KR102106131B1 - 연산호 큰수지맨드라미 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연산호(soft coral) 큰수지맨드라미(Dendronephthya gigantea) 에탄올 추출물을 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 제주에서 서식하는 연산호 큰수지맨드라미의 에탄올 추출물로부터 분리된 스테롤성 화합물을 포함하는 염증성 질환(inflammatory diseases) 등으로부터 유발되는 피부 질환을 개선시킬 수 있는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다. 염증 질환들이 전 세계적으로 주요 관심사가 된 현재에, 생물 활성 천연 약물의 확인은 염증 질환에 대한 해결책을 제공하고, 이와 같은 질환을 개선시키는데 잠재적인 기능성 제품 개발에 대한 연구의 시각을 넓힐 수 있다. 이러한 점에서 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료/개선의 효과가 있는 것으로 밝혀진 연산호 에탄올 추출물은 기능성 화장품 산업상 이용 가치가 매우 높다고 할 것이다.

Description

연산호 큰수지맨드라미 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물{FUNCTIONAL COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE ETHANOL EXTRACTS OF SOFT CORAL DENDRONEPHTHYA GIGANTEA AS AN EFFECTIVE COMPONENT}

본 발명은 연산호(soft coral) 큰수지맨드라미(Dendronephthya gigantea) 에탄올 추출물을 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 제주에서 서식하는 연산호 큰수지맨드라미의 에탄올 추출물로부터 분리된 스테롤성 화합물을 포함하는 염증성 질환(inflammatory diseases) 등으로부터 유발되는 피부 질환을 개선시킬 수 있는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

산호충(산호충류) 은 전세계적으로 6,100종 이상이 존재하며, 열대 바다에 가장 많이 서식하는 저생성 무척추 동물이다(Zhang 외., 2005). 그들은 독특한 생물학적 이차 대사 산물들을 가진 해양 생물체들 중 하나이다. 옥시리핀 유도체 및 지방산을 포함한 새로운 구조적 특성을 지닌 다양한 테르페노이드 대사 산물들이 연산호에서 발견되었다(Ma 외., 2008; Schmitz 외., 1979). 대부분 이러한 스테로이드들은 세포 독성을 가지며, 잠재적인 종양 억제 물질로 확인되었다(Kaul 및 Sindermann, 1978). 연산호는 수지맨드라미속에 속하며, 인도양, 홍해, 태평양 및 동남아시아 전역에 걸쳐 약 248종이 분포되어 있다(Ma 외., 2008). 연산호들은 산호충으로부터 자신들을 방어하기 위하여, 항육식제, 타감 작용 물질, 항균제 및 방오제로서 작용하는 독성 이차 대사 산물을 합성하고 저장하는 능력을 가지고 있다(Changyun 외., 2008). 많은 연구들을 통해, LPS 에 의해 자극된 RAW 264.7 대식 세포들에서 염증 전구 매개체, iNOS 및 COX-2의 발현을 감소시키는 항염증성 스테롤이 연산호들에서 발견되었다(Chang 외., 2008; Hu 외. 2011; Huang 외., 2008). 해양 스테롤에 대한 포괄적인 논문이 1993년에 발표되었다. 논문에 따르면 해양 생물에서 200가지가 넘는 다양한 종류의 모노히드록시스테롤이 발견되었다(D'Auria 외., 1993). 스테로이드, 특히 글루코코르티코스테로이드는 인터루킨(IL)-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, 종양 괴사 인자(TNF)-α 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 등 전염증성 사이토카인의 전사(RNA를 만드는 과정)를 억제하기 때문에, 사이토카인 매개 염증을 조절하는데 매우 효과적인 역할을 한다(Guyre 외., 1988). 또한, 류코트리엔, 프로스타글란딘 및 혈소판 활성인자(PAF)와 같은 염증 매개체들에 대한 스테로이드의 억제 효과는 항염증 효과에도 영향을 줄 수 있다(Barnes 외., 1993).

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제주 해에서 채집한 큰수지맨드라미에서 생성되는 생물 활성 천연물질들에 대해서 지금까지 광범위하게 연구되지 않았다. 본 발명의 목적은 두 가지이다. 하나는 RAW 대식 세포들에서 LPS 에 의해 자극된 염증 반응에 대해 잠재적인 항염증 효과를 나타내는 화합물이 큰수지맨드라미의 에탄올 추출물에서 부분적으로 정제된 분획물에 존재하는지를 확인하고, 존재한다면 그 물질이 무엇인지를 확인하는 것이다. 다른 하나는 제브라피쉬 모델에서 LPS로 유도된 염증 반응에 대한 화합물의 치료 효과를 평가하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 연산호 큰수지맨드라미(Dendronephthya gigantea) 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

상기 연산호 큰수지맨드라미 에탄올 추출물은 상기 연산호 큰수지맨드라미 에탄올 추출물을 헥센으로 분획하여 헥센 분획물을 수득하고, 상기 헥센 분획물을 80% 헥센 및 20% 에틸아세테이트의 혼합 용매로 1차 용출시켜 1차 컬럼 분리물을 수득한 후, 상기 1차 컬럼 분리물을 95% 헥센 및 5% 에틸아세테이트의 혼합 용매로 2차 용출시켜 수득되는 2차 컬럼 분리물인 것이 바람직하다.

