CN102784170A - 蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的分离方法。在所述方法中，首先使用乙醇溶剂对蜂胶进行浸提。其次，进行固液分离然后旋转蒸发除去乙醇，获得作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的浸提膏。所述方法还通过柱层析和薄层层析法对浸提膏进一步分离得到活性组份。在所述方法中还可以包括对活性组份的化学结构鉴定，该步骤鉴定得到的物质为山奈酚和/或白杨素。本发明提供了从蜂胶中分离得到天然活性物质的方法以及该活性物质在抗粉尘螨过敏中的新用途。本发明不仅为蜂胶的深度开发利用提供了高效的方法体系，而且为粉尘螨过敏原引起的疾病提供了新的预防和治疗途径。

Description

蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的分离方法

技术领域

本发明涉及蜂胶的深度利用，更具体地说，本发明涉及蜂胶活性物质的提取方法以及蜂胶活性物质在抑制粉尘螨过敏原中的应用领域。

背景技术

蜂胶英文Propolis来源于古代希腊语，是由"pro"（在前方）和“lis”（城堡）组成，含义是蜂胶有缩小蜂巢入口的作用(Castaldo and Capasso 2002)。蜂胶一般是由工蜂采集植物的嫩芽、嫩枝，再混以树胶、花粉、蜂蜜等物质送至蜂巢，经由内勤蜂的舌腺、蜡腺等腺体加工转化而形成的不透明胶体状物质，多呈棕褐色、灰褐色、黄褐色、灰绿色、暗绿色，极少数呈深黑色(Rak1996)。由于蜂巢内部空间狭小、潮湿的特性使其有利于微生物的生存，内勤蜂便将蜂胶涂抹于蜂巢缝隙或其他需要的地方，以阻止外部细菌的进入、风干入侵者尸体，保证蜂巢内部环境的整洁，有利于蜂王浆、花粉等蜂产品的保存。

蜂胶作为一种汇集了动植物的多种产物和次级代谢产物而存在的天然物质，成分极为复杂（见下表1-1）。现阶段已经分离鉴定出的蜂胶成分达三百多种，其中黄酮类物质71种，氨基酸25种，芳香族酸、酯类59种，以及多种酯、醛、醇类化合物，还有多种维生素和铁、锌、镉等微量元素。化学成分的多样性赋予了蜂胶丰富的生物学活性，目前蜂胶已经被证实的生物学活性主要有抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎、护肝等生物学活性，还有资料显示蜂胶制剂对呼吸道疾病、皮肤疾病、心血管疾病等方面的疾病有显著疗效。

蜂胶资源稀少，一个五六万只得蜂群蜂胶的年产量仅为100多克，因此国外市场称蜂胶为“紫色黄金”。据调查1支浓度为25%、净含量为30g的蜂胶口服液在美国市场上的零售价为30美元左右，1支普通的蜂胶口服液（15ml,20g）的售价也在20美元以上，尤其是巴西蜂胶在世界上享誉盛名，其相关商品售价远远高于其他产地蜂胶产品，也已经分离出多种具有生物活性的化学成分。

表1-1蜂胶的主要成分列表

中国蜂胶研发起步较晚，早期主要以原材料的形式出口，加工利用率和附加值均较低。但是中国蜂胶相对于外国蜂胶而言具有储量大、分布范围广等资源优势。自2005年起蜂胶被列入《药典》后，蜂胶被广泛应用于在医疗卫生、食品贮藏加工、日用品加工和中医药等方方面面。加大中国蜂胶的活性成分研究，开发具有实际应用价值的蜂胶产品将会为中国蜂胶的产业化和标准化提供更好的理论依据。

随着现代分析技术的发展，关于蜂胶活性成分的提取、分离与鉴定成为研究的热点。从九十年代至今国内外对中国蜂胶样品的研究报道万余篇，现阶段也已经明确中国蜂胶化学组分和生物学活性具有丰富的多样性。

但是，如上所述，蜂胶的成分复杂，要从中提取出有活性的物质非常困难，本发明人长期致力于蜂胶的深度开发利用，并在长期研究的基础上建立了一套的从蜂胶中提取活性物质的方法体系。而且，在建立优化该方法体系的过程中，意外地发现所提取得到的物质能够有效地抑制粉尘螨过敏原的活性。

众所周知，粉尘螨是一类主要存在于室内尘土中的螨类，在世界范围内有60余种，仅中国就有34种。世界范围内统计结果证明居室内最优势的粉尘螨类是Dermatophagoides farinae品系。由于粉尘螨普遍存在于人类居住环境的灰尘中,可引起人体许多过敏反应如过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮肤疾患等。因此，粉尘螨越来越得到人们的重视。

