CN115089630A - 一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，涉及植物有效成分提取技术领域。一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，包括：步骤1、取氢键受体和氢键供体按比例混合形成DESs溶剂；步骤2、取夜交藤粉末置于容器中，加入DESs溶剂后超声提取得到提取液；步骤3、取提取液离心处理后吸取上清液；步骤4、用AB‑8大孔吸附树脂除去上清液中的DESs，浓缩干燥即可。本发明通过超声耦合DESs进行夜交藤中的多酚提取，降低提取时间；含水量20％，摩尔比1:2的氯化胆碱/乙二醇具有较低的粘度和较多的氢键形成基团，最适合于夜交藤多酚的提取；超声提取时间43.0mi n，提取温度为65.0℃，氯化胆碱/乙二醇体系含水量为23.5％。
Description
技术领域
本发明属于植物有效成分提取技术领域，特别是涉及一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺。
背景技术
多酚类化合物是广泛存在于植物界中的一大类次级代谢产物，在已经发现的8000多种不同结构类型中，黄酮和小分子酚酸是分布最广的酚类化合物，约占已知酚类化合物的60％。
近年来，一种新型的低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents，DESs)逐渐替代了ILs成为下一代绿色溶剂；DESs首先由Abbott等人提出，通过在适当的温度下混合氢键受体(Hydrogen bond acceptor,HBA)和氢键供体(hydrogen bond donor,HBD)即可轻松制备。与普通的有机溶剂相比，DESs具有价格低，制备简单、易得，可生物降解，毒性低等显著优点；由于采用单纯的DESs提取酚类化合物得率低，提取时间长。
夜交藤(Caulis Ploygoni multiflori)，亦称首乌藤，是何首乌的带叶藤茎或藤茎，植物化学研究表明，夜交藤中含有蒽醌、二苯乙烯苷、黄酮、色原酮等多种类型的酚类化合物。传统意义上，对多酚类酚类化合物的提取主要基于甲醇、乙醇或丙酮等有机溶剂的热处理技术；为了减轻多酚提取过程中有机挥发性溶剂对环境的不利影响，许多环境友好的溶剂和创新提取技术被相继开发，以从各种生物资源中获取酚类化合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，通过超声耦合DESs进行夜交藤中的多酚提取，解决了现有采用单纯的DESs提取酚类化合物得率低，提取时间长的问题。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明为一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，包括：
步骤1、取氢键受体和氢键供体按比例混合形成DESs溶剂；
步骤2、取夜交藤粉末置于容器中，加入DESs溶剂后超声提取得到提取液；
步骤3、取提取液离心处理后吸取上清液；
步骤4、用AB-8大孔吸附树脂除去上清液中的DESs，浓缩干燥即可。
进一步地，步骤1在所述步骤1中，所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体选自1,4-丁二醇、乙二醇、丙三醇、尿素、草酸、乳酸、柠檬酸、葡萄糖和蔗糖中的一种；所述氢键受体和氢键供体的的摩尔比为2:1-15。
进一步地，所述步骤4包括：将提取液加入到平衡好的AB-8大孔吸附树脂，首先用双蒸水进行洗脱，将极易溶于水的氯化胆碱和乙二醇以及提取液中的水溶性色素充分洗脱，随后用70％乙醇洗脱夜交藤多酚；70％的乙醇洗脱液浓缩至无醇味，冷冻干燥后，用质量分数为60％乙醇配制为浓度为1.0mg·mL-1的储备液，置于4℃冰箱中备用。
