였다.

이의 결과는 도 3에 나타나 있다. 이 결과로부터 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 투여농도에 비례하여 HepG2 2.2.15 세포의 배양액 내에서 B형 간염바이러스 외피항원이 감소하였음을 알 수 있다.

실험예 3: 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 B형 간염바이러스 복제 억제 효과 검정

HepG2 2.2.15세포를 페트리디쉬에 키운 후, 실시예 1로부터 얻은 큰등골짚신나물 수용성 추출물을 각각 25, 50, 100 및 200ug씩 처리하고 37℃에서 3일간 배양시켰다. 배양액을 취하여 1,200rpm, 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻은 상등액을 10% 부피에 해당하는 양만큼 PEG(Polyethylene Glycol)을 넣고 4℃에서 1시간 반응시킨 후 3,000rpm, 15분간 원심분리하였다. 침전물을 1% TNE(10mM Tris-Cl, 100mM NaCl, 1mM EDTA) 용액에 녹인 후 페놀과 페놀/클로로포름 용액을 사용하여 불순물들을 제거하였다. 여기에 다시 100% 에탄올을 첨가하고 13,000rpm에서 10분간 원심분리하여 바이러스 DNA만 회수하였다. 회수한 바이러스를 아가로즈 겔에 전기영동하여 그 양을 비교하였다.

이 결과는 도 4에 나타나 있다. 이 결과로부터 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 투여 농도에 비례하여 바이러스 DNA 양이 줄어들고 있음을 확인할 수 있다.

실험예 4: 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 B형 간염바이러스 폴리머라제 억제 효과 검정

간염 환자의 혈액 1ml을 20% 수크로즈(sucrose)에 섞은 후 100,000g에서 16시간 고속원심분리를 하여 상등액을 제거 한 후 50mM Tris 100ul와 분석완충용액(100mM Tris (pH7.5), 300mM NH₄Cl, 4mM EDTA, 100mM MgCl₂, 4% 베타-머캅토에탄올, 2% NP-40) 50ul을 넣고 현탁시켰다. 현탁액에 dATP, dGTP, dTTP 각 8ul와 ³²P-표지된 dCTP 2ul를 넣은 후에 4개로 분주하였다. 여기에 실시예 1로부터 얻은 큰등골짚신나물 수용성 추출물을 각각 0, 31.25, 62.5, 125ug 씩 넣고 37℃에서 하루를 반응시켰다. 반응액에 프로테이나제 K(Proteinase K, 10mg/ml) 10ul을 넣고 37℃에서 2시간 반응시켜 폴리머라제(polymerase)를 제거하였다. 그런 후에 동위원소가 표지된 DNA만을 정제하기 위하여 페놀과 페놀/클로르포름을 사용하여 불순물을 제거한 다음 이소프로판올을 사용하여 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 70% 에탄올로 세척하고 건조시킨 다음 이것을 물에 녹인 후에 아가로즈 겔에 전기영동하였다. 전기영동한 후 이 겔을 니트로셀룰로즈 막에 전이 키트(Transfer Kit)을 이용하여 3시간 동안 이전하였다. 이 막을 X-선 필름을 이용하여 감광시킨 후에 현상하였다.

이 결과는 도 5에 나타나 있다. 이 결과로부터 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 처리 양에 비례해서 새로 합성된 바이러스 DNA 양이 줄음으로써 바이러스 DNA 폴리머라제의 활성을 억제함을 알 수 있다.

실험예 5: 짚신나물속 식물 추출물들의 B형 간염바이러스 표면항원 억제 효과의 비 교 측정

간암 세포주 PLC/PRF/5가 배양되어 있는 96 웰 플레이트에 상기 실시예 1로부터 얻은 큰등골짚신나물, 짚신나물, 산짚신나물 및 털짚신나물의 각 추출용액(2.2mg/ml) 2ul 및 4ul을 포함하는 배양액을 총 부피가 100ul가 되도록 처리하였다. 48시간 후에 배양액 100ul를 B형 간염바이러스 표면항원에 대한 항체가 부착되어 있는 96 웰 플레이트에 옮기고 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 퍼옥시데이스 효소가 결합되어 있는 표면항체 용액 25ul를 각 웰에 첨가하여 30분간 반응시켰다. 그 후 인산완충용액으로 플레이트를 5회 세척하고 퍼옥시데이스에 대한 기질용액을 첨가하여 발색시켰다. 발색된 용액은 효소면역측정기로 450nm에서 흡광계수를 측정하였다.

