CN102283866A - 一种含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药、食品、饮料等技术领域，具体涉及一种含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，即确保重金属低含量、黄酮类成分高含量、保持产品“原汁原味”的蜂胶加工方法。本发明有针对性地研究蜂胶制备方法，得到的蜂胶提取物安全低毒，性质稳定，药理作用较强，且使用范围特别广，实用性较强，各类疾病的预防保健效果显著。该方法成本低，其制备工艺简单，有效成分得率高，能够获得高含量的黄酮类成分提取物，且重金属大大低于其他方法，特别是铅含量远低于国际标准，制备的制剂质量稳定，容易操作，更适于工业化生产。本发明提供了一种新的蜂胶提取物来源，对现有的蜂胶制备质量保证体系进行了完善，对提高现有的预防保健水平具有重要价值。

Description

一种含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法

技术领域

本发明涉及医药、食品、饮料等技术领域，具体地说是涉及一种药品、保健品或食品的加工技术，更具体地说是涉及一种含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，再具体地说是涉及一种在确保重金属低含量、黄酮类成分高含量的前提下，仍保持产品“原汁原味”的蜂胶加工方法。

背景技术

(一)蜂胶的研究概况

1、概述

蜂胶(Propolis)和蜂蜜及蜂王浆都是蜜蜂制造的天然物质，它最初被发现于蜂巢的入口处，因而得名。

蜂胶是蜜蜂从植物幼芽、新生枝芽及树干树皮上采集的树脂树胶，混以自身分泌物(上颚腺分泌物和蜂蜡等)加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物(芳香胶状体)。蜂胶是蜜蜂用于维持整个群体健康的有效物质，4万～5万只蜜蜂1年仅能采到40g～60g左右的蜂胶，被誉为“紫色黄金”。

蜂胶和蜂蜜、蜂王浆、花粉，都是小小蜜蜂奉献给人类的天然食品、保健品。蜂蜜、蜂王浆、花粉的营养价值和保健作用大家已比较了解，蜂胶由于相对发现得较晚，开发利用更是因现代生物提纯技术才得以实现，所以很多人对蜂胶可能还比较陌生。中外科学家在经过潜心研究后赞美说，蜂胶是最完美的天然广谱抗生物质；是天然免疫增强剂；是血管的清道夫；是健康的保护神；是天然的抗氧化剂……

由于蜂胶临床上具有显著抗病毒、抑菌、抗氧化、降血糖血脂、提高机体免疫力等医疗保健作用，因此对蜂胶的开发利用得到高度重视。

2、理化性质与来源

蜂胶为不透明固体，表面光滑或粗糙，折断面呈砂粒状，切面与大理石外形相似。呈黄褐色、棕褐色、灰褐色、灰绿色、暗绿色，极少数深似黑色。具有令人喜爱的特殊的芳香味。味微味，略带辛辣味，嚼之粘牙，用手搓捏能软化。温度低于15℃时变硬、变脆、易粉碎；36℃时质软、有粘性和可塑性；温度达60～70℃时熔化成为粘稠流体，并分离出蜂蜡。比重随不同植物种类而异，一般在1.112～1.136之间。不溶于水，微溶于松节油，部分溶于乙醇，极易溶于乙醚和氯仿。蜂胶溶于95％乙醇中呈透明的栗色，并有颗粒状沉淀。

纯蜂胶不应有其它杂质。近代研究证明，蜂胶所含有的丰富而独特的生物活性物质，使其具有抗菌、消炎、止痒、抗氧化、增强免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种功能，对人体有着广泛的医疗、保健作用，现已成为各国科学研究的热点，并成为新兴的保健品倍受推崇。

蜂胶生产期多为夏、秋季，中国的胶源植物大至有桦木科、杨柳科、松科、柏科和漆树科中的多数树种，以及桃、李、杏、栗、橡胶、桉树和向日葵等。

蜂胶是植物遗传物质与蜜蜂内分泌的复杂化合物，是蜜蜂从胶源植物的新生枝的嫩芽、腋芽、花蕾或创伤处采集的树脂类物质，经蜜蜂注入其腺体分泌物，经蜜蜂反复加工转化而成的胶状物质。

蜂胶具有防毒、杀菌、消炎、防腐、促进细胞再生及新陈代谢等作用，成为蜜蜂生命群体生存与发展的不可或缺的物质基础。经检测，蜂胶中含有二十余类、三百多种天然成份，蜂胶的主要功效成份是黄酮类、萜烯类等天然化合物。蜜蜂在产卵前，就是将蜂胶涂在巢壁或间隙，增强杀菌力，以保护蜂巢内部，使得蜂巢内部维持无菌状态。

蜂胶是蜜蜂以人力不可及的方式，使多种有效成份与活性物质有机融合而成的一种珍贵的蜜蜂产品，是天然营养保健食品。国家卫生部2002年3月5日卫法监发[2002]51号文件公布：蜂胶是可用于保健食品的物品。

3、中国药典2005版收载的蜂胶品种情况

中西药分类：中药(药材及饮片)

基原：本品为蜜蜂科昆虫意大利蜂Apis mellifera L.的干燥分泌物。多于夏季从蜂箱中收集，除去杂质。

性状：本品为团块状或不规则碎块，多数呈棕黄色、棕褐色或灰褐色，具光泽。20℃以下性脆、30℃以上逐渐变软，发黏性。气芳香，味苦，有辛辣感。

鉴别：取本品粉末0.5g，加甲醇20ml.超声处理20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取白杨素对照品、高良姜素对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液.作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-丁酮(9.4∶0.3∶0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

检查：干燥失重取本品粉末，减压干燥至恒重，减失重量不得过2.0％(附录Ⅸ G)。总灰分不得过8.0％(附录Ⅸ K)。酸不溶性灰分不得过6.0％(附录Ⅸ K)。氧化时间取本品粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25ml，密塞，振摇1小时，再精密加入水100ml，摇匀，滤过；精密量取续滤液0.5ml，置50ml的量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置具塞锥形瓶中，精密加入20％硫酸溶液2ml，振摇1分钟，精密加入0.02mol/L。高锰酸钾溶液0.05ml，同时，开动秒表计时，当溶液的紫红色完全消退时，停止秒表，记录的时间即为供试品的氧化时间。不得过22秒。

浸出物：照酸溶性浸出物测定法项下的冷浸法(附录Ⅹ A)测定，用乙醇作溶剂，不得少于50.0％。

含量测定：照高效液相色谱法(附录Ⅵ D)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.15％磷酸溶液(64∶36)为流动相；检测波长为268nm。理论板数按白杨素峰计算应不低于6000。对照品溶液的制备 精密称取白杨素对照品15mg，高良美素对照品10mg，分别置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取1ml，各置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。供试品溶液的制备 取本品粉末(过四号筛)约0.1g，精密称定，置索氏提取器中，加丙酮100ml，加热回流至提取液无色，提取液回收溶剂至于，残渣用甲醇溶解并转移至100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含白杨素(C₁₅H₁₀O₄)不得少于2.0％；含高良姜素(C₁₅H₁₀O₅)不得少于1.0％。

炮制方法：酒制蜂胶 取蜂胶粉碎，用乙醇浸泡溶解，滤过，滤液回收乙醇，晾干。

性味：苦，辛，寒。

功效：抗菌消炎、调节免疫、抗氧化、加速组织愈合。

主治：用于高脂血症和糖尿病的辅助治疗。

用法用量：0.2～0.6g。外用适量。

用药禁忌：过敏体质者慎用。

贮藏：置阴凉干燥处。

4、化学成分

蜂胶的品质与产地的植物种类有关。从蜂箱里收集的蜂胶含有大约55种树脂和香30始蜂蜡、少量芳香挥发油和花粉等夹杂物。

目前，已从中分离鉴定出的成分有黄酮类、萜烯类、醌类、酯类、醇类、酚类、醚类、有机酸和大量的氨基酸、酶类、维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆、维生素E和维生素A以及矿物质等。

含有大量的黄酮类、萜烯类化合物是蜂胶的重要特征，现已从蜂胶中分离鉴定的黄酮化合物有30余个。包括白杨素、柚柏素、芹菜素、金合欢素、槲皮素、高良姜素、芦丁、山柰酚、山柰甲素、鼠李素、松属素等，其中5，7-二羟基-3，4-二甲黄酮、5-羟基-4，7-二甲氧基双氢黄酮是蜂胶的特有成分，蜂胶大部分的生理及药理功能都与此类化合物有密切关系。有报道在巴西蜂胶中新发现的另一类酚类是异戊二烯-对-香豆酸和它的衍生物。在蜂胶中挥发物所占的比重较小，但芳香族化合物对蜂胶生物学活性起着重要作用。在蜂胶挥发物中，许多化学成分首次被鉴定出来，主要是单和倍半萜烯类物质。

4.1氨基酸

蜂胶中含有微量的氨基酸，包括缬氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、异氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、色氨酸(缺)、天门冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸。

4.2维生素B族

蜂胶中含有微量的维生素B族，包括维生素B1(硫胺素)、维生素B₂(核黄素)、维生素B₃(泛酸)、维生素B₆(毗多醇)、维生素B₇(维生素H)、维生素B₁₂(钴胺素)、肌醇(属B族)、维生素E(生育酚)等。

4.3矿物质和微量元素

蜂胶中含有丰富的矿物质和微量元素。

常量元素有：钙、镁、磷、钾、钠、硫、硅、氯、碳、氢、氧、氮等12种；

微量元素有：锌、硒、锰、钴、钼、氟、铜、铁、铝、锡、钛、锶、铬、镍、钡、金等25种之多(注：硒、锰、钴、钼这四种现被称为长寿元素的物质都可在蜂胶中找到)。

4.4有机酸

药材中所含的有机酸，有的具有一定的医疗价值，例如，水杨酸有解热止痛作用；缬草酸有镇静作用；苯甲酸有防腐、祛痰的作用；咖啡酸具有止血、镇咳、祛痰等效用；柠檬酸可用为搞凝剂等。近年来还发现一些有酸是某些中药的有效成分，如丁二酸是止咳平喘药地龙的有效成分之一；原儿茶酸是四季青中抑菌成分之一；异绿原酸是金银花中搞菌有效成分之一。

蜂胶含多种的有机酸，酸类化合物包括苯甲酸、丁苯甲酸、对羟苯甲酸、水杨酸、茵香酸、柠檬酸、酮戊二酸、桂皮酸、3，4-二甲氧桂皮酸、咖啡酸、阿Q酸、阿魏酸、异阿魏酸、芥子酸、对香豆酸等。

其中主要下述有三种：

①苯甲酸：有防腐、祛痰作用；

②阿魏酸：有消炎、止痛的作用。中药用于治疗偏头痛；

③咖啡酸：有止血、镇咳、祛痰的作用；

注：美国健康基金会的科学家研究发现，蜂胶中的咖啡酸能抑制培养器皿中结肠肿瘤细胞的增长和发生，因此认为，蜂胶中抗肿瘤的活性成份也包括咖啡酸在内。

蜂胶中羟基桂皮酸的衍生物是一组生物活性强的芳香族有机酸，如蜂胶中的咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、芥子酸、对香豆酸和3，4-二甲氧桂皮酸等。