进一步地，所述DESs溶剂中含水量为15-25％。
进一步地，所述步骤2中，每1g夜交藤粉末中加入的DESs溶剂量为10-40ml，所述提取时间为25-35min，提取温度为45-55℃。
进一步地，还包括夜交藤多酚含量测定；测定方法包括：取提取液离心处理后吸取上清液1.0mL，用蒸馏水定容到10mL，制备含量测定工作液；取工作液进行多酚含量以及Fe2+还原当量测定。
进一步地，包括以没食子酸为对照品，以福林酚试剂为显色剂，绘制多酚含量测定标准曲线；
具体包括：取100μg·mL-1没食子酸对照品工作液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL放置于10mL刻度量瓶中，依次加入福林酚试剂0.5mL，7.5％碳酸钠溶液2.0mL，每次间隔60sec，最后用蒸馏水定容到刻度，充分摇匀，室温反应60min后，以蒸馏水为空白对照，在400-800nm波长范围内进行扫描，确定最大吸收波长，并测定各反应液在最大吸收波长处的吸光度值；
以没食子酸对照品浓度为横坐标，相对应的吸光度值为纵坐标，对二者进行线性回归得到第一线性方程，建立多酚的含量测定方法。
进一步地，包括以硫酸亚铁为对照品，以邻二氮菲为络合显色剂，绘制Fe2+还原当量标准曲线；
具体步骤如下：精密吸取已经配制好，4℃冰箱保存的100μmol·L-1硫酸亚铁乙醇溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL放置于10mL刻度量瓶中，分别加入0.5mL 0.5％邻二氮菲乙醇溶液，用60％的乙醇定容到刻度，充分摇匀，室温暗处反应20min后，以60％乙醇为空白对照，在350-650nm波长范围内进行扫描，确定最大吸收波长，并测定各反应液在最大吸收波长处的吸光度值；
以硫酸亚铁摩尔浓度为横坐标，相对应的吸光度值为纵坐标，对二者进行线性回归得到第二线性方程，建立Fe2+还原当量的测定方法。
进一步地，在所述Fe2+还原当量测定过程中，以氯化高铁代替硫酸亚铁；，在所述步骤1中，将氢键受体和氢键供体按比例混合后，水浴加热至熔融。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过超声耦合DESs进行夜交藤中的多酚提取，降低提取时间；含水量20％，摩尔比1:2的氯化胆碱/乙二醇具有较低的粘度和较多的氢键形成基团，最适合于夜交藤多酚的提取；超声提取时间43.0min，提取温度为65.0℃，氯化胆碱/乙二醇体系含水量为23.5％，在此条件下，多酚平均得率为62.4±2.6mg·g-1；Fe2+还原当量平均值为125.3±4.2μmol·g-1，远高于水浴-DESs，超声-乙醇提取方法，展示了良好的应用前。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为提取溶剂类型对夜交藤中抗氧化多酚提取得率的影响；
图2为氯化胆碱/乙二醇摩尔比例对夜交藤中抗氧化多酚得率的影响；
图3为含水量对夜交藤中抗氧化多酚提取得率的影响；
图4为提取时间对夜交藤中抗氧化多酚提取得率的影响；
图5为提取温度对夜交藤中抗氧化多酚提取得率的影响；
图6为料液比对夜交藤中抗氧化多酚提取得率的影响；
图7为不同浓度下没食子酸-福林酚络合物全波长扫描图；
图8为不同浓度下Fe2+-邻二氮菲络合物全波长扫描图；
图9为为超声提取时间与温度影响多酚提取得率的响应曲面图；
图10为超声提取时间和含水量影响多酚提取得率的响应曲面图；
图11为超声提取温度与含水量影响多酚提取得率的响应曲面图；
图12为超声提取时间与温度影响夜交藤多酚Fe2+当量的响应曲面图；
图13为超声提取时间含水量影响夜交藤多酚Fe2+当量的响应曲面图；