대조군은 추출용액을 가하지 않은 배양액으로 하였다.

이 결과는 도 6에 나타나 있다. 이 결과로부터, 짚신나물속 4 종의 식물들의 추출물들은 모두 투여농도에 비례하여 각각 간암 세포주 PLC/PRF/5의 배양액 내에서 B형 간염바이러스 표면항원을 감소시킨 한편, 큰등골짚신나물 추출물이 짚신나물, 산짚신나물 및 털짚신나물의 추출물에 비하여 간암 세포주 PLC/PRF/5의 배양액 내에서 B형 간염바이러스 표면항원을 현저히 높은 정도로 감소시켰음을 알 수 있다.

실시예 3: 추출반응의 온도에 따른 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 B형 간염바이러스 표면항원 억제 효과의 비교 측정

큰등골짚신나물의 전초를 건조시킨 후에 분쇄하여 분쇄물 1g 당 증류수 40ml을 가하고 각각 37℃, 45℃, 55℃ 및 60℃에서 1시간동안 추출반응을 시켰다. 추출액을 고속원심분리하여 불용 성분을 제거한 후 상등액을 0.2um의 여과막을 통과시켜 불용 성분을 제거한 다음 건조시켜 단위 건조무게를 측정하였다. 이때 추출 상등액 1ml 당 건조무게는 2.2mg이었다. 각 추출용액(2.2mg/ml) 2ul, 4ul 및 6ul을 포함하는 배양액을 총 부피가 100ul가 되도록 처리하였다. 48시간 후에 배양액 100ul를 B형 간염바이러스 표면항원에 대한 항체가 부착되어 있는 96 웰 플레이트에 옮기고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 퍼옥시데이스 효소가 결합되어 있는 표면항체 용액 25ul을 각 웰에 첨가하고 30분 반응시킨 후, 인산완충용액으로 마이크로플레이트를 5회 세척하고 퍼옥시데이스에 대한 기질용액을 첨가하여 발색시켰다. 발색된 용액은 효소면역측정기로 450nm에서 흡광계수를 측정하였다.

대조군은 추출용액을 가하지 않은 웰의 배양액으로 하였다.

이 결과는 도 7에 나타나 있다. 이 결과로부터 추출반응의 온도를 증가시킴에 따라 동일처리농도에서 B형 간염바이러스 표면항원을 감소시키는 비율이 약 55℃ 이상의 온도로 가열하여 얻은 큰등골짚신나물 수용성 추출물에 의해 현저히 증가함을 알 수 있다.

실시예 4: 추출반응의 시간에 따른 큰등골짚신나물 수용성 추출물의 B형 간염바이러스 표면항원 억제 효과의 비교 측정

큰등골짚신나물의 전초를 건조시킨 후에 분쇄하여 분쇄물 1g 당 증류수 40ml 을 가하여 25℃에서 각각 3, 5 및 7일간 추출반응을 시킨 다음, 추출액을 고속원심분리하여 불용 성분을 제거한 후 상등액을 이용하였다. 각 추출물(2.2mg/ml) 2ul 및 4ul을 포함하는 배양액을 총 부피가 100ul가 되도록 처리하였다. 48시간 후에 배양액 100ul를 B형 간염바이러스 표면항원에 대한 항체가 부착되어 있는 96 웰 플레이트에 옮기고 37℃에서 1시간 반응한 후, 퍼옥시데이스 효소가 결합되어 있는 표면항체 용액 25ul를 각 웰에 첨가하여 30분간 반응시켰다. 그 후 인산완충용액으로 플레이트를 5회 세척하고 퍼옥시데이스에 대한 기질용액을 첨가하여 발색시켰다. 발색된 용액은 효소면역측정기로 450nm에서 흡광계수를 측정하였다.

대조군은 추출용액을 가하지 않은 배양액으로 하였다.

이 결과는 도 8에 나타나 있다. 이 결과로부터 큰등골짚신나물 수용성 추출물은 25℃의 온도하에서 7일 동안의 추출반응 후에 B형 간염바이러스 표면항원에 대한 억제효과가 현저히 증가하였음을 알 수 있다.