4.5烯、烃、砧类化合物与挥发油

包括半旅烯、菠烯、曹烯、坷巴烯、异长叶烯、石竹烯、卜愈刨木烯、听雪松烯、锋草烯、厂依兰油烯、杜松烯、鳖烯等。

蜂胶中有多种萜类化合物，主要有二种：①双萜：具有抗菌和抑癌活性；②三萜：这就是人参有效成分的皂甙，具有多方面的生物活性。换句话说，蜂胶也有人参的一些主要作用。

挥发油又称精油，是蜂胶蒸馏所得到的与水不相混合的挥发性油状成分的总称。挥发油具有芳香气味，其中所含的化学成分比较复杂，因来源不同，所含的成分也不亡样，但其由往往以某种或数种成分占较大的份量。其基本组成为脂肪族、芳香族和惦类等三类化合物，以及它们的含氧衍生物如醇、醛、酮、酸、酚、醚、酯、内酯等。

4.6黄酮类化合物

黄酮化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物，大多具有颜色，具有多方面的生理和药理活性，能帮助人体防治多种疾病，使机体各种功能正常化、增强化。许多治疗冠心病有效的许多中草药中含有黄酮类成分，并注意到具有活血化淤作用的中药，也多含有黄酮类成分。临床治疗冠心病常用的银杏叶制剂″舒血宁片″，其主要有效成分为槲皮素、山茶素、异鼠李素等，这三种黄酮类成分均能在蜂胶中分离到。

蜂胶中的黄酮类化合物，其品种之多、含量之高超过了一般的植物药。世界各地蜂胶样品中分离出的黄酮化合物，已见文献报道的有70种以上。

蜂胶保健食品，作为饮食黄酮类、萜烯类等化合物的不足的有益补充，调节机体生理功能；以蜂胶为主要原料加工生产的保健食品，具有免疫调节、改善睡眠、调节血脂、调节血糖、改善胃肠道功能、抑制肿瘤、抗疲劳、延缓衰老、抗氧化等多方面保健功效。

世界上很多科学家在研究蜂胶、应用蜂胶。根据世界各国几十年的研究应用结果，科学家们给予蜂胶许多美称——“最完美的天然广谱抗生物质”、“天然免疫增强剂”、“血管清道夫”、“天然抗氧化剂”、“二十世纪人类发现的最伟大的天然物质”等等。

虽然由于蜂胶中含有多种天然的物质，具有抗病原微生物(细菌、真菌、病毒、病原虫)作用，所以有的人就把蜂胶说成是抗生素；但是，这是不科学的。从科学角度讲：蜂胶不是抗生素，更不是什么“典型的天然抗生素”，而是天然营养保健食品。

属于黄酮类约有：白杨素、杨芽黄素、刺槐素、芹菜素、木榨草素、柳穿鱼素、蜜桶黄素、槲皮素、芦丁、福擂黄素等；

属于黄酮醇类的有：良姜素、高良姜素、鼠李素、鼠李秦素、异鼠李素、鼠李柠檬素、山奈素、山奈甲黄素、岳掸素，桑木黄素、揪皮素及芦丁等衍生物；

属无双氢黄酮类的有：乔松素、球松素、樱花素、异樱花素、袖皮素等；

属于双氢黄酮醇的有：短叶松素及其衍生物。

下面专门介绍蜂胶中的两种很有特色的黄酮类化合物：

(1)槲皮素

槲皮素的化学名为3，5，7，3，4-五羟基黄酮，它广泛分布在植物药中。它的3-羟基与芸香糖结合的甙，称为芦丁或芸香甙，有维生素P样的作用，多年来临床用做毛细血管性止血药和辅助降压药。现已证实，槲皮素具有非常广泛的生理和药理活性：

槲皮素是许多中草药，如罗布麻叶、银杏、三七、金荞麦、盐肤木、款冬花、高良姜、侧柏叶等均含有的成分，柳果、小叶枇杷等作为药用时都要检测槲皮素含量。

第一，有扩张冠状血管、降低血脂、降血压、抗血小板聚集(注：血小板聚集会妨碍血液的流通，以致容易引起心脏病、脑中风等心脑血管疾病)等作用。顾振纶等(1993年)、赵雪英等(1996年)进一步实验证实，它具有抑制花生四烯酸诱导血小板化学发光和聚集的作用，并与阿斯匹林有协同作用；可抑制不同状态下的内皮细胞释放内皮素，以降低血管的紧张性，为防治血栓栓塞性疾病提供了理论根据。

第二，具有止咳、祛痰、抗炎、抗病毒、抗过敏和抗氧自由基作用。宋必卫等(1994年)、龚珊等(1996年)还发现槲皮素有镇静作用，采用多种药理学测痛方法，观察动物被注射不同浓度的槲皮素后，能明显提高动物的痛阈，且具有剂量效应关系，证实200mg/kg槲皮素与100mg/kg的阿斯匹林或2mg/kg吗啡镇痛作用相当。

第三，近年来槲皮素对肿瘤的化学预防作用和治疗作用日益受到人们的重视。槲皮素不仅对多种致癌物、促癌物和致癌剂有拮抗作用，而且体外研究发现槲皮素能显著抑制人卵巢癌细胞、人结肠癌细胞、人骨髓瘤细胞、人白血病细胞、人乳腺癌细胞、人淋巴瘤细胞的生长，IC50为7～20mg/L。1995年，日本林原生物化学研究所研究发现，蜂胶原料中所含的抗肿瘤成分高达5％。有关槲皮素抗肿瘤作用机理已进行较广泛的研究，既有理论意义，又有临床实用价值。

(2)芦丁(Rutin)

芦丁就是芸香苷，有维生素P同样的作用。那就是，软化毛细血管、增强毛细血管的通透性，还能降低胆固醇，对防治心、脑血管硬化很有帮助。

4.7醇类化合物

包括苯甲醇、3，5-二甲氧苯甲醇、2，5-二甲氧苯甲醇、桂皮醇、校叶醇、卜哗木烯醇(乙酚氧)、椎木烯醇、甜没药惦醇、荫品-4-醇、愈创木醇、布黎醇等。

4.8酚、醛、酮、醚类化合物

包括丁香酚、香草醛、异香草醛、苯用醛、卜环柠檬醛、4，5-二甲-4-苯基AZ环己烯酮、苯乙烯醚、对甲氧苯乙烯谜，对香直酸酯、咖啡酸酯、咖啡酸苯乙酯、乓乙醚咖啡酸酯、卜甲咖啡酸苯乙酯、环己醇苯甲酸酯、环己二醇苯甲酸酯、松柏醇苯甲酸酯、对香豆醇香草酸酶、苯甲醇阿魏酸酯等。

4.9蜂胶中已分离的其它成分

包括脂肪酸、淄类化合物、酶和多糖等。

5、蜂胶提取工艺对比

自二十世纪五十年代房柱教授开始对蜂胶治疗皮肤病开始，中国真正对蜂胶投入精力去研发的是在国家九五期间，是由中国农业科学院蜜蜂研究所主持的国家九五重点科技攻关蜂胶项目，主持人是许正鼎和刘富海。并且此后再度主持了十五、948产业化等国家重点项目蜂胶的研发工作，取得了一系列的成果，其中低温逆流分段冷提取技术，是目前国际先进的提纯分离技术，有效分离了蜂蜡与杂质、重金属等。

948产业化期间，许正鼎等通过创建蜂珍科技公司、刘富海创建天宝康科技公司，提供低温逆流冷提取的技术支持等，形成了以蜂珍、知蜂堂、天宝康、中宏的一批最早期的蜂胶产业化企业，使得蜂胶真正开始进入寻常百姓家。

蜂胶原胶中含有大量重金属成分(如铅、汞等)，如提取不当，会对人体造成严重伤害，甚至死亡。所以蜂胶的提纯技术对于蜂胶的品质至关重要。随着科技的不断发展，及科研人员的不懈努力，目前中国在蜂胶提纯方面已经达到国际先进水平。

天然蜂胶中虽然各种成分很复杂，但绝大部分有效成分均能良好地溶于乙醇和氢氧化钠溶液，只有少数物质溶于非极性溶液，如蜂蜡。石油醚与乙醇混合可提出蜂胶中大部分有效物质，但工艺比较复杂，且因工艺限制只适于大规模生产。丙酮与乙醇的极性接近，但是提取物不如乙醇提取法可直接制成酊剂，浸膏应用于医药、食品、化装品等方面。以下介绍几种比较可行的蜂胶提纯技术。

5.1浸提法：文献报道粗蜂胶与乙醇1∶4配比，85℃下回流，过滤，回收乙醇得到蜂胶浸膏。此方法所用试剂来源丰富，回收率高，制备蜂胶得率41.59％。

乙醇溶液浸渍法具体操作如下：

将粉碎的蜂胶粉加入5倍的乙醇水溶液，浓度分别为75％，85％，95％。在常温下浸渍24h，提出浸液，在重复加入2次，合并浸液冷却至5℃以下过滤，减压回收溶剂。其浓缩物呈深棕色至黑色纯蜂胶。

工艺过程：

(1)原料经预选分级，去除杂质。

(2)将预选后的原料放入冷藏柜，置于-18℃温度下冷冻48h。

(3)冷冻后的原料，迅速放入破碎机中破碎。由于蜂胶的物理性质决定了它在常温下呈半塑性状态，很难破碎，但在-5℃以下的温度破碎就容易。

(4)破碎后的原料，立即进入震动筛(14目)，大于14目的颗粒返回冷藏柜。

(5)将破碎筛分后的原料放入浸渍釜，浸渍釜最好选用配回流冷凝器的反应釜。再加上90％乙醇(蜂胶(重量)∶乙醇(容积＝1∶4))，在常温下浸渍，并不断搅动。6h后，停止搅动，静置2h，放出上清液，再加90％乙醇如上述工艺重复3次，合并溶液。浸渍过程中温度应保持在25℃左右，温度过高会引起蜂蜡大量溶化，造成过滤困难；温度过低溶解度降低导致时间延长，溶剂用量加大。

(6)浸渍后的溶液进入冷却反应釜，在反应釜加套内通入循环冷却，机械搅动，降温至5℃以下。

(7)降温后的溶液趁冷通过泵进入板框式过滤机进行过滤。溶液温度应保持5℃以下，这样可以使溶入乙醇溶液中的蜂蜡析出而随滤渣滤出。

(8)滤液进入减压蒸发器，采用水浴加热。在此阶段温度应保持在50℃以下，这样可以减少挥发油的蒸发和有效成分受热变性。

(9)蒸发出的乙醇蒸气经冷凝器回收注入溶剂贮罐，循环使用。

(10)蒸发后的蜂胶注模成型后即成(纯蜂胶)商品。

5.2索氏提取：索氏提取法是利用索氏提取器加有机溶剂的方法进行加速提取，比传统水溶提取效率高，但一般耗时数小时或十几小时，并且高温、低品质，操作复杂。

例如，乙醇、石油醚双相溶剂萃取法具体操作如下：

将粉碎后的天然蜂胶粉置于萃取器内，加入90％乙醇4倍，60-90°石油醚1倍(重量∶容积)，在40℃恒温下搅拌萃取，如上述重复3次，合并萃取液分层，冷却后过滤，减压浓缩。将脂溶性与醇溶性物质合并即得较纯的蜂胶。通过实验证实：石油醚与乙醇溶液与蜂胶的容量重量比在1∶4∶1范围内，40℃温度下，提取率较高，成分较完整。但因设备、工艺较单溶剂提取法复杂，适合大规模生产。

