CN103360435B - 一种响应面法优化山茱萸果核中鞣质的提取工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种响应面法优化山茱萸果核中鞣质的提取工艺，包括以下步骤：请完整描述该方法的详细步骤，其中，乙醇浓度42％，料液比1∶22，超声时间71min，超声温度51℃。本发明响应面法优化山茱萸果核中鞣质的提取工艺得到的鞣质含量为69.2622mg/g。该工艺节省了资源，缩短了提取时间，提高了鞣质的得率，为下一步研究山茱萸果核中鞣质的药理作用和化学结构提供了可靠的实验依据，并为今后开发新的药用资源奠定基础。

Description

一种响应面法优化山茱萸果核中鞣质的提取工艺
技术领域
本发明属于化学技术领域，涉及一种响应面法优化山茱萸果核中鞣质的提取工艺。
背景技术
山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zuc)为山茱萸科落叶乔木，其味酸、涩，性温，归肝，肾经，其主要成分有皂苷，鞣质，有机酸，黄酮，多糖，蛋白质，氨基酸，挥发性成分等。我国山茱萸每年的总产量约5000余吨，其中，占总重量80％的果核被废弃，目前山茱萸果肉入药不能满足市场需求，因此，充分开发和利用山茱萸果核是解决市场需求的主要措施。研究表明，山茱萸果核主要的成分是粗纤维，鞣质，蛋白质，油脂和其他一些矿物质及有机酸等。其中鞣质占有15％-16％，在国内外研究中，鞣质具有抗肿瘤，抗氧化，抗病毒，抗过敏、疤疹以及收敛止血、止泻，抗菌，保护粘膜，降血糖等作用，有时也用作生物碱及重金属中毒的解毒剂。其药用有效成分已经逐渐为人们所认识。但是现有技术中急需一种响应面法优化山茱萸果核中鞣质的提取工艺
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种响应面法优化山茱萸果核中鞣质的提取工艺，对山茱萸果核中鞣质含量进行了响应面法优化，并确定了最佳提取工艺，为山茱萸果核的开发利用提供了理论基础和实验依据。其技术方案为：
一种响应面法优化山茱萸果核中鞣质的提取工艺，包括以下步骤：取1g山茱萸果核粉末置锥形瓶中，加入22ml42％乙醇，在温度51℃条件下，超声71min。
进一步优选，乙醇浓度42％，料液比1：22。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明响应面法优化山茱萸果核中鞣质的提取工艺得到的鞣质含量为69.2622mg/g。该工艺节省了资源，缩短了提取时间，提高了鞣质的得率，为下一步研究山茱萸果核中鞣质的药理作用和化学结构提供了可靠的实验依据，并为今后开发新的药用资源奠定基础。
附图说明
图1为单因素对提取方法的影响，其中，图1(a)不同的提取方法对鞣质含量的影响，图1(b)不同的提取溶剂对鞣质含量的影响，图1(c)不同的浸泡时间对鞣质含量的影响，图1(d)不同的乙醇浓度对鞣质含量的影响，图1(e)不同料液比对鞣质含量的影响，图1(f)不同超声时间对鞣质含量的影响，图1(g)不同超声温度对鞣质含量的影响；
图2为溶剂浓度和料液比对鞣质含量的影响；
图3为溶剂浓度和超声时间对鞣质含量的影响；
图4为溶剂浓度和超声温度对鞣质含量的影响；
图5料液比和超声时间对鞣质含量的影响；
图6为料液比和超声温度对鞣质含量的影响；
图7为超声时间和超声温度对鞣质含量的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
材料与方法
材料与试剂
丹风山茱萸干燥果核，粉碎，过40目筛，备用。没食子酸(购自Sigma公司，≥99.9％)，
钨酸钠、钼酸钠、磷酸、硫酸锂、无水碳酸钠、乙醇、甲醇、丙酮溶液等均为分析纯。
仪器设备
手提式粉碎机(温岭市林大机械有限公司，型号：DFT-50)，分析天平(河北虹宇仪器设备有限公司，型号：FA2004N)，SHB-HIA型循环水式多用真空泵(陕西太康生物科技有限公司)
超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：SB25-12DTD)，超微量分光光度计(美国BioTek，型号：Epoch)。
方法
标准曲线的制备
按2010版药典附录XB绘制。
对照品的制备：精密称取1mg没食子酸标准品，用超纯水定容到20ml棕色容量瓶，制备0.05mg/ml对照品溶液，待用。
标准曲线绘制：精密取对照品溶液4、8、12、16、20、24、28、32、36、40ul置于96孔板中，加入磷钼戊酸试液8ul，再分别补加蒸馏水到96ul，最后加入96ul29％Na2CO3溶液，静置30min后，以相应的试剂作为空白对照，在760nm处测吸收值，以吸收值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到方程：Y＝54.91X+0.008，其中，R2＝0.9990，在浓度0.001-0.01mg/ml范围内浓度和吸收值呈良好的的线性关系。
鞣质含量测定
总酚的测定：取供试品溶液16ul置96孔板，照标准曲线下的方法，自“加入磷钼戊酸试液8ul”起，760nm处测吸收值(A1)，依据标准曲线方程计算总酚含量(M1)。
不被吸附多酚的测定：取供试品5ml置离心管中，加入0.12g干酪素，30℃水浴1h，不断搅拌，冷却，过滤，取续滤液16ul置96孔板中，照标准曲线下方法，自“加入磷钼戊酸试液8ul”起，760nm处测吸收值(A2)，依据标准曲线方程计算不被吸附多酚的含量(M2)。
鞣质含量(M)＝总酚含量(M1)-不被吸附的多酚的含量(M2)