图14为超声提取温度与含水量影响夜交藤多酚Fe2+当量的响应曲面图；
图15为提取前后的夜交藤细胞扫描电镜谱图。
具体实施方式
实施例1
精密称取粉碎至60目的夜交藤粉末0.5g放置于50mL的锥形瓶中，加入15ml的DESs，浸泡20min后，在规定的温度下超声提取30min，其中DESs溶剂的含水量为20％；提取结束后，将悬浮液立即在12000r·min-1条件下离心5min即可；取提取液离心处理后吸取上清液；用AB-8大孔吸附树脂除去上清液中的DESs，浓缩干燥即可。
在上述中取，将氢键受体和氢键供体按比例混合后，水浴加热至熔融。
步骤4包括：将提取液加入到平衡好的AB-8大孔吸附树脂，首先用双蒸水进行洗脱，将极易溶于水的氯化胆碱和乙二醇以及提取液中的水溶性色素充分洗脱，随后用70％乙醇洗脱夜交藤多酚；70％的乙醇洗脱液浓缩至无醇味，冷冻干燥后，用质量分数为60％乙醇配制为浓度为1.0mg·mL-1的储备液，置于4℃冰箱中备用，
同时吸取上述工作液0.2mL进行多酚含量以及Fe2+还原当量测定；
夜交藤多酚含量测定；测定方法包括：取提取液离心处理后吸取上清液1.0mL，用蒸馏水定容到10mL，制备含量测定工作液；取工作液进行多酚含量以及Fe2+还原当量测定。
包括以没食子酸为对照品，以福林酚试剂为显色剂，绘制多酚含量测定标准曲线；具体包括：取100μg·mL-1没食子酸对照品工作液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL放置于10mL刻度量瓶中，依次加入福林酚试剂0.5mL，7.5％碳酸钠溶液2.0mL，每次间隔60sec，最后用蒸馏水定容到刻度，充分摇匀，室温反应60min后，以蒸馏水为空白对照，在400-800nm波长范围内进行扫描，确定最大吸收波长，并测定各反应液在最大吸收波长处的吸光度值；以没食子酸对照品浓度为横坐标，相对应的吸光度值为纵坐标，对二者进行线性回归得到第一线性方程，建立多酚的含量测定方法。
包括以硫酸亚铁为对照品，以邻二氮菲为络合显色剂，绘制Fe2+还原当量标准曲线；
具体步骤如下：精密吸取已经配制好，4℃冰箱保存的100μmol·L-1硫酸亚铁乙醇溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL放置于10mL刻度量瓶中，分别加入0.5mL 0.5％邻二氮菲乙醇溶液，用60％的乙醇定容到刻度，充分摇匀，室温暗处反应20min后，以60％乙醇为空白对照，在350-650nm波长范围内进行扫描，确定最大吸收波长，并测定各反应液在最大吸收波长处的吸光度值；
以硫酸亚铁摩尔浓度为横坐标，相对应的吸光度值为纵坐标，对二者进行线性回归得到第二线性方程，建立Fe2+还原当量的测定方法。
Fe2+还原当量测定过程中，以氯化高铁代替硫酸亚铁，夜交藤多酚能够将Fe3+定量还原为Fe2+，进而与邻二氮菲发生络合反应，络合物在可见光区有特异的吸收特性。
实施例2，在实施例1的基础上；
固定超声辅助提取过程中提取时间为30min，提取温度为50℃，溶剂用量为30mL·g-1，DESs溶剂的含水量为20％，分析不同类型DESs与传统甲醇、乙醇等有机溶剂以及水做提取介质时对抗氧化多酚提取得率的影响，实验结果见图1所示；
如图1中,D1-D9、W、E、M代表提取介质依次为以1,4-丁二醇、乙二醇、丙三醇、尿素、草酸、乳酸、柠檬酸、葡萄糖和蔗糖作为为氢供体的DESs溶剂；其中W、E、M分别代表采用水、甲醇、乙醇作为提取介质。
由图1的实验结果可知，不同的DESs液体作为提取介质能够显著影响到夜交藤抗氧化多酚的提取得率：以乙二醇、丙三醇、草酸、乳酸、柠檬酸为氢供体的DESs溶剂为提取介质时所获得的夜交藤多酚提取得率及Fe2+还原当量值均显著高于相同条件下甲醇作为提取介质时的量。
