KR101991894B1 - 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환을 개선시키기 위한 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환을 개선시키기 위한 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101991894B1
KR101991894B1 KR1020170152391A KR20170152391A KR101991894B1 KR 101991894 B1 KR101991894 B1 KR 101991894B1 KR 1020170152391 A KR1020170152391 A KR 1020170152391A KR 20170152391 A KR20170152391 A KR 20170152391A KR 101991894 B1 KR101991894 B1 KR 101991894B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
extract
solvent
composition
dermatitis
firewood
Prior art date
Application number
KR1020170152391A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180054501A (ko
Inventor
권학철
함정엽
이재욱
박진수
이주영
박영태
차진욱
권재영
김성훈
박웅비
황호성
박재규
김선여
강민철
Original Assignee
한국과학기술연구원
가천대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원, 가천대학교 산학협력단 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to PCT/KR2017/012958 priority Critical patent/WO2018093150A2/ko
Priority to EP17871096.8A priority patent/EP3542810B1/en
Publication of KR20180054501A publication Critical patent/KR20180054501A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101991894B1 publication Critical patent/KR101991894B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
    • A61K36/282—Artemisia, e.g. wormwood or sagebrush
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/318—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on skin health and hair or coat

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

본 발명은 개똥쑥 식물체(Artemisia annua)를 저극성 용매로 추출하고 남은 잔사를 친수성 용매로 추출하는 것을 포함하는 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법 및 그에 따라 분리된 세스퀴테르펜 락톤 저함량의 개똥쑥 추출물, 분획물 또는 이들로부터 단리된 화합물을 포함하는 피부질환 예방, 또는 치료용 조성물을 제공한다.

Description

개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환을 개선시키기 위한 조성물 및 그 제조방법{Composition for ameliorating skin disorder comprising Artemisia annua extracts and method for preparation thereof}
개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
개똥쑥(Artemisia annua)은 주로 중국에서 자생하나 국내 여러 지역에서 재배하는 국화과의 한해살이 풀이다. 개똥쑥은 전통적으로 발열, 감기, 학질, 소아경기, 소화불량, 이질 등의 치료에 사용해 왔고 항말라리아제인 아르테미시닌의 원료 식물로서 알려져 있다. 개똥쑥을 피부노화 또는 아토피와 같은 피부질환에 활용하기 위한 기술은 개똥쑥의 정유성분, 아르테미시닌과 그 유도체, 또는 세스퀴테르펜 락톤을 주성분으로 포함하는 비교적 저극성 분획물 또는 추출물을 피부에 적용하는 연구 또는 기술개발이 이루어져 왔다. 그러나, 저극성 분획물 또는 추출물을 제거하고 얻어지는 추출물 또는 이로부터 제조되는 분획물을 피부가려움증 및 피부염 개선 용도로 개발한 예는 전무하다.
피부가 항원에 직접 접촉하여 알러지 반응 또는 피부자극이 발생하고, 이들이 지속적인 스트레스 인자로 작용하여 피부방벽의 항상성이 무너져 가려움과 염증이 유발된다. 특히 아토피 피부염은 그 원인이 명확하지 않아 확실한 치료방법이 없고 단지 스테로이드성 항염증 약물을 사용하여 증상을 임시적으로 가라앉히거나 보습 크림 등의 보습제를 피부에 도포하여 가려움증을 완화하는 방법이 일반적으로 사용되고 있다. 최근에는 영유아와 어린이의 약 10 % 정도가 아토피 피부염으로 고통받고 있으며 계속적으로 환자가 증가하고 있는 추세이다. 또한 인구 고령화에 따라 노인성 피부 건조증이 증가하면서 다양한 형태의 피부염이 증가하고 있다. 스테로이드 제제는 부작용과 그에 대한 내성을 유발하므로, 아토피성 피부염을 포함한 피부염을 치료할 수 있는 비스테로이드성 천연약물의 개발이 시급히 요구되고 있다.
또한 종래의 연구는 개똥쑥의 아르테미시닌 또는 세스퀴테르펜 락톤 성분을 포함하는 추출물이나 정유성분에 대하여 수행되었으며 본 발명의 아르테미시닌을 포함한 세스퀴테르펜 락톤 성분과 정유성분의 대부분을 제거한 추출물의 피부염 개선 효과는 알려진 바 없다.
이에 본 발명자들은 종래에 보고된 바 없는 세스퀴테르펜 락톤과 정유성분 및 식물 스테롤 대부분을 제거한 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 다양한 피부질환 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법을 제공한다.
일 양상은 개똥쑥 식물체(Artemisia annua)를 저극성 용매에 접촉시켜 상기 저극성 용매 중에 개똥쑥 식물체 성분을 추출시키는 단계; 상기 접촉 후 얻어진 혼합물로부터 상기 저극성 용매를 분리하여 제거하고 잔여물을 얻는 단계; 및 상기 잔여물을 친수성 용매에 접촉시켜 상기 개똥쑥 식물체 성분을 상기 친수성 용매 중에 추출시키는 단계를 포함하는 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법에 따라 제조된 개똥쑥 식물체 추출물을 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 화합물 이상을 포함하는 것인 피부질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법에 따라 제조된 개똥쑥 식물체 추출물, 또는 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 화합물 이상을 포함하는, 약학, 의약외품, 식품 또는 화장료 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상은 개똥쑥 식물체(Artemisia annua)를 저극성 용매에 접촉시켜 상기 저극성 용매 중에 개똥쑥 식물체 성분을 추출시키는 단계; 상기 접촉 후 얻어진 혼합물로부터 상기 저극성 용매를 분리하여 제거하고 잔여물을 얻는 단계; 및 상기 잔여물을 친수성 용매에 접촉시켜 상기 개똥쑥 식물체 성분을 상기 친수성 용매 중에 추출시키는 단계를 포함하는 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법을 제공한다.
상기 식물체는 전체 또는 부분일 수 있다. 상기 부분은 지상부, 또는 지하부일 수 있다. 상기 지상부는 잎, 꽃, 과실, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 지하부는 지하의 줄기, 뿌리 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 식물체는 건조된 것일 수 있다. 상기 개똥쑥은 상업적으로 구입하거나, 자연에서 채취 또는 재배하여 사용할 수 있다.
상기 추출물은 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 따라서, 상기 추출물은 조추출물, 분획물, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 조추출물은 개똥쑥을 추출 용매와 접촉시켜 얻어지는 것으로서 특정 성분을 포함하는 것으로 분리하지 않은 것을 말한다. 상기 분획물은 상기 조추출물에 대하여 특정 성분을 포함하는 물질을 분리한 것을 말한다. 상기 추출물, 또는 그의 분획물은 본 발명의 조성물 중에 개똥쑥 식물체의 추출물, 그의 분획물, 또는 소분획물이 각각 또는 그 혼합물로서 포함된 것일 수 있고, 단리된 화합물만을 포함하거나, 상기 화합물을 주성분으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 소분획물은 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 것일 수 있다.
일 구체예에서 상기 분리는 여과, 침지, 원심 분리, 크로마토그래피 또는 이들의 조합에 의한 것일 수 있다. 상기 크로마토그래피는 다양한 조건 즉, 크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것으로서 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, HPLC, 고속유체크로마토그래피, 컬럼 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 또는 그 조합일 수 있다. 상기 저극성 용매를 분리하여 제거하는 단계는 상기 개똥쑥 식물체를 상기 저극성 용매에 접촉시킨 후 상기 개똥쑥 식물체 및 저극성 용매의 혼합물로부터 성분 물질이 추출되고 남은 개똥쑥 식물체 즉, 잔여물을 저극성 용매로부터 분리하고, 분리된 저극성 용매를 제거하는 것을 의미한다.
상기 추출은 상기 식물체를 용매 중에 일정 시간 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있고, 또는 가열하는 것을 포함할 수 있다. 상기 인큐베이션은 실온 내지 환류 온도에서 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있다. 인큐베이션 온도는 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 실온 내지 환류 온도, 30 ℃ 내지 환류 온도, 40 ℃ 내지 환류 온도일 수 있다. 상기 가열은 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 80 ℃, 또는 환류 온도까지 가열하는 것을 포함할 수 있다. 상기 가열은 50 ℃ 내지 환류 온도, 60 ℃ 내지 환류 온도, 70 ℃ 내지 환류 온도, 80 ℃ 내지 환류 온도, 또는 환류 온도까지 가열하는 것일 수 있다. 상기 추출 시간은 선택된 온도에 따라 달라질 수 있는데 1 시간 내지 2 개월, 예를 들면, 1 시간 내지 1 개월, 1 시간 내지 15 일, 1 시간 내지 10 일, 1 시간 내지 5 일, 1 시간 내지 3 일, 1 시간 내지 2 일, 1 시간 내지 1일, 5 시간 내지 1개월, 5 시간 내지 15일, 5 시간 내지 10일, 5 시간 내지 5일, 5 시간 내지 3일, 5 시간 내지 2일, 5 시간 내지 1일, 10 시간 내지 1개월, 10 시간 내지 15일, 10 시간 내지 10일, 10 시간 내지 5일, 10 시간 내지 3일, 또는 10 시간 내지 2일일 수 있다. 상기 추출은 상기 식물체를 용매 중에서 환류 추출하는 것일 수 있다. 상기 용매는 상기 식물체 중량에 대하여 1 배, 2 배, 5 배, 10 배 또는 15배 이상의 부피를 갖는 것일 수 있다. 상기 용매는 상기 식물체 중량에 대하여 1배 내지 15배, 2배 내지 15배, 5배 내지 15배, 10배 내지 15배 또는 약 15배의 부피를 갖는 것일 수 있다. 상기 식물체는 음지에 건조한 것일 수 있다.
상기 추출 방법으로는 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 냉침법, 마이크로웨이브 추출, 환류냉각 추출, 가압추출, 아임계추출, 초임계추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 침지 추출 방법일 수 있다. 침지 추출은 온침 또는 상온에서 침지하는 것일 수 있고, 1회 내지 5회 추출하는 것일 수 있다. 상기 개똥쑥 식물체는 0.1 내지 10배 또는 1 내지 6배의 추출 용매에 접촉되는 것일 수 있다. 냉침 추출온도는 20 ℃ 내지 40 ℃ 인 것일 수 있다. 온침 또는 가열 추출온도는 40 ℃ 내지 100 ℃일 수 있다. 냉침 추출시간은 24 내지 120시간인 것일 수 있으며, 온침 또는 가열 추출온도는 0.5시간 내지 48시간인 것일 수 있다.
상기 추출은 또한 얻어진 추출액으로부터 감압 농축과 같은 알려진 방법에 의하여 용매를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출물을 동결건조와 같은 건조에 의하여 건조 추출물을 제조하는 것을 포함할 수 있다. 상기 감압농축은 진공 감압농축기 또는 진공 회전증발기를 이용하는 것일 수 있다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있다.
본 발명의 개똥쑥 식물체의 추출물을 포함하는 조성물은 세스퀴테르펜 락톤(sesquiterpene lactone)을 저함량 포함하거나 거의 포함하지 않는다. 따라서 상기 저극성 용매는 상기 세스퀴테르펜 락톤을 용해 또는 추출시킬 수 있어, 상기 개똥쑥 식물체 성분을 추출시키는 단계 후 얻어진 혼합물로부터 상기 저극성 용매를 분리함으로서 상기 개똥쑥 식물체 추출물로부터 상기 세스퀴테르펜 락톤이 제거될 수 있다. 상기 세스퀴테르펜 락톤은 탄소 수 15 및 락톤 고리를 포함하는 구조를 의미하나, 유도체 또는 세스퀴테르펜 락톤의 하위 분류에 따라 탄소 수는 다양할 수 있다. 상기 세스퀴테르펜 락톤은 저마크라놀리드(Germacranolides), 헬리안골리드(Heliangolides), 구아이아놀리드(Guaianolides), 슈도구아이아놀리드(Pseudoguaianolides), 히포크레테놀리드(Hypocretenolides), 또는 유데스마놀리드(Eudesmanolides)을 포함한다.