상기 2차 컬럼 분리물은 다음의 화학식 1 내지 화학식 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3β-히드록시-Δ⁵-스테로이드 동질체(3β-hydroxy-Δ⁵-steroidal congeners)를 포함하는 것이 바람직하다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

상기 기능성은 항염증, 피부 미백, 주름 개선 및 보습으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 기능성 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 팩트, 립글로즈, 립스틱, 섀도우, 샴푸 및 린스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형인 것이 바람직하다.

염증 질환들이 전 세계적으로 주요 관심사가 된 현재에, 생물 활성 천연 약물의 확인은 염증 질환에 대한 해결책을 제공하고, 이와 같은 질환을 개선시키는데 잠재적인 기능성 제품 개발에 대한 연구의 시각을 넓힐 수 있다. 이러한 점에서 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료/개선의 효과가 있는 것으로 밝혀진 연산호 에탄올 추출물은 기능성 화장품 산업상 이용 가치가 매우 높다고 할 것이다.

도 1은 본 발명의 DGEH21의 정제 공정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 DGEH21의 Gas chromatography-tandom mass spectrometry(GC-MS/MS) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 RAW 264.7 대식세포에서 본 발명의 DGEH21의 항염증 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 DGEH21의 염증 조절 인자의 발현에 대한 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 제브라피쉬에서 본 발명의 DGEH21의 LPS 유도된 NO 생성, ROS 생성, 세포 사멸의 저해 활성을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자는 제주에서 서식하는 연산호 큰수지맨드라미(Dendronephthya gigantea)로부터 에탄올 추출물을 조제하고, 이로부터 여러 유기 용매 분획물을 회수하였고, 이들의 RAW 264.7 대식세포 및 제브라피쉬에 대한 항염증 활성을 검정하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 연산호 큰수지맨드라미(Dendronephthya gigantea) 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

상기 연산호 큰수지맨드라미 에탄올 추출물은 상기 연산호 큰수지 맨드라미 에탄올 추출물을 헥센으로 분획하여 헥센 분획물을 수득하고, 상기 헥센 분획물을 80% 헥센 및 20% 에틸아세테이트의 혼합 용매로 1차 용출시켜 1차 컬럼 분리물을 수득한 후, 상기 1차 컬럼 분리물을 95% 헥센 및 5% 에틸아세테이트의 혼합 용매로 2차 용출시켜 수득되는 2차 컬럼 분리물인 것이 바람직하다.

상기 2차 컬럼 분리물은 다음의 화학식 1 내지 화학식 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3β-히드록시-Δ⁵-스테로이드 동질체(3β-hydroxy-Δ⁵-steroidal congeners)를 포함하는 것이 바람직하다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

상기 기능성은 피부 염증에 의한 질환, 예를 들어, 여드름, 피부염, 아토피 등의 개선에 도움을 줄 수 있고, 아울러, 피부 미백, 주름 개선 및 보습에도 효과가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 유효성분은 조성물 총 중량에 대해 0.01 내지 50중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 20중량%, 더욱 바람직하게는 1 내지 10중량%이다. 이러한 함량 범위에서 적절한 제형 안정성을 확보할 수 있으며, 목적하는 항산화 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 본 발명의 유효성분 외에도 본 발명의 유효 활성을 저해하지 않는 범위에서 항산화, 피부 노화 방지 및 피부 재생 촉진의 효과를 위한 공지의 천연물 추출물이나 기타 성분을 추가로 포함시켜 이용할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분들, 예를 들면, 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제와 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제나 담체를 포함하여 특정 제형으로 성형될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 팩, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 팩트, 립글로즈, 립스틱, 섀도우, 샴푸 및 린스 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 연산호 큰수지맨드라미(Dendronephthya gigantea) 에탄올 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, "염증성 질환"이란 외부의 물리, 화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예를 들어, iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예를 들어, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 비염, 위염, 장염, 신장염, 간염, 폐렴, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 염증, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 습진, 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 연산호 큰수지맨드라미(Dendronephthya gigantea) 에탄올 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 건강 기능 식품은 상술된 염증성 질환과 관련된 각종 질환의 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.

상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다.

상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 상기 활성 분획물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 연산호 큰수지맨드라미(Dendronephthya gigantea) 에탄올 추출물을 포함하는 세포 내 염증성 매개 인자의 활성을 억제시키기 위한 연구용 시약으로 적용될 수도 있다.

