CN103342687A - 一类具有酪氨酸酶抑制活性的化合物及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一类具酪氨酸酶抑制活性的化合物,包括五种从波罗蜜木材中提取的具有酪氨酸酶抑制活性的多酚类化合物,属于医药、化妆品和食品技术领域。将木材经95%乙醇超声提取三次,浓缩、大孔树脂分离、洗脱、洗脱液浓缩干燥,再用硅胶和凝胶柱层析分离,收集溶液,浓缩干燥后得样品并进行结构鉴定。本发明提供的五种多酚类化合物具有较强的酪氨酸酶抑制活性,能够有效用于果蔬的酶促褐变的抑制、美白化妆品,以及制备用于预防和治疗黑色素过多导致的人体色素沉着性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病症药物的各种制剂。
Description
技术领域
本发明涉及到一类具酪氨酸酶抑制活性的化合物及其制备方法与用途,属于医药、化妆品和食品技术领域。
背景技术
波罗蜜,又称大树菠萝或木波罗,是桑科波罗蜜属常绿乔木,在海南,广西,广东,云南等地有种植。是我国南亚热带著名的特产水果之一,其果大而美观,味极甜,香气浓郁。现代药理学研究表明,从该植物中获得的一些成分具有抗炎、抗氧化、抑制黑色素生物合成、抑制血小板聚集等诸多药理作用。波罗蜜的木材化学成分有黄酮,萜类,二苯乙烯类,长链脂肪酸类等。前面我们发现一类2',4'-二羟基取代的黄酮类化合物普遍具有较强的酪氨酸酶抑制活性,作为后续的研究,最近我们又陆续发现一些具有较强酪氨酸酶抑制活性的新化合物和新天然产物。
酪氨酸酶作为黑色素合成的关键酶,其表达和活性与果蔬的褐变和人体色素沉着性疾病密切相关。因此,酪氨酸酶抑制剂可作为黑色素抑制剂应用于食品、化妆品、医药等领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一类具酪氨酸酶抑制活性的化合物,是从波罗蜜木材中提取的一类具有酪氨酸酶抑制活性的多酚类化合物,包括Artoheterophyllin E、Artoheterophyllin F、Artoheterophyllin G、2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one和2-(3,5-dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran,其结构分别如下:
本发明的第二个目的是提供所述具有酪氨酸酶抑制剂活性化合物的制备方法,通过以下步骤实现:
(1)波罗蜜木材用95%(v/v)乙醇超声提取,提取液减压浓缩至干燥物,称重;
(2)提取物用95%(v/v)乙醇溶解,定性滤纸过滤;
(3)上述过滤液与Amberlite XAD16以质量比1:2混合,减压浓缩至干;
(4)将上述搅拌物上大孔树脂,先后分别用20%、40%、60%、80%、95%(v/v)乙醇洗脱。
所述Artoheterophyllin E通过以下步骤得到:步骤(4)收集40%乙醇洗脱部分6个柱体积,浓缩干燥得样品,称重,用硅胶柱层析分离,醋酸乙酯-正己烷洗脱,先后得到2A、2B、2C三个洗脱流分,流分2C经凝胶柱层析,甲醇-水洗脱,即得Artoheterophyllin E;所述醋酸乙酯-正己烷体积比为3:1,甲醇-水体积比为1:1。
所述2-(3,5-dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran通过以下步骤得到:步骤(4)收集60%乙醇洗脱部分6个柱体积,浓缩得干燥样品,称重,经凝胶柱层析进行分离,二氯甲烷-甲醇洗脱,先后得到3A、3B、3C三个流分,流分3B进一步凝胶柱层析,甲醇-水洗脱,即得2-(3,5-dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran;所述二氯甲烷-甲醇体积比为20:1,甲醇-水体积比为1:1。
所述2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one通过以下步骤得到:步骤(4)收集60%乙醇洗脱部分6个柱体积,浓缩得干燥样品,称重,用凝胶柱层析进行分离,正己烷-醋酸乙酯洗脱,先后得到4A、4B、4C、4D和4E五个流分,流分4E进一步凝胶柱层析,甲醇-水洗脱,即得2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one;所述正己烷-醋酸乙酯体积比为3:1,甲醇-水体积比为1:1。
所述Artoheterophyllin F通过以下步骤得到:步骤(4)收集80%乙醇洗脱部分6柱个体积,浓缩得干燥样品,称重,用硅胶柱层析分离,进行梯度洗脱,先后得到5A、5B、5C、5D四个洗脱流分,流分5D用凝胶柱层析进行分离,甲醇-水洗脱,先后得到H、I、J、K四个洗脱流分,流分K经硅胶柱层析,二氯甲烷-甲醇洗脱,即得Artoheterophyllin F;所述甲醇-水的体积比为3:2,二氯甲烷-甲醇的体积比为25:1;所述梯度洗脱,是先后分别采用1000mL的二氯甲烷、体积比为50:1的二氯甲烷-甲醇及体积比25:1的二氯甲烷-甲醇进行洗脱。
