CN101579478A - 中药复方五子抵瘤抗肿瘤活性有效部位组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种由五味子、山茱萸、金樱子、诃子、白及五味药组成的中药复方WZDL的药物及其组合物。以及从该组合物中分离制备总木脂素(WZDLI)、总皂苷(WZDLII)、总多糖(WZDLIII)、总鞣质(WZDLV)有效部位的方法及含有有效部位活性成分的组合物在抗肿瘤药物中的应用。本发明的有效部位制备方法，具有工艺简单，收率高，经济且环境污染小，易于大规模的工业化生产等特点。同时本发明制备含有抗肿瘤活性成分的中药有效部位组合物经体内、体外药理活性研究表明：总木脂素(WZDLI)、总皂苷(WZDLII)、总多糖(WZDLIII)、总鞣质(WZDLV)及其组合物均具有较好的抗肿瘤活性，有望研制成低毒高效的肿瘤治疗的中药复方制剂。

Description

中药复方五子抵瘤抗肿瘤活性有效部位组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于中药制剂技术领域，涉及含有抗肿瘤的中药复方组成、有效部位及其制备方法；更进一步涉及中药复方有效部位的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

随着人类生活环境和水平的不断变化，恶性肿瘤已经成为当今世界上威胁人类健康的最严重疾病之一，其发病率和死亡率位居榜首，成为人类健康的头号大敌。因此预防和治疗恶性肿瘤疾病药物的研发日益成为医药界的研究热点，由于临床常用的化疗药物本身的缺陷，使具有抗肿瘤活性的传统中药越来越受到科研人员的高度重视。

中医学认为由于人体正气内虚，脏腑功能失调，以致邪毒乘虚而入，蕴及于经络脏腑，使得机体阴阳失调，气血功能障碍，导致气滞，血瘀，痰凝，毒聚相互结交的一系列病理变化，日久而形成肿瘤。因此，中医治疗肿瘤的方法，主要为扶正和祛邪两个方面。扶正的方法有补气，补血，滋阴温阳等；祛邪的方法有清热解毒，化瘀软坚等。中医药治疗癌症有其独特优势：即“祛邪不伤正”因而避免了一些风险大，复发率高、后遗症多的手术；也没有化疗药物的毒副反应和难以耐受的弊端，从而提高了部分患者的生存质量和生存率，在与癌症的斗争中，中医药显示了不可忽视的作用。

发明内容

本发明的目的之一提供一种抗肿瘤中药复方及其组成和剂量配比。

本发明的目的之二是提供一种抗肿瘤有效部位及其制备方法。

本发明的目的之三是提供以所述有效部位的药物组合的各种制剂。

本发明的目的之四是提供所述有效部位在制备抗肿瘤及其相关药物中的应用。

中药复方一般以药材(饮片)入药，存在着剂量大，服用不方便等诸多不利因素。提取中药复方有效部位，对其药理活性进行验证，进一步将有效部位复配，制成有效部位复方是一条可行的路子。本发明涉及的中药复方含有总木脂素、总皂苷、总多糖、总鞣质中的一种或多种有效部位，这些有效部位因其结构特点，表现出抗肿瘤，抗病毒，抗菌消炎，增强免疫功能等多方面的生物活性。在研究中药复方及其组成和剂量配比的基础上，寻找和发现中药复方抗肿瘤有效部位及其制备方法及其应用十分必要。因此，本发明提供了含有抗肿瘤活性成分的中药有效部位组合物，由五味子10～50g，山茱萸10～60g，金樱子10～80g，诃子为5～30g，白及10～20g中的总木脂素、总皂苷、总多糖、总鞣质中的一种或多种有效部位组成。

本发明所述的有效部位可以总木脂素、总皂苷、总多糖、总鞣质中的一种或多种有效部位组成以及药学上可接受的载体混合制成各种制剂。例如口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。

本发明所述含有抗肿瘤活性成分的中药有效部位组合物的制备方法，其特征在于该有效部位是由下述方法制备而成：

(1)将山茱萸药材用8倍量90％的乙醇浸泡4h后，回流提取2h，同样方法再重复提取2次，合并滤液，旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，常压50℃干燥，最后称重得浸膏，取浸膏适量，溶于水后，过滤，沉淀用蒸馏水洗3次，干燥后得粗总皂苷；

(2)金樱子和诃子等量，粉碎过10目筛。装入渗漉桶，用1∶6丙酮-水(4∶1)浸泡4天，然后开始以2ml/min的速度进行渗漉，并不断填加新的渗漉溶剂，至渗滤液澄清，减压回收溶剂只有很少固形物，明胶实验也基本没有沉淀为止，渗漉液减压浓缩回收溶剂至基本不含丙酮，浓缩液有沉淀析出，减压抽滤，滤液回收，沉淀水洗干燥得淡黄色粉末，定性鉴别为总鞣质；

(3)五味子药材，加8倍量95％的乙醇溶液，浸泡过夜，回流提取2h，同法重复提取2次，合并滤液，减压回收溶剂，得提取浸膏，浸膏于40℃真空干燥2d，称取浸膏，加氯仿超声溶解，加少量硅胶拌匀，在硅胶柱表面均匀铺上样品。先用石油醚洗脱，至回收后没有残留物，合并石油醚洗脱产物，除色素。再用氯仿洗脱，洗脱液回收浓缩，合并，减压蒸干溶剂得总木脂素；