响应面优化实验
称取1g已过40目筛的果核粉末，在不同的条件下提取，然后用超微量分光光度计测定鞣质的含量。考察不同因素对鞣质含量的影响。在单因素实验的基础上，通过Box-Behnken中心组合法设计和响应面图的分析，确定鞣质的最佳提取工艺。
结果与分析
单因素实验结果
提取方法的影响
在料液比为1∶10，提取次数1次，提取溶剂为丙酮的条件下，考察不同提取方法对鞣质含量的影响。结果如图1(a)所示，不同的提取方法，鞣质的含量差异较大，通过比较，得出最佳的提取方法是浸泡后超声。
提取溶剂的影响
在提取方法为浸泡后超声，提取次数1次的条件下，考察不同的溶剂对鞣质含量的影响。结果如图1(b)所示，溶剂为乙醇时，鞣质含量最高，因此，确定乙醇作为最佳的提取溶剂。
浸泡时间的影响
在料液比为1∶10，提取次数1次，提取溶剂为乙醇的条件下，考察不同浸泡时间对鞣质含量的影响。结果如图1(c)所示，浸泡超过1h后鞣质含量差异较小，考虑到实际操作的便捷，确定最佳的浸泡时间是1h。
溶剂浓度的影响
在料液比为1∶10，提取次数1次，提取方法为浸泡后超声的条件下，考察不同浓度的乙醇对鞣质含量的影响。如图1(d)所示，乙醇浓度为40％时，鞣质的含量最高，故选择40％乙醇作为最佳的溶剂浓度。
料液比的影响
在提取次数为1次，提取方法为浸泡后超声，提取溶剂为60％乙醇，超声30min的条件下，考察不同料液比对鞣质含量的影响。如图1(e)所示，考虑到要合理利用资源，最终选择料液比为1∶20。
超声时间的影响
在料液比为1∶10，提取次数1次，提取溶剂60％乙醇的条件下，考察不同超声时间对鞣质含量的影响。如图1(f)所示，超声时间为60min时，鞣质含量已经达到最大值，故选择最佳的超声时间是60min。
超声温度的影响
在料液比为1∶10，提取次数1次，提取溶剂60％乙醇，浸泡1h，超声30min的条件下，考察不同的超声温度对鞣质的含量的影响。如图1(g)所示，温度对鞣质的含量影响很大，通过比较发现，最佳的超声温度是50℃。
响应面优化实验结果
响应面分析因素的选取
在单因素实验的基础上，选取溶剂浓度、料液比、超声时间、超声温度4个因素，根据Box-Behnken中心组合法进行实验设计，实验因素和水平如表1。
响应面实验方差及回归方程分析结果
根据响应面分析方法，以鞣质含量为响应值，实验分析结果如表2。
表1试验因素水平编码表
Tabl.1Factors and levels of response surface experiments
表2响应面实验结果
Tabl.2Design and results of reponse surface method
注：***为超显著(P＜0.0001)；**为极显著(P＜0.001)；*为显著差异(P＜0.05)
根据表2结果，由软件Design-expert7.1.3分析，得到回归方程：Y＝66.83+4.12A+1.03B+2.91C+1.94D+0.43AB+0.026AC+3.12AD+0.33BC-0.11BD+0.79CD-12.86A2+0.095B2-4.48C2-9.48D2，在一次项、交互相和二次项中都有显著性差异，比较得出，A、C有极显著性差异，D有显著性差异，AD有显著性差异，二次项中，A2、D2有超显著性差异，C2有显著性差异，比较F和P值发现，影响因素的大小顺序为：A＞C＞D＞B。
响应曲面图分析结果
如图2-7所示，根据曲面图和上述的回归方程得出最佳的提取工艺为：提取溶剂浓度41.94％乙醇，料液比1∶22超声时间71.26min，超声温度51.43℃，测定鞣质的含量为69.1308mg/g。考虑到实际操作的便利，确定最终的工艺条件为：42％乙醇，料液比1∶22，超声时间71min，超声温度是51℃。
响应面验证实验
根据上述最佳提取条件，重复3次，测定得到鞣质的含量分别为69.2648mg/g、69.2428mg/g、69.2789mg/g，平均值为69.2622mg/g，标准偏差为1.82％，与响应面分析预测的结果相符。
干酪素法测定鞣质含量的原理是能有选择性地结合有生物活性的鞣质，与无生理活性的鞣质则不产生沉淀，即鞣质在一定条件下与磷钼戊酸试剂反应，利用分光光度法测定其吸收值，根据标准曲线计算鞣质含量，和传统的皮粉法相比较，具有更好的选择性，精确度高。因此，本实验采用干酪素法测定鞣质含量。
响应面分析法(Response Surface Methodology，简称RSM)是一种数学与统计结合的分析方法，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，全面的研究各因素交互作用对鞣质含量的影响，通过回归方程和响应曲面分析，确定最佳的提取工艺为：42％乙醇，料液比1∶22，超声时间71min，超声温度51℃，在此条件下得到的鞣质含量为69.2622mg/g。该工艺节省了资源，缩短了提取时间，提高了鞣质的得率，为下一步研究山茱萸果核中鞣质的药理作用和化学结构提供了可靠的实验依据，并为今后开发新的药用资源奠定基础。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种响应面法优化山茱萸果核中鞣质的提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：取1g山茱萸果核粉末置锥形瓶中，加入22ml 42％乙醇，然后在温度51℃条件下，超声71min。
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