其中，以氯化胆碱/乙二醇体系为提取介质时能够获得最大的多酚得率和Fe2+还原当量，上述两个指标值分别达到51.2±3.0mg·g-1和105.4±3.2μmol·g-1，是相同条件下甲醇作为提取溶剂43.9±2.4mg·g-1和87.5±3.0μmol·g-1的1.16和1.20倍。氯化胆碱/乙二醇体系具有相对较小的分子质量和较多的氢键形成基团，具有较低的粘度和较高的细胞穿透力，能够较容易渗透进入夜交藤植物细胞，与细胞内的多酚类物质形成较多的分子间氢键，极大的提高了对多酚类物质的溶解度，因此能够显著的提高夜交藤多酚的提取效率。多酚的提取效率提高，其抗氧化活性指标Fe2+还原当量也会随之提高。
实施例3，如图2，在实施例1的基础上；
固定超声辅助提取过程中提取时间为30min，提取温度为50℃，溶剂用量为30mL·g-1，溶剂含水量为20％，分析氯化胆碱/乙二醇体系中二者之间的摩尔比对夜交藤抗氧化多酚提取得率的影响；
按如图2可知；氯化胆碱与乙二醇摩尔比在1:1-1:5范围内改变时，多酚得率和Fe2+还原当量这两个指标首先显著提高而后逐渐降低，在摩尔比为1:2时达到一个较高的水平，分别为52.3±2.9mg·g-1和103.5±4.2μmol·g-1；分析其原因为：氯化胆碱/乙二醇提取介质的粘度和表面张力会随着体系中乙二醇摩尔比例的增加而显著降低，这能够改善提取体系的传质和扩散效果，能够有效提高多酚提取效率；然而乙二醇摩尔比再继续提高时，则会导致体系中氯离子比例减少，降低多酚类物质与氯离子间的作用力，最终导致多酚提取得率以及Fe2+还原当量指标值的降低。
实施例4，如图3，在实施例1的基础上；
固定超声辅助提取过程中提取时间为30min，提取温度为50℃，溶剂用量为30mL·g-1，氯化胆碱/乙二醇摩尔比例为1:2，考察溶剂体系的含水量对抗氧化多酚提取得率的影响。
如图3可知，当提取溶剂体系含水量≤20％时，多酚得率与Fe2+还原当量随含水量提高而增加，这是因为添加水后能够显著降低提取溶剂粘度，改善传质效果；同时水的加入还能够提高提取体系的极性，增强对极性多酚分子的溶解能力。但是当提取溶剂体系含水量大于20％时，多酚得率与Fe2+还原当量值明显降低，主要原因是过量水分子的加入，破环了氯化胆碱—乙二醇体系间的氢键网格结构，导致其与多酚化合物分子间氢键能力降低。此外，极性过高也不利于多酚的溶解和释放。
实施例5，如图4，在实施例1的基础上；
以含水量20％，摩尔比例为1:2氯化胆碱/乙二醇体系为提取溶剂，固定超声辅助提取过程中提取温度为50℃，溶剂用量为30mL·g-1，分析超声提取时间对抗氧化多酚提取得率的影响；
如图4可知，在10-40min较为宽广的时间范围内，多酚得率与Fe2+还原当量随提取时间的延长而提高，在40min时候分别达到53.6±4.1mg·g-1和107.7±3.5μmol·g-1的较高水平。随后，再延长提取时间至50min，上述两个指标值均明显的下降为48.8±3.6mg·g-1和98.4±3.2μmol·g-1。相比较于甲醇、乙醇等传统有机溶剂，DESs溶剂具有粘度较高的缺点，因此适当延长提取时间，有利于传质过程的进行，增加提取溶剂与目标活性成分间的接触几率，可以促进目标活性成分的溶解和转移；但是提取时间过长，会导致非目标成分的溶解与转移，同时也会导致一些对温度以及对超声过程中剪切作用敏感的化合物的降解。
实施例6，如图5，在实施例1的基础上；
以含水量20％，摩尔比例为1:2氯化胆碱/乙二醇体系为提取溶剂，固定超声辅助提取过程中提取时间为30min，溶剂用量为30mL·g-1，分析超声提取温度对抗氧化多酚提取得率的影响；