실시예 5: 큰등골짚신나물의 용매 분획별 표면항원에 대한 억제 효과 측정

도 1에 도시한 추출방법에 따라, 큰등골짚신나물 전초(10.015g)를 메틸알콜로 추출하였다. 추출물에 비수용성 유기용매인 헥산을 동량 처리하여 헥산 분획(0.145g)과 수용성 분획으로 분리하였다. 수용성 분획에 동량의 클로르포름을 처리하여 클로르포름 분획(0.329g)과 수용성 분획으로 분리하였다. 수용성 분획에 다시 동량의 부틸알콜을 처리하여 부틸알콜 분획(0.807g)과 분별 분획한 후 남은 수용성 분획(0.462g)으로 분리하였다. 각각의 분획을 완전히 건조시키고 메틸알콜 에 용해시켜 실험에 이용하였다.

간암 세포주 HepG2 2.2.15가 배양되어 있는 96 웰 플레이트에 각 분획 2ug, 5ug, 10ug을 투여한 후 48시간 동안 반응시켰다. 후에 배양액 100ul를 B형 간염바이러스 표면항원에 대한 항체가 부착되어 있는 96 웰 플레이트에 옮기고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 퍼옥시데이스 효소가 결합되어 있는 표면항체 용액 25ul을 각 웰에 첨가하고 30분 반응시킨 후, 인산완충용액으로 마이크로플레이트를 5회 세척하고 퍼옥시데이스에 대한 기질용액을 첨가하여 발색시켰다. 발색된 용액은 효소면역측정기로 450nm에서 흡광계수를 측정하였다.

대조군은 추출용액을 가하지 않은 웰의 배양액으로 하였다.

이 결과는 도 9에 나타나 있다(H: 헥산 분획; C: 클로르포름 분획; B: 부틸알콜 분획; Aq: 수용성 분획). 이 결과로부터 각 유기 용매의 분획이 분별 분획한 이후에 남은 수용성 분획보다 B형 간염바이러스의 표면항원 억제능이 더 높게 나타났음을 알 수 있다.

실시예 6: 큰등골짚신나물의 용매 분획별 외피항원에 대한 억제 효과 측정

실시예 5로부터 얻은 큰등골짚신나물의 헥산 분획, 클로르포름 분획, 부틸알콜 분획 및 수용성 분획을 간암 세포주 HepG2 2.2.15가 배양되어 있는 96 웰 플레이트에 2ug, 5ug 및 10ug을 투여한 후 48 시간동안 반응시켰다. 후에 배양액 100ul를 B형 간염바이러스 외피항원에 대한 항체가 부착되어 있는 96 웰 플레이트에 옮기고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 퍼옥시데이스 효소가 결합되어 있는 e항체 용액 25ul을 각 웰에 첨가하고 30분 반응시킨 후, 인산완충용액으로 마이크로플레이트를 5회 세척하고 퍼옥시데이스에 대한 기질용액을 첨가하여 발색시켰다. 발색된 용액은 효소면역측정기로 450nm에서 흡광계수를 측정하였다.

대조군은 추출용액을 가하지 않은 웰의 배양액으로 하였다.

이 결과는 도 10에 나타나 있다. 이 결과로부터 헥산(H), 클로르포름(C), 부틸알콜(B) 분획이 분별 분획한 이후에 남은 수용성(Aq) 분획보다 B형 간염바이러스의 외피항원 억제능이 더 높게 나타났다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 짚신나물 속 식물의 추출물, 특히 큰등골짚신나물의 추출물은 간 질환의 치료 및 예방에 효과가 우수하다.

Claims

약제학적 유효량의 큰등골짚신나물 추출물을 포함하는, B형 간염바이러스에 의해 유발되는 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 추출물이 수용성인 약제학적 조성물
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큰등골짚신나물, 산짚신나물 또는 털짚신나물을 분쇄하여 분쇄물을 물과 혼합하고, 상기 혼합물을 가열하여 추출액을 생성하며, 상기 추출액으로부터 불용 성분을 제거하여 수용성 추출물을 수득하는 단계를 포함하여 구성되는, B형 간염바이러스에 의해 유발되는 간 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 큰등골짚신나물, 산짚신나물 또는 털짚신나물의 수용성 추출물을 제조하는 방법.
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큰등골짚신나물, 산짚신나물 또는 털짚신나물을 유기 용매로 추출하여 수용성 분획을 제거하고 유기 용매 분획을 수득하는 단계를 포함하여 구성되는, B형 간염바이러스에 의해 유발되는 간 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 큰등골짚신나물, 산짚신나물 또는 털짚신나물 유기 용매 가용성 추출물을 제조하는 방법.
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제 15항의 방법에 따라 제조된 큰등골짚신나물, 산짚신나물 또는 털짚신나물 유기 용매 가용성 추출물을 포함하는, B형 간염바이러스에 의해 유발되는 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.