粉尘螨过敏原的组成非常复杂，种类繁多。目前国际免疫联合会(1UIS)已经把粉尘螨过敏原进行了归纳和分类，共有14种之多。

粉尘螨属于吸入性过敏原中最重要的一种，当灰尘被扬起时粉尘螨的虫体、尸体、粪便、卵及脱落下的皮壳等过敏原，随之进入人的呼吸系统，进而引发呼吸系统的过敏性疾病。

从粉尘螨过敏原的免疫学参数比较可知，90%以上的粉尘螨过敏患者的IgE检测属于25kDa和14kDa两组过敏原，国际上将这两组最重要的过敏原组分分别命名为DerⅠ和DerⅡ过敏原。针对主要过敏原进行筛选确定和研究不仅有助于粉尘螨引发的过敏性疾病的临床诊断、提高免疫学治疗的安全性，而且有助于阐述粉尘螨的发病机理。粉尘螨引发的过敏性疾病引发的过敏性疾病包括：支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮肤疾病等疾病。

随着人们生活水平的提高、生活方式的变化和环境污染,过敏性疾病的发病率普遍上升。研究发现通过减少环境中的粉尘螨数量，能有效降低儿童和青少年患过敏性疾病的危险，提高免疫治疗的效果。由此为降低过敏反应的发生，就要对粉尘螨相关的指标进行严格干预，如粉尘螨的活体数量、粉尘螨过敏原数量等。

减少粉尘螨的数量可以通过物理方法和化学方法来实现：常见的物理方法比如降低房间的相对湿度、使用防尘布、更换地毯、家具和及时清洁床上用品等，但是这些方法较为繁琐也难于控制；早在1976年Wharton就总结了30种化学试剂对尘螨的室内活性测定，仅1%林丹（lindane）的杀螨活性较好。由于林丹毒性较高不容易降解，并没有被应用为室内杀螨剂商品化使用。当前市场上常用的杀螨剂仍主要集中于农用方向的开发，如拟除虫菊酯类（Pyrethroids）、1%虫螨磷（pirimiphos methyl）等多数为薰蒸毒剂，不能在室内长期使用；而且多数化学杀螨剂仅仅能够减少活体的数量，而不能有效的降低粉尘螨排泄物、残体等过敏原的数量，仍然会引起过敏性疾病的发生。所以化学方法控制粉尘螨数量在商品化应用中至今还存在很大的空白。

常规物理化学方法的局限性以及现代生物学技术的发展，为治疗粉尘螨引起的过敏反应提出了新的思路：有效的规避和减少粉尘螨过敏原在环境中的数量，才是针对致敏源头进行控制的有效措施。

目前急需能够有效抑制灰尘螨过敏原、低毒、绿色环保的抑螨/杀螨剂。本发明人为了解决这个问题。本发明不仅为蜂胶的深度开发提供了高效的方法体系，而且还提供了蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质。

发明内容

蜂胶虽然含有很多不同的活性物质，但是由于蜂胶的成分复杂，特别是由于其含有大量的树脂、蜂蜡和花粉，因此从蜂胶中提取或分离出活性物质一直是一个非常棘手的技术难题。另一方面，蜂胶由于产量低，原料价格高，因此非常希望鉴定出蜂胶中的活性物质以期能够利用任何合成的方式合成出同样的活性物质，从而减少对蜂胶原料的依赖。

根据本发明，提供了一种蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的分离方法，其中，所述方法包括如下步骤：1）使用乙醇溶剂对蜂胶进行浸提；和2）进行固液分离然后去除液相中的乙醇，获得作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的浸提膏。

其中，所述乙醇溶剂为乙醇水溶液，浓度为35体积%至95体积%。

其中，所述浓度为55体积至95体积%。

其中，所述浓度为75%。

其中，在浸提时液料比为1:3至1:20，所述液料比为蜂胶克数与乙醇溶剂毫升数的比例。

其中，所述液料比为1:5至1:15。

其中，所述液料比为1:5。

其中，浸提是在4℃至50℃进行。

其中，浸提是在25℃至45℃进行。

其中，所述方法进一步包括利用层析法对所述浸提膏分离的初次分离步骤，以得到作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的初次分离物。

其中，所述层析法使用薄层层析法进行。

其中，所述层析法使用的样品为所述浸提膏在三氯甲烷中的分散体。

其中，所述层析法使用的洗脱剂为三氯甲烷与甲醇的混合洗脱剂。

其中，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为99:1至5:5。

其中，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为99:1至95:5。

其中，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为99:1。

其中，所述方法进一步包括利用薄层层析法对所述初次分离物进行分离的二次分离步骤，以得到作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的二次分离物。