또한, 본 발명의 연산호 큰수지맨드라미(Dendronephthya gigantea) 에탄올 추출물은 생체 외(ex vivo) 조건 하에서 세포에 본 발명의 유효성분을 처리하는 것을 특징으로 하는 세포의 염증성 물질 생성 억제 방법을 제공한다.

상기 생체 외 조건은 세포가 생체로부터 물리적으로 완전히 분리되어 존재하는 상태를 의미하며, 시험관 내(in vitro) 조건인 것이 바람직하다.

상기 세포는 환자로부터 분리된 프라이머리 세포(primary cell)이거나, 이를 계대 배양한 세포이거나, 세포주일 수도 있다. 바람직하게는 대식세포(macrophage)이다.

상기 처리는, 예를 들어, 세포 배양 접시 내의 세포를 포함하는 배지에 본 발명의 유효성분을 첨가함으로써 수행될 수 있고, 처리 농도는 1 내지 50μg/ml인 것이 바람직하다.

본 발명의 유효성분을 세포로 처리하는 경우 염증성 매개 물질인 NO 생성, ROS 생성, iNOS, COX-2, PEG2, TNF-α, IL1-β, IL-6의 생성을 효과적으로 억제시킬 수 있다.

상기 설명된 바와 같이, 생체 외의 환경에서 본 발명의 유효성분을 세포에 처리하는 방법은 본 발명의 유효성분을 이용한 염증 치료제 개발을 위한 연구 과정에서 효율적인 방법론으로 이용될 수 있다.

이하에서는, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예를 기재한 것이며, 하기 실시예에 기재된 사항에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되어 해석되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 재료 및 방법

1.1. 세포 및 시약

한국 세포주 은행(KCLB, 서울, 한국) 에서 RAW 264.7 대식세포를 구입하였다. 한국에 있는 생선 거래 상인으로부터 실험용 제브라피쉬 성체를 구입하였다. 깁코(뉴욕, 미국)에서 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM), 소태아 혈청(FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신 혼합물을 구입하였다. 시그마 알드리치(미국)에서, 2',7'-2'7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCFH2-DA), 4-아미노-5-메틸아미노-2',7'-디플루오루플루오레신 디아세테이트(DAF-FM DA), 아크리딘 오렌지, 및 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT)를 구입하였다. 싼타 크루즈 생물 공학(미국)에서 iNOS, COX-2 및 β-액틴 항체들을 구입하였다. 이바이오 사이언스 주식회사(미국), BD 바이오 사이언스(미국) 및 알 엔 디 시스템 주식회사에서 마우스 EL-1β, 마우스 IL-6, TNF-α 및 PGE2 를 포함한 상업용 ELISA 키트를 구입하였다. 추출 및 분획할 때 사용되는 모든 유기 용매는 분석 등급이었다.

1.2. 샘플 채취/추출

예비 연구 결과를 바탕으로, 2016년 4월에 한국의 제주도 제주시 연안의 수심 10~15미터인 지역에서 연산호 샘플인 큰수지맨드라미를 채취하였다(Sanjeewa 외., 2016; Wang 외., 2016). 제주 생물 다양성 연구소의 도움을 받아서 샘플을 확인 하였으며, 샘플 저장소는 제주 대학교 해양 생물 자원 연구소에 두었다. 샘플을 두 번 세척 한 다음, 조각으로 절단하였고, 동결 건조하고 분쇄하여, 분말로 만들었다. 건조 분말 482g을 70% 에탄올을 사용하여 3회 추출하였다. 회전 증발기를 사용하여 진공 하에서 용매를 증발시킨 후에 조 추출물을 얻었다.

1.3. 분획 및 추가 정제

조 추출물을 증류수에서 균질화시키고, 각각 헥센, 클로로포름 및 에틸아세테이트를 용매로 사용하여 분획하였다. 사용한 용매를 진공 하에서 제거하였다. 실리카 개방 컬럼을 사용하여 항염증 활성을 나타내는 헥센 분획을 선택하여 추가로 정제하였다. 이때, 헥센(H) 및 에틸아세테이트(EA)를 다음과 같은 농도의 순서로 용출하였다(100% H, 80% H+20% EA, 50% H+50% EA, 100% EA (첫 번째 컬럼 분리)). 각각의 용출액의 용매를 진공 하에서 제거하였다. 첫 번째 컬럼에서 80% H+20% EA 분획을 선택하였고, 이 분획을 두 번째 실리카 개방 컬럼에서 헥센(H) 및 에틸아세테이트(EA)를 다음과 같은 농도의 순서로 (95% H+5% EA, 85% H+15% EA, 80% H+20% EA) 추가 정제하였다. 이때 포함된 용매는 다시 진공 하에서 제거하였다. 각 정제 단계들은 TLC를 사용하여 모니터링 하였다. TLC 는 UV 하에서 관찰하였고, 10% H₂SO₄를 사용하여 에탄올 염색을 실시하였다. 추출 및 정제 과정은 관련 약어와 함께 도 1에 요약되어 있다. Xiong 외. (2007)에 의해 기술된 리베르만-부르하르트 비색 분석법을 조금 수정한 방법을 이용하여 컬럼 분획들 중의 스테롤 함량을 측정 하였다. 아세톤 무수물과 빙초산을 11:10(v/v)의 비율로 혼합하고, 그 혼합물과 차가운 고농도 황산을 1:1.5의 부피 비율로 혼합하여 리베르만-부르하르트 시약을 제조하였다.