(4)白及药材，磨碎成粉，加8倍水浸泡1d。转移入渗漉桶，以7ml/min的流速进行渗漉，至流出液不再粘稠。渗漉液加热浓缩至药材/渗滤液1∶1，加无水乙醇沉淀，使混合液中含醇量约85％，白及多糖充分沉淀后，减压抽滤，固体再依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗掉脂溶性杂质。充分干燥后，得到白色的白及多糖粉末；

(5)其中所述有效部位总皂苷采用的大孔吸附树脂纯化，经过静态吸附和动态吸附两个方面，筛选出HPD-300型大孔吸附树脂分离、纯化总皂苷效果较好，洗脱溶媒为50％-70％乙醇；所述有效部位总鞣质的纯化采用梯度萃取法，结果表明氯仿、乙醚部位主要是脂溶性杂质和色素，鞣质集中在乙酸乙酯萃取部位，且纯度较高；所述有效部位总多糖选用的MG-1大孔吸附树脂脱色效果明显，Sevag法除蛋白。

本发明同时也提供了一种抗肿瘤中药复方制剂及其组成和剂量配比：它五味子五味子10～50g，山茱萸10～60g，金樱子10～80g，诃子为5～30g，白及10～20g中的总木脂素、总皂苷、总多糖、总鞣质中的一种或多种有效部位与药学上可接受的载体组成。其制备方法如下：

1)将山茱萸药材用8倍量90％的乙醇浸泡4h后，回流提取2h，同样方法再重复提取2次，合并滤液，旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，常压50℃干燥，最后称重得浸膏，取浸膏适量，溶于水后，过滤，沉淀用蒸馏水洗3次，干燥后得粗总皂苷；

(2)金樱子和诃子等量，粉碎过10目筛。装入渗漉桶，用1∶6丙酮-水(4∶1)浸泡4天，然后开始以2ml/min的速度进行渗漉，并不断填加新的渗漉溶剂，至渗滤液澄清，减压回收溶剂只有很少固形物，明胶实验也基本没有沉淀为止，渗漉液减压浓缩回收溶剂至基本不含丙酮，浓缩液有沉淀析出，减压抽滤，滤液回收，沉淀水洗干燥得淡黄色粉末，定性鉴别为总鞣质；

(3)五味子药材，加8倍量95％的乙醇溶液，浸泡过夜，回流提取2h，同法重复提取2次，合并滤液，减压回收溶剂，得提取浸膏，浸膏于40℃真空干燥2d，称取浸膏，加氯仿超声溶解，加少量硅胶拌匀，在硅胶柱表面均匀铺上样品。先用石油醚洗脱，至回收后没有残留物，合并石油醚洗脱产物，除色素。再用氯仿洗脱，洗脱液回收浓缩，合并，减压蒸干溶剂得总木脂素；

(4)白及药材，磨碎成粉，加8倍水浸泡1d。转移入渗漉桶，以7ml/min的流速进行渗漉，至流出液不再粘稠。渗漉液加热浓缩至药材/渗滤液1∶1，加无水乙醇沉淀，使混合液中含醇量约85％，白及多糖充分沉淀后，减压抽滤，固体再依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗掉脂溶性杂质。充分干燥后，得到白色的白及多糖粉末；

(5)将上述分离得到的5个有效部位中的一个或多个与药学上可接受的载体混合制成复方制剂。

本发明所涉及的抗肿瘤中药复方制剂或含有有效部位的组合物，其组方由五味子、山茱萸、金樱子、诃子、白及五味药原料药组成。中药复方WZDL是根据中医药君臣佐使理论，优选五种中药组合而成。中医药在中国用于治疗肿瘤已有悠久的历史，并形成了自己独有的一套完整体系。中医药治疗肿瘤的方法主要有扶正固本、活血化淤、清热解毒等，这些方法是针对肿瘤本身，起到抑制或杀灭肿瘤的作用。然而，肿瘤具有侵袭和转移的特性，肿瘤发展到后期在人体内形成多处转移是肿瘤患者死亡的主要原因。因此，针对这一特性，拟研究收敛固涩法治疗肿瘤转移作用。复方WZDL由中药中经典的收敛固涩药组成，君药五味子“主益气，咳逆上气，劳伤羸瘦，补不足，强阴，益男子精”(《本经》)，“养五脏，除热，生阴中肌”(《本经》)，“补元气不足，收耗散之气”(李杲)；君药山茱萸“壮元气，秘精”(《雷公炮炙论》)，“主心下邪气寒热，温中，逐寒湿痹，去三虫”(《本经》)；臣药诃子“生用则能清金行气，煨用则能暖胃固肠”(《本草通玄》)，“消痰，下气，除烦治水，调中”(《日华子本草》)；佐药金樱子“收虚汗，敛虚火，益精髓，壮筋骨，补五藏，养血气”(《本草正》)；使药白及“治痨伤肺气，补肺虚，止咳嗽，消肺痨咳血，收敛肺气”(《滇南本草》)，“主痈疽恶疮败疽，伤阴死肌，胃中邪气，贼风痱缓不收”(《本经》)^[2]。诸药合用，收敛固涩，收敛正气，防止正气耗散，纠正虚失固状态；固涩癌毒，防止和减少癌毒的扩散和转移。