5.3超声提取：通过超声波的发射、振动使蜂胶有效成分溶解在溶剂中，从而达到分离，提纯的目的。超声波萃取法一般耗时十几分钟至1小时，具有提取速度快，节省溶剂，能耗小，从而降低成本，提高经济效益。

5.4氢氧化钠溶剂提取法：将粉碎后的天然蜂胶加入1％，2％的氢氧化钠溶液10倍，充分搅拌，使之溶后立即过滤，再加入5％HCL水溶液酸化蜂胶析出，经水洗后注模成型。

这种方法工艺上比较难以掌握，在用碱液溶解及酸化过程中都会出现时间过长、温度过高等情况，使析出的蜂胶呈炉渣样样物质。分析证明：虽然氢氧化钠溶液对蜂胶有效成分均有良好的溶解特性，但酸化后并不能使所有成分还原，而出现了部分异物化，部分皂化成酸性等不可逆反应。所以，氢氧化钠作为天然蜂胶全部有效成分的溶剂是不妥的。

5.5超临界CO₂流体(SFE-CO₂)萃取：超临界流体是温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有液体同样的凝聚力和溶解力，扩散系数接近气体的扩散系数，通常是液体的近百倍，因此萃取速度快。利用超临界流体的这种特殊性能，在超临界状态下，采用CO₂作溶剂，乙醇作夹带剂(因蜂胶在CO₂溶解度不大)进行萃取，从而获取纯蜂胶。其具有以下特点：改善了以往蜂胶制品的口感，并且色泽淡黄、杂质少、安全无毒、无溶剂残留，温度低，重金属含量低，纯度高，工艺流程简单等优点，但由于此萃取过程是在高压下进行，故萃取设备投资较高，能耗较大。

5.6超临界萃取复合微波辅取萃取(SFE-MAE)：微流萃取是一种新型食品分离技术。微波萃取实际是微波对萃取溶剂和物料的加热过程。微波能直接穿透溶剂和物料内部，加速分子运动，使物料充分并且快速溶解于溶剂从而达到萃取目的。

微波萃取具有如下特点：热效率及能量利用率高，迅速省时，萃取均匀，产品质量高，低温短时，组份不易破坏，设备简单，操作方便。超临界萃取复合微波辅助萃取是把两者结合起来，发挥各自的优势，通过不同萃取技术，分阶段地将蜂胶中的活性物质多糖、萜烯类、黄酮类物质、多环脂类逐渐提取出来，使得萃取更彻底，萃取率更高，萃取产物多，可以制作功能不同的保健食品或天然药物，从而实现蜂胶有效成分的充分利用。但由于这是两种工艺的结合，工艺流程相对复杂，设备昂贵，能耗也大。

6、蜂胶中总黄酮的提取及含量测定方法

以乙醇为溶剂，采用超声提取的方法对蜂胶中的总黄酮进行提取，利用紫外-可见分光光度法对总黄酮的含量进行测定。该检测方法简便、快速、适用性好，可用于质量控制，具有较高的开发应用价值。

蜂胶是蜜蜂的分泌物，因其含有丰富的黄酮类化合物而名声显赫，是自然界中总黄酮含量最高的天然物质之一。总黄酮具有很强的抗氧化和清除自由基作用；同时具有抗炎症，抗过敏，抗感染，抗肿瘤，抗化学毒物，抑制寄生虫，抑制病毒，防治肝病，防治血管疾病，防治血管栓塞，防治心与脑血管疾病等医疗功效。为了有效的对总黄酮进行提取及质量控制，本实验采用了紫外-可见分光光度法对总黄酮的含量进行测定，为实际生产提供了质量控制依据。

1.实验部分

1.1实验药材 蜂胶

1.2试药与试剂 芦丁标准品、乙醇、甲醇、苯、聚酰胺；

1.3仪器 分析天平、超声清洗仪、紫外分光光度计；

1.4供试品溶液的制备

精密称取蜂胶细粉约0.08g，加乙醇定容至25ml，摇匀后，超声提取20min。放置，吸取上清液1.0ml于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。先用20ml苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱总黄酮，收集甲醇液定容至25ml，即得。

1.5标准曲线的测定

1.5.1对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品5.15mg，加甲醇溶解并定容至100ml，即得51.5μg/ml的溶液。

1.5.2波长的选择

对芦丁对照品溶液和样品溶液分别在波长200-400nm之间进行扫描，结果显示对照品溶液在360nm和254nm处有最大吸收峰，而蜂胶中所含成分比较复杂，多数在254nm处都有吸收，对总黄酮的含量测定存在干扰，故本实验选择360nm作为检测波长。

1.5.3标准曲线的绘制

精密量取1.5.1项下制备的对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，于360nm波长处测定吸光度。数据经处理得回归方程为Abs＝0.02612*C-0.02486，R＝0.99581，结果表明总黄酮在5.15μg/ml-25.7μg/ml间呈良好的线性关系。

1.6蜂胶中总黄酮含量的测定

精密称取蜂胶细粉①0.0801g；②0.0807g加乙醇定容至25ml，摇匀后，超声提取20min。放置，吸取上清液1.0ml于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。先用20ml苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱总黄酮，收集甲醇液定容至25ml，于波长360nm处测定吸收值，依回归方程计算其含量。

由上表可知，蜂胶中总黄酮的平均含量为9.71g/100g。

1.7精密度试验

取浓度为51.5μg/ml的芦丁标准品溶液2.0ml至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。

按此法平行做5个样品，分别测定；

求得RSD＝0.1％，本实验精密度较好。

1.8稳定性试验

取浓度为51.5μg/ml芦丁对照品2ml，置10ml量瓶中，按标准曲线法操作，在360nm处测定结果见下表3。

求得RSD＝0.3％，本实验稳定性较好。

1.9重现性试验

分别精密称取蜂胶细粉0.0803g；0.0809g；0.0812g；0.0809g；0.0810g加乙醇定容至25ml，摇匀后，超声提取20min。放置，吸取上清液1.0ml于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。先用20ml苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱总黄酮，收集甲醇液定容至25ml，分别于波长360nm处测定吸收值，按标准曲线法操作。

求得RSD＝0.5％，可见本实验重现性较好。

1.10准确度试验

精密吸取1.6项下的供试品溶液①1ml，置10ml量瓶中，精密加入浓度为51.5μg/ml的芦丁对照品溶液2ml，加甲醇定容至刻度，摇匀。按标准曲线法操作，在360nm处测定吸光度。

计算公式：回收率＝(测出量-样品含量)/加入量*100％

测得平均回收率为99.25％，RSD为0.1％。

2讨论

2.1分别选用乙醇超声20min提取，回流0.5h提取，浸泡1h提取，经测定，前两种方法提取的总黄酮几乎相同，后者提取的含量较低。相比较，超声方法操作简便，提取的总黄酮含量高，故采用超声方法。

2.2本实验分别用30％、95％、100％不同浓度的乙醇进行提取，结果经定性检测，30％乙醇提取液几无总黄酮，100％乙醇提取液中总黄酮含量最高，故选择无水乙醇作为提取溶剂。

3结论

本实验通过对蜂胶中总黄酮提取方法及含量测定的研究，利用聚酰胺柱层析初步纯化蜂胶中总黄酮，并提供了测量蜂胶中总黄酮含量的一种快速、准确的方法-紫外分光光度法，无论是在制药工业还是食品工业上，都具有广泛的应用前景，为进一步分离其中的单体黄酮及研究其药理活性打下了基础。

(二)蜂胶的应用进展

1、蜂胶史话

(1)远在1亿5千万年以前，蜜蜂就生活在我们这个星球上(比人类早1亿多年)，在这漫长的1亿多年里，蜜蜂抵御病原微生物侵袭最重要的“秘密武器”就是蜂胶。

(2)3000年以前，古埃及人发现蜂胶具有杀菌、防腐作用，将蜂胶用于制作木乃伊，以防止尸体腐败。

(3)古希腊哲学家亚里士多德在《动物志》中记录了蜂胶可治疗各种皮肤病、刀伤、割伤和一些细菌感染症。

(4)公元11世纪，伊朗哲学家阿维森纳在《医典》中记载了蜂胶具有“自动消毒伤口及缓和肿瘤的疗效”。

(5)明朝李时珍所著《本草纲目》中记载了蜂胶在治疗牙痛、杀菌等方面的功效。

(6)1899-1902年，在英国与南非的战争中，军医用蜂胶与凡士林混合，作为手术后的外涂药，防止感染。

(7)1909年，亚历山大罗夫发表《蜂胶是药》的论文，引起了人们的极大关注，这是蜂胶药用的里程碑。

(8)1972年，首届国际蜂胶大会在捷克斯洛伐克召开。

(9)1978年9月，被海外誉为“蜂胶之父”的房柱的一篇题为“关于蜂胶医疗效用的研究”论文被译成英、俄、德、法、西班牙、塞尔维亚多种文本发表，这是中国的蜂胶研究成果第一次得到国外同行的认可。

(10)1995年，中国蜂产品协会蜂胶专业委员会成立。

(11)2001年，国家科技部、农业部、国家林业总局、中国科学院将“蜂胶资源高效利用与产业化发展”列为“十五”国家重点科技攻关项目。

(12)2005年蜂胶被正式列入《中华人民共和国药典》，成为一味法定的中药。

(13)截至2005年，蜂胶研制产品获国家卫生部、国家食品药品监督管理局批准的药品、保健品已有160多种。(中国农产品加工网综合)

2、药理作用

2.1抗细菌作用

抗细菌蜂胶是一种天然抗生素对多种细菌有抗菌作用，能抑制金葡菌、链球菌、沙门氏菌、变形杆菌、炭疽杆菌、出血败血性杆菌、产气英膜杆菌、枯草杆菌、腊杆菌、单核细胞增多性李司忒氏菌、丹毒丝菌属、马棒状杆菌、大肠杆菌等20余种细菌；其中对金葡菌、绿色链球菌、溶血性链球菌和变形杆菌的杀菌作用较青霉素、四环素等抗菌素强。蜂胶水溶液尚有抗结核杆菌的作用。另有报道，对白色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、大肠魏氏梭菌、大肠艾氏菌也均有抑菌作用。

2.2抗真菌

蜂胶中所含黄酮类化合物是其抗真菌作用的重要成分。10％的蜂胶醇溶液对毛霉、根霉、细黄链霉菌均有抑制作用。尤其对放线菌、真菌中腐生根霉毛霉酵母菌抑制作用较好，而对平菇、金针菇等食用菌都抑制作用弱，为此可作为食用菌生产中的抑菌剂。