其中，所述薄层层析法为基于玻璃的薄层层析法。

其中，所述二次分离物包含作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的山奈酚和/或白杨素。

本发明还提供了由以上技术方案的方法分离得到的蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质。

本发明还提供了由上述技术方案所述的蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质在制备用于治疗由粉尘螨过敏原引起的疾病的药物中的用途。

本发明方法能够从蜂胶中有效地提取活性物质，并且提供了蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质，因此不仅能够为蜂胶的深度开发利用提供了高效的方法体系，而且粉尘螨过敏原引起的各种疾病提供了新的预防和治疗途径。

附图说明

图1是不同蜂胶样品处理后粉尘螨SDS凝胶电泳图。M为分子标记（Marker，Bio-Rad All Blue:Catalog#161-0373）；C为空白对照粉尘螨浸提液蛋白质条带；1～13为经YP-1～YP-13处理的粉尘螨浸提液蛋白质条带。

图2是YP-7初次分离产物薄层层析色谱图。展开剂为三氯甲烷：甲醇=9:1。

图3是YP-7初次分离产物处理后粉尘螨SDS凝胶电泳图。注：M为Marker（Bio-Rad All Blue:Catalog#161-0373）；C为空白对照粉尘螨浸提液蛋白质条带；C1～C8为经C1～C8处理的粉尘螨浸提液蛋白质条带。

图4是YP-7-C2第二次分离产物色谱图。对C21、C22、C23进行粉尘螨过敏原抑制活性分析。C21和C22组分的抑制活性均较好，可以进行深入的分析，确定其化学组成。

图5是YP-7-C2二次分离产物处理后粉尘螨SDS凝胶电泳图，M为分子标记（Marker，Bio-Rad All Blue:Catalog#161-0373）；C为空白对照粉尘螨浸提液蛋白质条带；C21～C23为经C21～C23处理的粉尘螨浸提液蛋白质条带。

图6是YP-7-C21高效液相色谱图。

图7是YP-7-C21多级质谱图。

图8是YP-7-C21核磁共振波谱图。

图9是YP-7-C22高效液相色谱图。

图10是YP-7-C21多级质谱图。

图11是YP-7-C22核磁共振波谱图。

具体实施方式

下面将对本发明的具体实施方式进行说明，但是这些实施方式仅为举例说明目的，不应解释为是对本发明的范围进行的限制。

如上所述，蜂胶的成分非常复杂，并且由于含有树脂、蜂蜡、花粉等物质，非常难以将其中的活性物质进行提取或分离。而且蜂蜡产量少，价格高，非常需要确认其中的活性物质，以期使用其他途径来源的活性物质来代替蜂蜡。本发明人长期致力于蜂蜡的深度开发利用，意外地发现蜂蜡浸提物的产率在特定的溶剂、溶剂浓度、液料比和/或温度条件下可以得到明显的提高，从而建立了一种高效的用于蜂蜡浸提的方法体系。

于是，在本发明的第一方面，提供了一种从蜂胶中分离抗粉尘螨过敏活性物质的方法，其中，所述方法包括如下步骤：1）使用乙醇溶剂对蜂胶进行浸提；和2）进行固液分离然后去除液相中的乙醇，以由液相获得作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的浸提膏。

在一些实施方式中，所述乙醇溶剂优选为乙醇水溶液，该水溶液的浓度优选为35体积%至95体积%，更优选为所述浓度为55体积至95体积%，最优选为75%。

在一些实施方式中，在浸提时蜂胶与乙醇溶剂的体积重量比（g/mL，简称液料比）为1:3至1:20，更优选为1:5至1:15，最优选为1:5。

在一些实施方式中，浸提是在4℃至50℃进行，更优选在在25℃至45℃进行，最优选为在45℃进行。

本发明方法对固液分离方式没有特别限制，例如可以过滤或离心的方式进行。本发明对去除固液分离后得到的液相中的乙醇的方式也没有特别限制，但是考虑到乙醇具有易挥发性，因此优选采用旋转蒸发的方式进行。

由以上方法得到的浸提膏可以直接用于制备抑制粉尘螨过敏原的药物，也可以用于活性物质的进一步分离纯化。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括利用层析法对所述浸提膏分离的初次分离步骤，以得到作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的初次分离物。优选的是，所述层析法使用柱层析法和/或薄层层析法进行。在一些优选的实施方式中，所述层析法优选为薄层层析法。用于进行层析法的样品优选为将以上方法得到的浸提膏分散在三氯甲烷中的分散体。本发明对于分散体中的浸提膏与三氯甲烷的比例没有特别限制，只要浸提膏能够充分分散在三氯甲烷中即可。