상기 저극성 용매는 비극성 용매를 포함하는 의미로서 친수성에 반대되는 의미일 수 있으며, 유전상수 15 미만인 경우 저극성 또는 비극성으로 구분할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 세스퀴테르펜 락톤은 저극성 용매 또는 비극성 용매에 비교적 용해되어 용출되는바, 상기 저극성 용매는 직쇄 또는 분지된 알칸, 알켄, 알킨, 시클로알칸, 시클로알켄, 에테르, 에스테르, 케톤, 및 술폭시드를 포함할 수 있다. 알칸, 알켄, 알킨, 시클로알칸, 시클로알켄, 에테르, 에스테르, 케톤, 또는 술폭시드는 각각 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 1 내지 12 개, 예를 들면, 1 내지 6 개, 1 내지 3 개, 3 내지 12 개, 3 내지 8 개, 또는 3 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 것일 수 있다. 상기 용매는 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1-C6의 알칸, 알켄, 또는 알킨, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C3 내지 C12, C5 내지 C12, 또는 C5 내지 C10의 시클로알칸, 또는 시클로알켄, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 알킬아세테이트로서, 상기 알킬은 알킬기가 C1 내지 C5 또는 C1 내지 C3의 탄소를 갖는 것, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C6의 에테르, 또는 케톤일 수 있다. 상기 치환기는 할로겐 원소로서 F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 저극성 용매는 예를 들어, 액체 이산화탄소, 메탄, 에탄, 이소프로판, 부탄, 펜탄, 이소펜탄, 헥산, 헵산, 옥탄, 석유에테르, 시클로헥산, DMSO, 아세토니트릴, 테트라히드로퓨란, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 이소프로필아세테이트, n-부틸아세테이트, 아세톤, 디에틸에테르, t-부틸메틸에테르, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 아세토니트릴, 1,2-디클로로에텐, 디클로로메탄, 메틸렌클로리드, 또는 이들의 조합일 수 있다.
또한 상기 세스퀴테르펜 락톤의 경우와 같이 본 발명의 개똥쑥 식물체의 추출물을 포함하는 조성물은 정유 성분을 저함량 포함하거나 거의 포함하지 않는다. 따라서 본 발명의 개똥쑥 식물체의 추출물을 포함하는 조성물은 세스퀴테르펜 락톤, 정유 성분 및 이들의 조합을 저함량 포함하거나 거의 포함하지 않는다.
상기 개똥쑥 추출물을 분리하는 방법에서 상기 친수성 용매(hydrophilic solvent)는 오르니틴(ornithine), 피니톨(pinitol), 뮤코-이노시톨(muco-inositol), 키로-이노시톨(chiro-inositol), 베타인(betain), 클로로겐산(chlorogenic acid), α-리놀렌산(α-linolenic acid), 리놀레산(linoleic acid), 및 팔미트산(palmitic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 용해시킬 수 있는 것일 수 있다. 상기 개똥쑥 식물체의 추출물, 또는 그의 분획물에서 상기 친수성 용매에 용해되어 용출될 수 있는 화합물들은 하기의 화학식 1 내지 6의 화합물 또는 그 유도체, 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 형태 중 4개 이상을 포함하는 것일 수 있고, 화학식 7의 화합물 또는 그 유도체, 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 형태를 더 포함하는 것일 수 있다. 즉, 상기 친수성 용매는 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산으로 이루어진 군으로부터 선택된 4 개 이상의 화합물을 용해시킬 수 있는 것일 수 있고, α-리놀렌산, 리놀레산, 및 팔미트산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 용해시킬 수 있는 것일 수 있다.
화학식 1
Figure 112017113602555-pat00001
화학식 2
Figure 112017113602555-pat00002
화학식 3
Figure 112017113602555-pat00003
화학식 4
Figure 112017113602555-pat00004
화학식 5
Figure 112017113602555-pat00005
화학식 6
Figure 112017113602555-pat00006
화학식 7
Figure 112017113602555-pat00007
상기 화학식 1의 화합물은 오르니틴, 화학식 2의 화학물은 피니톨, 화학식 3의 화합물은 뮤코-이노시톨, 화학식 4의 화합물은 키로-이노시톨, 화학식 5의 화합물은 베타인, 화학식 6의 화합물은 클로로겐산, 및 화학식 7의 화합물은 α-리놀렌산으로 명명되는 것일 수 있다.
상기 친수성 용매는 예를 들면, 물, 알코올 또는 그 조합에 의하여 추출된 것일 수 있다. 상기 알코올은 저급알코올로서 C1 내지 C3, C1 내지 C4, C1 내지 C5 또는 C1 내지 C6의 하나 이상의 -OH기를 갖는 화합물일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 C1 내지 C4의 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올, tert-부탄올, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 방법은 상기 추출물을 분획화 용매에 접촉시켜 분획화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 분획화는 크로마토그래피 매질에 상기 추출물을 접촉시켜 결합시키고 분획화 용매로 용출시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 분획화 용매는 친수성 용매일 수 있는데, 일 구체예에서 상기 친수성 용매는 저급알코올, 또는 이들의 조합일 수 있고, 상기 저급알코올은 C1 내지 C3, C1 내지 C4, C1 내지 C5 또는 C1 내지 C6의 하나 이상의 -OH기를 갖는 화합물일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 C1 내지 C4의 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올, tert-부탄올, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 분획화 용매는 분획화 용매 총 부피에 대하여 알코올이 0 내지 100부피%일 수 있고, 따라서 알코올:물 부피비로 0:10, 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 1:9, 또는 0:10 일 수 있다. 상기 부피비에서 그 비율이 '0'인 경우, 순수한 물 또는 알코올인 것을 의미한다. 예를 들어, 알코올:물 부피비가 2:8인 경우 알코올이 20 부피%라 할 수 있다. 일 구체예에서, 분획화 용매 총 부피에 대하여 20 이상 내지 40 미만, 40 이상 내지 60 미만, 60 이상 내지 100 미만, 및 100 부피%의 알코올로 용출하는 것일 수 있고, 따라서 예를 들어 상기 분획화에 의한 분획물은 분획화 용매 총 부피에 대하여 알코올이 20, 40, 60, 및 100 부피%인 용매에 의해 분획화된 것일 수 있다. 일 구체예에서 상기 알코올은 저급알코올일 수 있고, 상기 저급알코올은 C1 내지 C3, C1 내지 C4, C1 내지 C5 또는 C1 내지 C6의 하나 이상의 -OH기를 갖는 화합물일 수 있다. 일 구체예에서 상기 저급알코올은 에탄올일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법에 따라 제조된 개똥쑥 식물체 추출물, 분획물 또는 이들의 단리된 화합물을 포함하는 피부질환 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에 의하여 추출된 개똥쑥 식물체 추출물은 세스퀴테르펜 락톤을 용해시킬 수 있는 저극성 또는 비극성 용매를 사용하여 상기 세스퀴테르펜 락톤을 추출하여 분리 및 제거하는 단계를 포함하므로, 본 발명의 개똥쑥 식물체 추출물, 분획물 또는 그의 소분획물은 세스퀴테르펜 락톤을 저함량 포함하거나 거의 포함하지 않는다. 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 상기 저극성 또는 비극성 용매는 정유 성분 또한 용해시킬 수 있으므로, 상기 세스퀴테르펜 락톤의 경우와 같이 본 발명의 추출물로부터 정유 성분이 추출되어 분리 및 제거될 수 있다. 따라서 본 발명의 개똥쑥 식물체 추출물, 분획물 또는 그의 소분획물은 세스퀴테르펜 락톤, 정유 성분 및 이들의 조합을 저함량 포함하거나 거의 포함하지 않는다. 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세스퀴테르펜 락톤을 1.00 % 내지 0.001 %, 0.80% 내지 0.001 %, 0.60% 내지 0.001 %, 0.50 % 내지 0.001 %, 0.40 % 내지 0.001 %, 0.30 % 내지 0.001 %, 0.20 % 내지 0.001 %, 0.10 % 내지 0.001 %, 0.08 % 내지 0.001 %, 0.06 % 내지 0.001 %, 0.05 % 내지 0.001 %, 0.04 % 내지 0.001 %, 0.03 % 내지 0.001 %, 0.02 % 내지 0.001 %, 0.01 % 내지 0.001 %, , 0.1 % 이하, 0.05 % 이하, 0.01 % 이하, 0.005 % 이하, 또는 0.001 % 이하의 중량비(w/w)로 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 정유 성분을 1.00% 내지 0.01 %, 0.80% 내지 0.01 %, 0.60% 내지 0.01 %, 0.50 % 내지 0.01 %, 0.40 % 내지 0.01 %, 0.30 % 내지 0.01 %, 0.20 % 내지 0.01 %, 0.10 % 내지 0.01 %, 0.08 % 내지 0.01 %, 0.06 % 내지 0.01 %, 0.05 % 내지 0.01 %, 0.04 % 내지 0.01 %, 0.03 % 내지 0.01 %, 0.02 % 내지 0.01 %, 0.1 % 이하, 0.05 % 이하, 0.01 % 이하, 0.005 % 이하, 또는 0.001 % 이하의 중량비(w/w)로 포함하는 것일 수 있다. 상기 정유 성분은 휘발성 정유 성분일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 추출물은 상기 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 화합물의 조합을 포함하는 것일 수 있거나, 또는 리놀레산, 팔미트산, 및 α-리놀렌산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과 조합을 이루어 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 화합물의 조합은 분획화 용매 총 부피에 대하여 상기 알코올이 20 이상 내지 40 미만, 40 이상 내지 60 미만, 60 이상 내지 100 미만, 및 100 부피%의 분획화 용매에 의한 분획물 중에 포함된 것일 수 있다. 분획화 용매 총 부피에 대하여 상기 알코올이 20 이상 내지 40 미만, 40 이상 내지 60 미만, 및 60 이상 내지 100 미만 부피%인 분획화 용매에 의한 분획물은 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 클로로겐산 또는 이들의 조합을 주성분으로 포함할 수 있으나, 상기 알코올이 100 부피%의 분획화 용매에 의한 분획물은 리놀레산, 팔미트산, α-리놀렌산 또는 이들의 조합을 주성분으로 포함할 수 있으며, 각 분획물에 포함된 각 화합물의 함량이 다를 수 있으므로 상기 각 분획물들은 최적의 약리효과를 달성하기 위해 적절한 비율로 교반하거나 혼합되어 존재할 수 있으며, 필요에 따라 구성 및 비율을 달리할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 분획화 용매 총 부피에 대하여 상기 알코올이 20 이상 내지 40 미만, 40 이상 내지 60 미만, 60 이상 내지 100 미만, 및 100 부피%인 분획화 용매에 의한 분획물을 각각 제1 분획물, 제2 분획물, 제3 분획물 및 제4 분획물로 명명하는 경우, 제1 분획물 및 제2 분획물, 제1 분획물 및 제3 분획물, 제1 분획물 및 제4 분획물, 제2 분획물 및 제3 분획물, 제2 분획물 및 제4 분획물, 또는 제3 분획물 및 제4 분획물; 제1 분획물, 제2 분획물 및 제3 분획물, 제1 분획물, 제3 분획물 및 제4 분획물, 또는 제2 분획물, 제3 분획물 및 제4 분획물; 또는 제1 분획물, 제2 분획물, 제3 분획물 및 제4 분획물이 혼합된 것일 수 있다. 상기 분획물이 2종 혼합된 경우, 상기 분획물의 혼합물 중 그 중량비는 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 또는 1:9일 수 있고, 상기 분획물이 3종 혼합된 경우, 그 중량비는 1:1:8, 1:2:7, 1:3:6, 1:4:5, 1:5:4, 1:6:3, 1:7:2, 1:8:1, 2:1:7, 2:2:6, 2:3:5, 2:4:4, 2:5:3, 2:6:1, 2:7:1, 3:1:6, 3:2:5, 3:3:4, 3:4:3, 3:5:2, 3:6:1, 4:1:5, 4:2:4, 4:3:3, 4:4:2, 4:5:1, 5:1:4, 5:2:3, 5:3:2, 5:4:1, 6:1:3, 6:2:2, 6:3:1, 7:1:2, 7:2:1, 또는 8:1:1일 수 있고, 상기 분획물이 4종 혼합된 경우, 그 중량비는 1:1:1:7, 1:2:1:6, 1:3:1:5, 1:4:1:4, 1:5:1:3, 1:6:1:2, 1:7:1:1, 1:1:2:6, 1:1:3:5, 1:1:4:4, 1:1:5:3, 1:1:6:2, 1:1:7:1, 2:1:1:6, 2:2:1:5, 2:3:1:4, 2:4:1:3, 2:5:1:2, 2:6:1:1, 2:1:2:5, 2:1:3:4, 2:1:4:3, 2:1:5:2, 2:1:6:1, 3:1:1:5, 3:2:1:4, 3:3:1:3, 3:4:1:2, 3:5:1:1, 3:1:2:4, 3:1:3:3, 3:1:4:2, 3:1:5:1, 4:1:1:4, 4:2:1:3, 4:3:1:2, 4:4:1:1, 4:1:2:3, 4:1:3:2, 4:1:4:1, 5:1:1:3, 5:2:1:2, 5:3:1:1, 5:1:2:2, 5:1:3:1, 6:1:1:2, 6:2:1:1, 6:1:2:1, 또는 7:1:1:1일 수 있다.