2.3抗原虫

蜂胶制剂在低浓度时能抑制阴道滴虫的生长，浓度为150mg/I-NN能完全杀灭之，与其所含黄酮类化合物的作用有关。此外对艾美尔球虫等原生动物的感染也有治疗作用。

2.4抗病毒

体外试验，蜂胶水提液能显著减轻牛痘病毒的感染，但体内试验抗病毒作用较弱。体外抗病毒试验，证实蜂胶对单纯疽疹病毒和疽疹性口腔炎病毒外壳均有杀灭作用；还证明其对脊髓灰质炎病毒繁殖的抑制作用最强，而腺病毒敏感性较差。

2.5防突变、抗肿瘤

抗肿瘤作用为蜂胶最引人注目的生理活性作用，蜂胶具有抑制和消灭癌作用，而不影响正常细胞，其关键是蜂胶的消除活性氧作用和增强免疫作用。

2.6抗炎、调节免疫作

抗炎蜂胶通过有效抑制机体PGst和LTs的合成，产生较阿司匹林更强的抗炎效果，为临床治疗关节炎，哮喘、牛皮癣等提供理论基础。其抗炎作用与其所含类黄酮化合物-咖啡酸和金合欢素有关。

2.7增强免疫功能

蜂胶本身无明显的抗原性。但它与一些抗原混合免疫动物时，能起免疫增强作用，能增加免疫动物的血清总蛋白和球蛋白的含量，并能促进免疫器官一脾脏及免疫细胞1淋巴细胞及巨噬细胞再生，提高两种球蛋白活性，明显增强血清IgG的合成；并增强巨噬细胞的吞噬功能。免疫调节是慢性肝病尤其是慢性病毒性肝炎治疗的重要环节，可以利用蜂胶对慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎进行肝癌的二级预防。

2.8抗氧化延缓衰老

多数资料报道，蜂胶中起抗氧化作用的主要成分之一是黄酮类化合物，也有资料显示蜂胶中众多的其他类化合物亦有抗氧化作用，阿魏酸、咖啡酸等含有酚羟基的有机酸可消除自由基，抑制氧化反应和自由基反应，具有保肝和抗肝脂质过氧化作用，糖类中的果糖也有明显的抗氧化作用。蜂胶黄酮对小鼠脑氧化氮影响的研究，显示可明显提高脑组织抗氧化酶的活性，同时显著降低脑组织NO的含量，提示蜂胶黄酮可以抑制N啪细胞毒作用，达到延缓衰老的作用。

2.9对中枢神经系统的作用

蜂胶对中枢神经系统有明显的抑制作用。腹腔注射蜂胶醇提取物(100～200mg/kg)，能减少小鼠的自主活动，其作用与剂量成正比。除之，还能显著延长环己巴比妥对大鼠的麻痹作用，并增强二甲基亚砜提高小鼠痛阈和降温作用。蜂胶水提液还能拮抗咖啡因引起的中枢兴奋作用，并具有局部麻醉作用。还有止痛作用和戒烟功效。

2.10对心血管系统的作用

王南舟等利用蜂胶乙醇提取液与中药甘草、芍药配伍的复合制剂为实验材料，以牛蛙为实验对象，通过在体蛙心运动描记法和离体蛙心灌注，探讨了蜂胶对蛙心活动的影响。两者均能使心肌收缩力加大，而心律变化不大，从而增加心输出量。蜂胶水提物对心脏有负性肌力作用，还能扩张血管，这些作用可能与其拟毒章碱作用有关。蜂胶乙醇提取物具有短暂的降血压作用。尚有报道蜂胶对高血压、低血压、白血病均有效，还可影响高粘滞血症的血液流变学、全血比粘度，血浆粘度等项指标。

2.11其他

蜂胶可促进肝细胞能量代谢，蛋白质核酸合成和生物膜转运功能，有利生长发育。另有报道蜂胶有促进组织再生，加快创伤愈合，而用于创伤和深度烧伤治疗，还可用来治疗牛皮癣和疱疹等外科疾患和预防龋齿。

3、蜂胶的应用

蜂胶味微甘；性平。治鸡眼、胼胝、疣和寻常疣。治恶性肿瘤和创伤有效。润肤生肌；消炎止痛。主胃溃疡；口腔溃疡；宫颈糜烂；带状疱疹；牛皮屑；银屑病；皮肤裂痛；鸡眼；烧烫伤。

蜂胶还能够明显改善睡眠，特别适合白领和中老年人。

3.1医疗和食品保健

由于蜂胶中含有大量类黄酮、芳香酸及其酯、有机酸、萜烯类等物质，具有抗细菌、真菌、霉菌、局部麻醉作用；并且临床证明类黄酮、萜烯类、酶类、醇类可抑制胸腺嘧啶、尿嘧啶和亮氨酸的结合，影响DNA合成，从而抑制癌细胞的新陈代谢；同时这些物质可以增强心脏收缩力和血管韧性，软化血管，降低血脂、血糖，清除血管内壁堆积物，固有心血管的“清道夫”之称。蜂胶的消炎、止痛、杀菌作用，广泛用于呼吸、耳鼻喉、口腔、皮肤科等疾病的治疗，蜂胶中的这些物质再加上还有氨基酸、矿物质、多糖，可增加机体免疫力，提高自愈力，广泛用于烧伤、烫伤的治疗。既然蜂胶有这么好的功效，于是人们把蜂胶加入食品，进行食疗保健也是众之所归，如蜂胶糖、蜂胶奶、蜂胶可乐等。

蜂胶保健食品温和有效、性平无毒，四季皆宜，可以放心食用。大量实践证明：常食蜂胶保健食品，有益于人体健康。需要注意的是，过敏体质者慎用。

玺源堂蜂胶是蜂胶中的极品，其总黄酮含量为每100g≥9300mg，是目前同类产品中含量最高的，且其余成分黄金配比，协同作用。科学家给予玺源堂蜂胶很多美称：血管清道夫、血糖守护神、抗癌勇士、天然免疫增强剂。

蜂胶在临床上的应用：

(1)在外科上的应用：由于蜂胶抗菌消炎作用强，局部止痛快，能促进上皮增生和肉芽生长，减轻疤痕形成程度，改善血液和淋巴循环，所以在治疗慢性下腿溃疡、肛裂等外科疾病上应用较多且效果较好。

(2)在皮肤上的应用：蜂胶制剂可用于治疗鸡眼、带状疱疹、扁平疣、寻常疣、毛囊炎、汗腺炎、晒斑、射线皮炎、皮裂、湿疹、搔痒症、神经性皮炎、银屑病、寻常痤疮、斑秃等皮肤病。有医院用蜂胶制剂治疗化脓性皮肤病，治愈率为75％。用蜂胶制剂治疗1000例各种皮炎患者，其中浸润性秃发病疗效率100％，斑秃疗效率为82％；用蜂胶治疗脚鸡眼治愈率达90％。

(3)在耳、鼻、咽喉科的应用：用蜂胶制剂(油膏剂或滴剂)治疗中耳炎或鼻炎，一般用药3～4次，10～15天可痊愈，个别3～4天可痊愈。另外，用蜂胶浸膏治疗急性和慢性鼻炎、委缩性鼻炎、鼻窦炎、咽炎、扁桃体炎、上呼吸道炎、外耳炎、中耳炎、听力障碍等都有较好的效果。

(4)在口腔科上的应用：早在50年代，国外就应用蜂胶软膏成功地治疗了复发性口疮、口腔糜烂、溃疡等口腔疾病。

(5)在内科上的应用：胃及十二指肠溃疡是比较顽固的慢性病，临床实践证明，用蜂胶酊治疗胃及十二指肠溃疡，其中90％以上的患者3～5天就有明显好转，胃酸度趋于正常，胃分泌机能恢复正常。蜂胶片治疗高血脂症有明显的降血脂作用，治疗冠心病也收到良好的效果。

3.2日用化工

蜂胶有消炎、止痛、杀菌、促进组织再生作用，有利于保护皮肤，防止某些皮肤病，有助于坏死皮脱落；促进表皮更新，目前有蜂胶牙膏、洗发水、沐浴露、护肤霜、蜂胶酊、洗面奶、洗手液、香皂等产品热销，并且蜂胶中萜烯类、芳香酸及酯等物质的存在，有特殊香气，用作香水不仅香气溢人，而且可以用来驱逐蚊蝇。

3.3农牧业方面

蜂胶有抗氧化、抗菌、抑制植物萌芽等生长的作用，并且蜂胶中酮类、酚类、醇类、醛类物质有抗菌、防腐的作用。故用于蜂胶植物调节剂、防腐剂、杀虫剂等方面。蜂胶有促进动物生长发育的作用，可用作饲料添加剂，有试验研究：用添加蜂胶的饲料喂养猪，同等时间内比没添加蜂胶的饲料喂养的猪体重增加多，并且节省饲料。并且最近报道，蜂胶对蜂螨有麻醉杀灭作用，一旦蜂胶杀螨剂出现将使蜂产品中农药残留和蜂螨产生抗药性的问题得到解决。

3.4食品贮藏和保鲜

由于蜂胶提取液能够形成保护膜，降低了果蔬的新陈代谢，减少水分蒸发，从而起到保鲜作用，延长了保存期，品质得到保证；蜂胶还有抗氧化作用，对油类食物的贮藏效果较好，现在已用于柑橘、蔬菜、水产品加工以及猪油和花生仁的保鲜和贮存。有人将蜂胶用于禽蛋保鲜，用10.4％蜂胶乙醇提取液处理，107天后蛋重损失率平均为2.25％，未见变质，对照组存60天时蛋白呈稀水棒，全部变黑腐臭。

4.食用标准

蜂胶的食用方法并不像服用其他蜂产品那么简便，必须经过提取过程，将有害物质剔除后方可应用，千万不可服用原蜂胶。直接服用原蜂胶或自行用白酒浸泡服用，虽也有一定程度的作用，却存在着潜在的负面影响，这是很危险的。当前，提取蜂胶和除铅技术虽已过关，可准确掌握这一技术的单位和个人并不很多，有些道听途说简便行事，甚至用白酒泡一泡就服用，这是不科学的。一定要食用厂家生产的产品，如：蜂胶胶囊、蜂胶液。

如何鉴别蜂胶市场上的蜂胶产品？由于厂商很多，品质良莠不齐。

(1)关于蜂胶产品的合法性：蜂胶未列入2002年卫生部(卫法监发2002.51号)发布的食品和既是食品又是药品的名单，即蜂胶产品不能以食品名义生产销售。卫生部在同一文件中将蜂胶列入保健食品原料名单，就是说蜂胶类产品必须通过申报，获得保健食品批准证书后方取得合法生产销售资格。

目前仍有相当多的蜂胶产品，利用当地卫生部门核发的普通食品卫生许可证，或QS认证以普通食品的名义进行生产经营，使相当多的没有获得保健号食品批文的蜂胶产品“合法化”。