在一些优选的实施方式中，所述层析法使用的洗脱剂为三氯甲烷与甲醇的混合洗脱剂，更优选的是，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为99:1至5:5，进一步优选的是，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为99:1至95:5，最优选的是，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为99:1。

在一些优选的实施方式中，所述方法进一步包括利用柱层析法和/或薄层层析法对所述初次分离物进行分离的二次分离步骤，以得到作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的二次分离物。在一些实施方式中，优选使用薄层层析法。更优选的是，所述薄层层析法为基于玻璃的薄层层析法。

在一些优选的实施方式中，所述二次分离物包含作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的山奈酚和/或白杨素，更优选的是，所述二次分离物包含作为主要活性物质的山奈酚和/或白杨素。在一些实施方式中，所述二次分离物包含作为主要活性物质的山奈酚。在一些实施方式中，所述二次分离物包含作为主要活性物质的白杨素。

本发明的方法对于蜂胶的来源没有特别限制，但是优选所述蜂胶为中国蜂胶。

在本发明的第二方方面，提供了由以上方法浸提或分离得到的蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质。

在本发明的第三方面，提供了由以上方法浸提或分离得到的蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质在制备用于治疗由粉尘螨过敏原引起的疾病的药物中的用途。

实施例

为了进一步更容易理解本发明，本发明在下文将以实施例的形式对本发明进行更为详细地说明，但是这些实施例仅为说明目的，不应理解为式对本发明的范围进行限制。

实施例1蜂胶浸提方法体系的建立

1材料和方法

1.1材料

1.1.1材料的采集

实验人员从2009年在以湖北省康思农蜂产品有限公司为依托，通过与蜂农直接联系及自己采样的方式，获得了蜂胶样品。该蜂胶呈棕褐色、团块状，蜂种为意蜂采集地环境多有杨树和松树等。

将采集样品置于－20℃下冷藏数日，待其处于坚硬状态后，粉碎为小块状，存放于4℃冰箱中备用。

表2-1中国不同地域蜂胶样品特征

1.1.2主要仪器

1.1.3主要试剂

无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷，均为分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司；

1.2方法

1.2.1中国不同地域产蜂胶样品有效物质提取工艺优化

蜂胶有效物质的提取产量由有机溶剂类型、液料比、提取温度、提取时间等因素影响，不同环境条件下所需要的最佳条件有很大差异。以湖北采集1号样品为例对以上因素进行考察，寻找最适合的实验室提取工艺。

首先将经冷冻粉碎的1号蜂胶样品（10g），分别溶于200mL的95%甲醇、乙醇、乙酸乙酯和三氯甲烷中，静置3d,过滤后在25℃条件下旋转蒸发，每种溶剂进行三次重复，计算其蜂胶提取率，进而筛选出最佳有机溶剂。同理依次对有机溶剂的浓度梯度、液料比和最佳温度进行单因素实验。以最佳组合条件对所有样品进行提取，各个样品取得的有效物质EEP(蜂胶乙醇提取物)编码为YP-1～YP-13；

2结果与分析

2.1中国不同地域产蜂胶样品有效物质提取最佳工艺

2.1.1有机溶剂的选择

用极性大小不同的有机溶剂对蜂胶样品进行粗提取，结果如表2-2。当选用甲醇、乙醇作为提取溶剂时，无显著性差异提取率均为40%以上，原则上均可以选为常用提取试剂。

但是本研究以探索高效无毒的天然产物为目标，尽量避免有毒试剂的使用，故选择乙醇为浸提溶剂。

表2-2不同有机溶剂对蜂胶有效物质产量的影响

注：提取温度为25℃，样品量为10g(n=3),显著水平p﹤0.05。

2.1.2乙醇溶液浓度的选择

在选定提取液为乙醇后，对不同浓度的乙醇提取物进行有效物质得率的测定，选定最佳的浓度，结果如表2-3所示。

表2-3不同乙醇浓度对蜂胶有效物质产量的影响

注：提取温度为25℃，样品量为10g(n=3),显著水平p=0.05。

统计分析表明，乙醇浓度在35%～75%的范围内进行梯度变化时，其有效物质的含量随乙醇浸提液浓度的升高而逐渐增加，平均提取率也逐步上升。各个浓度下的提取率存在显著性差异；乙醇浓度在75%～95%时有效物质的平均提取率无显著性差异。综合比较实验的可操作性，并为了更好的进行产业化推广应用，选取75%的乙醇浓度作为蜂胶提取的最佳浓度，进行后续提取操作。

