CN105496846A - 一种赤芍协同美白提取物的提取方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药产品提取分离领域，尤其涉及一种赤芍协同美白提取物的提取方法及应用，用以解决现有的添加中药提取物美白化妆品一般由中药粗提取物制成，存在色素等杂质含量高以及美白效果差的问题。本发明提供的一种赤芍协同美白提取物的提取方法包括：浸泡、醇提、浓缩、离心、纯化步骤，得产品。该产品含有芍药苷亚硫酸酯、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰基芍药苷、苯甲酰氧芍药苷、苯甲酰芍药苷等7种芍药单萜苷类化合物和儿茶素、二氢槲皮素、紫云英苷、柚皮素等4种黄酮类化合物；具有酪氨酸酶抑制作用活血作用及抗氧化作用，体现了本产品保持中药化妆品功效成分多样性发挥协调美白作用的特点。
Description
技术领域
本发明属于中药产品提取分离领域，尤其涉及一种赤芍协同美白提取物的提取方法及应用。
背景技术
由于中药具有低毒安全、多成分多靶点的特点，所以成为美白化妆品开发关注的焦点，目前的中药美白化妆品，主要存在以下问题：(1)市场上的所谓中药化妆品有其名无其实，只是象征性加入微量或没有加入中药成分；(2)只能算是添加了植物成分的化妆品，没有体现中医药多成分、多靶点的综合效果；(3)含中药的化妆品，一般为中药粗提取物制成，颜色较深，味道较重，不为消费者所接受。
赤芍，中药名，为毛茛科植物赤芍或川赤芍的干燥根，春、秋二季采挖，除去根茎、须根及泥沙，晒干。性苦、微寒、归肝经，是著名野生地道中药材，应用历史悠久，产量较大、用途广泛，有清热凉血的功效。由于赤芍产量较大以及用途广泛，目前，已经有一些中药美白化妆品中添加赤芍提取物用以达到美白功效，但是现有的添加赤芍提取物中药美白化妆品一般由中药粗提取物制成，主要存在色素含量高以及美白效果差的问题。
因此，研发出一种赤芍协同美白提取物的提取方法，通过该提取方法得到的产品，色素含量低，可以有效提升产品的美白效果，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种赤芍协同美白提取物的提取方法，通过该提取方法制得的产品可以有效解决色素等杂质含量高的问题，同时还可以有效提升产品的美白效果。进一步地，本发明通过借助现代分析手段，进一步分离产品得到产品各组成成分，从机理上证明了中药化妆品成分功效多样性发挥协调美白作用的特点体现。
本发明提供的一种赤芍协同美白提取物的提取方法，所述提取方法包括：浸泡：将赤芍粉末浸泡于乙醇，得第一产物；醇提：将所述第一产物水浴回流加热，得第二产物；浓缩：将所述第二产物浓缩，得第三产物；溶解：将所述第三产物溶于去离子水，得第四产物；离心：将所述第四产物离心，取上清液，得第五产物；纯化：将所述第五产物流经大孔树脂层析柱后，再用去离子水冲洗大孔树脂，最后用乙醇溶液冲洗大孔树脂，收集大孔树脂下端液体，得产品。
优选地，所述赤芍粉末的直径为24目，赤芍粉末与乙醇的质量比为1:(6～18)。
优选地，所述第一份量乙醇溶液的体积浓度为50～90％，所述第一产品与所述第一份量乙醇溶液的质量比为1:(6～18)。
优选地，所述水浴回流加热的温度为40～80℃，所述水浴回流加热的时间为0.5～2.5h，所述水浴回流加热的次数为1～3次。
优选地，所述浓缩的温度为70～80℃，所述浓缩产物含水量为5％。
优选地，所述第三产物与所述去离子水的质量比为：1：10。
优选地，3000r/min，所述离心的时间为30min。
优选地，所述大孔树脂为D101型大孔树脂，所述第五产物与所述大孔树脂的体积比为(1～2):1。
优选地，所述去离子水与所述大孔树脂的体积比为(3～7):1，所述第二份量乙醇溶液的浓度为50～70％，所述第二份量乙醇溶液与所述大孔树脂的体积比为(1～3):1。
优选地，所述大孔树脂层析柱的径高比为1:(3～9)，所述第五产物、去离子水、第二份量乙醇溶液流经所述大孔树脂的吸附流速为2柱体积/小时。
本发明还提供了一种包括以上任意一项的制备方法得到的产品在美白化妆品中的应用。
综上所述，本发明提供的一种赤芍协同美白提取物的提取方法，经过浸泡、醇提、浓缩、溶解、离心以及纯化步骤制得产品，通过该提取方法制得的产品于传统提取方法得到的对照产品相比，可以有效提升美白效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例一种赤芍协同美白提取物中芍药苷亚硫酸酯的质谱示意图；