如图5可知，在30-60℃温度范围内，多酚得率与Fe2+还原当量随提取温度的升高而提高，在60℃时候达到最大值为55.4±3.2mg·g-1和111.8±3.7μmol·g-1。随后提高温度为70℃，上述两个衡量指标略有降低，分别为53.8±3.3mg·g-1和108.9±3.9μmol·g-1。DESs溶剂的粘度显著受到温度的影响，在较高的提取温度下，DESs的粘度明显降低，这大大增加了这类提取介质的渗透、溶解和转移目标活性成分的能力，导致提取效率的显著提高。但是温度过高，也能够增加非目标活性成分在提取介质中的溶解度，在溶剂用量一定的情况下，势必会导致目标活性成分提取得率的降低；同时高的提取温度还可能导致部分多酚类化合物的降解，这也是导致夜交藤中抗氧化多酚提取得率降低的一个主要原因。
实施例7，如图6，在实施例1的基础上；
以含水量20％，摩尔比例为1:2氯化胆碱/乙二醇体系为提取溶剂，固定超声辅助提取过程中提取时间为30min，提取温度为50℃，考察溶剂用量对抗氧化多酚提取得率的影响，实验结果见图2-8。由图2-8的实验结果可知，在料液比为10-30mL·g-1范围内，多酚得率与Fe2+还原当量随料液比的升高而提高，但料液比超过30mL·g-1后，多酚得率与Fe2+还原当量这两个衡量指标并没有发生显著变化(P>0.05)，说明在料液比30mL·g-1情况下就能够将夜交藤中大部分多酚类物质提取出来。
实施例8，10-80μg·mL-1的没食子酸对照品工作液与福林酚试剂络合反应后的全波长扫描测试结果见图7所示，由测试结果可知，反应体系所形成的络合物在765nm处有最大吸收，且在该最大吸收位置处的吸光度值随着没食子酸对照品浓度的增加成比例提高。对不同浓度没食子酸对照品与对应的吸光度值进行线性回归拟合，由拟合结果可知，在10-80μg·mL-1浓度范围内，没食子酸对照品在765nm处的吸光度值与浓度呈现出良好的线性关系：A＝0.0145C+0.002，R2＝0.9998，可以利用该方法对多酚含量进行准确测定。
实施例9，Fe2+在广泛的pH范围内能够特异性的与邻二氮菲发生络合反应，可以准确的用于Fe2+的含量测定。
10-80μmol·L-1的硫酸亚铁工作液与邻二氮菲络合反应后的全波长扫描测试结果见图8所示，由扫描结果可知，Fe2+与邻二氮菲所形成的络合物在510nm处有最大吸收，且与反应体系中的Fe2+浓度呈现良好的相关性。对不同浓度硫酸亚铁溶液与对应的吸光度值进行线性回归拟合。由拟合结果可知，在10-80μmol·L-1浓度范围内，所形成的络合物在510nm处的吸光度值与浓度呈现出良好的线性关系：A＝0.0122C+0.05，R2＝0.9994，可以利用该方法准确测定夜交藤多酚还原Fe3+为Fe2+的抗氧化性能。
实施例10
基于单因素实验结果，氯化胆碱/乙二醇体系的含水量，超声提取过程中的提取时间，提取温度等3个因素能够显著影响到夜交藤中抗氧化多酚的提取得率，因此本部分基于Box-Behnken试验设计原理对氯化胆碱/乙二醇体系的含水量、超声提取时间、提取温度三因素间的相互作用进行研究，并获取最优提取方案。
各个因素水平见表1所示：
实验设计及结果见表2所示：
首先，应用Design-Expert软件对表2中的Box-Behnken实验数据的真实值和理论值进行相关性分析，分析结果见图7，由图7所示，在该Box-Behnken实验设计中，多酚得率以及Fe2+还原当量这两个衡量指标的理论值与真实值均具有良好的相关性，初步说明上述回归方程的准确性和适用性。
应用Design-Expert软件对表2验数据进行二次多元函数回归拟合，获得超声提取时间(X1)、提取温度(X2)、含水量(X3)与夜交藤多酚得率以及Fe2+还原当量间的二次回归方程，分别为：
总多酚得率(mg·g-1)＝59.86+2.21X1+2.54X2+1.12X3+1.20X1X2+0.22X1X3+0.77X2X3–4.13X1 2–3.18X2 2–2.25X3 2；