2.1.3液料比的选择

在对天然物质的有效物质进行提取的过程中，当样品量一定时，增加溶剂的量可以降低样品粒子周围的浓度极差，更有利于有效成分的溶出。因此实际生产过程中常常采用加大溶剂用量来获得较高的有效物质提取率。由表2-4统计分析表明，当蜂胶样品与75%乙醇溶液的液料比（蜂胶克数与乙醇毫升数的比例）在1:5～1:15范围内时，其有效物质的得率大于45%且均显著性差异。但是在天然物质的提取过程中，液料比过高虽然也可以将有效物质提取，但是会降低液料中蜂胶样品的浓度，大大延长了有效物质浓缩所需时间和能耗，不利于实际生产的使用。综合比较选取1:5的液料比作为75%的乙醇溶液提取过程中最佳液料比。

表2-4不同液料比对蜂胶有效物质产量的影响

注：提取温度为25℃，样品量为10g(n=3),乙醇浓度为75%，显著水平p=0.05；

2.1.4提取温度的选择

一般来说升温有利于有效物质在天然产物中的溶出，但是温度过高有可能会破坏天然组分的结构和活性等。在其他因素一定的情况下研究4℃、25℃、45℃、50℃下蜂胶有效物质提取率的变化，如表2-5所示。4℃～45℃时有效物质的提取率随着温度的升高而逐渐上升，但是在50℃时出现下降的趋势，这与一般来说升温有利于有效物质在天然产物中的溶出的常规看法完全不一样。经过综合比较，本发明人认为选取温度在45℃可以更有效地保证有效物质的溶出。

表2-5不同提取温度对蜂胶有效物质产量的影响

注：提取样品量为10g(n=3)，乙醇浓度为75%，液料比为1：10，显著水平p=0.01；

蜂胶是一种成份复杂的混合物，本实施例对影响有效物质提取率的因素进行了实验，确定了蜂胶提取条件的最优组合，从而为蜂胶活性物质提取建立了高效的浸提方法体系。

实施例2蜂胶提取物对粉尘螨过敏原的抑制活性

目前世界范围内，引起过敏性反应疾病的最重要过敏原之一就为粉尘螨（Dermatophagoides farinae）。粉尘螨作为最主要的吸入性过敏原可以引发各个年龄阶段的过敏性疾病，尤其是在儿童身上的发病率最高。因此如何有效的控制粉尘螨已经成为医学界、农药学界共同关注的研究热点。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1供试虫体

粉尘螨（Dermatophagoides farinae），1999年起从Department ofPhraseology and Institute of Tropical Medicine,College of Medicine,YonseiUniversity获得，在实验室条件下饲养多代，期间未施用任何杀螨剂。

1.1.2主要仪器

BIO-RAD No.422电泳槽，BIO-RAD No.041BR电泳仪，光照培养箱，高速离心机，小型匀浆器，水浴锅，摇床(染色/脱色)

1.1.3主要缓冲液及配方

1.2方法

1.2.1粉尘螨室内饲养方法

粉尘螨（Dermatophagoides farinae）饲养条件：温度28±1℃,湿度75%，于培养箱暗室内饲养。粉尘螨放入盛有饲料的塑料盒（12.5×10.5×5.0cm）内饲养。

饲料配方：煎料（Fried feed）与干酵母1:1混配后放入50℃的烘箱里1小时灭菌处理。Fried feed成分测定为粗蛋白（44.0%），粗脂肪（3.0%），粗纤维（4.0%），灰粉（17.0%），钙（1.0%），磷（1.8%），饲料添加周期为7天。

饲养环境严格无菌，饲料、用具平时贮存于烘箱中，所有器具只用清水清洗。每次饲养之前确保光照培养箱内温度、湿度等条件，及时处理死亡试虫。

1.2.2粉尘螨虫体蛋白提取方法

粉尘螨的浸出液可用于特异性诊断和治疗，目前国内外多通过对其粗提物进行分离、提取来获得主要过敏原，从而进行相关的免疫学研究。粉尘螨蛋白提取的方法有很多，如PBS和SDS去垢剂法等，研究证实均可以获得较为明显的过敏原组分。

本实验过程中为减少粉尘螨饲料等的影响，确保实验的可靠性和可重复性，利用避光法收集虫体；同时由于粉尘螨的表明存在坚硬的几丁质成分，因此采用先冷冻后研磨再低温匀浆的方法，提高其蛋白回收率。