1.4. GC-MS/MS 분석

GC-MS/MS 분석을 통해 최상의 항염증 특성을 나타내는 선택된 컬럼 용출물(DGEH21)을 분석하였다. 분석 시에는 Rtx-5MS 융합-실리카 모세관 컬럼(30.0m x 0.25mm i.d. 0.25μm)이 장착된 시마즈 GCMS-TQ8040 시스템(일본)을 사용하였다. 철 소스 온도 200℃, 스캔 범위 50-500m/z, GC 오븐 프로그램; 260℃, 3분, 6℃/분~320℃, 5℃/분~330℃, 2분. 헬륨은 0.73mL/분의 일정 유속을 가진 캐리어 가스(운반 기체)로 사용 하였다. 샘플은 스플릿리스 모드로 주입하였다.

1.5. 세포 배양 및 NO 생산 측정

RAW 264.7 쥐 대식 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 항생제(100μg/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신)가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포의 배양은 5% CO₂의 대기 상태를 제공해 주는 배양기에서 이루어졌고, 배양 온도는 37℃를 유지하였다. 이 세포들은 주기적으로 계대 배양하였다. 빠르게 성장하는 세포들은 실험을 위하여 24웰 배양 플레이트에 1 x 10⁴세포/mL의 농도로 시딩하였다. 세포 시딩을 하고 24시간 동안 배양한 이후에 세포들을 서로 다른 농도의 샘플들로 처리하였다. 샘플 처리 이후 1시간이 지나고, 각 웰에 LPS 를 최종 농도 1μg/mL 가 되도록 넣어주었다. LPS가 유도하는 NO 생성을 평가하기 위하여, 그리스(Griess) 분석을 실시하였고, 세포 생존능을 평가하기 위하여, MTT 분석을 실시하였다(Wijesinghe 외., 2014).

1.6. 웨스턴 블랏 분석 (단백질 발현 분석)

세포들에 샘플을 처리하고 24시간 동안 세포를 배양한 후에, RAW 대식세포들을 채취하고, 용해 완충액을 사용하여 그 세포들을 용해시켰다. 용해되지 않은 세포 조각들은 12,000g에서 이루어진 원심 분리를 통해 제거하였다. 이때 추출된 단백질의 30μg을 표준화된 샘플과 함께 단백질 겔에 로딩하고, 전기영동을 실시하였다. 단백질 밴드들을 니트로 셀룰로오스 멤브레인 상에 흡착시켰고, 단백질이 흡착된 멤브레인 상의 비특이적 결합 부위를 탈지유를 사용하여 차단하였다. 멤브레인을 각각 1^ry(4℃에서 8시간) 및 2^ry(실온에서 2시간) 항체로 반응시켰다. 트윈 20을 포함한 트리스 완충 식염수로 세척하여, 멤브레인에 비특이적으로 결합한 과도한 항체들을 제거하였다. 화학 발광 기질(씨나겐 스릴, 보로그나, 이탈리아)을 첨가하여 해당 단백질의 시그널을 검출하였다(Wang 외., 2016). 푸존 솔로 바버 로마트 시스템(파리, 프랑스)을 사용하여 형광 이미지를 촬영하였다. 단백질 밴드들의 강도는 이미지 J 프로그램을 사용하여 정량화하였다.

1.7. PGE2 및 전염증성 사이토카인 생성 평가

샘플 처리 24시간 후에 RAW 세포들로부터 배양 배지를 따로 채취하였다. 그 다음 PGE2 양과 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, 및 IL-6) 생성을 측정하였다. 실험은 제조사의 지침에 따라 이루어졌으며, 시판중인 효소 면역 측정법 키트를 사용하였다(Wijesinghe 외., 2014).

