CN103589433B - 一种利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法,属于植物提取技术领域。为了解决现的正交提取法提取效率和精确性低的问题,提供一种利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法,该方法包括将加拿大一枝黄花花粉粉碎,脱脂处理;经过脱脂处理后,加入丙酮和水的混合溶剂中,进行超声提取,采用响应面法设定提取的变量参数为X1、X2和X3,所述变量参数X1为丙酮体积分数;X2为超声时间;X3为液固比,超声提取结束后,离心分离,得到含有抗氧化成分的提取液。该方法具有精度和效率高的优点,且提取液中总酚提取率和·OH清除率高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法,属于植物提取技术领域。
背景技术
加拿大一枝黄花(Solidago Canadensis L.)又称霸王花,多年生草本植物,原产于北美,在1935年作为庭院观赏植物引进我国,尤其是上海、南京一带,后也有逸生野外。由于加拿大一枝黄花以根状茎、种子两种方式繁殖,繁殖力极强,传播速度快,生长优势明显,生态适应性广阔,从而对生物多样性构成严重威胁。
而另一方面,加拿大一枝黄花的药用部位主要是枝叶和药序,内存大量的皂苷和黄酮类成分,目前,化学成分研究多集中于多炔、萜类、皂苷和黄酮等成分。同时,加拿大一枝黄花在欧洲、亚洲作为利尿剂、抗菌消炎药已有悠久的历史,用于治疗肾炎、膀胱炎,对其抗菌、抗癌、降血压等活性已有大量的研究报道。因此,加拿大一枝黄花具有广泛的药用前景,但目前的研究主要侧重于其生物学、生理生态学及防治方面的研究,对其化学成分和生物活性的研究较少。其中,加拿大一枝黄花的酚类抗氧化成分具有较强的抗氧化、清除自由基的作用,其也可以延缓或阻止其他营养成分的氧化,但目前对于加拿大一枝黄花中酚类成分的提取工艺主要是采用正交优化方法进行提取,提取效率太低,不利于生产工业化。如郭婕在扬州大学硕士学位论文中发表的加拿大一枝黄花的酚类成分和生物活性研究一文中,提到了采用正交实验法优选提取的方法,采用正交实验法能够筛选出影响指标的显著因素并给出最佳因素水平组合,但存在无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的缺点,且多采用线性模型,与实际情况存在偏差,精度不高等问题。
发明内容
本发明针对以上现有技术中存在的缺陷,提供利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法,该方法具有提取效率高的优点。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的,一种利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法,该方法包括以下步骤:
A、将加拿大一枝黄花花粉粉碎,然后用索氏提取器进行脱脂处理;
B、将经过脱脂处理的加拿大一枝黄花花粉加入丙酮和水的混合溶剂中,进行超声提取,采用响应面法设定提取的变量参数为X1、X2和X3,所述变量参数X1为丙酮体积分数;X2为超声时间;X3为液固比,超声提取结束后,离心分离,得到含有抗氧化成分的提取液。
在上述利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法中,作为优选,步骤A中所述脱脂处理采用石油醚溶剂,升温至回流进行脱脂处理。脱脂处理的目的为了防止脂肪对后续的响应法工艺参数的影响,使本发明的方法精确性和提取效率得到大大的提高。
在上述利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法中,作为优选,所述响应面法设定提取的变量参数通过以下二次多项回归方程:
Y1=2.1734+0.1097X1+0.0806X2+0.2435X3+0.0889X1X2+0.1665X1X3-0.0645X2X3-0.1737X1 2+0.0915X2 2-0.1884X3 2;