本发明所述中药复方组成或含有有效部位组合物制剂的制备方法如下：

使用标准和常规的技术，将本发明4个有效部位中的一个或多个与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成各种制剂。这些制剂形式包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。所述的药学上可接受的固体或液体载体，包括制剂中常规的稀释剂、填充剂(如乳糖、聚乙二醇)，粘合剂(淀粉、微晶纤维素)，崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素)，润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)，湿润剂(如丙二醇、乙醇)，稳定剂(EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠、烟酰胺)等等。其中固体剂型包括片剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、干淀粉、聚山梨酯-80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。

本发明所述中药复方制剂或含有有效部位组合物以及单元剂型中含有的活性成份的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定的加以应用，所用(活性成分的有效部位)的量或浓度在一个较宽的范围内调节，通常，活性成分的有效部位的量范围为组合物的0.5％～90％(重量)。另一优选的范围为0.5％-70％。

本发明所涉及的复方药材有效部位的具体提取方法如下：

(1)将山茱萸药材用8倍量90％的乙醇浸泡4h后，回流提取2h，同样方法再重复提取2次，合并滤液，旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，常压50℃干燥，最后称重得浸膏，取浸膏适量，溶于水后，过滤，沉淀用蒸馏水洗3次，干燥后得粗总皂苷；

(2)金樱子和诃子等量，粉碎过10目筛。装入渗漉桶，用1∶6丙酮-水(4∶1)浸泡4天，然后开始以2ml/min的速度进行渗漉，并不断填加新的渗漉溶剂，至渗滤液澄清，减压回收溶剂只有很少固形物，明胶实验也基本没有沉淀为止，渗漉液减压浓缩回收溶剂至基本不含丙酮，浓缩液有沉淀析出，减压抽滤，滤液回收，沉淀水洗干燥得淡黄色粉末，定性鉴别为总鞣质；

(3)五味子药材，加8倍量95％的乙醇溶液，浸泡过夜，回流提取2h，同法重复提取2次，合并滤液，减压回收溶剂，得提取浸膏，浸膏于40℃真空干燥2d，称取浸膏，加氯仿超声溶解，加少量硅胶拌匀，在硅胶柱表面均匀铺上样品。先用石油醚洗脱，至回收后没有残留物，合并石油醚洗脱产物，除色素。再用氯仿洗脱，洗脱液回收浓缩，合并，减压蒸干溶剂得总木脂素；

(4)白及药材，磨碎成粉，加8倍水浸泡1d。转移入渗漉桶，以7ml/min的流速进行渗漉，至流出液不再粘稠。渗漉液加热浓缩至药材/渗滤液1∶1，加无水乙醇沉淀，使混合液中含醇量约85％，白及多糖充分沉淀后，减压抽滤，固体再依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗掉脂溶性杂质。充分干燥后，得到白色的白及多糖粉末；

(5)将上述分离得到的5个有效部位中的一个或多个与药学上可接受的载体混合制成复方制剂。

本发明所述的复方有效部位系上述4个有效部位之一或各部位的自由组合物。例如WZDL I与WZDL II，组合WZDL I与WZDL III组合；WZDL I与WZDL II和WZDLIII组合；WZDL II与WZDL III组合；WZDL I与WZDL II和WZDLV组合；其中WZDLI、WZDL II、WZDL III、WZDL V组合效果最好。

本发明进一步提供了各有效部位组合物在制备抗肿瘤药物中的应用；其中的肿瘤包括：人乳腺癌、肝癌、人食管癌细胞、肺癌。下面通过体内、体外抗肿瘤实验进一步说明本发明各有效部位组合物的药理活性。

(1)体外抗肿瘤实验：分别以抑制MCF-7、Hep-G2、9706、A549细胞增殖能力为指标。取人乳腺癌细胞系MCF-7、肝癌细胞系Hep-G2、人食管癌细胞9706、肺癌A549细胞系在含10％小牛血清的RPMI一1640培养液，37℃，5％CO₂培养箱中生长至细胞旺盛，取对数生长期的细胞进行实验，经0.25％胰酶后加入0.02％EDTA消化，制成细胞悬液，将细胞悬液均匀接种于96孔微量培养板中(细胞个数为2×10⁴个/孔)100μl，培养过夜，给药组分别加入不同剂量的预处理好的药物浓度，对照组加入相应的培养液，终体积为200μl/孔，继续培养48h，加2mg/ml MTT40μl(四甲基偶氮唑：Sigma)，培养4h，弃去上清液，加二甲基甲酰胺(DMSO)150μl，于恒温震荡器震荡3min，待蓝色结晶体完全溶解，用酶标仪在550nm波长处测定吸光度(OD)值，并按下列公式计算其抑制率。抑制率计算公式：抑制率(％)＝[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100％。有效部位对四种肿瘤细胞株的抑制作用结果以OD±S表示。计算50％细胞杀伤时药物浓度(IC₅₀)，IC₅₀采用加权直线回归法处理。