所述Artoheterophyllin G通过以下步骤得到:步骤(4)收集95%乙醇洗脱部分6个柱体积,浓缩得干燥样品,称重,用硅胶柱层析进行分离,二氯甲烷洗脱,得到上述另外四个已知化合物及另一流分,将该另一流分再进一步硅胶柱层析,二氯甲烷-正己烷洗脱,即得Artoheterophyllin G;所述二氯甲烷-正己烷体积比为1:2。
本发明的另外一个目的是提供所述具有酪氨酸酶抑制活性的化合物在制备抗果蔬酶促褐变抑制剂、化妆品美白剂,制备用于预防和治疗黑色素异常导致的人体色素沉着性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病症的药物中的应用。
本发明的五种波罗蜜木材中的提取的具有酪氨酸酶抑制活性的多酚类化合物可以作为活性成分,不加或加入食品添加剂辅料,化妆品辅料或药剂上接受的辅料,按照相应剂型的制备方法制成制剂。
所述的剂型包括固体粉末、水溶液、醇溶液、乳液、面膜、巴布剂、注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩剂、微丸等。
本发明的有益之处在于:首次从波罗蜜木材中分离提取得到新的具有酪氨酸酶抑制活性的多酚类化合物,具有比阳性对照物曲酸更强的活性,制成相应制剂易于质量控制,可在抗果蔬酶促褐变抑制剂、化妆品美白剂、制备预防和治疗黑色素异常导致的人体色素沉着性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病症的药物中应用。
附图说明
图1为化合物Artoheterophyllin E的1H NMR谱
图2为化合物Artoheterophyllin E的13C NMR谱
图3为化合物Artoheterophyllin F的1H NMR谱
图4为化合物Artoheterophyllin F的13C NMR谱
图5为化合物Artoheterophyllin G的1H NMR谱
图6为化合物Artoheterophyllin G的13C NMR谱
图7为化合物2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one的1H NMR谱
图8为化合物2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one的13C NMR谱
图9为化合物2-(3,5-dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran的1H NMR谱
图10为化合物2-(3,5-dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran的13C NMR谱
具体实施方式
下面将结合实施例进一步详细说明本发明的实质内容和有益效果,这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。此外,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。样品的减压浓缩:提取液用滤纸过滤后,于东京理化旋转蒸发仪上减压回收溶剂,得浓缩液或固体。
实施例1Artoheterophyllin E的制备
将20kg波罗蜜木材用6倍质量的95%乙醇(v/v)超声波(50Hz,250w)提取2次,每次1h,减压浓缩至干燥,称重。取适量干燥物用95%乙醇(只要能溶解就行,无需精确比例)溶解,定性滤纸过滤,与Amberlite XAD16以质量比1:2混合,自然晾干或减压蒸干,然后上Amberlite XAD16层析柱,先后分别用20%、40%、60%、80%及95%(v/v)乙醇分别洗脱6个柱体积,收集洗脱液。所收集40%乙醇洗脱部分6个柱体积,减压浓缩干燥得样品,称重,用200-300目硅胶柱层析分离,醋酸乙酯-正己烷(v/v:3/1)洗脱,先后得到三个洗脱流分(流分2A、2B、2C),流分2C部分经凝胶柱层析(Sephadex LH-20),甲醇-水(v/v:1/1)洗脱,即得Artoheterophyllin E。
Artoheterophyllin E的核磁共振光谱数据如下:
1H NMR(Acetone-d6,400MHz)δ:9.28(1H,br s,OH-6'),9.12(1H,br s,OH-4),8.91(1H,brs,OH-4'),7.08(1H,d,J=8.4Hz,H-6),6.31(1H,dd,J=8.4,2.4Hz,H-5),6.18(1H,d,J=2.4Hz,H-3),5.94(1H,d,J=2.0Hz,H-5'),5.69(1H,d,J=2.0Hz,H-3'),5.20(1H,br t,J=2.8Hz,H-1''),5.15(1H,br t,J=2.8Hz,H-3''),2.12(2H,m,H-2'');13C NMR(Acetone-d6,100MHz)δ:160.3(C,C-4'),160.2(C,C-4),158.2(C,C-6'),155.8(C,C-2,2'),132.4(CH,C-6),114.0(C,C-1),108.9(CH,C-5),103.6(CH,C-3),102.4(C,C-1'),96.0(CH,C-5'),95.0(CH,C-3'),67.8(CH,C-1''),62.8(CH,C-3''),27.8(CH2,C-2'')。
ESI-MS:m/z271.1[M-H]-,273.2[M+H]+(C15H12O5)。
结构解析表明该化合物为Artoheterophyllin E。