在美国和欧盟等国，蜂胶是作为普通食品销售的。既然蜂胶是普通食品，就不能对人体造成任何伤害。国家质检总局、卫生部在2009年7月22日发布(关于进口食品、食品添加剂检验有关适用标准问题的公告)，在其中的附件1(进口食品及对应适用标准目录)中，第198页已确定将进口蜂胶胶囊定为普通进口食品(蜂胶液及其他蜂胶制品不在此类)，其标准参照SB/T10096-1992《蜂胶》，GB2760-2007食品中添加剂使用卫生标准。蜂胶胶囊检测方法标准：GB4789.2-1994食品微生物学检验菌落总数测定，GB4789.3-1994食品微生物学检验大肠菌群测定，GB4789.4-1994食品微生物学检验沙门氏菌检验，GB4789.5-1994食品微生物学检验志贺氏菌检验，GB4789.10-1994食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验，GB4789.15-1994食品微生物学检验霉菌和酵计数，GB/T5009.11食品中总砷及无机砷的测定方法，GB/T5009.12食品中铅的测定方法，GB/T5009.17食品中总汞及有机汞的测定方法，GB7718-1994食品标签通用标准，JJF1070定量包装商品净含量计量检验规则。

进口蜂胶胶囊作为普通食品必须经过中华人民共和国进出口检验检疫局法定检验，还要做到一批一检，经检验合格后由中华人民共和国进出口检验检疫局核发《卫生证书》，而且给每瓶合格的进口蜂胶瓶上，加贴中华人民共和国进出口检验检疫局CIQ防伪标识。

(2)蜂胶黄酮含量：最近制定的《蜂胶国家标准(报批稿)》对总酮含量有具体规定指标范围，超出正常含量范围是不可能的。蜂胶产品中的蜂胶含量是有一定比例的，有的企业把蜂胶原料折总黄酮含量检测结果当作产品的总黄酮含量进行宣传是一种欺骗行为。总黄酮含量仅是一个标志性成分指标，除黄酮外蜂胶还含有萜烯类和有机酸等多种功效成分，总黄酮含量高并不意味其它功效成分也同比例提高。蜂胶的保健作用是多种功效成分共同作用的结果，并非只是黄酮类物质在起作用。所以单纯宣传黄酮高是不科学的也是不符合实际的。

(3)蜂胶中的含铅量

蜂胶保健效果明显，食用蜂胶不应间断。蜂胶的铅含量超标问题，主要表现在原料上。蜂胶中的铅并不是在原胶中就有的，而是与蜂胶的采集环境、生产环节中受的污染，所以我们才说原料蜂胶不能直接食用；因此，蜂胶保健品的生产有特殊的要求，尤其是蜂胶中铅的分离技术。蜂胶中铅分离技术是一项食品加工基础技术，符合保健食品生产条件的蜂胶生产企业，在蜂胶技术人员指导下都能解决，均能达到国家制定的铅含量标准要求。卫生部、国家食品药品监督管理局批准的蜂胶保健食品，都通过指定权威机构严格的安全毒理性评价和保健功效评价，食用是安全的，也是有效的。

其实铅含量问题不是蜂胶特有的，所有的食品、药品、化妆品等都有铅含量问题，国家有关部门早就制定了相关产品的铅含量标准，超标产品就判定为不合格。一些厂家借题发挥炒作过分的渲染，以至误导，起到一些负面影响。正规的保健食品都必须进行铅、砷、汞的检测，只要合格产品尽可放心消费，不必谈铅色变。

5、蜂胶中抗肿瘤成分的研究

蜂胶作为一种天然药物，已证明其具有抗病原微生物、抗炎、免疫调节和抗肿瘤作用，特别是其抗肿瘤作用引起人们广泛的关注。研究表明蜂胶对人鼻咽癌、子宫颈癌、乳腺癌、肾癌、大肠癌等人癌细胞株均具有强烈的毒杀作用。已有多种抑制肿瘤细胞生长的有效成分已被鉴定出来，主要是咖啡酸及肉桂酸类的衍生物和黄酮类化合物等。

(1)咖啡酸类衍生物

咖啡酸苯乙酯(简称：CAPE)是蜂胶中一种较早被确认的抗肿瘤成分。近年国外研究报道，作为蜂胶抗肿瘤作用的主要活性成分，对人白血病细胞和多种实体瘤细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用，而且能显著抑制NIH/3T3细胞被肉瘤相关病毒MuSV-124的恶性传染。CAPE能抑制两种肿瘤细胞系的生长，调节两种细胞系中与肿瘤相关抗体的表达。CAPE可选择性诱导癌细胞株的DNA断裂。如鼠高肝转移性结肠癌26-Ij细胞株、鼠高肝转移性恶性黑色素瘤BL₆细胞株、鼠肺癌LLC细胞株、人纤维肉瘤HT-1080细胞株、人肺腺癌A₅₄₉细胞株和人宫颈癌HeLa细胞株的生长均有抑制作用，但不同的细胞株对，CAPE的敏感性不同。结肠癌26-L₅细胞的半数致死浓度(简称：EC50)为0.15μmol·L^-1，而HeLa细胞为10.7μmol·L^-1。CAPE还可减少由致癌物氧化偶氮甲烷导致的小鼠结肠畸形腺窝灶(简称：ACF)的形成和肿瘤的产生，而目前认为结肠黏膜ACF的形成是导致大肠癌发生的关键阶段。更值得研究人员兴奋的是CAPE及其衍生物对不同细胞具有选择性的毒性作用，对舌鳞癌、颈部牙龈转移癌等肿瘤细胞生长具有明显的抑制作用，但对黏膜成纤维细胞等正常细胞却没有作用。

CAPE的抗肿瘤作用部分机理已经被阐明。Hye等认为具有潜在的抑制肿瘤入侵及转移作用，这种作用是由细胞基质金属蛋白酶的调节决定的。细胞基质金属蛋白酶是一种Zn-依赖的蛋白水解酶，在细胞外基质的分裂增殖过程中起着关键作用。用不同剂量CAPE处理人成纤维肉瘤发现CAPE能够显著下调基因的表达水平。另外，也观察到CAPE能抑制MMP-2活化的全过程，如人侵、活动、细胞迁移、聚集，为CAPE抗肿瘤提供了有力证据。

CAPE抗肿瘤作用可能与CAPE能够修复细胞间缝隙连接有关。用CAPE处理缝隙连接缺失的WB-ras2细胞后，可引起细胞生长受抑，细胞缝隙连接明显恢复，其细胞连接相关蛋白连接素-43的表达上调并定位于细胞膜。

CAPE能够抑制肿瘤基因的表达。CAPE对TPA引起的肿瘤增长和5-经甲基-2’-脱氧尿嘧啶形成有潜在的抑制活性，在Hela细胞培养基中1.25、2.5、5、10、20mmol·L^-1的CAPE对DNA合成抑制率分别为32％、44％、56％、79％、95％；对RNA合成抑制率分别为39％、43％、58％、64％、75％，对蛋白质合成抑制率分别为29％、30％、37％、32％、47％。CAPE处理两个p53肿瘤突变异种细胞系NCI-H358和SKOV-3及缺乏型p53细胞引起cas-pase-3和DNA断裂。

CAPE引起肿瘤细胞凋亡作用还可由p38丝裂原活化蛋白激酶通路介导。CAPE(50μmol·L^-1)处理C6胶质瘤细胞，能够诱导细胞色素C从线粒体释放到细胞浆，激活CPP32，也上调了p53、Bax和Bak基因的表达。活化了细胞外的ERKs/p38 MAPK通路，p38激酶和p53形成一个复合体，诱导p53磷酸化，使得C6胶质瘤细胞凋亡。

另外，从荷兰蜂胶中提取得到CAPE类似物咖啡酸苯乙酯、咖啡酸苯丙酯、咖啡酸肉桂醇酯。3种成分对鼠肝转移结肠癌26-L5细胞都显示了抑制作用，EC50分别为0.288、1.76和0.114μmol·L^-1。

(2)肉桂酸类衍生物

近年来研究人员发现，阿替匹林(Artepillin C)及其结构衍生物是蜂胶中一类独特的对肿瘤细胞具有细胞毒性作用的活性成分。实验中发现，在体外肿瘤细胞抑制试验中，100μml-1 Anepillin C发现具有明显的细胞毒作用，能够强烈抑制人肺癌HLC细胞(腺癌)、肠癌HGC细胞、鼠肝癌HTSA细胞、鼠恶性肿瘤Colon 26和B-16细胞、喉癌KB细胞、和鼠黑素瘤上皮细胞Clone M-3的DNA合成，并能引起HLC、HGC、Colon 26、人白血病细胞的细胞凋亡。在裸鼠移植HLC、HGC、Colon 26、HTSA、PLC/PRF/5、黑色素瘤细胞动物实验中，每只裸鼠瘤内注射Artepillin C 500μg，即检测到细胞凋亡、有丝分裂中止、肿瘤细胞核溶解、肿瘤细胞死亡，最后癌病变组织被胶原限制，肿瘤细胞入侵浸润也被阻止，而人正常细胞的生长不受影响。低剂量Artepillin C(500μg)还可以预防铁-氮基三醋酸酯(简称：FeNTA)诱发的小鼠支气管和细支气管腺瘤恶性转化，阻止肺癌的发展。

Artepllin C对于不同系列的人白血病细胞如T-淋巴细胞性白血病细胞、β-淋巴细胞性白血病细胞、髓性白血病细胞、非淋巴、非髓性白血病显示了明显的细胞毒作用，100μml·L^-1“处理24h，能显著诱导这些白血病肿瘤细胞凋亡，其中对T-淋巴细胞性白血病细胞作用最强。所有细胞都观察到了凋亡小体和DNA碎片。所有白血病细胞的DNA合成都受到抑制，同时显微镜观察到细胞被瓦解。白血病细胞的凋亡可能与Fas抗原的表达增强和丧失线粒体膜电位有关。试验证明Artepllin C有抗白血病作用，但对正常的淋巴细胞仅仅是有限的抑制作用。

氧化偶氮甲烷处理DDY小鼠造成结肠癌模型，灌胃80和160mgkg^-1蜂胶或10mgkg^-1Artepillin C(相当160mg蜂胶)能够显著将结肠畸形腺窝灶的发生率降低39.2％，43.7％和43.4％。Shimizu等将Artepllin C加到人结肠癌腺细胞WiDr中，发现能够诱导细胞周期G(O)肥(1)期，并抑制肿瘤细胞生长。通过增强肿瘤关键蛋白Cip1/p21的活性，刺激Cip1/p21的表达来影响肿瘤细胞周期。

Akao等报道了另外两种肉桂酸的衍生物drupanin、Baccharin对结肠癌细胞、胃癌细胞、白血病细胞的抑制活性。浓度为150μmol·L^-1时，它们对以上所有细胞均有显著抑制作用，抑制效果为artepillin C＞Baccharin＞drupanin。从试验结果推测出该类化合物苯环上3位异戊二烯基团有助于抗肿瘤活性。但Drupanin似乎体现了比artepillin C更小的副作用，对于Con-A诱导的人正常血中淋巴细胞的细胞毒作用，Drupanin要弱于Artepillin C。