具体步骤如下：

⑴首先使用PBS获得粉尘螨虫体浸提液（为防止蛋白变性，操作在冰盒中进行）；

⑵浸提液于4℃冰箱中存贮72h后取出，在14000rpm、4.0℃下离心30min；

⑶待离心机温度降至0℃时小心取出浸提液，收集上清，用蛋白酶抑制剂

（Sigma,St Louis,Mo）处理后，存放于-70℃冰箱中防止蛋白质降解。

1.2.3蜂胶对粉尘螨致敏蛋白的抑制活性测定方法

分别称取适量YP-1～YP-13与DMSO按照1:9（1mg:9μL）的比例充分混合。取5μL以上混合物后与3μL粉尘螨蛋白质提取物，室温静置1h后，加入4μL溴酚蓝指示剂在100℃沸水中加热10min,快速离心后将样品注入制备的SDS-gel。根据文献（Laemmli1970）描述方法配制12%分离胶和5%凝固胶，电压设定为130v分离80～90min。

1.3图像分析方法

SDS-PAGE凝胶用考马斯亮蓝试剂染色后，放入脱色液中脱色数次直至背景清晰，利用Quantity One Software软件观察分析并拍照。

用条带分析仪对各个处理的蛋白条带进行分析，记录不同处理后主要过敏原组分DerⅠ和DerⅡ的Intensity参数。相对抑制活性参数使用以下公式：

式中，T：处

理的强度（Intensity）值；C：空白处理的强度值；

抑制活性分级标准为RAI﹥80,80-61,60-41和≦40，分别表示极高、高、中等、低、无过敏抑制作用。

2结果与分析

将YP-1～YP-13处理后的蛋白粗提液按照1.2.3方法进行SDS-PAGE,结果如图1所示。由结果可以明显看出经过处理的粉尘螨蛋白表达量显著下降，中国蜂胶对粉尘螨蛋白表达具有普遍的抑制作用。

在SDS-PSGE结果的基础上记录各个处理的Intensity参数，计算RAI参数，参考活性分级标准，统计结果如表3-1所示。

从表中可以看出，样品中对其中一组过敏原具有活性的占46%左右，对两组均用抑制活性的占54%左右。其中YP-6和YP-7具有中等以上活性，但是YP-6在处理中出现了新的蛋白条带，YP-7则对两组过敏原都具有极高的抑制活性。

表3-1不同蜂胶样品对粉尘螨过敏原的相对抑制活性

注：▲极高活性；●高活性；中等活性；◎低活性；×无活性；※出现新的蛋白条带；

3讨论

现阶段从粉尘螨引起的吸入性过敏性疾病的发展趋势来看，纯天然的抗过敏药物会避免西药无法根治、有不良反应的缺陷，已经发展成为研究热点。中国蜂胶资源丰富、活性物质成分多样性等优势完全符合过敏性疾病预防治疗的发展要求。

本部分实验以主要的吸入性过敏原之一粉尘螨为研究对象，将蜂胶和粉尘螨过敏原从微观的角度紧密的联系在一起。目前，已知90%以上的粉尘螨过敏性疾病都是由DerⅠ和DerⅡ两组过敏原引起的，蜂胶的浸提物质抑制这两组过敏原的表达，可以有效的降低过敏性疾病的发生，在体外就达到较好的预防效果。

由于不同产地蜂胶的活性成分不同，其抑制活性高低也不同。因此对活性较高的YP-7进行分离、纯化和鉴定，深层次挖掘活性单体物质，提高我国蜂胶资源的有效利用率。

实施例3蜂胶抗粉尘螨过敏原活性物质的分离纯化

蜂胶生物活性的多样性已经被越来越多的人接受，但是由于其产地、胶源植物的多样性导致其生物活性的高低也不同，发挥生物活性的物质成分更是不尽相同。目前在对蜂胶的各种生物活性进行研究时，必需和其活性成分的研究有机结合起来，才能更好的应用到生产实践中。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1供试样品

13种毛蜂胶样品采取第二章中优化工艺获得的蜂胶膏后，编号YP-1～YP-13置于4℃冰箱内以备使用。根据第三章各样品对致敏蛋白表达的抑制作用比较，选用YP-7分离鉴定活性成分。

1.1.2供试虫体

同第三章1.1.1粉尘螨（Dermatophagoides farinae）品系。

1.1.3仪器与药品

1.2方法

1.2.1蜂胶对粉尘螨致敏蛋白的抑制活性测定方法

与实施例2中的相同，活性分级标准与实施例2中的相同。

1.2.2活性成分的初次分离方法

YP-7初次分离采取硅胶柱层析法，湿法上样法装柱。经过多次TLC预实验后发现采用三氯甲烷：甲醇（C：M）溶剂体系时，样品的最大R_f值为0.26，且比较稳定，因此确定选取C:M为溶剂体系进行洗脱，具体步骤如下：