实施例2Artoheterophyllin F的制备
波罗蜜木材的提取、大孔树脂分离过程同实施例1。所不同的是收集80%乙醇洗脱部分6个柱体积,减压浓缩得干燥样品,称重,用200-300目硅胶柱层析分离,进行梯度洗脱,分别用1000mL的二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇(v/v:50/1)和二氯甲烷-甲醇(v/v:25/1)洗脱,先后得到四个洗脱流分(流分5A-5D),流分5D用凝胶柱层析(Sephadex LH-20)进行分离,甲醇-水(v/v:3/2)洗脱,先后得到另外四个洗脱流分(流分H-K),流分K用200-300目硅胶柱层析,二氯甲烷-甲醇(v/v:25/1)洗脱得到Artoheterophyllin F。
Artoheterophyllin F的核磁共振光谱数据如下:
1H NMR(Acetone-d6,400MHz)δ:8.57,8.42,8.39(3H,br s,OH-3,2',4'),7.40(1H,d,J=8.4Hz,H-6'),7.35(1H,d,J=16.4Hz,H-7'),6.87(1H,d,J=16.4Hz,H-8'),6.71(1H,d,J=10.0Hz,H-1''),6.57(1H,d,J=1.2Hz,H-2),6.49(1H,br s,H-6),6.44(1H,d,J=2.4Hz,H-3'),6.39(1H,dd,J=8.4,2.4Hz,H-5'),5.58(1H,d,J=10.0Hz,H-2''),5.13(1H,m,H-6''),2.14(2H,m,H-4''),1.71(2H,m,H-5''),1.64(3H,H-9''),1.57(3H,s,H-8''),1.37(3H,s,H-10'');13C NMR(Acetone-d6,100MHz)δ:159.3(C,C-4'),157.1(C,C-2'),155.3(C,C-5),154.1(C,C-3),140.7(C,C-1),132.0(C,C-7''),128.4(CH,C-6'),127.8(CH,C-2''),126.1(CH,C-8'),125.2(CH,C-6''),124.5(CH,C-7'),118.4(CH,C-1''),117.3(C,C-1'),109.4(C,C-4),108.6(CH,C-5'),106.4(CH,C-2),106.3(CH,C-6),103.7(CH,C-3'),78.7(C,C-3''),41.9(CH2,C-4''),26.6(CH3,C-10''),25.9(CH2,C-9''),23.5(CH2,C-5''),17.7(CH3,C-8'')。
ESI-MS:m/z377.3[M-H]-,401.3[M+Na]+(C24H26O4)。
结构解析表明该化合物为Artoheterophyllin F。
实施例32,3-Dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one的制备
波罗蜜木材的提取、大孔树脂分离过程同实施例1。所不同的是收集60%乙醇洗脱部分6个柱体积,减压浓缩得干燥样品,称重,用凝胶柱层析(Sephadex LH-20)进行分离,正己烷-醋酸乙酯(v/v:3/1)洗脱,先后得到五个流分(流分4A-4E),流分4E进一步凝胶柱层析(Sephadex LH-20),甲醇-水(v/v:1/1)洗脱得到2,3-Dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one。
2,3-Dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one的核磁共振光谱数据如下:
1H NMR(Acetone-d6,400MHz)δ:12.20(1H,s,OH-5),9.65(1H,br s,OH-7),8.64(1H,br s,OH-2'),7.41(1H,d,J=9.2Hz,H-6'),6.53(1H,dd,J=7.6,2.4Hz,H-5'),6.52(1H,d,J=2.4Hz,H-3'),5.97(1H,d,J=2.0Hz,H-8),5.95(1H,d,J=2.0Hz,H-6),5.73(1H,dd,J=13.2,2.8Hz,H-2),3.76(3H,s,OMe),3.17(1H,dd,J=17.2,13.2Hz,H-3),2.74(1H,dd,J=17.2,2.8Hz,H-3);13C NMR(Acetone-d6,100MHz)δ197.7(C=O,C-4),167.4(C,C-7),165.4(C,C-5),164.8(C,C-9),162.0(C,C-4'),156.3(C,C-2'),129.0(CH,C-6'),118.8(C,C-1'),106.1(CH,C-5'),103.3(CH,C-10),102.5(CH,C-3'),96.9(CH,C-6),95.9(CH,C-8),75.4(CH,C-2),55.6(CH3,OMe),42.7(CH2,C-3)。
ESI-MS:325.2[M+Na]+,301.1[M-H]-(C16H14O6)。
结构解析表明该化合物为2,3-Dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one。