(2)体外抗肿瘤粘附实验：肿瘤自原发部位向远处转移，首先要侵袭并粘附在毗邻的细胞外基质和基底膜上，才能分泌一系列酶来降解基底膜继而进入循环系统；肿瘤细胞随循环系统迁移，要在远处定居，首先也要能粘附在基底膜上。所以，粘附参与肿瘤侵袭转移的整个过程并起重要作用。细胞外基质的成分纤维连接蛋白(FN)是肿瘤细胞粘附的重要靶点，本文的思路是以肿瘤细胞对FN的粘附性作为肿瘤转移能力的一个指标，筛选抗肿瘤转移的药效部位。本方法以各有效部位的肿瘤细胞毒性实验结果为参照，在不杀死大部分肿瘤细胞的前提下设计药物浓度。测定肿瘤细胞与基底膜成分的粘附能力，将FN铺于96孔培养板中，然后加入肿瘤细胞，经过一定时间的孵育后冲洗掉未粘附的细胞，粘附于FN上的细胞数量用MTT法测定的吸光值来反映。

具体操作步骤如下：

(1)用预冷的tip无菌操作吸取Fn，稀释至20μl/ml。

(2)96孔培养板每孔加入0.1ml(2μg)稀释后的Fn，于超净台内室温干燥备用。

(3)加入2％BSA20μl/孔封阻非特异性位点，置37℃培养箱，保温1小时，PBS冲洗并弃去。

(4)对数生长期的肿瘤细胞悬浮于含0.1％BSA的RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度1×10⁶个/ml。

(5)用不同浓度的药物预处理肿瘤细胞24小时。

(6)以含0.1％BSA的RPMI-1640无血清培养基悬浮肿瘤细胞，调整细胞浓度，每孔加入4×10⁴个预处理的细胞，设3个复孔，对照组加等量的PBS，37℃孵育1小时。

(7)弃培养基，用PBS液轻轻冲洗2次，弃去未粘附细胞。

(8)每孔加入50μl MTT(1g/L)，37℃继续培养4小时。

(9)吸取MTT，每孔加入100μl DMSO用恒温振荡器振摇15分钟，使甲臜完全溶解。

(10)490nm波长酶标仪测定处每孔的OD值，每实验组均设立对照组，以残留细胞计算出粘附抑制率。

实验结果

粘附抑制率计算公式：

有效部位对四种肿瘤细胞株的抗粘附作用结果以OD±S表示，计算出粘附抑制率。

(3)体内抗肿瘤实验：主要观察各有效部位给药后，对小鼠肝癌H₂₂肿瘤的抑制作用。选择腹腔接种6～8天，生长良好的荷H22肝癌小鼠，颈椎脱臼处死，无菌抽取腹水，以无菌生理盐水按1∶2比例稀释成5.4×10⁷个/ml瘤细胞悬液，接种于健康小鼠右前肢腋部皮下，每只0.2mL，接种。接种次日，按体重随机分组，对照组(水)，阳性对照组(顺铂)，有效部位总木脂素(WZDL I)、总皂苷(WZDL II)、总多糖(WZDL III)、总鞣质(WZDLV)小剂量，中剂量，大剂量及这四个有效部位等比例组合(1∶1∶1∶1)，灌胃给予0.6ml受试药物高、中、低剂量，每日1次，连续9天。对照组给予生理盐水，每只0.3ml。阳性对照组腹腔注射顺(5mg·kg^-1·d^-1)，每次给药0.2ml，隔天给药1次，共给药3次。每日观察小鼠的一般活动、皮毛、粪便等情况。于末次给药后24h颈椎脱臼处死小鼠，剥取肿瘤组织，称重，同时剖取小鼠肝、脾脏、胸腺，观察小鼠的生理指标，并按下列公式计算其抑瘤率。

抑瘤率计算公式：

抑瘤率(％)＝[(空白组瘤重值-给药组瘤重值)/空白组瘤重值]×100％

体内抗肿瘤实验整体解剖实验观察，得出数据结果采用SAS统计学软件处理。结果表明：各有效部位不同剂量对肝癌H₂₂抑制作用不同，其中WZDL I和四组等比例组配抑制肿瘤的效果最好，分别为48.3％和50.9％，同时对免疫功能系统损伤小，起到保护作用。

具体实施方式

以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

有效部位的制备方法：

五味子、山茱萸、金樱子、诃子、白及洗净干燥后进行有效部位的提取纯化。

实施例2

将山茱萸药材用8倍量90％的乙醇浸泡4h后，回流提取2h，同样方法再重复提取2次，合并滤液，旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，常压50℃干燥，最后称重得浸膏，取浸膏适量，溶于水后，过滤，沉淀用蒸馏水洗3次，干燥后采用的大孔吸附树脂纯化，经过静态吸附和动态吸附两个方面，筛选出HPD-300型大孔吸附树脂分离、纯化总皂苷效果较好，洗脱溶媒为50％-70％乙醇，纯化后得到总皂苷WZDL II。

实施例3

金樱子和诃子等量，粉碎过10目筛。装入渗漉桶，用1∶6丙酮-水(4∶1)浸泡4天，然后开始以2ml/min的速度进行渗漉，并不断填加新的渗漉溶剂，至渗滤液澄清，减压回收溶剂只有很少固形物，明胶实验也基本没有沉淀为止，渗漉液减压浓缩回收溶剂至基本不含丙酮，浓缩液有沉淀析出，减压抽滤，滤液回收，沉淀水洗干燥得淡黄色粉末，定性鉴别为鞣质，总鞣质的纯化采用梯度萃取法，不同极性的有机溶剂萃取，结果表明氯仿、乙醚部位主要是脂溶性杂质和色素，鞣质集中在乙酸乙酯萃取部位，且纯度较高，回收乙酸乙酯层得到有效部位WZDLV。