일 구체예에서 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 화합물; 및 리놀레산, 팔미트산, 및 α-리놀렌산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물의 조합을 포함하는 조성물은 상기 추출물 중 분획화 용매 총 부피에 대하여 상기 알코올 20 이상 내지 40 미만 부피% 용매에 의해 분획된 분획물 및 상기 알코올 100 부피% 용매에 의해 분획된 분획물의 혼합 또는 조합일 수 있다. 따라서 본 발명의 두 가지 분획물은 각각의 분획물을 단독으로 포함하는 것일 수 있고, 상기 두 가지 분획물의 조합을 중량비로 하여 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 또는 1:9로 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 상기 두 가지 분획물의 조합을 9:1 중량비로 하여 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물은 피부질환을 치료, 개선 또는 예방하는 것일 수 있다. 일 구체예에서 상기 피부질환은 염증성 피부질환일 수 있다. 또한 상기 개똥쑥 식물체의 추출물, 그의 분획물 또는 이들로부터 단리된 화합물은 염증 반응을 억제하는 것일 수 있다. 따라서 상기 조성물 중 개똥쑥 식물체 추출물, 그의 분획물 또는 이들로부터 단리된 화합물은 피부질환을 유발하는 염증 반응을 억제시키거나 상처를 회복시키기에 유효한 양으로 포함될 수 있다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 조성물 1,000 mg 당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg일 수 있다. 상기 조성물은 인 비트로 또는 개체 중의 세포에서 염증 반응을 억제시키기 위한 것일 수 있다. 개체 중의 세포는 예를 들면 염증 반응이 진행되고 있거나 진행될 것으로 예상되는 부위, 또는 염증 반응에 의하여 질병 상태가 외관상 관찰되는 부위에 위치하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 피부질환은 피부염일 수 있다. 상기 피부 질환은 피부가려움증, 두드러기, 아토피, 건조성 피부염, 신경성 피부염, 접촉성 피부염과 같은 질환을 포함하는 것일 수 있다. 상기 피부가려움증은 벌레 물림이나 피부가 민감하게 반응할 수 있는 특정 접촉물에 의하여 자극을 받거나, 아토피, 피부염, 건선, 감염, 건성 피부 또는 피부노화로 인하여 피부신경이 약하게 지속적인 자극을 받아 발생하는 못 견디게 긁고 싶은 증상을 의미하는 것일 수 있다. 상기 두드러기는 강한 정신적 스트레스, 음식 또는 약이나 알레르기 항원에 의하여 발생하는 알레르기성 염증 반응에 의한 피부 발진을 의미하는 것일 수 있다. 상기 아토피는 알레르기 항원에 대한 직접 접촉 없이도 신체가 피부가 민감하게 과도한 면역 반응을 일으켜 발진, 습진과 심한 가려움증을 수반하는 알레르기성 염증질환을 의미하는 것일 수 있다. 상기 건조성 피부염은 피부 각질이 많이 일어나는 피부 건조증이 심화되면서 건조성 습진이나 노인성 습진으로 악화된 피부염 증상을 의미하는 것일 수 있다. 상기 신경성 피부염은 신경이 과민해져서 사소한 자극으로도 심한 가려움을 느껴 긁기 때문에 각질층과 피부 주름이 두꺼워지고 그에 따라 가려움증이 심화되어 계속 긁기 때문에 결국 습진 등의 피부염으로 악화되는 증상을 의미하는 것일 수 있다. 상기 접촉성 피부염은 알레르기 항원이나 특정 자극원에 노출되었을 때 국지적인 발진이나 자극 및 가려움증이 나타나는 증상을 의미하는 것일 수 있다.
상기 피부질환은 구체적으로 피부 소양증, 땀띠, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 탈락 피부염, 어린선, 한선염, 농가진, 아토피성 피부염, 약물알레르기, 당뇨병성 피부염, 피부 건조증, 피부 변색증, 세균성 피부염, 진균성 피부염, 수두, 동상, 화상, 습진, 부종, 돌발성 발진, 콜린성 두드러기, 모낭염, 여드름, 모공성 각화증, 사마귀, 광선각화증, 비립종, 건선, 한선염, 베체트 병, 욕창, 켈로이드성 질환, 환부 부종, 조갑주위염, 조갑이영양증, 생인손, 알레르기성 피부염, 만성단순태선, 피부 농양, 신경성 피부염 또는 이들의 조합일 수 있다.
또 다른 양상은 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 화합물을 포함하는 것인 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 개똥쑥 식물체로부터 획득된 추출물 또는 분획물 중에 포함된 것일 수 있고, 상기 분획물의 소분획, 또는 추가적인 공정에 의해 단리된 화합물로서 포함된 것일 수 있고, 상기 화합물은 입체 이성질체, 그의 용매화물, 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다. 상기 조성물은 4개 화합물, 5개 화합물, 또는 6개 화합물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 4개 화합물은 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 및 키로-이노시톨; 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 및 베타인; 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 및 클로로겐산; 오르니틴, 피니톨, 키로-이노시톨, 및 베타인; 오르니틴, 피니톨, 키로-이노시톨, 및 클로로겐산; 오르니틴, 피니톨, 베타인, 및 클로로겐산; 오르니틴, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 및 베타인; 오르니틴, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 및 클로로겐산; 오르니틴, 뮤코-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산; 오르니틴, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산; 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 및 베타인; 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 및 클로로겐산; 피니톨, 뮤코-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산; 피니톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산; 또는 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산일 수 있다. 상기 5개 화합물은 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 및 베타인; 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 및 클로로겐산; 오르니틴, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산; 오르니틴, 피니톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산; 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산; 또는 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산일 수 있다. 상기 조성물은 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인 및 클로로겐산 중 하나 이상을 포함한다. 상기 6 개 화합물은 조성물에 포함되는 경우, 1 내지 5: 4 내지 35: 1 내지 8: 2 내지 16 : 2 내지 20 : 2 내지 16 중량비로 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인 및 클로로겐산 중 하나 이상이 포함되는 경우, 이들 화합물 각각은 전체 중량에 대하여 0.1 내지 4 (w/w)%, 0.6 내지 25 (w/w)%, 0.2 내지 8 (w/w)%, 0.3 내지 16 (w/w)%, 0.3 내지 24 (w/w)%, 및 0.2 내지 12 (w/w)%로 포함되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 상기 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산 중 선택된 4개 이상의 화합물이 리놀레산, 팔미트산, 및 α-리놀렌산 중 선택된 하나 이상 화합물과 추가적으로 조합을 이루는 것일 수 있다. 따라서 상기 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산 중 선택된 4개 이상의 화합물이 리놀렌산; 팔미트산; α-리놀렌산; 리놀레산 및 팔미트산; 리놀레산 및 α-리놀렌산; 팔미트산 및 α-리놀렌산; 또는 리놀레산, 팔미트산 및 α-리놀렌산과 추가적으로 조합을 이루는 것일 수 있다. 상기 조성물은 α-리놀렌산, 리놀레산, 및 팔미트산을 1 내지 30: 1 내지 15 : 1 내지 15의 중량비로 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 전체 중량에 대하여 α-리놀렌산, 리놀레산, 및 팔미트산을 각각 1 내지 30 (w/w)%, 1 내지 15 (w/w)%, 및 1 내지 15 (w/w)%로 포함하는 것일 수 있다.
상기 조합은 단순히 용매 중에 혼합, 혼화, 혼합용융, 용해, 현탁 또는 콜로이드를 이루는 것일 수 있고, 상기 조성물이 투여되는 경우 상기 화합물은 각각 동시에, 개별적으로, 또는 순차적으로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 개똥쑥(Artemisia annua) 식물체의 추출물, 또는 그의 분획물과 이들로부터 단리된 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물일 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 개똥쑥 식물체의 추출물, 그의 분획물, 또는 이들로부터 단리된 화합물을 개체에 투여되기 위하여 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 형태로 하는 약제 또는 제제일 수 있다. 용어 '약학적'은 약리활성을 갖는 것을 의미하는 것으로서, 질병 치료를 위한 좁은 의미의 약학적 조성물로 사용되는 것 외에 본 발명의 조성물의 약리활성을 이용하고자 하는 목적을 위한 모든 용도를 포함하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 피부건강을 위한 기능성 식품, 화장품, 의약 외품, 또는 피부외용제로 사용하기 위한 조성물일 수 있다.
상기 '약학적으로 허용가능한 염'은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 본 발명의 조성물 내 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 것이며, 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트일 수 있다.
또 다른 양상은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있으며, 상기 포유동물은 인간일 수 있으며, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다.
상기 투여는 경구 투여 또는 정맥, 복강, 피내, 피하, 상피 또는 근육투여 등과 같은 비경구 투여를 위해 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 사용될 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
특히 피부에 적용하기 위한 피부외용제는 패취, 밴드, 유액, 연고, 팩, 젤, 크림, 로션, 액제 또는 분말제의 형태로 적용될 수 있고, 화장품으로서 유연화장수, 영양화장수, 마사지 크림, 영양크림, 보습크림, 기능성 로션, 미스트, 팩, 젤 또는 피부 점착타입 제형으로서 적용될 수 있다. 따라서 상기 피부외용제로 사용되기 위하여 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예컨대 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제등이 조성물에 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다.
상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
//
다른 양상은 상기 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법에 따라 제조된 개똥쑥 식물체 추출물, 분획물 또는 이들의 단리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 동물용 의약품을 제공한다.
상기 동물은 포유류, 조류, 어류, 또는 파충류일 수 있고, 가축, 애완동물, 또는 양식용 어류 일 수 있고, 또는 닭, 돼지, 소, 말, 개, 토끼, 고양이, 오리, 산양 및 면양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 동물일 수 있다.
상기 동물용 의약품은 단독 의약품으로 사용될 수 있고, 동물용 사료 첨가제로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 동물용 사료 첨가제로서의 동물용 의약품은 분체, 과립, 펠릿, 액상, 또는 현탁액 등의 제형일 수 있고, 단독 또는 사료에 혼합되어 공급되는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법에 따라 제조된 개똥쑥 식물체 추출물, 분획물 또는 이들의 단리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부질환을 예방 또는 개선시키기 위한 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 식품적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품일 수 있다.
본 발명에서 정의되는 건강기능식품은 2008년 개정된 건강기능식품에 관한 법률을 통하여 새롭게 정의된 인체에 대한 기능성 및 안전성이 충분하게 확립되어 식품의약품안전청 식약청 고시 제2008-72호에 규정된 건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정에 수재된 건강기능식품일 수 있다.
본 발명의 조성물을 건강기능식품에 포함하여 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 조성물을 구성하는 유효 성분을 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.2 내지 10 중량%로 포함할 수 있으며, 음료로서 제조될 경우 100 mL를 기준으로 0.1 내지 30g, 바람직하게는 0.2 내지 5 g의 비율로 함유할 수도 있고, 음료 전체가 천연물 성분으로 구성될 수도 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품용 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강기능식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 침제, 액제, 엑스제, 껌, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 음료의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제로는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 목적 또는 기호에 따라 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 과한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다.
다른 양상은 상기 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법에 따라 제조된 개똥쑥 식물체 추출물, 분획물 또는 이들의 단리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부질환을 예방 또는 개선시키기 위한 의약외품 조성물을 제공한다. 상기 의약외품 조성물은 의약외품적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있다.
용어 '의약외품'이란 약사법에 따라 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로서, 질병을 치료하거나 예방하기 위해 쓰는 의약품보다 인체에 대한 작용이 경미한 물품에 대해 보건복지부가 따로 정한 분류 기준에 의한 약품을 의미한다. 따라서 인간 또는 동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 또는 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등을 포함할 수 있다. 일 구체에서 상기 의약외품은 피부소양증 또는 아토피성 피부염 보습, 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법에 따라 제조된 개똥쑥 식물체 추출물, 분획물 또는 이들의 단리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부질환을 예방 또는 개선시키기 위한 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 기능성 화장품일 수 있다.
식품의약품안전처에 의해 2016년 8월 11일에 입법 예고된 '화장품법 시행규칙' 일부 개정안에 따르면 기능성 화장품에 아토피 피부 보습 기능을 추가함에 따라, 일 구체예에서 상기 기능성 화장품은 아토피 피부염 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
일 양상에 따른 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법에 의하면, 세스퀴테르펜 락톤이 적거나 거의 포함되지 않은 추출물을 효율적으로 분리할 수 있다.