(3)黄酮类化合物

蜂胶中对肿瘤起作用的黄酮类化合物主要是黄酮及黄酮醇类、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物，这些物质对致癌物有抑制作用。试验中用抗微核实验模型对一些黄酮和黄酮醇衍生物进行筛选，发现大多数黄酮醇有抗苯并花的作用，其中高良姜黄素活性最强。蜂胶中的芦丁、桑黄素、槲皮素均能抑制苯并芘对小鼠皮肤的致癌作用；芹黄素、山奈酚、槲皮素对黄曲霉素B1与DNA加合物的形成有抑制作用，并能明显抑制对二甲基苯并蒽诱导的小鼠皮肤癌作用；槲皮素对TPA、3-甲基胆恿、N-甲基-N-亚硝基脂等引起的皮肤癌也有抑制作用。

Kyung等的实验发现蜂胶中的白杨素(Chrysin)能够诱导人白血病细胞U937细胞凋亡，并阐明了机理。在U937细胞中，如使用PI3K抑制剂，抑制了Akt的磷酸化，就会发现增强了Chrysin的诱导凋亡作用；而如果Akt的过度表达，则会抑制Chrysin诱导肿瘤细胞凋亡。提示了Akt信号途径在chrysin诱导人白血病细胞凋亡过程中起着重要作用，即有可能是建立了ChrYsin和P13K从kt-相关的通路之间的连接。这对恶性血液疾病提供了一个新的治疗策略。还有研究表明Chrysin能够显著下调NF-IL6，抑制了NF-IL₆与DNA的结合，抑制和阻断癌基因表达。Chen等从台湾蜂胶中分离到三种新异戊二烯基黄酮，PropolinA、B、C。Propolin A和B对3个癌细胞系的都显示了细胞毒性，DNA含量和DNA片段分析，Propolin A有效地诱导癌细胞凋亡，并表现出强力的抗大部分自由基的消除作用。Propolin C对于人黑色素瘤细胞也观察到细胞毒作用(IC50为8.5μmol·L^-1)，能够剂量或时间依赖性地降低几种能够引起人黑色素瘤细胞凋亡的蛋白的水平如Procaspase-8，Bid蛋白、procaspase-3，而且能使细胞色素C从线粒体释放到细胞浆中，提示了Propolin C的细胞毒作用是由线粒体介导。

(4)双萜烯酸类化合物

试验用高效液相色谱从巴西蜂胶甲醇提取液中分离出一种抗肿瘤物质，定性为新clerodane二萜烯(简称：PMS-1)，分子式C₂₀H₃₂O₃(分子量320)。该化合物能够抑制DNA的合成减少皮肤癌的发生率，并且通过降低DNA的合成抑制肿瘤的生长。日本研究人员根据对人肝细胞癌细胞毒性的检验，从巴西蜂胶甲醇提取液中分离出两个clerodane双萜异构体，分别为15-氧代-3，13Z-kolavadien-17-含氧酸和15-氧代-3z-13E-kolavadien-17-含氧酸。

(5)苯并吡喃类

Luo从巴西蜂胶中分离出活性成分苯并-Y-毗喃衍生物PM-3，能够抑制人胸腺癌MCF-7细胞生长。在G1阶段用PM-3处理MCF-7细胞，结果导致细胞周期蛋白D1和E蛋白水平的降低，PM-3也抑制了转录水平上的细胞周期蛋白D1的表达。从巴西蜂胶分离出(Z)-2，2-甲基-8-(3-甲基-2-丁基)-苯并吡喃-6-丙烯酸(A)和(E)-2，2-甲基-8-(3-甲基-2-丁基)-苯并吡喃-6-丙烯酸(B)。在紫外线(365nm)照射下B迅速变成A，也观察到相反的反应。反应从A或B开始，A和B的比率到达2.3，达到一个光稳定态。在抗人肺癌细胞HLC-20方面，A比B的细胞毒性强7倍。

蜂胶的抗肿瘤作用早已为人所知，但是一些研究报道值得注意。乌拉圭蜂胶的乙醇提取物是乳腺癌的一种抑制剂，而巴西蜂胶的水提取物和乙醇提取物对乳腺癌影响不大。说明蜂胶的来源和制备对于抑制肿瘤非常重要。还有报道，在成年大鼠抗艾氏癌实验中，蜂胶醇提液与博来霉素合用时的大鼠存活率要低于二者单独使用时的存活率。

近十年来，蜂胶以及其中的抗肿瘤活性成分的研究取得了巨大进展。不少效果良好的抗肿瘤成分成分结构新颖、有药用前途的先导化合物。我国是世界上养蜂和蜂产品生产大国，蜂胶资源丰富，随着对蜂胶抗肿瘤作用及其作用机理的不断深入研究，蜂胶在征服癌症中必将发挥应有的作用。

(三)常用中草药有效成分的提取分离方法

1、溶剂提取法

(1)原理：溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。当溶剂加到中草药原料(需适当粉碎)中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出，继续多次加入新溶剂，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。中草药成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为亲水性有机溶剂及亲脂性有机溶剂，被溶解物质也有亲水性及亲脂性的不同。有机化合物分子结构中亲水性基团多，其极性大而疏于油；有的亲水性基团少，其极性小而疏于水。各类溶剂的性质，同样也与其分子结构有关。这样，发明人就可以通过对中草药成分结构分析，去估计它们的此类性质和选用的溶剂。总的说来，只要中草药成分的亲水性和亲脂性与溶剂的此项性质相当，就会在其中有较大的溶解度，即所谓“相似相溶”的规律。这是选择适当溶剂自中草药中提取所需要成分的依据之一。

(2)溶剂的选择：运用溶剂提取法的关键，是选择适当的溶剂。溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶剂要注意以下三点：①溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；②溶剂不能与中药的成分起化学变化；③溶剂要经济、易得、使用安全等。常见的提取溶剂可分为以下三类：

①水：水是一种强的极性溶剂。中草药中亲水性的成分，如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及苷类等都能被水溶出。为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及碱水作为提取溶剂。

②亲水性的有机溶剂：也就是一般所说的与水能混溶的有机溶剂，如乙醇(又称：酒精)、甲醇(又称：木精)、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好，对中草药细胞的穿透能力较强。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。难溶于水的亲脂性成分，在乙醇中的溶解度也较大。还可以根据被提取物质的性质，采用不同浓度的乙醇进行提取。用乙醇提取比用水量较少，提取时间短，溶解出的水溶性杂质也少。乙醇为有机溶剂，虽易燃，但毒性小，价格便宜，来源方便，有一定设备即可回收反复使用，而且乙醇的提取液不易发霉变质。由于这些原因，用乙醇提取的方法是历来最常用的方法之一。甲醇的性质和乙醇相似，沸点较低(64℃)，但有毒性，使用时应注意。

③亲脂性的有机溶剂：也就是一般所说的与水不能混溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提出亲水性杂质。但这类溶剂挥发性大，多易燃(氯仿除外)，一般有毒，价格较贵，设备要求较高，且它们透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。如果药材中含有较多的水分，用这类溶剂就很难浸出其有效成分，因此，大量提取中草药原料时，直接应用这类溶剂有一定的局限性。

(3)提取方法：用溶剂提取中草药成分，常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等。同时，原料的粉碎度、提取时间、提取温度、设备条件等因素也都能影响提取效率，必须加以考虑。

①浸渍提取法(简称：浸渍法)：浸渍法系将中草药粉末或碎块装入适当的容器中，加入适宜的溶剂(如乙醇、稀醇或水)，浸渍药材以溶出其中成分的方法。本法比较简单易行，但浸出率较差，且如用水为溶剂，其提取液易发霉变质，须注意加入适当的防腐剂。

②渗漉提取法(简称：渗漉法)：渗漉法是将中草药粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。当溶剂渗进药粉、溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。但应控制流速，在渗渡过程中随时自药面上补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止。或当渗滴液颜色极浅或渗涌液的体积相当于原药材重的10倍时，便可认为基本上已提取完全。在大量生产中常将收集的稀浸出液作为另一批新原料的溶剂之用。

③煎煮提取法(简称：煎煮法)：煎煮法是中国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。

④加热回流提取法：应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内装药材约为容量的20％～60％，溶剂浸过药材表面约1～2cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾3～6小时，放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。

⑤连续回流提取法：应用挥发性有机溶剂提取中草药有效成分，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少，提取成分也较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。连续提取法，一般需数小时才能提取完全。提取成分受热时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。

2、分离和纯化方法：

上述提取法所得到的中草药提取液或提取物仍然是混合物，需进一步除去杂质，分离并进行精制。

(1)溶剂分离法：一般是将上述总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步进行提取分离。水浸膏或乙醇浸膏常为胶状物，难以均匀分散在低极性溶剂中，故不能提取完全，可拌入适量惰性填充剂，如硅藻土或纤维粉等，然后低温或自然干燥，粉碎后，再以选用溶剂依次提取，使总提取物中各组成成分，依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。利用中草药化学成分，在不同极性溶剂中的溶解度进行分离纯化，是最常用的方法。

(2)溶剂萃取法

①萃取法：溶剂提取萃取法又简称萃取法，是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。萃取时如果各成分在溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高；如果在水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行萃取，如果有效成分是偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。还可以在氯仿、乙醚中加入适量乙醇或甲醇以增大其亲水性。提取黄酮类成分时，多用乙酸乙脂和水萃取。提取亲水性强的皂苷则多选用正丁醇、异戊醇和水作萃取。不过，一般有机溶剂亲水性越大，与水作萃取的效果就越不好，因为能使较多的亲水性杂质伴随而出，对有效成分进一步精制影响很大。

②逆流连续萃取法：是一种连续的溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多的萃取管。管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充，以增加溶剂萃取时的接触面。如果一种中草药的水浸液需要用比水轻的苯、乙酸乙酯等进行萃取，则需将水提浓缩液装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位容器内。萃取是否完全，可取样品用薄层层析、纸层析及显色反应或沉淀反应进行检查。

③逆流分配法：逆流分配法又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法与溶剂逆流萃取法原理一致，但加样量一定，并不断在一定容量的溶剂中，经多次移位萃取分配而达到混合物的分离。

④液滴逆流分配法：液滴逆流分配法又称液滴逆流层析法。为近年来在逆流分配法基础上改进的溶剂萃取法。对溶剂系统的选择基本同逆流分配法，但要求能在短时间内分离成，并可生成有效的液滴。由于移动相形成液滴，在细的分配萃取管中与固定相有效地接触、摩擦不断形成新的表面，促进溶质在溶剂中的分配，故其分离效果往往比逆流分配法好。

(3)大孔吸附树脂法：大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的一类有机高聚物吸附剂，具有良好的吸附性能，近十余年来逐渐被应用于中草药化学成分的提取分离和中药新药的开发研制。