实施例42-(3,5-Dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran的制备
波罗蜜木材的提取、大孔树脂分离过程同实施例1。所不同的是收集60%乙醇洗脱部分6个柱体积,浓缩得干燥样品,称重,用凝胶柱层析(Sephadex LH-20)进行分离,二氯甲烷-甲醇(v/v:20/1)洗脱,先后得到三个流分(流分3A-3C),流分3B进一步凝胶柱层析(SephadexLH-20),甲醇-水(v/v:1/1)洗脱得到2-(3,5-Dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran。
2-(3,5-Dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran的核磁共振光谱数据如下:
1H NMR(Acetone-d6,400MHz)δ:8.57(2H,br s,OH-3',5'),7.82(1H,br s,OH-6),7.12(1H,s,H-4),7.01(1H,s,H-3),7.00(1H,s,H-7),6.82(2H,d,J=2.4Hz,H-2',6'),6.34(1H,t,J=2.4Hz,H-4'),3.89(3H,s,OCH3);13C NMR(Acetone-d6,100MHz)δ:160.0(C,C-3',5'),155.7(C,C-2),150.7(C,C-7a),146.7(C,C-6),146.4(C,C-5),133.5(C,C-1'),121.6(C,C-3a),103.7(CH,C-2',6'),103.5(CH,C-4'),103.4(CH,C-4),102.7(CH,C-3),98.5(CH,C-7),56.9(OCH3)。
ESI-MS:m/z271.1[M-H]-(C15H12O5)。
结构解析表明该化合物为2-(3,5-Dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran。
实施例5Artoheterophyllin G的制备
波罗蜜木材的提取、大孔树脂分离过程同实施例1。收集95%乙醇洗脱部分6个柱体积,浓缩得干燥样品,称重,用200-300目硅胶柱层析进行分离,二氯甲烷洗脱,得到上述实施例中的另外四个已知化合物及另一流分,将该另一流分进一步以200-300目硅胶柱层析,以二氯甲烷-正己烷(v/v:1/2)洗脱得到Artoheterophyllin G。
Artoheterophyllin G的核磁共振光谱数据如下:
1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:8.21(1H,d t,J=2.0,1.2Hz,H-6'),8.16(1H,d t,J=2.0,1.2Hz,H-3'),7.79(1H,m,H-5'),7.77(1H,m,H-4'),7.74(1H,d,J=2.0Hz,H-3),7.72(1H,d,J=6.8Hz,H-6),7.20(1H,dd,J=6.8,2.0Hz,H-5);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ:151.9(C,C-4),144.2(C,C-2'),143.9(C,C-2),141.3(C,C-1'),134.9(C,C-1),132.1(CH,C-6),131.0(CH,C-5'),130.6(CH,C-4'),129.8(CH,C-6'),129.3(CH,C-3'),120.0(CH,C-3),109.1(CH,C-5)。
ESI-MS:m/z195.1[M-H]-,197.1[M+H]+(C12H8N2O)。
结构解析表明该化合物为Artoheterophyllin G。
实施例6酪氨酸酶抑制活性评价
将artoheterophyllin E、artoheterophyllin F、artoheterophyllin G、2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one和2-(3,5-dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran均分别配成3.33、1.67、0.84、0.33、0.17、0.03μg/mL这5个浓度的溶液。阳性对照曲酸分别配成25、20、10、7.5、5、2.5μg/mL浓度的溶液。取上述五种浓度溶液各30μL,用970μL的pH值为6.8磷酸盐缓冲溶液配成1mL,加进0.1mg/mL的酪氨酸1mL,然后加入由pH值6.8的磷酸盐缓冲溶液配成的1mL酪氨酸酶(200U/mL),在37°C下孵育20min,于490nm处测定吸光值。
酶活性抑制率=[(A2-A1)-(B2-B1)]/(A2-A1)×100%
A1为0min时候未加抑制剂的吸收值;A2为20min后未加抑制剂的吸收值;
B1为0min时候加抑制剂的吸收值;B2为20min后加了抑制剂的吸收值。
实施例7五个化合物酪氨酸酶抑制活性评价