Fe2+还原当量(μmol·g-1)＝122.54+4.77X1+4.64X2+2.66X3+2.50X1X2+0.45X1X3+1.77X2X3–9.53X1 2–7.41X2 2–5.51X3 2；
对上述回归方程进行显著性方差检验分析，分析结果如表3所示：
分析表3中多酚提取得率的回归模型方差结果，我们可以得出以下结论：(1)、回归方程模型的F检验值为122.09，P值<0.0001，说明该回归方程模型极其显著；失拟项的P值为0.5881>0.05，无显著性差异，说明实验误差较小，应用此模型可以较为准确的预测不同超声条件下夜交藤多酚的提取得率。同时，该回归方程模型的确定系数R2为0.9937，说明该模型能够解释99.37％的因素变化所导致的响应值改变，这意味着该回归模型与实际实验过程拟合良好。
(2)、一次项中，超声提取时间、提取温度和含水量对多酚得率的线性效应极显著(P<0.001)，这与单因素实验结果相符合，说明实验所选取的这三个因素均能够显著影响到夜交藤多酚的提取过程。
(3)、二次项中上述三个因素对多酚提取得率的曲面效应极显著(P<0.0001)，也印证了所选取因素的合理性。
(4)、在提取因素间的交互作用比较中，超声时间与超声温度间的交互作用高度显著(P＝0.0017<0.05)，提取温度和含水量两个因素间的交互作用显著(P＝0.0153<0.05)，而提取时间和含水量两个因素间的交互作用不显著(P＝0.3854>0.05)。
(5)、以上分析结果说明，在该提取过程中，超声提取时间、温度和溶剂含水量对多酚提取得率均有较大的影响，提取时间的延长、提取温度的提高以及含水量的增加可以加速夜交藤中多酚类成分与DESs间的交换，提高提取得率；但是过长的提取时间、过高的提取温度或含水量可能导致多酚类化合物的降解、非目标成分的溶出释放以及对目标成分溶解度的降低等多种情况的出现，最终导致多酚类化合物提取得率的降低。超声提取时间与温度，温度与含水量因素间的交互作用比较显著，说明提取温度的提高能够降低提取介质的粘度，促进传质过程的进行，随时间的延长这种改变会越加明显，进而改变多酚的提取得率。但固定提取温度后，提取介质的粘度不再发生显著的变化，传质速率也不会有明显的改变，所以提取时间和含水量间的交互作用表现的不是很显著。
同理，对于Fe2+还原当量：(1)、回归方程的F检验值为128.20，相对应的P值<0.0001，失拟项的P值为0.9318>0.05，提取模型的相关系数R2为0.9940；上述分析数据说明该提取模型也能够准确的描述各个提取因素与响应值之间的关系，能够用来准确的预测不同实验条件下的实验值。(2)、一次项和二次项中，超声提取时间、提取温度和含水量对Fe2+还原当量的线性效应和曲面效应极显著(P<0.001)，交互项中，超声提取时间和温度，超声温度与含水量交互作用高度显著(P＝0.0021，0.0118<0.05)，而提取时间与含水量间的交互作用不明显(P＝0.4198>0.05)。综合上述分析结果可知，较长的提取时间与较高的提取温度之间以及较高的提取温度和较高的含水量之间有协同作用，能够显著影响到夜交藤多酚的Fe2+还原当量值。
根据拟合的回归方程总多酚得率和Fe2+还原当量，采用Origin软件绘制了超声提取时间、提取温度、溶剂含水量与夜交藤多酚提取得率、Fe2+还原当量之间的响应面和等高线图，用以判断和剖析因素之间的相互关系以及对多酚提取得率及抗氧化活性的影响。通常情况下，在响应面图中，坡度越加陡峭，表明该提取因素条件对多酚提取得率和Fe2+还原当量这两个评价指标的影响越加显著；在等高线图中，等高线形状越椭圆化，说明两个因素之间的相互作用越加显著。