实施例4

五味子药材，加8倍量95％的乙醇溶液，浸泡过夜，回流提取2h，同法重复提取2次，合并滤液，减压回收溶剂，得提取浸膏，浸膏于40℃真空干燥2d，称取浸膏，加氯仿超声溶解，加少量硅胶拌匀，在硅胶柱表面均匀铺上样品。先用石油醚洗脱，至回收后没有残留物，合并石油醚洗脱产物，除色素。再用氯仿洗脱，洗脱液回收浓缩，合并，减压蒸干溶剂得总木脂素WZDL I；

实施例5

白及药材，磨碎成粉，加8倍水浸泡1d。转移入渗漉桶，以7ml/min的流速进行渗漉，至流出液不再粘稠。渗漉液加热浓缩至药材/渗滤液1∶1，加无水乙醇沉淀，使混合液中含醇量约85％，白及多糖充分沉淀后，减压抽滤，固体再依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗掉脂溶性杂质。充分干燥后，得到白色的白及多糖粉末，总多糖选用的MG-1大孔吸附树脂脱色，Sevag法除蛋白后得到纯化后的总多糖WZDLIII。

实施例6：

有效部位对人乳腺癌细胞系MCF-7的抑制结果体外抗肿瘤活性实验

肿瘤细胞株：人乳腺癌细胞系MCF-7在含10％小牛血清的RPMI-1640培养液，温度37℃，5％CO2培养箱中生长至细胞旺盛，取对数生长期的细胞进行实验，经0.25％胰酶后加入0.02％EDTA消化，制成细胞悬液，将细胞悬液均匀接种于96孔微量培养板中(细胞个数为2×104个/孔)100μl，培养过夜，给药组分别加入不同剂量的有效部位，对照组加入相应的培养液，终体积为200μl/孔，继续培养48h，加2mg/ml MTT40μl，培养4小时，弃去上清液，加DMSO 150μl，于恒温震荡器震荡10min，待蓝色结晶体完全溶解，用酶标仪在550nm波长处测定吸光度(OD)值，并按下列公式计算其抑制率。有效部位对肿瘤细胞株的抑制作用结果以OD±S表示。

抑制率计算公式：

抑制率(％)＝[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100％

计算50％细胞杀伤时药物浓度(IC50)，IC50采用加权直线回归法处理。

对人乳腺癌细胞系MCF-7的抑制结果：

总木脂素50μg/ml即达到84.7％的抑制率，且随浓度升高抑制率有所提高，总皂苷和有效部位组合物的IC50分别为：87.4μg/ml，495.3μg/ml。

与空白组比较，*P＜0.01，**P＜0.05

实施例7

有效部位对人乳腺癌细胞系HepG2的抑制结果体外抗肿瘤活性实验

肿瘤细胞株：人乳腺癌细胞系HepG2在含10％小牛血清的RPMI一1640培养液，温度37℃，5％CO2培养箱中生长至细胞旺盛，取对数生长期的细胞进行实验，经0.25％胰酶后加入0.02％EDTA消化，制成细胞悬液，将细胞悬液均匀接种于96孔微量培养板中(细胞个数为2×104个/孔)100μl，培养过夜，给药组分别加入不同剂量的有效部位，对照组加入相应的培养液，终体积为200μl/孔，继续培养48h，加2mg/ml MTT40μl，培养4小时，弃去上清液，加DMSO 150μl，于恒温震荡器震荡10min，待蓝色结晶体完全溶解，用酶标仪在550nm波长处测定吸光度(OD)值，并按下列公式计算其抑制率。有效部位对肿瘤细胞株的抑制作用结果以OD±S表示。

抑制率计算公式：

抑制率(％)＝[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100％

计算50％细胞杀伤时药物浓度(IC50)，IC50采用加权直线回归法处理。

总木脂素和总皂苷号药对HepG2的抑制率也很高，最低剂量50μg/ml时的分别为92.9％、67.4％，且随着浓度增大，抑制率都不低于50％，有效部位组配药的IC50分别为365.1μg/ml。

与空白组比较，*P＜0.01，**P＜0.05

实施例8

有效部位对人食管癌细胞系9706的抑制结果体外抗肿瘤活性实验

肿瘤细胞株：人食管癌细胞系9706在含10％小牛血清的RPMI一1640培养液，温度37℃，5％CO2培养箱中生长至细胞旺盛，取对数生长期的细胞进行实验，经0.25％胰酶后加入0.02％EDTA消化，制成细胞悬液，将细胞悬液均匀接种于96孔微量培养板中(细胞个数为2×104个/孔)100μl，培养过夜，给药组分别加入不同剂量的有效部位，对照组加入相应的培养液，终体积为200μl/孔，继续培养48h，加2mg/ml MTT40μl，培养4小时，弃去上清液，加DMSO 150μl，于恒温震荡器震荡10min，待蓝色结晶体完全溶解，用酶标仪在550nm波长处测定吸光度(OD)值，并按下列公式计算其抑制率。有效部位对肿瘤细胞株的抑制作用结果以OD±S表示。