다른 양상에 따른 상기 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법에 따라 제조된 개똥쑥 식물체 추출물을 포함하는 조성물에 의하면, 스테로이드성 약물의 대체 약물 또는 그와의 조합으로 아토피, 염증성 피부질환, 또는 소양증 등의 피부질환에서 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
또 다른 양상에 따른 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상을 포함하는 조성물에 의하면, 단일 화합물의 조합에 의한 조성물로서 스테로이드성 약물의 대체 약물 또는 그와의 조합으로 피부질환에서 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다.
또 다른 양상에 따른 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부질환을 예방 또는 치료하는 방법에 따라 스테로이드성 약물의 대체 약물 또는 그와의 조합으로 개체의 피부질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또 다른 양상에 따른 상기 조성물을 포함하는 의약품, 동물용 의약품, 건강기능식품, 의약외품 또는 기능성 화장품에 의하면, 스테로이드성 약물의 대체 약물 또는 그와의 조합으로 인간 및 동물의 아토피, 염증성 피부질환, 또는 소양증 등의 피부질환에서 예방, 개선, 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
도 1은 개똥쑥 디클로로메탄 추출 후 남은 잔사로부터 추출된 개똥쑥 에탄올 추출물의 HPLC 크로마토그램이다.
도 2 및 3은 실시예 2에 기재된 개똥쑥 고극성 분획물(AAMM-분획1)의 HPLC 크로마토그램이다.
도 4와 도 5는 AAMM-분획4의 HPLC 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 6은 개똥쑥 디클로로메탄 추출물(AAM)과 디클로로메탄 추출 후 잔사를 에탄올로 추출한 개똥쑥 에탄올 추출물(AAMM)을 쥐의 염증부위에 처리한 후 18F-FDG를 트레이서로 이용한 PET-CT 이미지를 나타낸다.
도 7은 개똥쑥 추출물 AAM 및 AAMM을 쥐의 염증부위에 처리한 후 조직의 변화를 나타낸 현미경 사진이다.
도 8은 DNFB, 덱사메타손, AAMM, AAMM-분획 1, 2, 3 및 4를 쥐의 염증부위에 처리한 후 조직의 변화를 H&E 염색을 통하여 나타낸 조직병리 현미경 사진이다 (배율 x200).
도 9는 DNFB, 덱사메타손, AAMM, AAMM-분획 1, 2, 3 및 4를 쥐의 염증부위에 처리한 후 조직의 변화 중 콜라겐 분포를 나타낸 피크로사리우 레드(Picrosirius Red) 염색 조직 절편의 현미경 사진이다 (배율 x100).
도 10은 세스퀴테르펜 락톤을 포함하는 추출물(AA)과 AAMM-1+4를 쥐의 염증부위에 처리한 후 조직의 변화를 H&E 염색 및 Picrisirious Red로 염색하여 표피의 두께, 염증세포 유무, 극피와 가시세포증(acanthosis) 및 콜라겐 분포를 나타내는 현미경 사진이다 (배율 x200).
도 11(A)는 화학식 1 내지 7 중 어느 하나의 화학식을 갖는 화합물의 오토파지(autophagy) 유도를 통한 세포보호 활성을 나타낸 것이고, 도 11(B)는 화학식 1 내지 7 중 어느 하나의 화학식을 갖는 화합물의 선택적 조합을 포함하는 조성물의 오토파지 유도 활성을 나타낸 그래프를 나타낸 것이다. (RPM=양성대조군 라파마이신(Rapamycin), C=음성대조군 시험약물을 용해시킨 농도의 DMSO 처리군)
도 12는 DNFB 도포를 통하여 염증을 일으킨 부위에 AA-M6 조성물과 AA-M9 조성물을 처리하고, 피부조직의 절편을 H&E 염색 후 조직절편을 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 중국산 개똥쑥을 메틸렌클로리드로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 메탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다.
도 14는 중국산 개똥쑥을 디에틸에테르로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다.
도 15는 중국산 개똥쑥을 에틸아세테이트로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다.
도 16은 중국산 개똥쑥을 아세톤으로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다.
도 17은 중국산 개똥쑥을 액체 이산화탄소로 초임계 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다.
도 18은 한국산 개똥쑥을 메틸렌클로리드로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 메탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다.
도 19는 한국산 개똥쑥을 디에틸에테르로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다.
도 20은 한국산 개똥쑥을 에틸아세테이트로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다.
도 21은 한국산 개똥쑥을 아세톤으로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다.
도 22는 AAE1 및 AAEM1 추출물이 세포에서 IL-1β의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 23은 AAE1 및 AAEM1 추출물이 세포에서 LC3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 개똥쑥 ( Artemisia annua ) 추출물의 제조
1. 개똥쑥의 세스퀴테르펜 및 정유성분 추출물 제조
개똥쑥(중국산)의 지상부 건조물을 구입하여 시료 5 kg을 세절한 후 추출 용기인 50 L 유리병에 넣은 다음, 디클로로메탄(dichloromethane) 40 L를 가한 후 48 시간 상온에서 흔들어서 교반하여 추출하고 이 혼합물을 0.34 mm의 필름 두께를 가지는 whatman 종이 여과지와 직경 30 cm 유리 깔대기를 사용하여 중력 여과하는 과정을 2회 반복('추출-여과' 2 회)하여, 여과된 추출액을 수득하였다. 상기 여과된 추출액을 감압 농축기에 넣고 감압 하에 30 ℃에서 용매를 완전히 증발시켜 농축하였다. 그 결과, 아르테미시닌을 포함한 세스퀴테르펜 락톤 성분과 정유성분을 주성분으로 함유하는 개똥쑥 디클로로메탄 추출물 114 g(이하 'AAM'라고 함)을 수득하였다. (수득율 2.3 %)
2. 개똥쑥의 세스퀴테르펜 및 정유성분의 대부분을 제거한 알코올 추출물의 제조
1절에서 디클로로메탄 추출액을 여과하고 남은 잔여물에 에탄올 40 L를 가한 후 48 시간 45 ℃에서 흔들어 교반한 후 담가두어, 상온으로 냉각시킨 후 이 혼합물을 0.34 mm의 필름 두께를 가지는 whatman 종이여과지와 직경 30 cm 유리깔대기를 사용하여 중력 여과하는 과정을 2회 반복하였다('온침-여과' 2회). 그런 다음 상기 여과된 추출액을 감압 농축기에 넣고 감압 하에 40 ℃에서 용매를 완전히 증발시켜 농축하였다. 그 결과, 아르테미시닌을 포함한 세스퀴테르펜 락톤 성분과 정유성분 대부분을 제거한 개똥쑥 에탄올 추출물 484 g(이하 'AAMM'라고 함)을 수득하였다. (수득율 9.7 %)
상기 AAMM 추출물을 하기한 분석 조건에 따라 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하였다. 그 결과, 머무름 시간(residence time) 14 분 이후에 주로 관찰되는 세스퀴테르펜 락톤, 세스퀴테르펜 및 정유성분들로 구성된 저극성 성분들의 피크들이 매우 작거나 또는 거의 없는 것으로 확인되었다. 구체적으로, 상기 AAMM 추출물 중량 대비 세스퀴테르펜 락톤은 약 0.001 (w/w)%, 휘발성 정유 성분은 약 0.01 (w/w)% 이하였다. 세스퀴테르펜 락톤은 아르테미시닌, 아르테미신산, 아르테아누인, 및 아르테미시틴을 포함한다.
도 1은 개똥쑥 디클로로메탄 추출 후 남은 잔사로부터 추출된 개똥쑥 에탄올 추출물의 HPLC 크로마토그램이다. 도 1에서, A, B 및 C는 자외선(UV) 검출기에서 254 nm, 320 nm 및 420 nm 파장을 검출하여 얻어진 크로마토그램을 각각 나타낸다. 도 1의 C에서, 30분 이후에서 주로 검출된 저극성 성분들은 표준(reference) UV 스펙트럼을 검색하여 비교한 결과 주로 카로테노이드 성분 및 클로로필 성분으로 확인되었다.
상기 AAMM의 HPLC 분석 조건은 하기한 바와 같다.
사용장비: Waters 1525 HPLC system
컬럼: RP C-18 HPLC 컬럼 (4.6x150 ㎜, 5 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA (Trifluoroacetic acid)를 함유한 아세토니트릴
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성: 0 분 (a) 용매:(b) 용매 부피비 10:90으로 용출 시작
0 분에서 30 분 (a) 용매 비율을 10 %에서 100 %로 증가
30 분에서 37 분 (a) 용매 100 %로 용출
이동상 유속: 1.0 ml/min
검출기 검출 파장: 자외선 254 ㎚; 320 nm; 420 nm
3. 개똥쑥의 에탄올 추출물의 제조
중국 재배 개똥쑥의 전초 건조물을 구입하여 시료 200 g을 세절한 후 추출 용기에 넣은 다음, 에탄올 1.6 L 가한 후 48 시간 45 ℃에서 흔들어서 교반 후 담가두고 상온으로 냉각시킨 후 여과하는 과정을 2회 반복하였다. 그런 다음, 여과된 추출액을 감압 농축기에 넣고 감압 하에 40 ℃에서 용매를 완전히 증발시켜 농축시켰다. 그 결과, 아르테미시닌을 포함한 세스퀴테르펜 락톤 성분과 정유성분 및 상기 2절로부터 제조된 AAMM 추출물이 함유하는 성분들의 대부분을 함유하는 개똥쑥 에탄올 추출물 23 g (이하 'AA'라고 함)을 수득하였다(수득률 11.3 %).
4. 용매를 달리한 추출물의 제조
중국 재배 또는 한국산 개똥쑥을 각각 메틸렌 클로리드(methylene chloride), 디에틸에테르(diethyl ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 아세톤(acetone), 또는 액체 이산화탄소로 추출 후, 추출액을 제거하고 남은 잔사를 2절에 기재된 방법에 따라 메탄올, 에탄올, 또는 90% 에탄올 수용액으로 추출하여 분석 시료를 제조하였다. 모든 추출은 1절에 기술된 방법에 준하여 수행되었다. 다만, 액체 이산화탄소 전처리 추출은 중국 재배 개똥쑥만 가지고 수행하였으며, 액체 이산화탄소를 이용한 전처리 추출방법은 특허 명세서에 언급한 추출방법 중 하나인 초임계추출 방법을 사용하였고, 액체 이산화탄소 추출액 제거 후 사용 시료 제조를 위한 잔사 추출은 에탄올을 용매로 2절에 기술된 방법으로 수행하였다.
상기 메탄올, 에탄올, 또는 90% 에탄올 수용액을 하기한 분석방법으로 분석한 결과, 결과물은 2절의 AAMM 추출물과 모두 유사한 성분 패턴을 나타내었다.
도 13은 중국산 개똥쑥을 메틸렌클로리드로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 메탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다. 도 13에서, 그래프의 피크 넓이를 기준으로 계산된 전체 화합물 중 각 화합물의 함량 또는 비는 화합물 2: 3: 4: 5: 6 = 4.62 %; 1.52%: 3.18%: 4.71%; 1.00%이었다. 상기 비는 추출물 중량에 대한 중량 % 함량에 해당한다.
도 14는 중국산 개똥쑥을 디에틸에테르로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다. 도 14에서, 그래프의 피크 넓이를 기준으로 계산된 전체 화합물 중 각 화합물의 함량 또는 비는 화합물 2: 3: 4: 5: 6 = 1.93 %; 0.92%: 3.05%: 2.75%; 0.57%이었다.
도 15는 중국산 개똥쑥을 에틸아세테이트로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다. 도 15에서, 그래프의 피크 넓이를 기준으로 계산된 전체 화합물 중 각 화합물의 함량 또는 비는 화합물 2: 3: 4: 5: 6 = 1.14 %; 0.86%: 2.42%: 2.80%; 0.83%이었다.
도 16은 중국산 개똥쑥을 아세톤으로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다. 도 16에서, 그래프의 피크 넓이를 기준으로 계산된 전체 화합물 중 각 화합물의 함량 또는 비는 화합물 2: 3: 4: 5: 6 = 0.66 %; 0.62%: 2.22%: 2.64%; 0.58%이었다.
도 17은 중국산 개똥쑥을 액체 이산화탄소로 초임계 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다. 도 17에서, 그래프의 피크 넓이를 기준으로 계산된 전체 화합물 중 각 화합물의 함량 또는 비는 화합물 2: 3: 4: 5: 6 = 1.77 %; 0.83%: 2.82%: 1.55%; 1.12%이었다.
도 18은 한국산 개똥쑥을 메틸렌클로리드로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 메탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다. 도 18에서, 그래프의 피크 넓이를 기준으로 계산된 전체 화합물 중 각 화합물의 함량 또는 비는 화합물 2: 3: 4: 5: 6 = 3.43 %; 0.73%: 1.01%: 2.74%; 0.24%이었다.