⑴将580-600g硅胶置于三氯甲烷中2h以上（过夜放置更好），使硅胶处于饱和状态更易于样品的分离。

⑵正确装置色谱柱：将色谱柱置于架子上，确保柱子的顶端与底部必须保证竖直；使用之前确保色谱柱的干净，可使用三氯甲烷清洗（如果柱子过脏可预先用10%H2SO4清洗直至清洗液颜色不改变为止）。清洗过程中注意色谱柱底部海砂部位的气泡，边洗柱子边拍动使气泡流出。色谱柱清洗过后注入选择的溶剂体系三氯甲烷，至柱子顶端约30cm位置时停止。

⑶灌胶：用大规格移液管快速转移已处于饱和态的硅胶，转移时沿色谱柱壁旋转加入，注意避免气泡的产生。确保硅胶柱内无气泡、液面恒定不变时结束灌胶。用1L三氯甲烷流入色谱柱，维持体系的稳定。每隔15min观察柱子上端和下端，避免上端溶剂流空和下端锥形瓶中液体溢出。

⑷上样：取8gYP-7充分溶解在三氯甲烷中，用小规格移液管快速均匀上样。用适量三氯甲烷清洗色谱柱壁，打开开关使溶剂缓慢流出，刚刚没过样品时停止。加入1.5～2.0cm的海砂，开始进行梯度洗脱（如表4-1）。最后使用适量的甲醇清洗，直至色谱柱在紫外灯检测下无明显颜色。整个洗脱过程按照250mL/瓶进行收集。

表4-1硅胶柱层析梯度洗脱体系

将色谱柱初次分离成分进行TLC（薄层层析法）实验，用30%H₂SO₄喷洒层析板，加热后观察层析板上分离现象，根据实验结果将有相似R_f值的溶剂聚合并旋转蒸发,完成有效成分的初次分离，得到初次分离物。

1.2.3活性成分的二次分离方法

将硅胶柱层析初次粗分离得到的各个初次分离物进行抑制活性检测，对比RAI后选定活性较高的组分进行二次精细分离，在样品量较少的情况下可以选用TLC、GLASS-TLC和GC-MS等相互结合的方法。

1.2.4活性物质的结构鉴定

对于二次分离后得到的活性组分利用HPLC-PAD、GC-MS、NMR和标准品等方法进行检测。

GC-MS检测条件：色谱柱规格为VF-5ms（0.25mm×30m×0.25μm)；载气为He₂（99.99%）；进样口温度170℃，柱内表面温度280℃；样品浓度为10mg/ml，进样量1μL，流速1mL/min，分流比50∶1；MS采用EI离子源（70ev），50-500amu全程扫描，扫描间隙为0.5s。

NMR检测条件：¹H-NMR 400MHz,¹³C-NMR,400MHz进行鉴定，CD₃OD为溶剂，TMS为内设基准化合物，使用Standard Bruker software软件对物质结构进行比对分析。

2结果与分析

2.1YP-7初次分离产物及活性鉴定结果

利用硅胶柱层析法对YP-7进行初次分离，采用薄层层析法对各个洗脱样进行初步鉴定（图2）。将具有相似图谱的洗脱样进行收集合并，浓缩后得种八种组分，依次编号为C1～C8（表4-2）。

表4-2YP-7初次分离组分含量

对C1～C8进行粉尘螨过敏原抑制活性分析如图3，参照RAI分级标准如表4-3所示。C1、C7和C8成分对过敏原均无抑制活性，而C5组分处理后的粉尘浸提液出现空白带；可见活性物质并非分布在极性最高或者最低的组分。

C2、C3、C4组分对Der II过敏原均有中等抑制活性，再结合其TLC结果分析，三者可能含有共同物质。C3对Der I也具有中等抑制活性，但是由于C3、C4组分的得率较低，在实际分离过程中很难精确收集，影响再次分离纯化的效果。占YP-7的54%的C2组分具有较好的抑制活性，应含有较高的有效活性物质含量。因此选择C2进行二次分离纯化，以期寻找到有效的活性单体物质。

表4-3YP-7初次分离产物对粉尘螨过敏原的相对抑制活性

注：▲极高活性；●高活性；中等活性；◎低活性；×无活性；

※出现新的蛋白条带；○无明显蛋白条带；

2.2YP-7-C2组分二次分离产物及活性鉴定

根据2.1中所得结论，对YP-7-C2进行精细分离。首先对样品进行了HPLC、MPLC、HSCCC等预实验，结果发现由于蜂胶样品的特殊性，在以上几种方法下样品的分离均未达到最佳效果。最终确定用上样量少、回收率高的GLASS-TLC法对该成分进行分离纯化，以达到最佳的效果。