抑制率计算公式：

抑制率(％)＝[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100％

计算50％细胞杀伤时药物浓度(IC50)，IC50采用加权直线回归法处理。

木脂素、总皂苷及有效部位组合物的IC50分别为：625μg/ml、262.5μg/ml、38.1μg/ml。

与空白组比较，*P＜0.01，**P＜0.05

实施例9

有效部位对人食管癌细胞系9706的抑制结果体外抗肿瘤细胞粘附实验

细胞外基质的成分纤维连接蛋白(FN)是肿瘤细胞粘附的重要靶点，本方法以各有效部位的肿瘤细胞毒性实验结果为参照，在不杀死大部分肿瘤细胞的前提下设计药物浓度。测定肿瘤细胞与基底膜成分的粘附能力，将FN铺于96孔培养板中，然后加入肿瘤细胞，经过一定时间的孵育后冲洗掉未粘附的细胞，粘附于FN上的细胞数量用MTT法测定的吸光值来反映。

实验步骤

用预冷的tip无菌操作吸取Fn，稀释至20μl/ml，96孔培养板每孔加入0.1ml(2μg)稀释后的Fn，于超净台内室温干燥备用。加入2％BSA20μl/孔封阻非特异性位点，置37℃培养箱，保温1小时，PBS冲洗并弃去。对数生长期的肿瘤细胞悬浮于含0.1％BSA的RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度1×10⁶个/ml。用不同浓度的药物预处理肿瘤细胞24小时，加药后的各药物的终浓度见下表。以含0.1％BSA的RPMI-1640无血清培养基悬浮肿瘤细胞，调整细胞浓度，每孔加入4×10⁴个预处理的细胞，设3个复孔，对照组加等量的PBS，37℃孵育1小时。弃培养基，用PBS液轻轻冲洗2次，弃去未粘附细胞。每孔加入50μl MTT(1g/L)，37℃继续培养4小时。吸取MTT，每孔加入100μlDMSO用恒温振荡器振摇15分钟，使甲臜完全溶解。490nm波长酶标仪测定处每孔的OD值，每实验组均设立对照组，以残留细胞计算出粘附抑制率。

实验结果

粘附抑制率计算公式：

有效部位对人食管癌细胞系9706粘附能力的抑制结果以OD±S表示。()内为各浓度下相应有效部位的粘附抑制率，(采用t检验进行统计学分析，*p＜0.01)。

总木脂素、总皂苷及有效部位组配物的IC50分别为：625μg/ml、262.5μg/ml、38.1μg/ml。

与空白组比较，*P＜0.01，**P＜0.05

实施例10：

复方有效部位体内抗肿瘤活性实验

复方WZDL为原生药1∶1组合而成，复方中各药经提取、纯化得到四个有效部位等比例组合，复配得到的复方高、中、低剂量组浓度分别为：0.45g·Kg^-1、0.225g·Kg^-1、0.13g·Kg^-1。

实验方法

选择腹腔接种6～8天，生长良好的荷H22肝癌小鼠，颈椎脱臼处死，无菌抽取腹水，以无菌生理盐水按1∶2比例稀释成5.4×10⁷个/ml瘤细胞悬液，接种于健康小鼠右前肢腋部皮下，每只0.2mL，接种50只。接种次日，按体重随机分为5组，灌胃给予0.6ml受试药物高、中、低剂量，每日1次，连续9天。对照组给予生理盐水，每只0.3ml。阳性对照组腹腔注射顺(5mg·kg^-1·d^-1)，每次给药0.2ml，隔天给药1次，共给药3次。每日观察小鼠的一般活动、皮毛、粪便等情况。于末次给药后24h颈椎脱臼处死小鼠，剥取肿瘤组织，称重，同时剖取小鼠肝、脾脏、胸腺，称重。

检测指标

抑瘤率(％)＝(1-T/C)×100％(T：治疗组平均瘤重，C：对照组平均瘤重)

采用t检验进行统计学分析，以

表示，总复方对H22的抑瘤结果见表。中药复方WZDL的低剂量组即表现出对肿瘤的抑制作用，抑瘤率29.4％，中、高剂量组表现出显著的抑瘤作用，从整体看出WZDL对小鼠体内H22肝癌具有明显的抗肿瘤作用，且抑瘤作用有剂量依赖效应。

与对照组比较*P＜0.001，**P＜0.05。

实施例11：

药物制剂剂型的研究：

(1)片剂：不同含量(WZDL I∶WZDL II∶WZDL III∶WZDL V＝2∶1∶2∶3)，包衣：提取物压片制成片剂的使用，用作赋型剂的辅料有MgSO₄、玉米淀粉、滑石粉(规格：100mg、150mg、200mg、300mg)。

(2)胶囊：(活性成分WZDL I∶WZDL II∶WZDL III＝4∶1∶2)普通及肠溶胶囊，不同规格。

(3)散剂：(活性成分WZDL I∶WZDL II∶WZDL III＝4∶1∶3)药物提取后加入一定辅料后，干燥研粉。

(4)颗粒冲剂：(WZDL I∶WZDL II∶WZDL III＝2∶5∶3)袋装速溶颗粒剂。

(5)滴丸剂：(活性成分WZDL I∶WZDL II∶WZDL V＝2∶5∶2)增加吸收率和吸收速度，起效快。

(6)注射剂：(活性成分WZDL III∶WZDL II∶WZDL V＝1∶1∶1)过滤，除菌，除热源，用注射用水按一定比例溶解完全均匀，吸收效果好，起效快。

(7)冻干粉针：(活性成分WZDL III∶WZDL II∶WZDL V＝4∶2∶1)便于贮存。

各种药物制剂的制备具体操作如下：

(1)按配置总量计称取含10～70％有效部位提取物，加入30～90％的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等，充分搅拌混合制成颗粒，在60～70℃干燥2～4小时后，压制成片，使每片含有效部位提取物50～150mg。