图2为本发明实施例一种赤芍协同美白提取物中氧化芍药苷的质谱示意图；
图3为本发明实施例一种赤芍协同美白提取物中芍药内酯苷的质谱示意图；
图4为本发明实施例一种赤芍协同美白提取物中芍药苷的质谱示意图；
图5为本发明实施例一种赤芍协同美白提取物中没食子酰基芍药苷的质谱示意图；
图6为本发明实施例一种赤芍协同美白提取物中苯甲酰氧芍药苷的质谱示意图；
图7为本发明实施例一种赤芍协同美白提取物苯甲酰芍药苷的质谱示意图；
图8为本发明实施例一种赤芍协同美白提取物二氢槲皮素的质谱示意图；
图9为本发明实施例一种赤芍协同美白提取物紫云英苷的质谱示意图；
图10为本发明实施例一种赤芍协同美白提取物柚皮素的质谱示意图；
图11为本发明实施例一种赤芍协同美白提取物儿茶素的质谱示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更详细说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种赤芍协同美白提取物的提取方法，进行具体地描述。
实施例1
称取粒径为24目赤芍粉末100克，于1200mL去离子水中80℃水浴回流加热1h后70℃条件下浓缩至含水量为5％，即得对照品。
实施例2
称取粒径为24目赤芍粉末100克，浸泡于1200mL50％乙醇中，浸泡1h，得第一产物1。将第一产物80℃水浴回流加热0.5h得第二产物1。将第二产物170℃条件下浓缩至含水量为5％，得第三产物1。将第三产物1溶于200mL去离子水中，得第四产物1。将第四产物1于3000r/min下离心30min，取上清液，得第五产物1。取100mL第五产物1流经径高比为1:9，体积为100mL的D101型大孔树脂层析柱吸附后，用400mL去离子水冲洗大孔树脂，最后用300mL体积浓度为65％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液得产品1。上样液、去离子水及乙醇溶液流经大孔树脂的流速均为2倍柱体积/小时。
实施例3
称取粒径为24目赤芍粉末100克，浸泡于1200mL70％乙醇中，浸泡1h，得第一产物2。将第一产物80℃水浴回流加热0.5h得第二产物2。将第二产物270℃条件下浓缩至含水量为5％，得第三产物2。将第三产物2溶于200mL去离子水中，得第四产物2。将第四产物2于3000r/min下离心30min，取上清液，得第五产物2。将100mL第五产物2流经径高比为1:9，体积为100mL的D101型大孔树脂层析柱吸附后，用400mL去离子水冲洗大孔树脂，最后用300mL体积浓度为65％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液得产品2。上样液、去离子水及乙醇溶液流经大孔树脂的流速均为2倍柱体积/小时。
实施例4
称取粒径为24目赤芍粉末100克，浸泡于1200mL80％乙醇中，浸泡1h，得第一产物3。将第一产物80℃水浴回流加热0.5h得第二产物3。将第二产物370℃条件下浓缩至含水量为5％，得第三产物3。将第三产物3溶于200mL去离子水中，得第四产物3。将第四产物3于3000r/min下离心30min，取上清液，得第五产物3。将100mL第五产物3流经径高比为1:9，体积为100mL的D101型大孔树脂层析柱吸附后，用400mL去离子水冲洗大孔树脂，最后用300mL体积浓度为65％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液得产品3。上样液、去离子水及乙醇溶液流经大孔树脂的流速均为2倍柱体积/小时。
实施例5
实施例2～4制得的产品1～3通过UPLC/Q-TOFMS技术分析产品的组成，得到的产品包括7种芍药单萜苷类化合物(详见表1)和4种黄酮类化合物(详见表2)，分离得到的11种物质的质谱图请参阅图1～图11。
表1：芍药单萜苷类化合物的ESI(-)离子模式下的一级质谱测定及鉴别信息
表2：黄酮类化合物的ESI(-)离子模式下的一级质谱测定及鉴别信息
实施例6
本实施例为实施例1制得的对照品和实施例2～4制得的产品1～3黑色素抑制功效的实验。
现代研究表明，皮肤色素沉着是由于人体黑素细胞产生过多黑色素所致，而黑色素经一系列反应得到的物质。而其中，酪氨酸酶是黑色素合成反应中不可缺少的关键酶，也是合成反应的限速酶，因此，通过抑制酪氨酸酶的活性，可以减少黑色素的生成，达到美白祛斑的目的。本测定方法利用L-酪氨酸与酪氨酸酶的显色反应，考察中药提取物对酪氨酸酶的抑制功效。