大孔吸附树脂为吸附和筛选原理相结合的分离材料。它的吸附性是由于范德华引力或生成氢键的结果。筛选原理是由于其本身多孔性结构所决定。由于吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而分开。这使得有机化合物尤其是水溶性化合物的提纯得以大大简化。大孔吸附树脂的骨架由苯乙烯和二乙烯苯缩聚而生成，由于改性剂的加入，大孔吸附树脂的极性发生改变，按照树脂的表面性质，吸附树脂一般分为非极性、中极性和极性三类。

非极性吸附树脂是由偶极矩很小的单体聚合物制得的不带任何功能基的吸附树脂。典型的例子是苯乙烯-二乙烯苯体系的吸附树脂，如D101、XAD-1、DiaionHP-10大孔吸附树脂。

中极性吸附树脂指含酯基的吸附树脂，如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯与双甲基丙烯酸酯等交联的一类共聚物。它是在非极性大孔吸附树脂的基础上，加入丙烯酸甲酯或丙烯腈缩聚而成，如中国国内经常使用的AB-8大孔吸附树脂。

极性吸附树脂是指含酰胺基、腈基、酚羟基等含氮、氧、硫极性功能基的吸附树脂。此外，有时把含氮、氧、硫等配体基团的离子交换树脂称作强极性吸附树脂，强极性吸附树脂与离子交换树脂的界限很难区别。极性大孔吸附树脂可以由甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺或亚砜类缩聚而成，如日本三菱化工的Diaion HP 2MG、美国Rohm-hass公司的XAD-10，XAD-9大孔吸附树脂。

与活性炭和其它吸附剂相比，大孔吸附树脂具有很多的优点，如对某种物质的吸附选择性较高；物理化学稳定性和机械强度较好；品种规格较多，可根据需要改变树脂物理或化学结构；吸附树脂一般为球状颗粒，流体阻力较小等等。因而被广泛应用于化工、医药等领域，近年来关于大孔吸附树脂在天然产物提取分离中的应用研究报道越来越多。大孔吸附树脂对中草药化学成分如生物碱、黄酮、皂苷、香豆素及其他一些苷类成分都有一定的吸附作用。对糖的吸附能力很差，对色素的吸附能力较强。

(4)沉淀法：是在中草药提取液中加入某些试剂使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法。如铅盐沉淀法：铅盐沉淀法为分离某些中草药成分的经典方法之一。由于醋酸铅及碱式醋酸铅在水及醇溶液中，能与多种中草药成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。然后将铅盐沉淀悬浮于新溶剂中，通以硫化氢气体，使分解并转为不溶性硫化铅而沉淀。

(5)盐析法：盐析法是在中草药的水提液中，加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离。常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。

(6)透析法：透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制。

(7)结晶、重结晶和分步结晶法：鉴定中草药化学成分，研究其化学结构，必须首先将中草药成分制备成单体纯品。在常温下，物质本身性质是液体的化合物，可分别用分馏法或层析法进行分离精制。一般地说，中草药化学成分在常温下多半是固体的物质，都具有结晶体的通性，可以根据溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。

3、常用干燥方法

(1)真空干燥：是基于这样一基本原理：水的饱和蒸气压与温度紧密相关，在真空状态下，水的沸点降低，即在真空下操作也就是在低温下操作，可避免在高温下营养成分如维生素等的破坏，同时提高了干燥速度。真空干燥在食品、制药、化工等行业有广泛的应用，中国也开发和引进了各种真空干燥设备，其结构形式多种多样。常用的形式主要有箱式真空干燥器、双锥式真空干燥器、带式真空干燥器等。这些传统的真空干燥装置主要采用热风，蒸汽或电等加热，利用热传导、对流或辐射原理将热量从外部传到物料内部。真空干燥具有干燥温度低，干燥室内相对缺氧，可避免脂肪氧化，色素褐变等一系列优点，适合于热敏感性食品物料的干燥，此外设备成本、干燥费用也相对较低。

(2)喷雾干燥：是流化技术用于液态物料干燥的一种方法。因是瞬间干燥，特别适用于热敏性物料，故所得产品质量好，保持原来的色香味，且易溶解。利用喷雾干燥来制备微囊的研究正在进行，它是将心料混悬在衣料的溶液中，经离心喷雾器将其喷入热气流中，所得的产品是衣料包心料而成的微囊，这种微囊粉末可采用于直接压片，也可制备胶囊剂、糖浆剂或混悬剂。

(3)冷冻干燥：是将干燥液体物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用冰的升华性能，使物料低温脱水而达到干燥的一种方法。由于物料在高度真空及低温条件下干燥，故对某些极不耐热物品的干燥很适合。王大林报道了一种喷雾通气冻干新技术，是利用冷的空气或氮气作为介质，迅速流经冻结物使水升华，喷雾冻干制得的产品微粒小、干燥快、时间短、均匀、流动性好，并具良好的速溶性。近年来，对膏状物料和粘稠物料干燥的研究取得了较大进展，流态化技术、喷射技术、惰性载体技术，则是在此研究基础上发展起来的。旋转闪蒸干燥机、热喷射气流干燥机、惰性载体干燥机均适合热敏性物料和膏状物料的干燥。这些新的研究成果用于中药制剂生产，将大大改善中药加工的技术水平，提高生产效率。

(4)远红外加热干燥法：是一项新的干燥技术，其干燥原理是将电能转变为远红外辐射，从而被药材的分子吸收，产生共振，引起分子和原子的振动和转动，导致物体变热，经过热扩散、蒸发和化学变化，最终达到干燥的目的。远红外干燥可节省电能20％～50％，效果较好。

(5)微波干燥法：是一项20世纪60年代迅速发展起来的新技术，微波干燥实际上是通过感应加热和介质加热，使被干燥物中的水分和脂肪不同程度地吸收微波能量，并把它转变为热量从而达到干燥的目的。微波干燥可杀灭微生物和霉菌，并具有消毒作用。目前中国生产的微波加热成套设备有915mhz和2450mhz两个频率。

4、超临界CO₂萃取方法

(1)有关动、植物成分的提取方法有：水煮法、水媒分离法、分子蒸馏和减压蒸馏法、金属加合法、萃取结晶法、分盘冷冻压榨法和有机溶剂法等。

采用水煮加热法，因加热时间长、温度高，易使对热不稳定的挥发成分发生变化，如一些不饱和脂肪酸的氧化。水媒分离法，此分离法的明显优点是消除了有机溶剂法造成的高费用和公害，但是这种技术的缺点是得到的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的纯度或级别不如有机溶剂分离法高。分子蒸馏和减压蒸馏法为减少热变性，需用尿素加合物等方法来除去大部分饱和脂肪酸，在得到的产品中必须将其除去；虽然可得到较纯的脂肪酸，但需几步才能达到目标，较费时、费力，增加了生产成本。金属加合法分离需要较低的低温处理，最后还要设法去除金属离子，清除不尽还会造成金属离子污染。萃取结晶法得到脂肪酸纯度较高，在较低的温度下进行，能防止脂肪酸的氧化，但时间较长，不太适用于大规模的工业化生产。分盘冷冻压榨法缺点是，安放盘架和液压机的冷冻室需要数千平方米的面积和庞大的冷却系统，大的设施需要多人操作，劳动强度高，分离速度缓慢，效率低，不能连续操作。有机溶剂法是采用石油醚或乙醚有机溶剂在水浴上加热情况下，进行回流循环提取；由于所采用的有机溶剂如石油醚或乙醚等均为一种低沸点物质，易燃易爆，同时，有机溶剂的使用一方面会污染环境，另一方面有机溶剂有可能在提取物中有残留，会影响提取物在医药上的进一步应用。

(2)有关动、植物成分的超临界CO₂萃取方法：一种流体当处在其临界温度和压力状态时，被称为超临界流体。由于超临界流体的密度接近于液体，具有与液体溶剂相当的萃取能力。又具有与气体相当的低粘度，扩散能力比液体要大100倍，因而具有较高的传质性。采用超临界萃取的时候，利用超临界流体的这些性质，使之与待分离的物质相接触穿透基体，从中萃取出目标物质。然后利用降压和/或升温的办法降低其密度，从而降低溶质在其中的溶解度，使被萃取物与溶剂分离。因为不同的物质在相同的萃取条件下溶解度是不同的，因而有可能借助这种差异将它们进一步分开。超临界流体萃取常常选用CO₂等临界温度低且化学惰性的物质为萃取剂，它特别适用于热敏物质和易氧化物质的分离，因此非常适用于对于动物油脂的提取分离。因此，本发明采取该方法，能够制备高纯度的被提取物。

超临界CO₂萃取方法是这样提取的：把干燥的被提取物的粗粉放在超临界萃取设备中用CO₂进行萃取，减压后即得被提取物，室温条件下呈浅黄色透明状；被提取物的纯度在40％以上，优于其他提取方法。

超临界CO₂萃取被提取物的方法包括如下步骤：

(1)将干燥的被提取物粉碎至10～30目后，置于超临界萃取釜中，连续地通入超临界状态下的CO₂进行萃取，优选的条件一般是：CO₂流量10～55kg/h·kg原料、压力5～50Mpa、温度15～75℃、时间0.5～6h；进一步优选的条件一般是：CO₂流量45kg/h·kg原料、压力35Mpa、温度50℃、时间1h；

(2)将萃取了被提取物的CO₂减压至1～12MPa，即可获得在室温条件下被提取物，被提取物的纯度在40％以上，萃取物的理化性状和纯度都优于其他提取方法。

萃取条件的选择是通过以下办法实现的：首先选定四因素、三水平，根据正交设计方法，按L9(3⁴)交设计表安排实验(正交实验设计安排参考郭祖超主编的《医学统计学》，人民军医出版社，1999年第一版)。从正交实验结果，分析得到萃取工艺条件。

对超临界CO₂萃取的被提取物进行甲酯化后，进行气相色谱-质谱分析。

超临界CO₂萃取被提取物的制备方法不使用有机溶剂等物质，不会污染环境，也不存在有害溶剂残留等问题，而且操作简便、萃取时间短、产品纯度高，使用的CO₂廉价而且可重复循环使用，工业生产成本低廉。

总之，经文献检索等现有的技术资料分析表明，到目前为止，尚未发现有确保重金属低含量、黄酮类成分高含量、保持产品“原汁原味”的蜂胶加工方法等方面的报道。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题是公开了一种含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，即确保重金属低含量、提高黄酮类成分含量的蜂胶加工方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

也就是说，本发明通过临床试验等研究及理论探索，目的在于提供一种新的含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法。

(一)技术构思

发明人经过研究的发现是：

蜂胶现有产业化的工艺，主要是以高浓度乙醇，超声或者微波提取，上清液浓缩回收，干燥粉碎，既有除杂质的效果，也有一定脱铅效果。针对重金属的问题，也有采用冰醋酸来进行脱铅的工艺；也有以热水直接超声或微波提取，有除杂质的效果，但是黄酮类成分损失会很大。

帕金森患者或L-芳香族氨基酸脱羧酶缺乏的病人特别是帕金森患者越来越多，严重影响中国人口的健康和生存质量，给家庭和社会带来沉重的负担，研制预防、诊断、检测、保护、治疗和研究有利于帕金森患者或L-芳香族氨基酸脱羧酶缺乏的病人等方面的产品，特别是药物、诊断试剂和保健品等，具有显著的社会效益、经济效益。