(2)将制成的颗粒直接充填入各种空胶囊壳中，使每粒胶囊含提取物50～200mg，为胶囊剂。当然各制剂配比及辅料选用会有所差异。

(3)按配置总量计称取含20～70％提取物，加入30-80％的助溶剂如糊精、矫味剂等，溶解均匀后干燥，磨细粉装袋，即得粉剂。

(4)按配置总量计称取含10％～60％提取物，加入40％～90％的填充剂、崩解剂、矫味剂等，充分搅拌混合用12～14目筛制成颗粒。在60～70℃干燥充分后装袋，使每克颗粒剂含提取物100～500mg。

(5)按配置总量计称取含10％～60％提取物，加入40％～90％的助溶剂聚乙二醇、抗氧剂等，加热熔融温度(40～90℃)，使原料和辅料充分混溶，滴制成丸，使每粒滴丸含提取物5～20mg。

(6)取水溶性提取物30g，加入适量的注射用水，搅拌并水浴60℃加热使之溶解，以5％Na2CO3溶液调pH值到6.5-8.0，加入0.1％活性炭加热煮沸15min，以脱色除去热源，待稍冷后过滤，注射用水加至全量5000ml，微孔滤膜过滤后熔封于5ml安瓿中，105℃加热灭菌即得。

(7)取水溶性提取物30g，加入适量的注射用水，搅拌并水浴60℃加热使之溶解，以5％Na2CO3溶液调pH值为6.5-8.0，加入0.1％活性炭加热煮沸15min，以脱色除去热源，待稍冷后过滤，注射用水加至全量2500ml，微孔滤膜过滤后分装于西林瓶中，每瓶中装2.5ml。冻干条件：预冻温度-25℃，预冻时间3小时，升华时间为10小时，第一次干燥温度20℃，干燥时间为4小时，第二次干燥温度40℃，干燥时间为6-8小时，105℃加热灭菌即得。

实施例12

用下述成分制备硬明胶胶囊：活性成分(WZDL I∶WZDL II∶WZDL III∶WZDLV四个有效部位等比例组成)320mg，干淀粉200mg，硬脂酸镁10mg，将上述成分混合后，以460mg填充入硬明胶胶囊中。

实施例13

活性成分(WZDL I∶WZDL II∶WZDL III∶WZDL V＝1∶2∶1∶1组成)10mg，淀粉45mg，羧甲基淀粉钠盐4.5mg，硬脂酸镁0.5mg，滑石粉1mg。将原辅料预先干燥，过100目筛备用。先将处方量的辅料充分混匀。将原料药以递增稀释法加到辅料中，每次加时充分混匀2-3次，保证药与辅料充分混匀，过20目筛，在55℃通风烘箱中干燥2h，干颗粒过16目筛整理，测定中间体含量，混合均匀，在压片机上压片。

实施例14注射液的制备

活性成分(WZDL II∶WZDL III∶WZDL V＝1∶1∶1)200mg，丙二醇100mg，聚山梨300ml。取活性成分加入到已溶解山梨醇和丙二醇的注射用水中，加入药用碱调节PH值至4-8使其溶解。加入活性炭，搅拌吸附30分钟，除炭、精滤、灌封、灭菌。

实施例15

活性成分(WZDL I∶WZDL II∶WZDL III∶WZDL V＝1∶1∶2∶1)100mg，药用碱1-7％，甘露醇55-85％。取活性成分加入注射用水，用药用碱调节PH值至4-8使其溶解。再加入甘露醇，按注射剂的要求进行高压灭菌，加入活性炭，采用微孔滤膜过滤，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得疏松块状物，封口即得。

综上所述，本发明的内容并不局限在的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (10)

1、一种含有抗肿瘤活性成分的中药有效部位组合物，其特征在于该组合物由五味子、山茱萸、金樱子、诃子、白及五味药原料药组成的WZDL复方有效部位组成；其中所述的复方有效部位包括总木脂素(WZDL I)、总皂苷(WZDL II)、总多糖(WZDLIII)、总鞣质(WZDL V)的一种或多种的组合物。

2、如权利要求1所述的组合物，其特征在于该组合物由五味子10～50g，山茱萸10～60g，金樱子10～80g，诃子为5～30g，白及10～20g中的总木脂素(WZDL I)、总皂苷(WZDL II)、总多糖(WZDL III)、总鞣质(WZDL V)中的一种或多种有效部位组成。

3、如权利要求1所述的组合物，其特征在于有效部位总木脂素(WZDL I)、总皂苷(WZDL II)、总多糖(WZDL III)、总鞣质(WZDL V)与药学上可接受的载体混合制成各种制剂。