Y2=57.0136-0.0594X1+1.3098X2-3.3161X3+6.7247X1X2+5.4617X1X3+2.6108X2X3-10.0966X1 2-4.5383X2 2-0.7085X3 2;式中,响应值Y1为总酚提取率;响应值Y2为·OH清除率,且设定提取的变量参数X1为丙酮体积分数;X2为超声时间;X3为液固比。由于总酚提取率和·OH清除率可以通过检测本发明得到的含有抗氧化成分的提取液,并通过采用上述二次多项回归方程能够有效的确定提取的工艺参数,提高提取的效率和高效性。也就是说,本发明将多因子试验由回归因子与试验结果的相互关系用多项式近似把因子与试验结果的关系函数化,能在整个区域上找到因素和响应值之间明确的函数表达式即回归方程,从而得到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值,实验精度更高,具有更好的预测性。作为进一步的优选,所述X1为30%~60%;所述X2为30~60分钟;所述X3为10:1~30:1。作为最优选,所述X1为43.56%;所述X2为45分钟;所述X3为23:1。
在上述利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法中,作为优选,步骤B中所述超声处理的温度为30℃~50℃。最优选超声处理的温度为40℃。
在上述利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法中,作为优选,所述的含有抗氧化成分的提取液可以进一步处理除去溶剂,得到相应的抗氧化成分提取物。溶剂的去除采用本领域常规的方法即可。
综上所述,本发明与现有技术相比,本发明通过采用丙酮和水的混合溶剂作为提取溶剂,并通过采用响应面法设定提取的变量参数丙酮体积分数、超声时间和液固比的提取方式,实现提取加拿大一枝黄花花粉抗氧化成分的效果,具有精度和效率高的优点,且提取液中总酚提取率和·OH清除率高的优点。
附图说明
图1是本发明的提取溶剂对总酚提取率和·OH清除率的影响图。
图2是本发明的丙酮体积分数对总酚提取率和·OH清除率的影响图。
图3是本发明的液固比对总酚提取率和·OH清除率的影响图。
图4是本发明的超声时间对总酚提取率和清除率的影响图。
图5是本发明的提取次数对总酚提取率的影响图。
图6是本发明的总酚提取率(Y1)-超声时间和丙酮体积分数(X1,X2)的响应曲面图。
图7是本发明的总酚提取率(Y1)-液固比和丙酮体积分数(X1,X3)的响应曲面图。
图8是本发明的总酚提取率(Y1)-超声时间和液固比(X2,X3)的曲面响应图。
图9是本发明的·OH清除率(Y2)-超声时间和丙酮体积分数(X1,X2)的响应曲面图。
图10是本发明的·OH清除率(Y2)-液固比和丙酮体积分数(X1,X3)的响应曲面图。
图11是本发明的·OH清除率(Y2)-超声时间和液固比(X2,X3)的响应曲面图。
图12是本发明的提取液和Vc的·OH清除率曲线图。
图13是本发明的提取液和Vc的还原能力曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例,对本发明的技术方案作进一步具体的说明,但是本发明并不限于这些实施例。
本发明一种利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法,该方法包括以下步骤:
A、将加拿大一枝黄花花粉粉碎,然后用索氏提取器进行脱脂处理;
B、将经过脱脂处理的加拿大一枝黄花花粉加入丙酮和水的混合溶剂中,控制温度在40℃的条件下进行超声提取,采用响应面法设定提取的变量参数为X1、X2和X3,所述变量参数X1为丙酮体积分数;X2为超声时间;X3为液固比,超声提取结束后,离心分离,得到含有抗氧化成分的提取液。
优选,为了更有利于保存,将含有抗氧化成分的提取液进行减压蒸馏除去溶剂,得到相应的抗氧化成分提取物。
上述的含有抗氧化成分的提取液的总酚提取率和羟自由基(·OH)消除率的测定可以采用以下方法计算得到:
总酚提取率的检测:
标准曲线的制作:
用超纯水溶解2.000g没食子酸,定容至100.00mL,然后准确移取10.00mL稀释到100.00mL,得到浓度为0.2mg/mL没食子酸的水溶液。然后,分别移取0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL和0.6mL上述配制的浓度为0.2mg/mL没食子酸的水溶液到比色管中,再分别加入6.00mL超纯水,混匀,再分别加入0.50mLFolin-Ciocalteu试剂,混匀,3min后,加入质量浓度为20g/100mL的Na2CO3溶液1.50mL,再用超纯水定容至10.0mL,混匀,在75℃的水浴条件下加热10min,并以空白试剂调零,然后,在765nm波长下测定吸光度。每个浓度测三次,取平均值作标准曲线。以吸光值对浓度进行线性回归分析,求得回归方程,y=0.0763x+0.0348,相关系数R2=0.9998。
上述式中,x-酚类浓度(ug/mL);y-吸光度。上述的相关系数越接近1,线性关系越好。