根据此想法和思路，发明人通过反复的实验研究和分析，已成功得到预期的研究结果和应用产品。

(二)含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法

本发明提供一种含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，对蜂胶提取工艺、方法等方面进行了多方面的试验和研究，评估蜂胶提取过程中有效成分和重金属含量的变化。

含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，包括以下步骤：

(1)制备蜂胶浸膏粗品

蜂胶原料以75～95％乙醇加热浸渍，处理后，放冷，过滤或离心，上清液浓缩回收，干燥粉碎，得到蜂胶浸膏粗品；

所述的75～95％乙醇优选95％乙醇；

所述的处理方法是包括超声处理方法、微波处理方法或以活性炭+活性白土加热脱色处理方法等中的一种或多种，优选以活性炭+活性白土加热脱色处理方法；

(2)精制蜂胶浸膏

以乙醇溶解蜂胶浸膏粗品，加盐酸水解，得黄酮类成分的苷元，浓缩至浸膏，浸膏以大于80％乙醇溶解，过滤或离心，上清液浓缩回收，干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏；

上述干燥方法均优选喷雾干燥，若性状不好可以添加辅料，效果更好；

为了获得更高黄酮类成分含量的提取物，在步骤(2)进行进一步改进如下：

将步骤(1)获得的蜂胶浸膏粗品以95％乙醇溶解，再以活性炭+活性白土脱色剂脱色，然后过滤、离心，上清液浓缩回收，于燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏；

为了获得更高黄酮类成分含量的提取物，在步骤(2)进行进一步改进的方法也可以如下：

将步骤(1)获得的蜂胶浸膏粗品以80％乙醇溶解，过树脂纯化，分段洗脱，浓缩回收，干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏；

所述的树脂是包括大孔树脂或Sephadex树脂中的一种或多种，优选大孔树脂；

所述的大孔树脂优选苯乙烯-二乙烯苯体系的吸附树脂，是包括D101大孔吸附树脂、XAD-1大孔吸附树脂或Diaion HP-10大孔吸附树脂中的一种或多种，进一步优选D101大孔吸附树脂。

(三)技术特长

本发明为各类疾病的预防保健提供了一种新的蜂胶提取物来源，从而对现有的蜂胶制备质量保证体系进行了完善和提高。

本发明有针对性地研究蜂胶制备方法，发现了一种新的蜂胶制备工艺，作出了意想不到的成绩：本发明得到的蜂胶提取物安全低毒，性质稳定，药理作用较强，使用安全，且使用范围特别广，实用性较强，各类疾病的预防保健效果显著。

本发明方法成本低，其制备工艺简单，有效成分得率高，能够获得高含量的黄酮类成分提取物，且重金属大大低于其他方法，特别是铅含量远低于国际标准，制备的制剂质量稳定，容易操作，更适于工业化生产；因此，该蜂胶提取物容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。

总之，本发明积极适应了现代医疗保健和科研领域的工作需要和人性化服务的需要，本发明为研究开发蜂胶产品提供了新的蜂胶提取物来源，对改进和提高现有的预防保健水平具有重要价值。

具体实施方式

本发明研究了现有的蜂胶制剂的来源，提供了一种新的蜂胶提取物及其制备方法，便于医疗保健行业的便捷和安全使用。

下面就实施的具体实验过程进行进一步阐述和说明。

蜂胶提取物的制备方法之一：

(1)制备蜂胶浸膏粗品

蜂胶原料以95％乙醇加热浸渍，以活性炭+活性白土加热脱色处理后，放冷，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到蜂胶浸膏粗品；

(2)精制蜂胶浸膏

以乙醇溶解蜂胶浸膏粗品，加盐酸水解，得黄酮类成分的苷元，浓缩至浸膏，浸膏以大于80％乙醇溶解，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏；

蜂胶提取物的制备方法之二：

(1)制备蜂胶浸膏粗品

蜂胶原料以75％乙醇加热浸渍，超声或微波处理后，放冷，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到蜂胶浸膏粗品；

(2)精制蜂胶浸膏

以乙醇溶解蜂胶浸膏粗品，加盐酸水解，得黄酮类成分的苷元，浓缩至浸膏，浸膏以大于80％乙醇溶解，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏；

蜂胶提取物的制备方法之三：

(1)制备蜂胶浸膏粗品

蜂胶原料以85％乙醇加热浸渍，以活性炭+活性白土加热脱色处理后，放冷，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到蜂胶浸膏粗品；

(2)精制蜂胶浸膏

以95％乙醇溶解蜂胶浸膏粗品，再以活性炭+活性白土脱色剂脱色，然后过滤、离心，清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏；

蜂胶提取物的制备方法之四：

(1)制备蜂胶浸膏粗品

蜂胶原料以95％乙醇加热浸渍，超声或微波处理后，放冷，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到蜂胶浸膏粗品；

(2)精制蜂胶浸膏

以80％乙醇溶解蜂胶浸膏粗品，过大孔树脂纯化，分段洗脱，浓缩回收，干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏；

本发明最终需要制备成蜂胶提取物进行应用，下面列举实施例进行进一步说明。

在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实施例均是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制发明的范围。下面通过实施例对本发明作详细描述。

实施例1、

(1)制备蜂胶浸膏粗品

蜂胶原料1000g以75％乙醇加热浸渍，超声处理后，放冷，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到蜂胶浸膏粗品445g；

(2)精制蜂胶浸膏

以95％乙醇溶解蜂胶浸膏粗品445g，加盐酸水解，得黄酮类成分的苷元，浓缩至浸膏，浸膏以大于80％乙醇溶解，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏293g，黄酮类成分含量9.2％，铅含量0.013mg/Kg。

实施例2、

(1)制备蜂胶浸膏粗品

蜂胶原料1000g以85％乙醇加热浸渍，微波处理后，放冷，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到蜂胶浸膏粗品456g；

(2)精制蜂胶浸膏

以95％乙醇溶解蜂胶浸膏粗品456g，加盐酸水解，得黄酮类成分的苷元，浓缩至浸膏，浸膏以大于80％乙醇溶解，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏310g，黄酮类成分含量9.8％，铅含量0.014mg/Kg。

实施例3、

(1)制备蜂胶浸膏粗品

蜂胶原料1000g以95％乙醇加热浸渍，以活性炭+活性白土加热脱色处理后，放冷，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到蜂胶浸膏粗品488g；

(2)精制蜂胶浸膏

以95％乙醇溶解蜂胶浸膏粗品488g，加盐酸水解，得黄酮类成分的苷元，浓缩至浸膏，浸膏以大于80％乙醇溶解，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏339g，黄酮类成分含量11.7％，铅含量0.011mg/Kg。

实施例4、

(1)制备蜂胶浸膏粗品

蜂胶原料1000g以95％乙醇加热浸渍，以活性炭+活性白土加热脱色处理后，放冷，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到蜂胶浸膏粗品485g；

(2)精制蜂胶浸膏

以95％乙醇溶解蜂胶浸膏粗品485g，再以活性炭+活性白土脱色剂脱色，然后过滤、离心，清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏396g，黄酮类成分含量14.8％，铅含量0.013mg/Kg。

实施例5、

(1)制备蜂胶浸膏粗品

蜂胶原料1000g以95％乙醇加热浸渍，以活性炭+活性白土加热脱色处理后，放冷，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到蜂胶浸膏粗品491g；

(2)精制蜂胶浸膏

以80％乙醇溶解蜂胶浸膏粗品491g，过XAD-1大孔吸附树脂纯化，分段洗脱，浓缩回收，干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏411g，黄酮类成分含量15.6％，铅含量0.008mg/Kg。

实施例6、

(1)制备蜂胶浸膏粗品

蜂胶原料1000g以95％乙醇加热浸渍，以活性炭+活性白土加热脱色处理后，放冷，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到蜂胶浸膏粗品488g；

(2)精制蜂胶浸膏

以80％乙醇溶解蜂胶浸膏粗品488g，过Diaion HP-10大孔吸附树脂纯化，分段洗脱，浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏413g，黄酮类成分含量15.9％，铅含量0.009mg/Kg。

实施例7、

(1)制备蜂胶浸膏粗品

蜂胶原料1000g以95％乙醇加热浸渍，以活性炭+活性白土加热脱色处理后，放冷，过滤或离心，上清液浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到蜂胶浸膏粗品493g；

(2)精制蜂胶浸膏

以80％乙醇溶解蜂胶浸膏粗品493g，过D101大孔吸附树脂纯化，分段洗脱，浓缩回收，喷雾干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏432g，黄酮类成分含量18.1％，铅含量0.006mg/Kg。

Claims (12)

1.一种含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

(1)制备蜂胶浸膏粗品

蜂胶原料以75～95％乙醇加热浸渍，处理后，放冷，过滤或离心，上清液浓缩回收，干燥粉碎，得到蜂胶浸膏粗品；

(2)精制蜂胶浸膏

以乙醇溶解蜂胶浸膏粗品，加盐酸水解，得黄酮类成分的苷元，浓缩至浸膏，浸膏以大于80％乙醇溶解，过滤或离心，上清液浓缩回收，干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏。

2.根据权利要求1所述的含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，其特征在于，所述的75～95％乙醇优选95％乙醇。

3.根据权利要求1或2所述的含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，其特征在于，所述的处理方法是包括超声处理方法、微波处理方法或以活性炭+活性白土加热脱色处理方法中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，其特征在于，所述的处理方法是以活性炭+活性白土加热脱色的处理方法。

5.根据权利要求1或2所述的含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，其特征在于，所述的干燥方法是喷雾干燥；若性状不好可以添加辅料，效果更好。

6.根据权利要求1所述的含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，其特征在于，所述的步骤(2)改进如下：

将步骤(1)获得的蜂胶浸膏粗品以95％乙醇溶解，再以活性炭+活性白土脱色剂脱色，然后过滤、离心，上清液浓缩回收，干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏。

7.根据权利要求1所述的含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，其特征在于，所述的步骤(2)改进如下：

将步骤(1)获得的蜂胶浸膏粗品以80％乙醇溶解，过树脂纯化，分段洗脱，浓缩回收，干燥粉碎，得到精制的蜂胶浸膏。

8.根据权利要求7所述的含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，其特征在于，所述的树脂是包括大孔树脂或Sephadex树脂中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，其特征在于，所述的树脂是大孔树脂。

10.根据权利要求9所述的含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，其特征在于，所述的大孔树脂是苯乙烯-二乙烯苯体系的吸附树脂。

11.根据权利要求10所述的含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，其特征在于，所述的苯乙烯-二乙烯苯体系的吸附树脂是包括D101大孔吸附树脂、XAD-1大孔吸附树脂或Diaion HP-10大孔吸附树脂中的一种或多种。

12.根据权利要求11所述的含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，其特征在于，所述的苯乙烯-二乙烯苯体系的吸附树脂是D101大孔吸附树脂。