配制0.2mol/LpH6.8磷酸缓冲液，配制方法为：秤取Na2HP04·12H2O17.9g，加蒸馏水溶解，250mL容量瓶定容，即得0.2mol/L磷酸氢二钠溶液；秤取NaH2P04·2H2O7.8g，加蒸馏水溶解，250mL容量瓶定容，即得mol/L磷酸二氢钠溶液；精密量取196mL的Na2HP04溶液与204mL的NaH2P04溶液混合均匀即得到400mL的0.2mol·L-1pH6.8的磷酸缓冲液。
配制L-酪氨酸浓度为0.04％的L-酪氨酸溶液，配制方法为：精确称取L-酪氨酸0.04g，，用蒸馏水溶解并定容至50mL，然后再用0.2mol/L的磷酸缓冲液稀释至100mL，搅拌均匀，即得百分浓度分别为0.04％的L-酪氨酸溶液。
配制浓度为120U/mL的酪氨酸酶溶液，配制方法为：精确称取蘑菇酪氨酸酶0.00124g加50％的磷酸缓冲液溶解，定容至10mL，即得酶活力为120U/mL的酪氨酸酶溶液，4℃储存备用。分别取3mL对照品及产品1～3用0.2mol/LpH6.8的磷酸缓冲液稀释，并定容至10mL，混匀，得生药量为100mg/mL的对照品溶液和中药溶液1～3。
取相同的A、B、C、D四支试管，向四支试管中分别加入磷酸缓冲液、酪氨酸酶溶液和中药产品1～3，混合，在30℃水浴中恒温10min。其中，每支试管磷酸缓冲液、酪氨酸酶溶液和中药溶液的添加量请参见表3。
表3：试管组成
在A、B、C、D四支试管中加入0.5mL浓度为0.04％的L-酪氨酸溶液，混合，孵育30min，移至3mLmL比色皿中，于493nm处测其吸光值，每组平行试验3次。
按照以下公式计算对酪氨酸酶活性的抑制率：抑制率％＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100％。其中，A为未加中药溶液/对照品溶液，而加酪氨酸酶的混合液所测的吸光度，B为未加中药溶液/对照品溶液亦未加酪氨酸酶的混合液所测的吸光度，C为加中药溶液/对照品溶液和酪氨酸酶的混合液所测的吸光度，D为加中药溶液/对照品溶液而未加酪氨酸酶的混合液所测的吸光度。
测定得到的抑制率结果参见表4。
表4：抑制率
| 对照品 | 产品1 | 产品2 | 产品3 | |
| 抑制率％ | 69.28 | 80.22 | 85.33 | 81.56 |
从表4可以得出，产品1～3的抑制率与对照品相比，要明显(P＜0.05)高于对照品，证明本发明提取工艺制得的赤芍协同美白提取物的酪氨酸酶抑制效果要明显(P＜0.05)优于现有工艺，进一步推知，本发明提取工艺制得的赤芍协同美白提取物具有良好的抑制黑色素生成的功效，起到美白的效果。
实施例7
本实施例为实施例2～4制得的产品1～3的抗氧化功效的实验。
本实施例通过DPPH自由基清除能力来测定产品1～3的抗氧化功效。
精密称取0.0050gVC粉末，加蒸馏水溶解，100mL容量瓶定容得0.05mg/mL对照品VC溶液。
分别取3mL对照品及产品1～3与7mL去离子水混合得得生药量为100mg/mL的对照品溶液和中药溶液1～3。
准确称取0.02604gDPPH，用95％乙醇溶解定容到100mL，DPPH浓度为0.25g·L-1储存备用。实验时取12mL0.25g·L-1的DPPH溶液用95％乙醇定容100mL，DPPH浓度为0.03g·L-1，在400-600nm处扫描最大吸收波长为518nm。
空白对照吸光度测定：取5mL0.03g·L-1的DPPH溶液到10mLEP管中，再加入0.1mL体积浓度为95％的乙醇溶液，混合。在518nm处测定其吸光度，记为A0。
待测液吸光度的测定：取5mL0.03g·L-1的DPPH溶液到EP管中，再加入0.1mL待测液，混匀。在518nm处测定其吸光度，记为Ai。
数据处理，将以上获得的数据按以下公式计算清除率E：
E＝1-Ai/A0×100％。
测定得到的自由基清除率结果参见表5：
表5DPPH清除作用
由表5可以看出，以IC50为标准，四个不同样品对自由基的清除能力由高到低为：产品2＞产品1＞产品3＞对照品。产品2清除DPPH·的能力最强，IC50为0.94g·L-1，与阳性对照VC(IC50为0.93g·L-1)清除DPPH·的能力相近。
实施例8
本实施例为实施例2～4制得的产品1～3的活血功效的实验。
本实施例测定对于小鼠尾部血栓及凝血作用的影响。
阳性对照药的制备：取阿司匹林肠溶片(拜耳医药保健有限公司生产，批号BJ04316，购于广东省中医药)，于研钵中研磨至粉末状，用蒸馏水溶解，配置成浓度为200mg·mL-1的药液，不断搅拌至均匀分散，4℃保存。