1.8. 생체 내 제브라피쉬 실험

실험용 성체 제브라피쉬는 한국에 있는 생선 거래 상인으로부터 구입하였다. 아침에 조명을 켜서 산란을 유도함으로써 제브라피쉬 배아를 얻었다. 선택된 건강한 배아들은 12개의 웰 배양 플레이트로 옮겨졌고, 이때 각 웰에는 배아들을 위한 배양 배지 1.0mL가 있었다. 배아 발달 단계를 지속적으로 모니터링 하였고, 수정 후 8시간이 지난 이후에 여러 농도의 DGEH21(25.00, 12.50 및 6.25μg/mL)를 배양 배지에 넣어 주었다. 제브라피쉬들을 여러 농도의 DGEH21에 1시간 동안 배양한 후에, 대조군을 제외한 모든 웰들을 10μg/mL LPS 로 자극하였다. 24시간 마다 배아 배지를 새로운 배지로 교체하였다. 수정 후 처리 3일째에, 부화한 유충들을 24개의 웰 배양 플레이트으로 옮겼고, 세포 사멸(아크리딘 오렌지), ROS 생산(2,7- 디클로로플루오레신 디아세테이트 (DCFH2-DA)), NO 양(디아미노 플루오로포레 4-아미노-5-메틸 아미노-2'7' 디플루오루플루오레신 디아세테이트 (DAF-FM DA))을 확인하기 위하여, 특정 형광 염료로 각 유충들을 염색하였다. 형광 염료를 함유한 배지에서 특정 기간 동안 배양한 후, 유충들을 두 번 씻어 내고, 마취시켰으며, 모티캠 컬러 디지털 카메라(모틱스, 샤먼, 중국)가 장착된 형광 현미경을 사용하여 유충들의 형광 염료를 관찰하였다. 각 유충의 형광 강도는 이미지 J 프로그램을 사용하여 정량하였다(Kim 외., 2014). 웨스턴 블랏 분석을 위한 단백질(iNOS 및 COX-2 발현)은 Kim 등 (2015)이 기술한 방법에 따라 아래와 같이 제브라피쉬 배아로부터 추출하였다: 20개의 배아들을 12개의 웰 플레이트로 옮기고, 샘플과 함께 처리한 다음 LPS 처리를 하였다. 수정 후 처리 3일째에, 유충들을 액체 질소를 사용하여 즉시 동결시키고, 용해 완충액에서 단백질을 추출하였다.

1.9. 통계 분석

모든 데이터들은 최소 세 번의 독립적인 실험을 통해서 얻어진 수치들이고, 평균 ± 표준 편차로 표시된다. 데이터들을 비교하기 위한 통계 분석은 IBM SPSS Statistics 20 소프트웨어를 사용하여 이루어졌다. Duncan의 다중 범위 테스트에 의한 일월변량분석(one way ANOVA) 방법이 통계 분석에 적용되었다. 0.05 미만의 P 값(P < 0.05)을 유의한 것으로 간주 하였다.

2. 결과 및 토의

2.1. 추출, 분류 및 정제 공정

도 1은 정제의 각 단계에서 얻어지는 각각의 수율을 나타내고 있으며, 추출 및 정제 공정을 그래프로 보여준다. 용매 분획물들 중에서, 수용액 분획이 가장 높은 수율을 보였다. LPS로 자극된 RAW 대식세포들에서 여러 분획물들 중에서 항염증 활성은 NO 생성의 억제에 의해 측정되었다. 이 결과에 따르면, 큰수지맨드라미(DGE)의 에탄올 추출물로부터 얻어진 헥센 용매 분획물(DGEH)이 수치가 제일 높았다. 그렇기 때문에, DGEH에 대해서 추가 정제를 실시하였다. 첫 번째 오픈 컬럼 정제를 통하여 4개의 용출물을 얻었고, 이 중에서 80% 헥센/20% 에틸아세테이트 용출물(DGEH2)이 목표로 했던 활성을 보였다. DGEH2에 대한 두 번째 오픈 컬럼 정제를 통하여 3개의 용출물을 얻었다. 이 중에서 95% 헥센/5% 에틸아세테이트 혼합물에 의해 용출된 DGEH21 컬럼 분획이 목표로 했던 활성을 보였다. 두 번째 오픈 컬럼 정제 전의 DGEH2와 두 번째 오픈 컬럼 정제 이후의 DGEH21, DGEH22, 및 DGEH23 에 대해서 박층 크로마토 그래피(TLC)를 시행하였다. TLC 결과는 샘플들에 대한 분리 효율을 입증하였다. 플레이트를 가열하고 에탄올에 10% H₂SO₄가 혼합된 용액으로 염색한 후, TLC 플레이트에서 관찰된 어두운 적색/흑색 점이 DGEH21 컬럼 분획에 스테로이드가 존재함을 나타냈다. 또한, DGEH2의 컬럼 분획에 대한 리베르만-부르하르트 비색 분석은 DGEH21, DGEH22 및 DGEH23에서 각각 93.85 ± 3.52%, 48.50 ± 2.82%, 및 66.58 ± 2.60%의 스테롤 함량을 나타냈다. 이러한 결과들은 선택된 분획(DGEH21)이 주로 스테로이드 유도체로 구성되어 있음을 나타낸다.