取适量YP-7-C2溶解在甲醇溶液中作为上样样品，由图4左GLASS-TLC结果可以看出，C2组分在C:M为95:5的条件下，迁移率各不相同，明显分离为三个组分。依次命名为C21、C22、C23，各组分含量依次为23.8%、33.3%、和42.9%。

对C21、C22、C23进行TLC初步检测，结果如图4右所示。在紫外检测下C21、C22的迁移率较为明显，推测为纯度较高的物质，拟定进行结构鉴定。由于三种组分均使用同一种展开剂，推测C23可能含有多种物质而未能充分分离。

表4-4YP-7-C2二次分离产物对粉尘螨过敏原的相对抑制活性（同时参见图5）。

注：▲极高活性；●高活性；

中等活性；◎低活性；×无活性；

2.3YP-7活性物质结构确定

2.3.1YP-7-C21活性成分结构确定

对YP-7-C21进行精细分离。首先将样品配制成一定浓度的甲醇溶液，进行GC-MS扫描获得化合物的分子量，和已知标准品进行初步比对。选择具有相同分子量的标准品进行HPLC色谱比对，然后进行多级质谱扫描，同时对¹H、¹³C的NMR图谱进行分析，综合以上信息确定活性成分的化学组成结构。

在对YP-7-C21进行MS扫描后，负离子模式下MS为287.1m/z[M-H]得知此化合物分子量为286。与已知标准品山奈酚（Kaempferol）的分子量一致。将标准品与YP-7-C21在相同处理下进行HPLC对比，发现两者的出峰时间在误差允许范围内（图6）。结合MSⁿ（图7）和NMR（图8）结果综合确定化合物为C₁₅H₁₀O₆，判断质谱的碰撞诱导裂解过程如下：

确定该活性成分为蜂胶主要成分之一山奈酚。

2.3.2YP-7-C22活性成分结构确定

对YP-7-C22进行精细分离。首先将样品配制成一定浓度的甲醇溶液，进行GC-MS扫描获得化合物的分子量，和已知标准品进行初步比对。选择具有相同分子量的标准品进行HPLC色谱比对，然后进行多级质谱扫描，同时对1H、13C的NMR图谱。

在对YP-7-C22进行MS扫描后，负离子模式下MS为255.1m/z[M-H]得知此化合物分子量为254。与已知标准品白杨素（Chrysin）的分子量一致。将标准品与YP-7-C22在相同处理下进行HPLC对比（图9），样品在白杨素出峰时间内也出现峰值，结合MSⁿ（图10）和NMR（图11）结果判定该成分和白杨素高度匹配，确定化合物为C₁₅H₁₀O₄但是该样品在其余时间内也出现杂峰，没有达到一定的纯度，因此可以判定该活性成分中含有白杨素。

针对粉尘螨引起的过敏性疾病的研究，目前有两个重要的方向：一是总阻断过敏原的角度出发，研发杀螨剂；二是在医学上研究新型的治疗方法；但是两种途径均存在一定的制约性，杀螨剂研发涉及到使用安全问题，而医学诊断时常常是患者已经有了过敏性症状，有一定的滞后性。本研究从引起过敏性疾病的过敏原入手，从源头降低了引发过敏性疾病的概率，同时选择天然产物蜂胶，一并解决了以上难题。据报道，蜂胶中咖啡酸苯基酯（CAPE，caffeic acid phenetyl ester)类物质具有抗过敏作用，但是目前具体是哪种化合物在对免疫反应进行调节仍不清楚。本发明人首次确认了蜂胶蜂胶中的活性物质白杨素和山奈酚。

上文已经对本发明的优选实施方式进行了详细地说明，但是这些优选实施方式仅出于说明目的，不应当理解为本发明仅限于这些优选的实施方式，本领域技术人员可以根据本申请所公开的内容对本发明进行各种改动，由这些改动得到的技术方案并没有脱离本发明的实质，应当认为处在本发明要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的分离方法，其中，所述方法包括如下步骤：

1）使用乙醇溶剂对蜂胶进行浸提；和

2）进行固液分离然后去除液相中的乙醇，获得作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的浸提膏。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述乙醇溶剂为乙醇水溶液，浓度为35体积%至95体积%。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述浓度为55体积至95体积%。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述浓度为75%。

5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其中，在浸提时液料比为1:3至1:20，所述液料比为蜂胶克数与乙醇溶剂毫升数的比例。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述液料比为1:5至1:15。

7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括利用层析法对所述浸提膏分离的初次分离步骤，以得到作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的初次分离物。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述层析法使用柱层析法和/或薄层层析法进行。

9.由权利要求1至8任一项所述的方法分离得到的蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质。

10.权利要求9所述的蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质在制备用于治疗由粉尘螨过敏原引起的疾病的药物中的用途。

Images