Artoheterophyllin E、Artoheterophyllin F、Artoheterophyllin G、2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one和2-(3,5-dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran抑制酪氨酸酶的IC50分别为18.5、3.6、32.4、4.5、36.8μM,曲酸的IC50为47.0μM。上述结果说明:五种化合物均有很强的酪氨酸酶抑制活性,都比曲酸强;五种化合物可以单独或混合作为酪氨酸酶抑制剂用于果蔬的酶促褐变的抑制,用于美白化妆品中美白,以及制备用于预防和治疗黑色素过多导致的人体色素沉着性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病症药物的各种制剂。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
2.制备权利要求1所述一类具有酪氨酸酶抑制活性的化合物的方法,其特征在于,通过以下步骤实现:
(1)波罗蜜木材用95%乙醇超声提取,提取液减压浓缩至干燥物,称重;
(2)提取物用95%乙醇溶解,定性滤纸过滤;
(3)上述过滤液与Amberlite XAD16以质量比1:2混合,减压浓缩至干;
(4)将上述搅拌物上大孔树脂,先后分别用20%、40%、60%、80%、95%乙醇洗脱。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于Artoheterophyllin E通过以下步骤获得:步骤(4)收集40%乙醇洗脱部分6个柱体积,浓缩干燥得样品,称重,用硅胶柱层析分离,醋酸乙酯-正己烷洗脱,先后得到2A、2B、2C三个洗脱流分,流分2C经凝胶柱层析,甲醇-水洗脱,即得Artoheterophyllin E;所述醋酸乙酯-正己烷体积比为3:1,甲醇-水体积比为1:1。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于2-(3,5-dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran通过以下步骤获得:步骤(4)收集60%乙醇洗脱部分6个柱体积,浓缩得干燥样品,称重,经凝胶柱层析进行分离,二氯甲烷-甲醇洗脱,先后得到3A、3B、3C三个流分,流分3B进一步凝胶柱层析,甲醇-水洗脱,即得2-(3,5-dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran;所述二氯甲烷-甲醇体积比为20:1,甲醇-水体积比为1:1。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one通过以下步骤获得:步骤(4)收集60%乙醇洗脱部分6个柱体积,浓缩得干燥样品,称重,用凝胶柱层析进行分离,正己烷-醋酸乙酯洗脱,先后得到4A、4B、4C、4D和4E五个流分,流分4E进一步凝胶柱层析,甲醇-水洗脱,即得2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one;所述正己烷-醋酸乙酯体积比为3:1,甲醇-水体积比为1:1。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,Artoheterophyllin F通过以下步骤获得:步骤(4)收集80%乙醇洗脱部分6柱个体积,浓缩得干燥样品,称重,用硅胶柱层析分离,进行梯度洗脱,先后得到5A、5B、5C、5D四个洗脱流分,流分5D用凝胶柱层析进行分离,甲醇-水洗脱,先后得到H、I、J、K四个洗脱流分,流分经K硅胶柱层析,二氯甲烷-甲醇洗脱,即得Artoheterophyllin F;所述甲醇-水的体积比为3:2,二氯甲烷-甲醇的体积比为25:1;所述梯度洗脱,是先后分别采用1000mL的二氯甲烷、体积比为50:1的二氯甲烷-甲醇及体积比25:1的二氯甲烷-甲醇进行洗脱。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,Artoheterophyllin G通过以下步骤获得:步骤(4)收集95%乙醇洗脱部分6个柱体积,浓缩得干燥样品,称重,用硅胶柱层析进行分离,二氯甲烷洗脱,得到上述四个已知化合物及另一流分,将该另一流分再进一步硅胶柱层析,二氯甲烷-正己烷洗脱,即得Artoheterophyllin G;所述二氯甲烷-正己烷体积比为1:2。
8.权利要求1所述一类具酪氨酸酶抑制活性的化合物在果蔬的抗酶促褐变、美白化妆品以及制备用于预防和治疗黑色素过多导致的人体色素沉着性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病症的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,采用Artoheterophyllin E、Artoheterophyllin F、Artoheterophyllin G、2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxy-4-methoxy-phenyl)-4H-1-benzopyran-4-one、2-(3,5-dihydroxyphenyl)-5-methoxy-6-hydroxybenzofuran中的一种或它们的混合物,通过不加或加入抗酶促褐变其他辅料、化妆品配方、药物制剂辅料制成。
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