2.2. DGEH21의 화학적 성분들의 특성 규명

생리 활성을 위한 이차 대사 산물들의 다양한 종류들 중에서 연산호들의 세스퀴-, 트리- 및 디테르펜 대사 산물들은 유명하다. 많은 트리테르펜은 분리할 수 없는 복잡한 혼합물 상태로 존재하며, GC-MS 을 통해서 확인할 수 있다. 최근에는 더 정확한 GC- 탠덤 MS 방법들을 통해서 확인할 수 있다(Sarma 외., 2009). 본 실시예에서 관찰된 항염증 활성을 나타내는 DGEH21의 화학 성분은 GC-MS/MS 분석을 통해 확인되었다(도 2A). 본 발명의 발명자는 DGEH21이 26,27-디노레르고스타-5,22-디엔-3-올(도 2B-1), 코레스타-5,22-디엔-3-올(도 2B-2 및 3), 코레스트-5-엔-3올(도 2B-4), 에르고스타-5,22-디엔-3-올(도 2B-5), 스티그마스타-5,24(28)-디엔-3-올(도 2B-6), 스티그마스타-5,22-디엔-3-올(도 2B-7), 스티그마스타-5-엔-3-올 (도 2B-8), 및 22,23-메틸렌 콜레스테롤(도 2B-9)을 포함하여 8개의 3β-히드록시-Δ⁵-스테로이드성 동질체의 혼합물로 구성된다는 것을 확인하였다(순서대로 화학식 1 내지 화학식 8). 도 2A에서, 2 및 3으로 표시된 피크들은 동일한 화합물을 나타낸다.

2.3. LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포들에서 NO 생성에 대한 항염증 활성

LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포들에서 NO 생성 억제에 대한 함수로서 추출물/분획물의 항염증 활성도를 평가하였다. 가장 강력한 항염증 활성을 지닌 분획물(생물학적 정량으로 확인)을 선택한 이후에, 해당 분획물에 대한 분리 및 정제를 다음과 같이 시행하였다. 31.58μg/mL의 IC₅₀ 값과 100% RAW 세포 생존능(결과는 표시되지 않음)을 가진 가장 우수한 항염증 활성을 나타내는 DGEH를 추가적인 오픈 컬럼 정제를 위해 선택하였다. 이때 얻어진 4개의 컬럼 분획물들 중에서, 80% 헥센/20% 에틸아세테이트 분획물(DGEH2)은 25.25μg/mL의 IC₅₀ 값 및 90% 이상의 RAW 세포 생존능(결과는 표시되지 않음)을 가진 가장 우수한 항염증 활성을 나타냈다. 2차 컬럼 정제를 통해 얻어진 95% 헥센/5% 에틸아세테이트 분획물(DGEH21)은 RAW 세포들에서 LPS로 유도된 NO 생산에 대해 가장 우수한 항염증 활성을 나타냈다(도 3). NO 생산 억제에 대해 계산된 IC₅₀ 값은 4.33 ± 0.50μg/mL이었고, RAW 세포 생존능은 95% 이상이었다. 이것은 DGEH21의 화합물들이 LPS로 유도된 세포 독성으로부터 세포를 보호하면서, RAW 264.7 대식세포들에서 LPS로 유도된 NO 생성에 대한 항염증 활성을 가지고 있음을 나타낸다. 그러나, 샘플 농도가 증가함에 따라 세포 생존능이 감소한다는 것은 스테롤이 높은 농도에서 세포 독성을 나타낼 수 있음을 보여준다.

2.4. 염증 매개체의 조절

웨스턴 블랏 분석에 따르면, LPS로 유도된 iNOS 및 COX-2의 발현을 DGEH21는 효과적으로 억제하였다. 이때의 발현 억제는 DGEH21의 양과 비례하여 발생하는 농도의존적인 방식이었다(도 4A). 또한, DGEH21은 농도의존적으로 PGE2와 TNF-α, IL1-β 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 발현도 감소시켰다(도 4B-E). iNOS 발현을 감소시키는 것은 LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포들에서 NO 생성을 감소시키는 DGEH21의 능력을 설명한다. 또한, 이러한 결과들은 DGEH21에 의해 유도된 COX-2 양의 감소가 PGE2 및 그 후속 단계의 신호 전달 분자들의 생성을 억제하여 해로운 염증 반응을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.

2.5. LPS로 자극된 제브라피쉬 배아에서 NO 생산, ROS 생성 및 세포 사멸을 억제하는 수단으로서 DGEH21의 항염증 효과

제브라피쉬 모델은 인간의 질병 상태를 모방하는 전통적인 마우스 모델에 비해 더 큰 인기를 얻고 있다(Kim et al., 2016). 도 5A에 나타낸 바와 같이, LPS로 처리한 제브라피쉬 배아에서 형광 강도의 급격한 증가는 ROS로 인한 세포 손상의 증가와 함께 NO 및 ROS의 생성이 증가된다는 것을 나타낸다. 그러나, DGEH21는 농도의존적인 방식으로 NO 및 ROS 양을 효과적으로 감소시키고, 세포 사멸을 억제하였다. 또한, 웨스턴 블랏 분석 결과(도 5B)는 DGEH21의 투여가 제브라피쉬 배아에서 LPS로 유도된 iNOS 및 COX-2의 발현을 농도의존적으로 억제할 수 있다는 것을 나타냈다. 이러한 결과들은 LPS로 유도된 제브라피쉬 모델에서 DGEH21이 염증 반응을 유의하게 감소시킨다는 것을 나타낸다.