도 19는 한국산 개똥쑥을 디에틸에테르로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다. 도 19에서, 그래프의 피크 넓이를 기준으로 계산된 전체 화합물 중 각 화합물의 함량 또는 비는 화합물 2: 3: 4: 5: 6 = 2.96 %; 1.14 %: 2.41%: 2.84 %; 1.37 %이었다.
도 20은 한국산 개똥쑥을 에틸아세테이트로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다. 도 20에서, 그래프의 피크 넓이를 기준으로 계산된 전체 화합물 중 각 화합물의 함량 또는 비는 화합물 2: 3: 4: 5: 6 = 1.14 %; 0.42%: 0.39%: 1.24%; 0.46%이었다.
도 21은 한국산 개똥쑥을 아세톤으로 추출한 후, 추출액을 제거한 후 남은 잔사를 에탄올로 추출한 추출물을 HPLC한 결과이다. 도 21에서, 그래프의 피크 넓이를 기준으로 계산된 전체 화합물 중 각 화합물의 함량 또는 비는 화합물 2: 3: 4: 5: 6 = 1.20 %; 0.25%: 0.93%: 1.58%; 1.46%이었다.
도 13 내지 21에 의하면, 추출물 중량에 대하여 각 화합물의 함량 또는 비는 화합물 2: 3: 4: 5: 6 = 0.66 내지 4.62 %; 0.25 내지 1.53 %: 0.39 내지 3.18 %: 1.24 내지 4.71 %; 0.24 내지 1.46 %이었다.
상기 결과물은 본 특허의 주요 유효성분인 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 및 화학식 6으로 표시되는 5종의 화합물들을 모두 함유하고 있었다. 본 특허의 화학식 2 내지 화학식 5로 표시되는 4종의 화합물은 하기한 분석 방법 1로 분석되었으며 (도 13 내지 21에서 A), 본 특허의 화학식 6으로 표시되는 화합물은 하기한 분석 방법 2로 분석되었다 (도 13 내지 21에서 B). 상기한 다른 용매를 사용한 추출 과정에서 얻어진 추출물은 디클로로메탄 추출 후 잔사로부터 에탄올 추출에 의하여 얻어진 추출물의 성분과 유사한 성분을 포함하고 있다. 또한, 상기 추출물은 하기 시험예에 기재된 AAMM 추출물 및 그 분획물과 유사한 염증성 피부를 개선시키는 효과를 가지고 있었다.
분석 방법 1
분석기기: HPLC (영린, YL9100 series)
검출기: ELSD (Temp: 50 ℃, Gas: 2.5 ln) (GmbH, ZAM 3000)
분석조건: 1 mL/min, 87% A (MeCN); 13% B (D.W), isocratic 50 min
컬럼: YMC NH2 (5 μm, 150 X 4.6 mm)
컬럼온도: 30 ℃
주입량: 10 μL
분석 방법 2
분석기기: HPLC (Waters)
검출기: 2996 PDA detector (254 nm) (waters)
분석조건: 1 mL/min, A (0.02% TFA in MeCN); B (0.02% TFA in D.W), 0 min:
10 % A -> 30 min: 100 % A
컬럼: Phenomenex Luna C18(2) (5 μm, 150 X 4.6 mm)
컬럼온도: 상온
주입량: 10 μL
따라서, 저극성 용매로서 메틸렌 클로리드, 디에틸에테르(diethyl ether), 에틸아세테이트, 아세톤, 액체 이산화탄소 또는 이들과 구조적으로 유사한 용매가 본원의 적극성 용매로서 사용될 수 있다.
실시예 2: AAMM 추출물로부터 분획물 제조
실시예 1의 2절에 기재된 개똥쑥의 AAMM 추출물 16 g을 에탄올, 물, 또는 에탄올 및 물의 혼합 용매를 이용하여 개똥쑥 AAMM 추출물의 분획물을 제조하였다. 구체적으로, 에탄올과 물의 부피 비율 2:8, 4:6, 6:4, 및 10:0으로 에탄올과 물을 포함하는 혼합물 또는 에탄올 1 L를 분획화 용매로 하였다.
즉, 상기 분획화 용매 에탄올과 물의 혼합물 일부에 상기 추출물을 접촉한 후, 고정상으로서 사용된 옥타데실-실리카(octadecyl-silica: ODS) 수지 100 g에 전개하고, 상기 각 용매로 용출하는 크로마토그래피를 수행하여 4종의 분획물['AAMM-분획 1' (에탄올:물-2:8 분획화 용매, 9.6 g), 'AAMM-분획 2' (에탄올:물-4:6, 2.4 g), 'AAMM-분획 3' (에탄올:물-6:4 분획화 용매, 1.3 g) 및 'AAMM-분획 4' (에탄올:물-10:0, 1.5 g) 라고 함]을 수득하였다.
하기 시험예 2의 방법으로 각 분획물의 효능을 측정한 후, 비교적 효능이 우수한 상기 분획 1과 분획 4를 각 수득율에 따라 분획 1:분획 4를 9:1로 혼합하여 'AAMM-분획 1+4' 시료를 조제하였다.
도 2 및 도 3은 AAMM-분획 1의 HPLC 결과를 나타내는 HPLC 크로마토그램이다. 도 2 및 도 3의 HPLC 조건은 각각 하기한 조건 1 및 2와 같다. 도 2 및 도 3에서 A 및 B는 각각 UV 검출기(254 nm) 및 ELSD 검출기를 사용한 것이다.
도 2B에 나타낸 바와 같이, 조건 1에 따른 HPLC 결과 화학식 1 내지 5로 표기되는 성분들이 주요 피크로 검출되었다. 또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 조건 2에 따른 HPLC 결과, 화학식 6으로 표기되는 클로로겐산(Chlorogenic acid)이 주요 피크로 검출되었다.
조건 1:
사용장비: 영린 9100 HPLC
컬럼: NH2 HPLC 컬럼 (4.6x250 ㎜, 5 ㎛)
이동상 조성: 아세토니트릴:물 부피비 80:20 (20 분 동안)
이동상 유속: 1.0 ml/min
검출기: 자외선 254 ㎚ (도 2A); ELSD (도 2B)
조건 2:
사용장비: 영린 9100 HPLC
컬럼: RP C-18 HPLC 컬럼 (4.6x150 ㎜, 5 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA(Trifluoroacetic acid)를 함유한 아세토니트릴
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성: 0 분 (a) 용매: (b) 용매 부피비 10:90으로 용출 시작
0 분에서 30 분 (a) 용매 비율을 10 %에서 100 %로 증가
30 분에서 37 분 (a) 용매 100 %로 용출
이동상 유속: 1.0 ml/min
검출기: 자외선 254 ㎚ (도 3A); ELSD (도 3B)
도 4와 도 5는 AAMM-분획4의 HPLC 결과를 나타내는 크로마토그램이다. 도 4 및 도 5의 HPLC 조건은 각각 하기한 조건 3과 조건 4와 같다. 도 4 및 도 5에서 A 및 B는 각각 UV 검출기(420 nm) 및 ELSD 검출기를 사용한 것이다.
도 4A에 나타낸 바와 같이, UV 검출기(검출 파장 420 nm)에서 카로테노이드 또는 클로로필로 추정되는 성분들이 주요 피크로 검출되었다. 도 5B에 나타낸 바와 같이, ELSD 검출기에서 화학식 7로 표기되는 알파-리놀렌산(α-linolenic acid)을 주요 불포화 지방산 성분으로 하여 이와 유사한 지방산 성분들이 주요 피크로 검출되었다.
조건 3:
검출기: 자외선 420 nm (도 4A); ELSD (도 4B)를 사용한 것을 제외하고, 조건 2와 동일하다.
조건 4:
사용장비: 영린 9100 HPLC
컬럼: RP C-18 HPLC 컬럼 (4.6x150 ㎜, 5 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA를 함유한 메탄올
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성:0 분에서 10 분 (a)용매:(b)용매 부피비 80:20으로 용출을 시작
(a) 용매의 비율을 증가시켜 100 % (a)용매로 변화
10 분에서 30 분 (a)용매 100 %로 용출
이동상 유속: 1.0 ml/min
검출기: 자외선 420 nm(도 5A); ELSD (도 5B)
실시예 3: 주 성분 화합물의 분리 및 동정
1. AAMM -분획 1 함유 성분들의 분리 및 동정
실시예 2의 AAMM-분획 1을 감압 농축한 후, 하기한 분리 방법 1과 같이 HPLC 분리법을 통하여 상기 소분획물을 분리하였다
그 결과, 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨 및 베타인을 분리하였다. AAMM-분획 1의 건조 중량 100 mg으로부터 오르니틴 3 mg, 피니톨 29 mg, 뮤코-이노시톨 4 mg, 키로-이노시톨(chiro-inositol) 7 mg, 및 베타인 3 mg을 수득하였다. 또한, AAMM-분획 1의 건조중량 대비 약 15 % 수득율로 과당(fructose)이 분리되었다.
분리 방법 1
사용장비: Waters 515 pump
컬럼: YMC NH2 HPLC 컬럼 (10x250 ㎜, 10 ㎛)
용매: (a) 아세토니트릴
(b) 물
이동상 조성: 0 분에서 (a)용매:(b)용매 부피비 80:20으로 용출 시작
6 분에서 60분까지 동일비로 용출
이동상 유속: 4.0 ml/min
검출기: RI
또한 AAMM-분획 1을 하기한 분리 방법 2와 같이 HPLC 분리법을 통하여 상기 소분획물을 분리하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 클로로겐산을 분리하였다. 클로로겐산은 AAMM-분획 1 100 mg으로부터 7 mg이 수득되었다.
분리 방법 2
사용장비: YMC LC-Forte R
컬럼: Phenomenex Luna C-18 RP HPLC 컬럼 (21.2x250 ㎜, 10 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA를 함유한 아세토니트릴
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성:0 분에서 (a)용매:(b)용매 부피비 10:90으로 용출 시작
0 분에서 40분 (a) 용매의 비율을 10 %에서 40 %로 증가
이동상 유속: 20.0 ml/min
검출기: 자외선 254 nm; ELSD
상기 분리된 화합물에 대하여 NMR 분석 및 질량 분석을 수행하여 데이터를 얻고, 이를 기존 문헌과 비교하여 그 구조를 확인하였다.
구체적으로, 오르니틴(ornithine)의 분자량은 Agilent 1100 고속유체크로마토그래피-질량 분광계(HPLC-ESI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 132로 결정하였으며, 핵자기공명기(Varian 500 ㎒ NMR)를 이용한 1H 및 13C-NMR 스펙트럼(spectrum) 분석을 통하여 그 구조를 하기 화학식 1로 표기되는 오르니틴으로 추정하였다. 또한 NMR 자료를 기존문헌(J.C. MacDonald et al. Can. J. Chem. 1976, 54, 1126-1133)의 자료와 비교하여 그 구조를 동정하였다.
화학식 1
Figure 112017113602555-pat00008
백색 분말; 분자식 C5H12N2O2; ESI-MS: m/z 132 [M-H]-;
1H NMR (500 MHz, D2O): δ 3.94(1H, dd, J = 9.0, 6.5 Hz), 3.23(1H, dt, J = 11.5, 7.0 Hz), 3.14(1H, dt, J = 11.5, 7.0 Hz), 2.16(1H, m), 1.89 (1H, m), 1.82 (2H, m) 13C NMR (125 MHz, D2O) : δ 174.6, 61.1, 45.9, 28.8, 23.6.
피니톨(pinitol)의 분자량은 Agilent 1100 고속유체크로마토그래피-질량 분광계(HPLC-ESI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 194로 결정하였으며, 핵자기공명기(Varian 500 ㎒ NMR)를 이용한 1H 및 13C-NMR 스펙트럼 분석을 통하여 그 구조를 하기 화학식 2로 표기되는 피니톨로 추정하였다. 또한 NMR 자료를 기존문헌(M. Della greca et al. Chem. Biodivers. 2007, 4, 118-128; C. Sridhar et al. Ind. J. Pharm. Sci. 2006, 68, 111-114)의 자료와 비교하여 그 구조를 동정하였다. 하기 화학식 2의 입체구조는 상대적 입체구조(Relative stereochemistry)를 표기한 것이다.
화학식 2
Figure 112017113602555-pat00009
백색 분말; 분자식 C7H14O6; ESI-MS: m/z 193 [M-H]-;
1H NMR (500 MHz, D2O*): δ 3.28(1H, t, J = 9.5 Hz), 3.54(3H, s), 3.59(1H, t, J = 9.5 Hz), 3.70(1H, dd, J = 9.5, 3.0 Hz), 3.75 (1H, dd, J = 9.5, 3.0 Hz), 3.95(1H, m), 3.94 (1H, m), *D2O δ4.79; 13C NMR (125 MHz, D2O): δ 82.6, 72.0, 71.5, 71.3, 70.3, 69.7, 59.6.