本发明的方法得到的含有抗氧化成分的提取液(以下称为样品)中总酚含量(总酚提取率)的测定:
取1.00mL样品液于比色管中,加入6.00mL超纯水,混匀,再加入0.50mL Folin-C试剂,混匀,3min后加入质量浓度为20g/100mL的Na2CO3溶液1.50mL,定容至10.0mL,混匀,在75℃的水浴条件下加热10min,并以空白试剂调零。然后,在765nm波长下测定吸光度,然后,根据回归方程算出溶液中总酚的浓度C(μg·mL-1),再按照以下公式计算总酚提取率(%)。
式中:C为溶液总酚浓度(μg·mL-1);V为提取液的体积(mL);N为稀释的倍数;W-原料干重(g)。
羟自由基(·OH)消除率的测定
清除羟自由基的能力是体外常用的评估抗氧化方法之一,本发明采用水杨酸捕获法进行测定,其原理是利用H2O2和Fe2+在水溶液中发生Fenton反应,生成羟自由基(·OH),反应方程式:H2O2+Fe2+→Fe3++·OH。水杨酸能够高效地捕捉·OH并生成有色物质,该物质在510nm波长处有最大吸收峰,通过吸光度的变化可以衡量试样清除羟自由基的能力。以·OH氧化水杨酸所得产物的吸光值表示·OH的多少,吸光值越大,·OH越多。本发明通过在试管中依次加入2.00mmol·mL-1FeSO4水溶液2.00mL、1.0mmol·mL-1H2O2水溶液2.00mL,本发明的方法得到的加拿大一枝黄花花粉提取液(样品)2.00mL,摇匀,静置15min后,再加入6.0mmol·mL-1的水杨酸水溶液2.00mL,摇匀,在37℃的水浴条件下加热15min后,在510nm波长下测得其吸光度Ai。羟自由基(·OH)消除率按下式计算:
式中:A0为不加样品(含有抗氧化成分的提取液)时溶液的吸光度;Aj为不加样品(含有抗氧化成分的提取液)和H2O2时溶液的吸光度;Ai为加样品(含有抗氧化成分的提取液)时溶液的吸光度。
作为优选,所述响应面法设定提取的变量参数通过以下二次多项回归方程:
Y1=2.1734+0.1097X1+0.0806X2+0.2435X3+0.0889X1X2+0.1665X1X3-0.0645X2X3-0.1737X1 2+0.0915X2 2-0.1884X3 2;
Y2=57.0136-0.0594X1+1.3098X2-3.3161X3+6.7247X1X2+5.4617X1X3+2.6108X2X3-10.0966X1 2-4.5383X2 2-0.7085X3 2。
以下实施例中分别采用不同的液固比、提取溶剂、提取溶剂的体积浓度、提取次数和超声时间进行单因素实验,考察单个因素对加拿大一枝黄花抗氧化成分的提取率的影响,以及在单因素实验的基础上,应用Box-Behnken设计进行实验,并运用响应面分析法,以总酚提取率(Y1)和·OH清除率(Y2)为响应值,对加拿大一枝黄花抗氧化成分提取过程进行优化。以下实施例1-5为单因素试验实施例。
实施例1
提取溶剂对总酚提取率和·OH清除率的影响
称取加拿大一枝黄花花粉五份,每份1.0000g,然后用索氏提取器进行脱脂处理;将经过脱脂处理的加拿大一枝黄花花粉加入溶剂中,使液固比为20:1,控制温度在40℃的条件下进行超声提取30min,所述超声的功率为100W,所述溶剂分别是体积分数为60%丙酮水溶液、60%乙酸乙酯水溶液、60%乙醇水溶液、60%甲醇水溶液和超纯水20.00mL,考察溶剂对总酚提取率和·OH清除率的影响。如图1所示,丙酮作为提取溶剂时,总酚的浓度(图1中采用酚类浓度表示)和·OH清除率的能力均较强,因此,本发明采用丙酮水溶液作为提取溶剂。
实施例2
丙酮的体积分数对总酚提取率和·OH清除率的影响
称取加拿大一枝黄花花粉六份,每份1.0000g,采用索氏提取器并在石油醚中进行回流脱脂处理后,以20:1的液固比,分别加入体积分数为40%、50%、60%、70%、80%和90%的丙酮水溶液(体积分数)20.00mL,在40℃超声处理30min,超声功率为100W,考察丙酮浓度对总酚提取率和·OH清除率的影响。具体考察结果如图2所示,随着丙酮浓度(丙酮体积分数)的增加,·OH清除率下降,而总酚提取率波动状态,当丙酮体积分数为40%~60%时,总酚提取率先降后升;而到丙酮体积分数大于60%后,随着浓度的增加总酚提取率反而下降,这可能是丙酮水溶液中存在氢键及团簇结构所致。当丙酮体积分数为40%时,总酚得率和清除·OH的能力都较强,故选体积分数为40%丙酮水溶液为最佳提取浓度。
实施例3
液固比对总酚提取率和·OH清除率的影响