3. 토의

연산호에 의해 생성되는 생물 활성 이차 대사 산물들의 주요 그룹은 세스퀴-, 트리- 및 디테르펜이다. 해양 생물들에서 일반적인 콜레스탄 핵 3β-히드록시-Δ⁵-(또는 Δ⁰-) 부분 및 C₈-C₁₀ 측쇄(Scheuer, 2013)를 가진 200가지 이상의 다양한 스테로이드들이 액체 크로마토그래피 정제 이후의 GC-MS 방법을 통해서 발견되었다. 이러한 많은 화합물들은 암, 염증 및 질병 상태의 병인에 대한 생리 활성제로서 잠재적인 병리학적, 생리학적 또는 약리학적 중요성을 갖는 것으로 밝혀졌다(Sarma 외., 2009). 본 실시예의 결과들을 통해서, 본 발명의 발명자는 스테롤의 확인을 위해서 GC-MS/MS 분석이 필요하다는 것을 확인하였다. 본 실시예의 샘플들에는 연산호 큰수지맨드라미의 70% 에탄올 추출물에서 헥센 분획물을 얻었다. 그 이후에 추가 분획 및 정제를 시행하였고, 이때 얻어진 비극성 컬럼 용출물로부터 8개의 스테롤이 있다는 것이 생물학적 검정을 통해서 확인되었다: 26,27-디노레르고스타-5,22-디엔-3-올[화학식 1], 코레스타-5,22-디엔-3-올[화학식 2], 코레스트-5-엔-3올[화학식 3], 에르고스타-5,22-디엔-3-올[화학식 4], 스티그마스타-5,24(28)-디엔-3-올[화학식 5], 스티그마스타-5,22-디엔-3-올[화학식 6], 스티그마스타-5-엔-3-올[화학식 7], 및 22,23-메틸렌 콜레스테롤[화학식 8]. 이 모든 화합물들은 공통 전구체와 연관된 Δ⁵-sterol 골격을 가지고 있다. Smith 및 Goad(1974)는 해양 생물에서 26,27-디노레르고스타-5,22-디엔-3-올을 확인하였다. 이전 연구는 심해 가리비 플라코펙텐 마겔라니쿠스에서 코레스타-5,22-디엔-3-올을 확인하였다(Idler 및 Wiseman, 1971). Barnathan 외. (1992)는 시나키레이라 속에 속하는 해양 해면류에서 여러 코레스타-5,22-디엔-3-올 유도체를 확인하였다. 에르고스타-5,22-디엔-3-올은 달톤의 림프종 복수 세포들에 대해서 중간 정도의 항암 효과를 나타내며, 연산호 서베르고르기아 레티쿠레이트에 존재한다고 보고되었다(Byju 외., 2014). 푸코스테롤로 알려진 스티그마스타-5,24(28)-디엔-3-올이 곰팡이류(Goad 외., 1984), 해면류 (Ribeiro 외., 2012; Sheikh 및 Djerassi, 1974), 및 갈조류 (Cattel 외., 1979)를 포함한 수 많은 생물체들에서 발견되었다. Ribeiro 외. (2012)는 해면류인 테티아 루브라 및 테티아 마자에서 8가지 스테롤을 확인하였다. 그것들 중 다음 6개의 화합물은 본 실시예에서도 확인되었다: 콜레스테롤, 코레스타-5,22-디엔-올, 에르고스타-5,22-디엔-3-올, 스티그마스타-5,22-디엔-3-올, 스티그마스타-5-엔-3-올, 및 스티그마스타-5,24(28)-디엔-3-올.