图9-11，为超声提取时间、提取温度和含水量三因素对多酚提取得率的影响。图9为超声提取时间与温度影响多酚提取得率的响应面和等高线图，由结果可知，夜交藤多酚提取得率随提取时间的延长和提取温度升高首先显著提高，随后又有一定程度的降低；适当延长提取时间和提高提取温度下能够获得更高的多酚提取得率。比较两因素，随提取温度的改变多酚得率的变化更为剧烈，表现为其等高线更为陡峭，这与方差分析结果完全一致。其原因可能是温度的改变能够显著改变提取溶剂的粘度，在较高的温度下，氯化胆碱/乙二醇体系的粘度会大大降低，有利于多酚提取的进行。图10为超声提取时间和含水量影响多酚提取得率的响应面和等高线图。由图可知，夜交藤多酚提取得率随提取时间的延长和含水量的提高也呈现先升高后降低的趋势，最大值在相对中心位置，说明这两个因素所选择的水平范围较为恰当。相对于含水量，超声时间所呈现出的等高线更为陡峭，这与方差分析结果一致，意味着提取时间对多酚提取得率的影响更大。由等高线图还可以看出，图形形状几乎为圆形，说明二者之间相互影响作用较弱。图11为超声提取温度与含水量影响多酚提取得率的响应面和等高线图。由实验结果可知，在较高的提取温度和适中的含水量条件下能够获得最大的多酚提取得率。超声温度所致的坡度更为陡峭，说明提取温度对多酚提取得率的影响更大。两个因素间的等高线图接近椭圆形，说明二者之间的相互作用显著，在一定范围内可以发挥协同作用提高多酚提取得率。
如图12-14所示，为超声提取时间、提取温度和含水量三因素对抗氧化活性指标Fe2+当量的影响。三因素所造成的响应面图的坡度陡峭程度先后顺序为提取时间>提取温度>含水量，说明提取时间对多酚的Fe2+当量指标影响最大，适当延长提取时间能够提高Fe2+当量指标值，有利于抗氧化多酚的提取。由等高线图可以看出，三因素两两之间的等高线图的圆心位置均在接近于图形中间位置，说明Fe2+当量最大值在所选择因素水平范围内；超声提取时间与温度，提取温度与含水量等因素两两之间的等高线图形状接近于椭圆形，说明二者之间具有内在的相互影响关系，适当延长提取时间，提高提取温度，或者提高提取温度和含水量可以发挥协同作用提高提取物抗氧化活性评价指标Fe2+当量值(模型方程中系数分别为+2.50和+1.77均大于0)。而超声提取时间与含水量两个因素间的等高线图接近圆形，说明二者之间的相互作用并不显著。
多项研究表明，在超声辅助DES提取过程中，二者的协同作用能够促使中药材细胞破碎，加速待提取有效成分的溶出。基于此，我们采用扫描电镜测试手段对夜交藤药材粉末提取前后的表面形态进行分析。由实验结果图15可以看出，提取前的夜交藤药材为表面光滑的不规则块状粉末，说明植物细胞结构较为完整，没有遭受到破坏。当采用超声-DESs技术处理后(图15)，样品表面开始变得凹凸不平，且有大量的孔洞出现，说明在超声和DES作用下，夜交藤植物细胞壁已经遭到较为严重的破环，细胞内的酚类化合物可以较为轻易的溶解、释放。这是超声-DESs技术提高夜交藤多酚提取得率的直观体现
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (10)
1.一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，其特征在于，包括：
步骤1、取氢键受体和氢键供体按比例混合形成DESs溶剂；
步骤2、取夜交藤粉末置于容器中，加入DESs溶剂后超声提取得到提取液；
步骤3、取提取液离心处理后吸取上清液；
步骤4、用AB-8大孔吸附树脂除去上清液中的DESs，浓缩干燥即可。
2.根据权利要求1所述的一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，其特征在于，步骤1在所述步骤1中，所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体选自1,4-丁二醇、乙二醇、丙三醇、尿素、草酸、乳酸、柠檬酸、葡萄糖和蔗糖中的一种；
所述氢键受体和氢键供体的的摩尔比为2:1-15。