4、如权利要求3所述的组合物，各种制剂包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。

5、一种制备权利要求1或2所述组合物的方法，其特征在于该有效部位是由下述方法制备而成：

(1)将山茱萸药材用8倍量90％的乙醇浸泡4h后，回流提取2h，同样方法再重复提取2次，合并滤液，旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，常压50℃干燥，最后称重得浸膏，取浸膏适量，溶于水后，过滤，沉淀用蒸馏水洗3次，干燥后得粗总皂苷WZDLII；

(2)金樱子和诃子等量，粉碎过10目筛。装入渗漉桶，用1∶6丙酮-水(4∶1)浸泡4天，然后开始以2ml/min的速度进行渗漉，并不断填加新的渗漉溶剂，至渗滤液澄清，减压回收溶剂只有很少固形物，明胶实验也基本没有沉淀为止，渗漉液减压浓缩回收溶剂至基本不含丙酮，浓缩液有沉淀析出，减压抽滤，滤液回收，沉淀水洗干燥得淡黄色粉末，定性鉴别为总鞣质WZDL V；

(3)五味子药材，加8倍量95％的乙醇溶液，浸泡过夜，回流提取2h，同法重复提取2次，合并滤液，减压回收溶剂，得提取浸膏，浸膏于40℃真空干燥2d，称取浸膏，加氯仿超声溶解，加少量硅胶拌匀，在硅胶柱表面均匀铺上样品。先用石油醚洗脱，至回收后没有残留物，合并石油醚洗脱产物，除色素。再用氯仿洗脱，洗脱液回收浓缩，合并，减压蒸干溶剂得总木脂素WZDL I；

(4)白及药材，磨碎成粉，加8倍水浸泡1d。转移入渗漉桶，以7ml/min的流速进行渗漉，至流出液不再粘稠。渗漉液加热浓缩至药材/渗滤液1∶1，加无水乙醇沉淀，使混合液中含醇量约85％，白及多糖充分沉淀后，减压抽滤，固体再依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗掉脂溶性杂质。充分干燥后，得到白色的白及多糖粉末WZDL III；

6、如权利要求5所述的制备方法，其中所述有效部位总皂苷采用的大孔吸附树脂纯化，经过静态吸附和动态吸附两个方面，筛选出HPD-300型大孔吸附树脂分离、纯化总皂苷效果较好，洗脱溶媒为50％-70％乙醇；所述有效部位总鞣质的纯化采用梯度萃取法，结果表明氯仿、乙醚部位主要是脂溶性杂质和色素，鞣质集中在乙酸乙酯萃取部位，且纯度较高；所述有效部位总多糖选用的MG-1大孔吸附树脂脱色效果明显，Sevag法除蛋白。

7、权利要求1～4任一项所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用；其中的肿瘤包括：人乳腺癌、肝癌、卵巢癌、人子宫颈癌或肺癌。

8、一种含有抗肿瘤药物的中药复方制剂，其特征在于，该复方由五味子10～50g，山茱萸15～60g，金樱子15～80g，诃子为15～30g，白及10～20g的提取物与一种或多种药学上可接受的载体组成。

9、权利要求8所述中药复方制剂的制备方法，其特征在于该复方制剂由下述方法制备而成：

(1)将山茱萸药材用8倍量90％的乙醇浸泡4h后，回流提取2h，同样方法再重复提取2次，合并滤液，旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，常压50℃干燥，最后称重得浸膏，取浸膏适量，溶于水后，过滤，沉淀用蒸馏水洗3次，干燥后得粗总皂苷WZDLII；

(2)金樱子和诃子等量，粉碎过10目筛。装入渗漉桶，用1∶6丙酮-水(4∶1)浸泡4天，然后开始以2ml/min的速度进行渗漉，并不断填加新的渗漉溶剂，至渗滤液澄清，减压回收溶剂只有很少固形物，明胶实验也基本没有沉淀为止，渗漉液减压浓缩回收溶剂至基本不含丙酮，浓缩液有沉淀析出，减压抽滤，滤液回收，沉淀水洗干燥得淡黄色粉末，定性鉴别为总鞣质WZDLV；

(3)五味子药材，加8倍量95％的乙醇溶液，浸泡过夜，回流提取2h，同法重复提取2次，合并滤液，减压回收溶剂，得提取浸膏，浸膏于40℃真空干燥2d，称取浸膏，加氯仿超声溶解，加少量硅胶拌匀，在硅胶柱表面均匀铺上样品。先用石油醚洗脱，至回收后没有残留物，合并石油醚洗脱产物，除色素。再用氯仿洗脱，洗脱液回收浓缩，合并，减压蒸干溶剂得总木脂素WZDL I；

(4)白及和山茱萸、五味子、金樱子和诃子醇提后的药渣(晾干)混和，磨碎成粉，加8倍水浸泡1d。转移入渗漉桶，以7ml/min的流速进行渗漉，至流出液不再粘稠。渗漉液加热浓缩至药材/渗滤液1∶1，加无水乙醇沉淀，使混合液中含醇量约85％，白及多糖充分沉淀后，减压抽滤，固体再依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗掉脂溶性杂质。充分干燥后，得到白色的白及多糖粉末WZDL III；

(5)将上述分离得到的4个有效部位中的一个或多个与药学上可接受的载体混合制成复方制剂。

10、如权利要求8或9所述的中药复方制剂，包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。