称取加拿大一枝黄花花粉六份,每份1.0000g,采用索氏提取器并在石油醚中进行回流脱脂处理后,分别按液固比为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1和60:1加入体积分数为40%丙酮水溶液,在40℃超声30min,超声功率为100W,考察液固比对总酚类得率和羟基清除率的影响,具体结果如图3所示,随着液固比的增大,总酚得率呈增加的趋势,·OH清除率先降后升,当液固比大于30:1时,·OH清除率开始增大,液固比为60:1时,虽然总酚提取率和·OH清除率都较高,但提取溶剂剂丙酮的用量太大,考虑到成本问题,故选液固比为20︰1进行提取。
实施例4
超声时间对总酚提取率和·OH清除率的影响
称取1.0000g加拿大一枝黄花花粉粉碎,采用索氏提取器并在石油醚中进行回流脱脂处理后,按液固比20︰1加入体积分数为40%丙酮水溶液,超声功率为100W、提取温度为40℃,超声波时间分别为10min、20min、30min、40min、50min和60min,考察超声波时间对总酚提取率和·OH清除率的影响,具体结果如图4所示,在40min时·OH清除率达到最大,总酚提取率在相应的时间范围内处在第二;超声60min时,虽然总酚得率最高,但·OH清除率有所下降,考虑到效率问题,故选超声时间为40min。随着超声波时间的延长,总酚提取率和·OH的清除率起伏不定,这可能和超声波作用时间过长,酚类被破坏有关。
实施例5
提取次数对总酚得率的影响
称取加拿大一枝黄花花粉1.0000g,采用索氏提取器并在石油醚中进行回流脱脂处理后,以20:1的液固比加入体积分数为40%的丙酮水溶液,超声功率为100W,在40℃的条件下超声40min后冷冻离心,过滤,得滤液。滤渣采用上述方法再进行浸提,如此提取五次,分别测定这五次提取液的总酚含量,考察提取次数对总酚得率的影响具体如图5所示,随着提取次数的增加,总酚的提取率显著降低,第二次总酚的提取率是第一次的31.39%、第三次是第一次的11.92%、第四次是第一次的4.60%、第五次是第一次的3.05%,故提取次数选3次为宜。从实验结果可知,提取次数不影响中心组合实验的结果,考虑到效率问题中心组合实验的提取次数为一次。
实施例6
超声温度对总酚提取率的影响
称取1.0000g加拿大一枝黄花花粉粉碎,采用索氏提取器并在石油醚中进行回流脱脂处理后,按液固比20︰1加入体积分数为40%丙酮水溶液,超声功率为100W、超声时间40min,由于丙酮的沸点为56.48℃,故选30℃、40℃和50℃三个温度点来考察超声波温度对总酚得率的影响,结果如表1所示:
表1:
由表1可知,超声温度在40℃时总酚得率最高,故选此温度为最佳提取温度。由于超声温度对总酚提取率影响不大,故后面的中心组合实验不把超声温度作为自变量来考虑。
实施例7
响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法
根据单因素试验的结果,在40℃超声功率为100W时提取1次,对丙酮体积分数(X1)、超声时间(X2)和液固比(X3)3个单因素实验所确定的水平范围内,采用Design-Expert8.0.6软件中的Box-Behnken Design实验设计方法设计了3因素3水平实验,见表2。以X1,X2,X3为自变量,以加拿大一枝黄花总酚提取率和·OH清除率为响应值(Y1和Y2),进行响应面分析试验,试验方案及结果见表3。
表2:
表3:
根据上述表3的结果进行验证,对试验数据进行多元回归拟合,得加拿大一枝黄花总酚的提取率(Y1)和OH清除率(Y2)对丙酮浓度(X1)、超声时间(X2)、液固比(X3)的二次多项回归模型方程为:
Y1=2.1734+0.1097X1+0.0806X2+0.2435X3+0.0889X1X2+0.1665X1X3-0.0645X2X3-0.1737X1 2+0.0915X2 2-0.1884X3 2;
Y2=57.0136-0.0594X1+1.3098X2-3.3161X3+6.7247X1X2+5.4617
X1X3+2.6108X2X3-10.0966X1 2-4.5383X2 2-0.7085X3 2。
以下表4是酚类提取率的试验结果方差分析表;以下表5是OH清除率的试验结果方差分析表。
表4:
表5:
[注]表4和表5中*:表示差异显著(P<0.05);**:表示差异极显著(P<0.01)。