3.根据权利要求1所述的一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，其特征在于，所述步骤4包括：将提取液加入到平衡好的AB-8大孔吸附树脂，首先用双蒸水进行洗脱，将极易溶于水的氯化胆碱和乙二醇以及提取液中的水溶性色素充分洗脱，随后用70％乙醇洗脱夜交藤多酚；70％的乙醇洗脱液浓缩至无醇味，冷冻干燥后，用质量分数为60％乙醇配制为浓度为1.0mg·mL-1的储备液，置于4℃冰箱中备用。
4.根据权利要求1所述的一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，其特征在于，所述DESs溶剂中含水量为15-25％。
5.根据权利要求1所述的一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，其特征在于，所述步骤2中，每1g夜交藤粉末中加入的DESs溶剂量为10-40ml，所述提取时间为25-35min，提取温度为45-55℃。
6.根据权利要求1所述的一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，其特征在于，还包括夜交藤多酚含量测定；测定方法包括：
取提取液离心处理后吸取上清液1.0mL，用蒸馏水定容到10mL，制备含量测定工作液；
取工作液进行多酚含量以及Fe2+还原当量测定。
7.根据权利要求6所述的一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，其特征在于，包括以没食子酸为对照品，以福林酚试剂为显色剂，绘制多酚含量测定标准曲线；
具体包括：取100μg·mL-1没食子酸对照品工作液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL放置于10mL刻度量瓶中，依次加入福林酚试剂0.5mL，7.5％碳酸钠溶液2.0mL，每次间隔60sec，最后用蒸馏水定容到刻度，充分摇匀，室温反应60min后，以蒸馏水为空白对照，在400-800nm波长范围内进行扫描，确定最大吸收波长，并测定各反应液在最大吸收波长处的吸光度值；
以没食子酸对照品浓度为横坐标，相对应的吸光度值为纵坐标，对二者进行线性回归得到第一线性方程，建立多酚的含量测定方法。
8.根据权利要求6所述的一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，其特征在于，包括以硫酸亚铁为对照品，以邻二氮菲为络合显色剂，绘制Fe2+还原当量标准曲线；
具体步骤如下：精密吸取已经配制好，4℃冰箱保存的100μmol·L-1硫酸亚铁乙醇溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL放置于10mL刻度量瓶中，分别加入0.5mL 0.5％邻二氮菲乙醇溶液，用60％的乙醇定容到刻度，充分摇匀，室温暗处反应20min后，以60％乙醇为空白对照，在350-650nm波长范围内进行扫描，确定最大吸收波长，并测定各反应液在最大吸收波长处的吸光度值；
以硫酸亚铁摩尔浓度为横坐标，相对应的吸光度值为纵坐标，对二者进行线性回归得到第二线性方程，建立Fe2+还原当量的测定方法。
9.根据权利要求8所述的一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，其特征在于，在所述Fe2+还原当量测定过程中，以氯化高铁代替硫酸亚铁。
10.根据权利要求1所述的一种夜交藤多酚超声耦合DESs提取工艺，其特征在于，在所述步骤1中，将氢键受体和氢键供体按比例混合后，水浴加热至熔融。
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