뮤코-이노시톨(Muco-inositol)의 분자량은 Agilent 1100 고속유체크로마토그래피-질량 분광계(HPLC-ESI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 180으로 결정하였으며, 핵자기공명기(Varian 500 ㎒ NMR)를 이용한 1H 및 13C-NMR 스펙트럼 분석을 통하여 그 구조를 하기 화학식 3으로 표기되는 대칭형 구조의 이노시톨 유도체로 추정하였다. 또한 본 발명의 뮤코-이노시톨의 NMR 자료는 기존문헌의 NMR 자료와 유사하여 (S.J. An gyal and L. Odier, Carbohydrate Res. 1982, 100, 43-54) 그 구조를 결정하였다. 화학식 3의 입체구조는 상대적 입체구조를 표기한 것이다.
화학식 3
Figure 112017113602555-pat00010
백색 분말; 분자식 C6H12O6; ESI-MS: m/z 179 [M-H]-;
1H NMR (500 MHz, D2O*): δ 3.95 (2H, br t, J = 6.0 Hz), 3.82 (4H, br d, J = 6.0 Hz), *D2O δ4.79; 13C NMR (125 MHz, D2O): δ 72.1, 70.0.
키로-이노시톨(chiro-inositol)의 분자량은 Agilent 1100 고속유체크로마토그래피-질량 분광계(HPLC-ESI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 180으로 결정하였으며, 핵자기공명기(Varian 500 ㎒ NMR)를 이용한 1H 및 13C-NMR 스펙트럼 분석을 통하여 그 구조를 화학식 4로 표기되는 이노시톨로 추정하였다. 또한 본 발명의 키로-이노시톨의 NMR 자료는 기존문헌의 NMR 자료와 유사하여 (R. Abraham et al. Ma gn. Reson. Chem. 2005, 43, 611-624), 그 구조를 결정하였다. 화학식 4의 입체구조는 상대적 입체구조를 표기한 것이다.
화학식 4
Figure 112017113602555-pat00011
백색 분말; 분자식 C6H12O6; ESI-MS: m/z 179 [M-H]-;
1H NMR (500 MHz, D2O*): δ 3.96 (1H, br t, J = 2.5 Hz), 3.96(1H, br t, J = 2.5 Hz), 3.69(1H, br t, J = 2.5 Hz), 3.68(1H, br t, J = 2.5 Hz), 3.53(1H, t, J = 6.5 Hz), 3.51 (1H, t, J = 6.5 Hz). *D2O δ4.79; 13C NMR (125 MHz, D2O): δ 72.6, 71.5, 70.3.
베타인(betaine)은 핵자기공명기(Varian 500 ㎒ NMR)를 이용한 1H 및 13C-NMR 스펙트럼 분석을 통하여 그 구조를 하기 화학식 5로 표기되는 베타인으로 추정하였다. 또한 NMR 자료를 기존문헌(W. Gronwald et al. Anal. Chem. 2008, 80, 9288-9297; D. godzisz et al. J. Mol. Struct. 2002, 606, 123-137)의 자료와 비교하여 그 구조를 동정하였다.
화학식 5
Figure 112017113602555-pat00012
백색 분말; 1H NMR (500 MHz, D2O*): δ 3.85 (2H, s), 3.21(6H, s) *D2O δ4.79; 13C NMR (125 MHz, D2O): δ 169.1, [65.97, 95.94, 95.92], [53.13, 53.16, 53.19].
클로로겐산의 분자량은 Agilent 1100 고속유체크로마토그래피-질량 분광계(HPLC-ESI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 355로 결정하였으며, 핵자기공명기(Varian 500 ㎒ NMR)를 이용한 1H-NMR 스펙트럼 분석을 통하여 그 구조를 화학식 6으로 표기되는 클로로겐산으로 추정하였다. 또한 NMR 자료를 기존문헌(T. Han et al. Chem. Nat. Comp. 2006, 42, 597-570)의 자료와 비교하여 그 구조를 동정하였다.
화학식 6
Figure 112017113602555-pat00013
백색 분말; 분자식 C16H18O9; ESI-MS: m/z 355 [M+H]+;
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δ 7.56 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.05 (1H, d, J = 1.5 Hz), 6.95 (1H, dd, J = 8.0, 1.5 Hz), 6.78 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.27 (1H, d, J = 16.0 Hz), 5.33 (1H, br td, J = 9.5, 3.0 Hz), 4.17 (1H, br m), 3.73 (1H, br dd, J = 9.5, 2.5 Hz), 2.18 (2H, br m), 2.04 (2H, br m).
2. AAMM -분획 4의 주성분 분리 및 동정
실시예 2의 AAMM-분획 1을 감압 농축한 후, 하기한 분리 방법과 같이 HPLC 분리법을 통하여 상기 소분획물을 분리하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 알파-리놀렌산을 분리하였다. 알파-리놀렌산은 AAMM-분획 4 100mg으로부터 25 mg이 수득되었다. 상기 알파-리놀렌산을 분리하는 과정에서 상기 분획 4의 건조중량 대비 각각 약 10 % 수득율로 리놀레인산(linoleic acid)과 팔미트산(palmitic acid)이 추가로 분리되었다.
분리 방법
사용장비: YMC LC-Forte R
컬럼: Phenomenex Luna C-18 RP HPLC 컬럼 (21.2x250 ㎜, 10 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA를 함유한 메탄올
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성:0 분에서 (a)용매:(b)용매 부피비 90:10으로 용출 시작
0 분에서 10분 (a) 용매의 비율을 90%에서 100%로 증가
10 분에서 40분까지 동일비로 용출
이동상 유속: 20.0 ml/min
검출기: 자외선 210 nm; ELSD
분리된 화합물에 대하여 GC-MS 분석과 NMR 분석을 수행하여 데이터를 얻고, 이를 기존 자료와 비교하여 그 구조를 확인하였다.
구체적으로 알파-리놀렌산의 분자량은 GC-MS (가스크로마토그래피-질량분석기)를 이용한 MS 측정을 통하여 278로 결정하였으며, GC-MS Database 검색과 핵자기공명기(Varian 500 ㎒ NMR)를 이용한 1H-NMR 스펙트럼 분석을 통하여 그 구조를 화학식 7로 표기되는 알파-리놀렌산로 추정하였다.
화학식 7
Figure 112017113602555-pat00014
α-리놀렌산
무색오일; 분자식 C18H30O2; ESI-MS: m/z 301 [M+Na]+;
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 0.97 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.30-1.38 (8H, br m), 1.62 (2H, m), 2.06 (4H, m), 2.35 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.81 (4H, br m), 5.31-5.42 (6H, m).
실시예 4: 화학식 1 내지 7의 화합물들로 구성된 혼합물 조제
실시예 1에서 제조된 개똥쑥 추출물 및 실시예 2에서 제조된 개똥쑥 분획물의 유효성분을 규명하기 위하여 실시예 3에서 분리된 단일 화합물들의 일부분 또는 전부를 모 분획물로부터의 수득율과 유사한 조성으로 다시 혼합한 조성물을 조제하였다.
구체적으로, 실시예 3의 1절에서 분리된 화학식 1 내지 6으로 표시되는 6종의 화합물 중 선택된 4 종 이상의 화합물로 구성된 혼합물, 또는 실시예 2절에서 분리된 알파-리놀렌산, 리놀레인산 및 팔미트산을 동량으로 혼합한 조성물을 조제하였다. 또한 화학식 1 내지 6으로 표시되는 6 종의 화합물 중 선택된 4 종 이상의 화합물로 구성된 혼합물에 알파-리놀렌산 또는 이와 유사한 불포화 지방산 또는 식물성 포화지방산 중 1 종 이상의 화합물을 추가하여 혼합물을 조제하였다. 조제한 혼합물의 조성 및 구성은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
표 1은 AAMM-분획 1 및 분획 4로부터 분리된 화합물을 조합한 조합물의 구성 성분 및 조성비를 나타낸다.
단일화합물 혼합물 코드명 및 단일화합물 혼합 조성비(중량비)
이름 코드명 AA-M2 AA-M3 AA-M4 AA-M5 AA-M6 AA-M7 AA-M8 AA-M9 AA-M10
오르니틴 AA-M1-A 1 1 - - 1 1 1 1 1
피니톨 AA-M1-B 8 8 - - 8 8 8 8 8
뮤코-이노시톨 AA-M1-E 1 1 - - - - - 1 1
키로-이노시톨 AA-M1-D 2 2 - - 2 2 2 2 2
베타인 AA-M1-F 4 4 - - 4 4 4 4 4
클로로겐산 AA-M1-J - 2 - 8 - 2 - 2 2
과당 AA-M1-C - - - - - - - - -
α-리놀렌산 AA-M1-H - - 1 1 - - 1.8 2.7 1.8
리놀레산 AA-M1-G - - 1 1 - 4 1.8 2.7 1.8
팔미트산 AA-M1-I - - 1 - - - - - 1.8
시험예 1: 실시예 1로부터 제조된 2종의 추출물 AAM 및 AAMM 의 피부염 완화 효과
본 발명자들은 실시예 1에서 수득한 개똥쑥 디클로로메탄 추출물(AAM) 및 디클로로메탄 추출 후 잔여물의 에탄올 추출물(AAMM)의 피부염 완화 효과를 알아보기 위하여, NC/Nga 아토피성 피부염 마우스 모델 (개체당 체중 30 g의 6주령 수컷, 중앙실험동물)을 구입하여 기류식 무균 실험대에 수용하여 표준 고형사료를 자율급식으로 1 주일간 사육하였다. 모든 시험약물들을 소량의 DMSO에 용해시킨 후 올리브오일로 희석하여 최종 농도를 0.2 %로 하여 시험에 사용하였다. 등의 털을 제모한 후 첫날 0.15 %의 1-플루오로-2,4-디니트로벤젠(1-fluoro-2,4-dinitrobenzene; DNFB)를 도포하고 이어서 5 일째에 0.15 % DNFB 도포 후, 9 일째에 0.2 %의 DNFB를 도포하여, DNFB에 의하여 피부 가려움증과 아토피성 염증을 일으킨 후, 시험 약물을 처리하였다. 구체적으로, 11 일째, 13 일째, 15 일째, 및 17 일째 (즉, 총 4회)에 걸쳐 2 % DNFB와 시험약물을 각각 도포하였다. 그 이후 18F-플루오로데옥시글루코스(Fluorodeoxy glucose: FDG)를 트레이서(tracer)로 하여 PET-CT 이미지와 조직염색 현미경 사진을 DNFB 염증 유발군과 AAM 추출물 처리군, AAMM 추출물 처리군의 상태를 비교하였다.
PET-CT 이미지 확보를 위하여 모든 마우스는 12 시간 물을 제외하고 금식하였다. 마우스들의 꼬리 정맥을 통하여 37 MBq (1.0 mCi)의 18F-FDG를 투여하고 60 분 후 22 분 동안 small animal PET scanner로 방사광 스캔(emission scan)을 수행하였다.?
도 6은 개똥쑥 디클로로메탄 추출물(AAM)과 디클로로메탄 추출 후 잔사를 에탄올로 추출한 개똥쑥 에탄올 추출물(AAMM)을 쥐의 염증부위에 처리한 후 18F-FDG를 트레이서로 이용한 PET-CT 이미지를 나타낸다. 도 6에서, A 및 B는 각각 수평면상(transaxial plane) 이미지 및 관상면상(coronal plane) 이미지를 나타낸다.
도 7은 개똥쑥 추출물 AAM 및 AAMM을 쥐의 염증부위에 처리한 후 조직의 변화를 나타낸 현미경 사진이다. 도 7에서, A, B 및 C는 각각 Hematoxylin 및 Eosin (H&E) 염색을 통한 조직병리(histopathology) 현미경 사진 (배율 x200) 및 토끼 모노클로날 일차 케라틴 10 폴리클로날 항체를 이용한 면역조직화학 현미경 사진 (배율 x200), 및 토끼 모노클로날 일차 물질(substance) P를 이용한 면역조직화학 현미경 사진 (배율 x200)이다.