交叉菜胶的制备：称取0.9g氯化钠粉末于150mL烧杯中，加入100mL蒸馏水制成生理盐水，再称取1.5g角叉菜胶于研钵中研磨成细小粉末，置于100mL烧杯中，加入于50mL生理盐水，制成浓度为3％的角叉菜胶溶液。
分别取6mL对照品及本产品1～3与4mL去离子水混合得生药量为100mg/mL的对照品溶液和中药溶液1～3。
取70只小鼠随机分为7组，每组10只，雌雄各半，分别为正常对照组、模型对照组及四组药物组。四组药物组分别每天灌胃相应中药纯化物供试液，正常对照组与模型对照组灌以等量的生理盐水，共八天；除正常对照组注射生理盐水外，其余各组动物均于第5天给药1h后在腰背部皮下注射3％角叉菜胶诱发血栓；于72h时用玻片法测定各组小鼠的CT(凝血时间，Clottingtime，CT)值。
用玻片法测定各组小鼠的凝血时间：用眼科镊将小鼠的眼球摘出，滴2滴血于洁净的玻片上，开始计时，每隔30s用干净针头从血滴边缘向中间挑动1次，观察，直到血丝出现为止，记录时间。
测定得到的凝血结果参见表7。
表7：凝血结果
从表7可以得出，本产品1～3的羟基自由基抑制率与对照品和阿司匹林相比，要明显高于对照品和阿司匹林，证明本发明提取工艺制得的赤芍协同美白提取物的活血效果要明显(P＜0.05)优于对照品和阿司匹林，进一步推知，本发明提取工艺制得的赤芍协同美白提取物具有良好的活血的功效，促进新陈代谢，起到美白的效果。
综上所述，本发明提供的一种赤芍协同美白提取物的提取方法，经过浸泡、醇提、浓缩、溶解、离心以及纯化步骤制得产品，通过该提取方法制得的产品，分别从酪氨酸酶抑制效果、抗氧化效果以及活血效果三个角度与传统提取方法得到的对照产品进行比较，相关指标均优于传统提取方法得到的对照产品，证明本发明提供的一种赤芍协同美白提取物的提取方法制得的提取产品可以有效提升美白效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种赤芍协同美白提取物的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：
浸泡：将赤芍粉末浸泡于第一份量乙醇，得第一产物；
醇提：将所述第一产物水浴回流加热，得第二产物；
浓缩：将所述第二产物浓缩，得第三产物；
溶解：将所述第三产物溶于去离子水，得第四产物；
离心：将所述第四产物离心，取上清液，得第五产物；
纯化：将所述第五产物流经大孔树脂层析柱后，再用去离子水冲洗大孔树脂，最后用乙醇溶液冲洗大孔树脂，收集洗脱液，得产品。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述赤芍粉末的直径为24目，所述浸泡时间为1h。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述第一份量乙醇溶液的体积浓度为50～80％，所述第一产品与所述第一份量乙醇溶液的质量比为1:(6～18)。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述水浴回流加热的温度为40～80℃，所述水浴回流加热的时间为0.5～2.5h，所述水浴回流加热的次数为1～3次。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述浓缩的温度为70～80℃，所述浓缩产物含水量为5％。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述第三产物与所述去离子水的质量比为1：10。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述离心的转速为3000r/min，所述离心的时间为30min。
8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述大孔树脂为D101型大孔树脂，所述第五产物与所述大孔树脂的体积比为(1～2):1。
9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述去离子水与所述大孔树脂的体积比为(3～7):1，所述第二份量乙醇溶液的浓度为50～70％，所述第二份量乙醇溶液与所述大孔树脂的体积比为(1～3):1，所述大孔树脂层析柱的径高比为1:(3～9)，所述第五产物、去离子水、第二份量乙醇溶液流经所述大孔树脂的吸附流速为2倍柱体积/小时。
10.一种包括权利要求1至9任意一项的制备方法得到的产品在美白化妆品中的应用。
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