연산호에서 발견되는 항염증성 스테로이드를 일부 연구에서 확인하였다(Fenical, 1987; Hu 외., 2011; Radhika 외., 2005). 그러나, 큰수지맨드라미에 있는 스테로이드의 항염증 특성에 관한 정보가 많지 않다. 현재의 관찰 결과에 따르면, 큰수지맨드라미에서 추출한 스테로이드가 풍부한 분획물이 강력한 항염증 활성을 가진다. 이 분획물은 대조군의 세포 생존능과 비슷한 세포 생존능을 보여 주고, 4.33 ± 0.50μg/mL의 IC₅₀ 값을 나타냈다. DGEH21의 스테롤 함량(93.85 ± 3.52%)을 보면, 이러한 스테롤의 작용으로 인해 항염증 작용이 있다고 결론 내릴 수 있다. iNOS, COX-2 및 PGE2 와 같은 여러 주요 중재자 역할을 하는 물질들을 포함한 많은 신호 전달 경로에 염증 반응이 조절된다. 이 화합물들은 NO 및 프로스타글란딘의 생산을 조절하여, 수 많은 세포 반응들을 조절한다(Fernando 외., 2016; Kim 외., 2010). TNF-α, IL-1β 및 IL-6 와 같은 전염증성 사이토카인들은 염증 반응을 향상시키고, 조직 파괴, 염증성 장 질환 및 류마티스성 관절염과 같은 유해한 효과를 유발한다. 따라서, 염증을 치료하기 위해서, 전염증성 사이토카인의 생산을 줄이는 것이 가장 필요하다. RAW 264.7 대식세포들에서 NO 생산을 억제하는 것은 iNOS 발현을 감소시키는 것과 관련이 있다. DGEH21은 PGE2 및 염증성 사이토카인의 발현을 효과적으로 억제하였다. 종합적으로, 시험관 내 실험은 DGEH21이 광범위한 항염증 특성을 가지고 있음을 나타낸다. DGEH21 농도 증가에 따라 RAW 264.7 세포 생존능이 점차적으로 감소하였다. 이러한 현상은 더 높은 농도일 때 스테로이드 대사 산물이 세포 독성을 가질 수 있다는 것을 나타낸다. 스테롤의 항암 특성을 확인하였던 이전 연구들에서도 이러한 사실들을 보고 하였다(Yoshikawa 외., 2000).

생체 내 조건에서 샘플들의 항염증 효과를 평가하면 생물체 내에서의 활성을 더 잘 이해할 수 있으며, 유해하고 만성적인 영향들에 대한 신뢰할 수 있는 데이터를 제공할 수 있다. 현재 연구 결과들은 NO 생산 및 ROS 생산의 감소를 통해 LPS가 유도한 제브라피쉬 모델에서 염증 반응들을 억제하고, LPS가 유도한 세포 독성 효과로부터 보호하는 DGEH21의 능력을 설명한다. 제브라피쉬에서 LPS로 유도된 iNOS의 억제는 NO 생산 감소에 대한 원인을 더 잘 설명한다. 더욱이, LPS가 유도한 COX-2의 발현을 DGEH21가 억제하는 것은 DGEH21이 항염증 효과를 억제하는 프로스타글란딘 생성을 추가적으로 감소시킬 수 있음을 나타낸다.

4. 결 론

제주 해에서 채취한 연산호 큰수지맨드라미는 항염증 활성을 가진 3β-히드록시-Δ⁵-스테로이달 유도체를 함유하고 있다. 현재 연구에 따르면, 시험관 내 RAW 세포 및 생체 내 제브라피쉬 모델 시스템에서 스테롤이 풍부한 DGEH21 분획물은 항염증 효과를 나타냈다. LPS에 의해 자극된 RAW 세포들에서, DGEH21은 iNOS 및 COX-2 염증 매개체들의 감소를 통해 NO 및 PGE2 생산을 억제하였다. 또한, DGEH21은 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 를 포함하는 전염증성 사이토카인들의 발현을 감소시켰다. DGEH21의 항염증 효과는 LPS로 자극된 생체 내 제브라피쉬 모델에서 다음과 같이 확인되었다: iNOS 및 COX-2 발현의 감소, NO 및 ROS 발현의 억제, 및 LPS 가 유도한 세포 독성에 대한 세포 보호 효과의 증가. 이러한 결과들을 통하여 우리는 특정한 생물 활성 기능을 평가하고, 치료제를 개발하기 위하여서는 생물 활성 물질들에 대한 추가적인 정제 및 분리가 필요하다는 것을 확인하였다.

Claims (5)

1. 연산호 큰수지맨드라미(Dendronephthya gigantea) 에탄올 추출물을 헥센으로 분획하여 헥센 분획물을 수득하고, 상기 헥센 분획물을 80%(v/v) 헥센 및 20%(v/v) 에틸아세테이트의 혼합 용매로 1차 용출시켜 1차 컬럼 분리물을 수득한 후, 상기 1차 컬럼 분리물을 95%(v/v) 헥센 및 5%(v/v) 에틸아세테이트의 혼합 용매로 2차 용출시켜 수득되는 2차 컬럼 분리물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 2차 컬럼 분리물은 다음의 화학식 1 내지 화학식 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3β-히드록시-Δ⁵-스테로이드 동질체(3β-hydroxy-Δ⁵-steroidal congeners)를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 화장료 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   
   [화학식 2]
   

   

   
   [화학식 3]
   

   

   
   [화학식 4]
   

   

   
   [화학식 5]
   

   

   
   [화학식 6]
   

   

   
   [화학식 7]
   

   

   
   [화학식 8]
   

   
4. 제 1항에 있어서, 상기 기능성은 항염증, 피부 미백, 주름 개선 및 보습으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기능성 화장료 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 기능성 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 팩트, 립글로즈, 립스틱, 섀도우, 샴푸 및 린스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 기능성 화장료 조성물.

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