PET-CT 이미지 조건:
Field-of-view(FOV) 38mm
Energy window 350 내지 650 keV
Algorithm/reconstruct OSEM 2D/iteratioin (2 times), subset: 8
Matrix size (mm) 128 x 128
Scan Time (분) 22 분
P.I time (분) 60 분
RI/Activity (uCi) 18F/ 1mCi
Focal spot size 50 ㎛
X-ray detector pixel 2,048 x 3,072
80 kV, 500 μA, 3600 of 200 projections rotation, Cone-beam Filter
PET-CT 스캔 이후에 마우스의 피부 세포를 취하여 4 % 파라포름알데히드(pH 7.4)로 고정하였고, 조직 시료를 5 um의 두께로 세절하여 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색한 후 광학현미경으로 조직을 관찰하였다.
또한, 면역조직화학법(immunohistochemistry)을 통한 조직 변화 관찰을 위하여 10 um 두께의 조직 절편을 인산완충식염수(PBS)내 3 % 태아소혈청(fetal bovine serum)에서 1 시간 내로 인큐베이션하였다. 절편에 토끼 모노클로날 일차성 케라틴 10 폴리클로날 항체 (1:100 희석, Covance, USA) 또는 토끼 모노클로날 일차성 물질 P 항체 (1:100 희석, Abcam, USA)를 가한 후 밤새 인큐베이션하였다. 각 시료는 PBS에서 3번 세척하고 Vectastain ABC 시약과 함께 인큐베이션한 후에 DAB (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride, Vector laboratories, USA)와 반응시켰다.
표 2는 약물 처치 부위에서의 Radio-isotope 18F-FDG 섭취 밀도(uptake density: UD)를 보여준다.
약물군 0.2% DNFB AAM (0.2%) AAMM (0.2%)
UD 9.71 2.40 0.17
표 2 및 도 6과 도 7에 기재된 바와 같이, 디클로로메탄에 의한 추출로써 아르테미시닌 및 아르테아누인 B 등의 세스퀴테르펜 락톤 성분들이 제거된 개똥쑥 에탄올 추출물(AAMM)은 DNFB에 의하여 유발되는 아토피성 염증과 가려움증을 현저하게 완화하는 효능이 있음을 확인할 수 있었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 염증유발군 (0.2 % DNFB) 및 AAM 처리군(0.2 %)은 염증부위의 18F-FDG의 세포내 축적으로 인하여 PET-CT 이미지에서 적색(밝게 나타난 부분의 주변부)으로 표시된다. 반면, AAMM 처리군의 경우는 약물적용 부위에서 세포 염증반응이 거의 없어 18F-FDG의 세포내 축적으로 인한 적색이 관찰되지 않고 푸른색(상기 적색 부분외 부분)으로만 관찰되었다. 18F-FDG PET는 정상세포에 비해 포도당 대사의 항진으로 인하여 염증조직의 세포 또는 악성 종양세포를 영상화함으로써 악성종양과 염증의 감별진단, 개선 여부의 확인 및 치료에 대한 반응평가 등에 널리 이용된다. 이러한 염증 또는 악성종양 조직에서의 FDG 세포내 축적 증가는 FDG가 포도당과 유사하게 포도당 수송단백질(glucose transporter protein)에 의해 세포로 이동하고 세포 내에서 헥소키나제에 의해 인산화되지만, 포도당과는 달리 인산화된 FDG인 FDG-6-포스페이트는 더 이상 대사되지 못하기 때문에 발생한다. 또한 매우 강한 극성물질인 FDG-6-포스페이트가 세포 밖으로 역확산되지 못함으로써 높은 FDG 축적량을 보이게 된다.
도 7A에 나타낸 바와 같이, 염증을 일으킨 조직의 절편을 H&E 염색 후 조직절편을 현미경으로 관찰한 결과 염증유발군(0.2 % DNFB) 및 AAM 처리군(0.2 %)에서는 표피에서 진한 청색(보다 어두운 색)으로 길죽한 모양의 가시세포층 또는 원형의 염증반응 세포들이 많이 관찰되었다. 반면, AAMM 처리군(0.2 %)의 경우는 비교적 깨끗한 표피조직이 관찰되었다.
도 7B는 염증을 일으킨 조직에서 각질의 케라틴을 선택적으로 염색한 사진으로써, 염증유발군(0.2 % DNFB) 및 AAM 처리군(0.2 %)에서는 표피면에서 진한갈색(보다 어두운 색)층으로 염색된 많은 케라틴을 관찰할 수 있었다. 그러나 AAMM 처리군(0.2 %)의 경우는 정상적인 피부조직의 모양으로 표피면에서만 매우 얇은 케라틴 층이 관찰되었다.
도 7C는 염증을 일으킨 조직에서 염증반응과 가려움증을 유발하는 물질로 알려진 물질 P를 선택적으로 염색한 사진으로써, 염증유발군(0.2 % DNFB) 및 AAM 처리군(0.2 %)에서는 표피면에서 진한갈색층(보다 어두운 색)으로 염색된 많은 물질 P를 관찰할 수 있는 반면, AAMM 처리군(0.2 %)의 경우는 정상적인 피부조직의 모양으로 물질 P가 거의 없거나 매우 적은 것으로 확인되었다.
시험예 2: 실시예 2로부터 분획물들의 피부염 완화 효과
본 발명자들은 실시예 1에서 수득한 디클로로메탄 추출 후 잔여물의 에탄올 추출물(AAMM) 및 실시예 2에서 AAMM으로부터 제조된 4종류의 분획물 AAMM-분획1, AAMM-분획 2, AAMM-분획 3 및 AAMM-분획 4의 피부염 완화 효과를 스테로이드성 소염제인 데사메타손의 효능과 비교하여 알아보기 위하여, NC/Nga 아토피성 피부염 마우스 모델 (개체당 체중 30 g의 6주령 수컷, 중앙실험동물)을 구입하여 기류식 무균 실험대에 수용하여 표준 자율급식하며 1 주일간 사육하였다. 염증 유발과 약물처치는 시험예 1에서와 동일한 방법으로 수행하였다. 시험약물들은 소량의 DMSO에 용해시킨 후 올리브오일로 희석하여 최종 농도를 0.2 %로 하여 시험에 사용하였다. 실험동물모델은 약물 대신 올리브오일만 도포한 대조군, 0.2 % DNFB 처치를 통한 피부염 유발 음성대조군(DNFB), 염증유발 부위에 0.2 % 덱사메타손을 적용한 양성 대조군(덱사메타손), 0.2 % AAMM을 적용한 비교군(AAMM), 및 상기 4종의 분획물을 각각 염증유발 부위 피부에 0.2 % 용량으로 적용한 약물 처리군으로 분류하였다. 약물처리는 11일째, 13일째, 15일째, 및 17일째 (즉, 총 4회)에 0.2 % DNFB와 비교약물 및 시험약물을 각각 도포하였다. 그 이후 상기 실시예 1에서의 방법과 동일하게 마우스의 피부 세포를 취하여 4 % 파라포름알데히드(pH 7.4)로 고정하였고, 조직 시료들을 5 um의 두께로 세절(section)하여 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)로 염색한 후 광학현미경으로 조직을 관찰하였다.
또한 콜라겐의 발현과 분포 정도는 피크로시리우스-레드(Picrosirius-Red) 염색 염색을 통해 염증 유발과 약물처리 부위의 조직 절편에서 적색으로 염색된 콜라겐을 현미경으로 관찰하였다. 각 실험군의 염증 정도와 개선 여부를 알아보기 위하여, DNFB 염증 유발군과 사진을 통하여 대조군, DNFB 처리군, 덱사메타손 처리군, AAMM 처리군 및 분획물 처리군의 상태를 비교하였다.
도 8은 DNFB, 덱사메타손, AAMM, AAMM-분획 1, 2, 3 및 4를 쥐의 염증부위에 처리한 후 조직의 변화를 H&E 염색을 통하여 나타낸 조직병리 현미경 사진이다 (배율 x200).
도 8에 나타낸 바와 같이, 염증을 일으킨 조직의 절편을 H&E 염색 후 조직절편을 현미경으로 관찰한 결과 정상조직(Control)에 비하여 염증유발군(0.2 % DNFB)에서는 표피면에 적색으로 염색된 두터운 케라틴층(보다 짙은 색의 층)과 길쭉한 형태의 가시세포증(Acnathosis) 및 표피층에서의 형태가 무너지고 진한 청색으로 염색된 많은 염증반응 세포(염색된 케라틴 층 아래로 이어지는 많은 작은 점(dots), 및 큰 둥근 형태의 집단)들이 관찰되었다. 반면, 덱사메타손과 AAMM 처리군에서는 표피면의 케라틴이 얇게 분포하고 가시세포증과 염증세포들이 매우 적은 수로 관찰되어서 염증 증상이 매우 호전되었다. AAMM-분획 1 또는 AAMM-분획 4 처리군들은 표피에서 진한 청색으로 길게 늘어진 모양의 가시세포증들이 관찰되어 덱사메타손과 AAMM 처리군보다 효능이 약했지만 케라틴이 비교적 얇게 분포하고 염증세포들이 거의 없는 등 AAMM-분획 2 또는 AAMM-분획 3에 비하여 상대적으로 우수한 효능을 나타내었다. 한편, AAMM-분획2 처리군에서는 염증 반응이 많이 관찰되었고, AAMM-분획 3 처리군은 케라틴이 비교적 얇게 분포하고 가시세포증들이 적게 관찰되어 염증 반응은 적었으나 콜라겐층 파괴가 두드러져 다소 약한 효능이 관찰되었다.
도 9는 DNFB, 덱사메타손, AAMM, AAMM-분획 1, 2, 3 및 4를 쥐의 염증부위에 처리한 후 조직의 변화 중 콜라겐 분포를 나타낸 피크로사리우 레드(Picrosirius Red) 염색 조직 절편의 현미경 사진이다 (배율 x100).
도 9에 나타낸 바와 같이, 염증유발군 (0.2 % DNFB)에서는 콜라겐의 분포가 무너져 있는 형태가 관찰되었고 덱사메타손(0.2 %)과 AAMM(0.2 %) 처리군에서는 치밀하게 콜라겐이 분포하고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, AAMM-분획 1 처리군 또는 AAMM-분획 4 처리군에서도 치밀한 콜라겐 분포가 관찰되었으나 AAMM-분획 2 처리군 또는 AAMM-분획 3 처리군에서는 표피층에서 다소 치밀하지 않은 콜라겐의 분포나 불규칙적인 공간의 분포가 관찰되어 콜라겐이 규칙적인 분포가 다소 무너져 있는 형태를 확인하였다.
표 3은 조직염색법으로 측정한 실시예 1의 개똥쑥 에탄올 추출물 및 실시예 2의 분획물의 항목별 생리활성 비교한 것으로서, 상기 현미경을 통한 조직 관찰을 지수화하여 항목별로 효능의 강도를 비교하여 나타낸 것이다.
항목 대조군 DNFB DM AAMM 분획 1 분획 2 분획 3 분획 4
Hyperkeratosis 0 3 1 1 1 2 1 1
Acanthosis 0 3 1 0 2 3 1 1
Number of inflammatory cells 0 3 0 0 0 3 1 1
Collagen 0 3 0 0 0 3 2 0
Score: None=0, Mild=1, Moderated=2, Severe=3
Hyperkeratosis: 각질증식, Acanthosis: 가시세포증,
Number of inflammatory cells: 염증성 세포수, Colla gen: 콜라겐 파괴
Control: DNFB 미처리 비염증군
DNFB: 0.2 % 1-플루오로-2,4-디니트로벤젠, 염증 유발 약물
DM: 0.2 % Dexamethaxone, 양성 대조군
AAMM: 실시예 1로부터 제조된 디클로로메탄 추출 후 잔여물에 대한 에탄올 추출물 (0.2 %)
분획1: 실시예 2로부터 제조된 20 % 에탄올 분획화 용매의 고극성 분획물 (0.2 %), AAMM-분획 1,
분획 2: 실시예 2로부터 제조된 40 % 에탄올 분획화 용매의 중간극성 분획물 (0.2 %), AAMM-분획 2,
분획 3: 실시예 2로부터 제조된 60 % 에탄올 분획화 용매의 중간극성 분획물 (0.2 %), AAMM-분획 3,
분획 4: 실시예 2로부터 제조된 100 % 에탄올 분획화 용매의 저극성 분획물 (0.2 %), AAMM-분획 4.
상기 결과를 통하여, AAMM은 스테로이드성 피부염 치료제인 덱사메타손과 동이한 용량에서 덱사메타손과 동일한 수준의 염증 치료 효능을 나타내었고, AAMM 추출물로부터 제조된 AAMM-분획 1 및 AAMM-분획 4는 덱사메타손과 동일한 용량에서 덱사메타손이나 AAMM에 비하여 다소 약하기는 하나 현저한 피부염증 치료 효능을 나타내었다.