由上述表4和表5可知,R-Squared相关系数R1=0.9778、R2=0.9638,响应面回归模型极显著(p≤0.01);模型失拟项,不显著(p>0.05),说明本发明的二次模型方程可以较好地描述各因素与响应值之间的关系,能够拟合真实的试验结果。从线性项看,表4中X3>X1>X2,说明液固比对总酚提取率的影响最大,其次是丙酮浓度(体积分数),超声时间影响较小。由表4回归方程偏回归系数显著性检验可知,丙酮浓度(X1)和液固比(X3)之间存在显著交互作用,其它因子间的交互作用均不显著。从图7中可以看出,当丙酮浓度(X1)为40%~50%时,液固比(X3)在23:1~30:1时,其交互效应达到最大。表5中X3>X2>X1,说明液固比对·OH清除率影响极大,超声时间次之,丙酮浓度影响最小。由表5回归方程偏回归系数显著性检验可知,丙酮浓度(X1)和超声时间(X2),丙酮浓度(X1)和液固比(X3)之间存在显著交互作用,从图9看出,当丙酮浓度(X1)在35.5%~46%,超声时间(X2)在34min~49.5min间时,其交互效应达到最大;由图10可知,当丙酮浓度(X1)在35%~39%之间,液固比(X3)为10:1~12:1时,其交互效应达到最大。最终确定本发明的方法最佳工艺参数为:丙酮体积分数为45%,超声波时间45min,液固比25:1。以此工艺参数做3次平行试验,总酚提取率分别为2.300%、2.313%和2.307%,平均得率为2.307%,与理论预测值2.334%相比,相对标准偏差为0.6519%;·OH清除率分别为54.26%、54.06%和54.36%,平均清除率为54.23%,与理论预测值55.79%相比,相对标准偏差为0.2819%。可见该模型能较好地模拟和预测超声波辅助提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的提取效果和对OH的清除率。
图12和图13中所用加拿大一枝黄花提取液的浓度接近Vc的10倍(提取液的浓度为922mg·L-1,Vc的浓度为93.6mg·L-1),由图12可以看出,随着提取液和Vc浓度的增加,两者对·OH清除率也逐渐增加,并呈现线性关系,但增加幅度提取液大,这可以从曲线的斜率看出。由图13可以看出,随着提取液和Vc浓度的增加,还原Ce(IV)的能力逐渐增加(吸光度A越小还原能力越强),并呈现良好的线性关系,增加的幅度Vc较大。综上所述,加拿大一枝黄花提取液的抗氧化能力要弱于Vc,但也能够实现抗氧化的作用。
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代,但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例,但是对本领域熟练技术人员来说,只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (4)
1.一种利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
A、将加拿大一枝黄花花粉粉碎,然后用索氏提取器进行脱脂处理;
B、将经过脱脂处理的加拿大一枝黄花花粉加入丙酮和水的混合溶剂中,进行超声提取,采用响应面法设定提取的变量参数,超声提取结束后,离心分离,得到含有抗氧化成分的提取液;
所述响应面法设定提取的变量参数通过以下二次多项回归方程:
Y1=2.1734+0.1097X1+0.0806X2+0.2435X3+0.0889X1X2+0.1665X1X3-0.0645X2X3-0.1737X1 2+0.0915X2 2-0.1884X3 2;
Y2=57.0136-0.0594X1+1.3098X2-3.3161X3+6.7247X1X2+5.4617X1X3+2.6108X2X3-10.0966X1 2-4.5383X2 2-0.7085X3 2;
上述式中响应值Y1为总酚提取率;响应值Y2为·OH清除率,且设定提取的变量参数X1为丙酮体积分数;X2为超声时间;X3为液固比;所述X1为30%~60%;所述X2为30~60分钟;所述X3为10:1~30:1;所述超声处理的温度为30℃~50℃。
2.根据权利要求1所述利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法,其特征在于,步骤A中所述脱脂处理采用石油醚溶剂,升温至回流进行脱脂处理。
3.根据权利要求1所述利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法,其特征在于,所述X1为43.56%;所述X2为45分钟;所述X3为23:1。
4.根据权利要求1所述利用响应面法提取加拿大一枝黄花抗氧化成分的方法,其特征在于,所述超声提取的次数为1~3次。
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