시험예 3: 실시예 1로부터 제조된 AA 추출물 및 실시예 2로부터 제조된 AAMM-분획 1+4 분획의 피부염 완화 효과
시험예 2에서 AAMM-분획 1 및 AAMM-분획 4의 각 효능이 모추출물인 AAMM의 효능보다 다소 약한 이유를 확인하기 위하여, AAMM 추출물로부터 제조된 수득율에 따라 AAMM-분획 1 및 AAMM-분획 4를 중량비 9:1로 혼합한 분획물 AAMM-분획 1+4를 조제하여 덱사메타손과 AAMM의 효능과 비교하였다. 또한 AAMM 추출물 제조의 중요성을 다시 한번 검증하기 위하여 실시예 1의 3절에서 제조된 AAMM 추출물과 AAM 추출물의 성분 대부분을 포함할 수 있는 AA 추출물의 효능을 AAMM 추출물의 효능과 비교하였다. 모든 약물의 농도는 0.2 %로 하였고 동물모델 확보와 약물처치는 상기 시험예 1에서의 방법과 동일하게 수행하였다. 약물 처치 2주 후에 18F-FDG를 트레이서로 하여 IVIS® Spectrum animal ima gin g system을 활용한 FDG 섭취(uptake) ROI (Regions of Interest) 값을 계산하여 (표 4) 각 시료들의 효능을 비교하였다. PET-CT 이미지 확보를 위하여 모든 마우스는 12 시간 물을 제외하고 금식하였다. 마우스들의 꼬리 정맥을 통하여 37 MBq (1.0 mCi)의 18F-FDG를 투여하고 60 분 후 30 분 동안 이미지 스캔을 수행하였다.
표 4는 IVIS® Spectrum animal ima gin g system을 활용한 FDG 섭취 ROI 값에 따른 실시예 3의 개똥쑥 총 에탄올 추출물 (AA), 실시예 2의 분획1 및 분획4의 혼합물 (분획1+4, 혼합비율 9:1), 및 관련 시험시료들의 피부염 완화 효능 비교 (모든 약물의 농도는 0.2 %)한 것을 나타낸 것이다. (단위: Value of ROI, x 105)
항목 대조군 DNFB DM AA AAMM 분획 1+4
약물투여 2 주후 ROI 6 25 11 22 13 12
대조군: DNFB 미처리 비염증군
DNFB: 0.2 % 1-Fluro-2,4-dinitrobenzene, 염증 유발 약물
DM: 0.2 % Dexamethaxone, 양성 대조군
AA: 실시예 3으로부터 제조된 개똥쑥의 건조물을 바로 에탄올로 추출한 에탄올 추출물 (0.2 %)
AAMM: 실시예 1로부터 제조된 디클로로메탄 추출 후 잔여물에 대한 에탄올 추출물 (0.2 %)
분획1+4: 실시예 2로부터 제조된 20 % 에탄올 분획화 용매의 고극성 분획물(AAMM-분획1)과 저극성 분획물 (AAMM-분획4)를 9:1의 비율로 혼합한 시료 (0.2 %)
표 4에 나타낸 바와 같이, 염증유발 영역에서의 FDG의 세포내 축적 수준을 나타내는 ROI 값이 덱사메타손 처리군과 AAMM 처리군에서 DNFB 염증유발군에 비하여 크게 감소하였다. 반면, AA 추출물은 효능이 약한 것으로 확인되어 본 발명의 AAMM 추출물 제조방법이 개똥쑥의 피부염증과 같은 피부질환 개선 효능에 매우 중요하게 작용한다는 사실을 다시 한번 확인할 수 있었다. 또한 AAMM 분획 1+4 효능은 AAMM 추출물의 효능 수준을 나타내어 AAMM 분획 1과 AAMM 분획 4를 혼합하여 사용하는 경우 모추출물의 우수한 효능을 보인다는 사실을 확인하였다. 따라서 본 발명의 피부질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 하나의 작용기전을 나타내는 단일 화합물 또는 단일 분획물로서가 아니라 각기 다른 작용기전의 물질들이 복합적으로 작용하여 덱사메타손과 대등한 우수한 효능을 나타내는 것으로 판단된다.
또한 상기 ROI 값의 신뢰성을 검증하기 위하여 실시예 1에서의 방법과 동일하게 대조군, DNFB 염증유발군, AA 추출물 처리군 및 AAMM-분획 1+4 처리군에 해당하는 마우스들의 피부 세포를 취하여 4 % 파라포름알데히드(pH 7.4)로 고정하였고, 조직 시료들을 5 um의 두께로 세절하여 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)로 염색한 후 광학현미경으로 조직을 관찰하였다 (도 10의 위). 또한 콜라겐의 발현과 분포 정도는 피크로시리우스-레드(Picrosirius-Red) 염색 염색을 통해 염증 유발과 약물처리 부위의 조직절편에서 적색으로 염색된 콜라겐을 현미경으로 관찰하였다 (도 10의 아래).
도 10의 위 도면에서와 같이, 염증을 일으킨 조직의 절편을 H&E 염색 후 조직절편을 현미경으로 관찰한 결과, 정상조직(Control)에 비하여 염증유발군(0.2 % DNFB)과 AA 추출물 처리군에서는 표피면에 상대적으로 두터운 케라틴층(표피 가장 외곽의 보다 짙은 색)과 표피층에서 가시세포증(Acnathosis)과 염증세포들이 관찰되었다. 반면, AAMM-분획 1+4 처리군에서는 표피면의 케라틴이 얇게 분포하고 가시세포증이 거의 나타나지 않았고 염증세포들이 매우 적은 수로 관찰되었다.
도 10의 아래 도면에서와 같이, 염증을 일으킨 조직에서 콜라겐을 적색으로 염색하여 콜라겐의 분포를 나타낸 결과, 염증유발군 (0.2 % DNFB)과 AA 추출물 처리군에서는 표면층 바로 아래에서 콜라겐의 분포가 무너져 있는 형태가 관찰되거나 표피층에 콜라겐 치밀도가 매우 떨어지는 형태가 관찰되었고 AAMM-분획 1+4 처리군에서는 표피층에서 치밀한 콜라겐 분포가 관찰되었다.
시험예 4: 실시예 4로부터 제조된 본 발명의 단일화합물들의 혼합물의 인 비트로 오토파지 유도 활성
시험예 2에서 분획 1 분획과 분획 4의 효능이 모추출물인 AAMM의 효능보다 다소 약한 이유를 다시 한번 확인하고 본 발명의 단일화합물들을 단독으로 사용하는 것에 비하여 복합조성물의 형태로 활용하는 유효성을 검증하기 위하여, 인간 피부 각질형성세포주인 HaCaT 세포에 대한 실시예 3에 개시된 단일화합물들의 생리활성과 실시예 4에 개시된 실시예 3의 단일화합물의 조성별 혼합물의 인 비트로 오토파지 유도 활성을 비교하였다.
HaCaT 세포는 10 % 태아소혈청 (FBS)와 0.1 % 항생제(penicillin, Streptomycin)를 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle`s medium(DMEM, Hyclone, Utah, US) 배지에 배양하여 실험에 사용하였다. 세포는 37 ℃, 5 % 이산화탄소의 습윤화된 배양기에서 적응시켜 배양하였다.
오토파지 유도활성 측정에 앞서 시료들이 시험에 사용하는 세포에 독성이 있는지를 측정하기 위하여 MTT 분석을 이용한 세포독성 측정을 수행하였다. HaCaT 세포를 96 well plate에 4×104 cell/㎖의 농도가 되도록 조절하여 분주하고 24 시간 배양하여 부착화 및 안정화를 시행하였다. 24 시간의 배양이 끝난 후 각 화합물 또는 혼합물들의 최종농도가 10, 50 및 100 ㎍/㎖이 되게 배양액에 희석하여 부착 및 안정화된 세포주에 공급하고 24 시간 배양하였다. 24 시간 배양 후 배지를 제거하였고 MTT 용액(0.5 ㎎/㎖ in PBS) 100 ㎕씩을 가해주고 다시 37 ℃와 5 % 이산화탄소의 습윤 배양기에서 30 분 동안 반응하여 MTT가 환원되도록 하였다. 각 웰에 생성된 포르마잔(formazan) 결정을 DMSO 200 ㎕로 잘 녹여서 microplate reader (Bio-Rad, USA)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하여 약물 미처리군(Ne gative Control) 대비 세포생존율(Cell Viablity)를 측정하였다.
HaCaT 세포주에 대한 시험시료들의 MTT 세포독성을 측정한 결과, 시험에 사용한 농도에서 모든 단일화합물 및 혼합물들은 80 % 이상의 세포생존율을 나타내어 모든 시험시료들이 주목할만한 세포독성은 없는 것으로 확인되었다.
오토파지 유도활성을 측정하기 위하여, HaCaT 세포를 60 mm 배양 접시에 분주하여 부착시킨 다음 배양하였다. 24 시간의 배양 후 비교약물인 라파미신은 최종농도가 250 nM이 되도록 배양액에 희석하였고 각 화합물 또는 혼합물들의 최종농도가 1 또는 10 ㎍/㎖이 되게 배양액에 희석하여 부착 및 안정화된 세포주에 공급하고 12 시간 배양하였다. 이 후 배양된 세포를 회수하여 RIPA 용해완충액을 첨가한 후 용해시키고, 12,000 rpm에서 30 분 동안 원심 분리 후 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질을 Bradford법(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)으로 정량하였으며, 정량한 단백질은 SDS-PA GE로 12 % 아크릴아미드 겔에 전기영동하고 니트로셀룰로스 막에 옮겼다. 니트로셀룰로스 막을 일차 항체 anti-LC3에 하루 동안 4 ℃에서 반응시킨 후, TBS-T로 10 분간 3회 세척한 후 상기 막을 2차 항체(horseradish peroxidase-linked(HRP))로 1 시간 반응시켰다. 항체와 발현이 끝난 뒤 TBS-T 용액으로 세척 후 enhanced chemiluminescence(ECL) Western Blot rea gents(GE Healthcare, Chalfont St. giles UK)로 반응시켜 Chemidoc system(Bio-rad, USA)으로 확인하였으며, 오토파지 측정 마커인 LC3B 발현정도와 LC3A와 LC3B의 비율을 비교 분석하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단일화합물 각각은 양성 대조군으로 사용된 오토파지 약물인 라파미신(Rapamycin) (농도 250 nM) 수준 또는 그 이하의 LC3B 발현량 증가 활성(오토파지 활성 지표)을 나타낸 반면, 알파-리놀렌산을 포함한 불포화지방산과 포화지방산 헥사데카노인산의 혼합물인 AA-M4 조성물(1㎍/ml, 10 ㎍/ml 농도)과, 클로게닌산과 불포화지방산의 혼합물인 AA-M5 조성물 (1 ㎍/ml 농도), '오르니틴'-'피니톨'-'키로-인노시톨'-'베타인'의 혼합물인 AA-M6 조성물 (1 ㎍/ml 농도) 및 상기 7종의 단일화합물을 모두 혼합한 AA-M9 조성물과 AA-M10 조성물(1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 농도)들이 라파미신 활성의 1.5배 이상의 현저한 오토파지 피부세포 보호 작용을 나타내었다. 상기 생리활성 시료 중 AA-M9과 AA-M10 조성물이 비교적 우수한 LC3B 발현 정도를 나타내었고 LC3A의 발현정도 대비 LC3B의 발현량으로 보았을 때도 AA-M9(1 ㎍/ml 농도)과 AA-M10(1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml 농도) 조성물이 자가포식체(autophagosome) 형성을 가장 많이 유도함을 확인할 수 있었다.
시험예 5: 실시예 4로부터 제조된 본 발명의 단일화합물들의 혼합물의 피부염 완화 효과
시험예 4에서 비교적 우수한 인 비트로 오토파지 유도 활성을 나타낸 조성물들의 인 비보 피부염 개선 효능을 검증하기 위하여 DNFB 유도 피부염 마우스 모델에서 시험예 4에서 생리활성 시료 중 AA-M6 조성물과 AA-M9 조성물의 효능을 DMSO에 0.3 %의 농도로 측정하였다. 비교군으로는 상기 시험예 4에서 혼합물들 중 상대적으로 약한 정도의 생리활성을 나타낸 AA-M7 조성물(0.3 % 농도 in DMSO)과 양성 대조군으로써 덱사메타손(0.15 % 농도 in DMSO)을 사용하였다. 또한 어떠한 용매나 약물도 처리하지 않은 대조군(Control)과 DNFB와 DMSO 용매만 처리한 대조군(Solvent Control)의 효능도 측정하여 시험군을 효능을 비교 확인하였다.
상기 시료들의 효능을 측정하기 위하여 NC/Nga 아토피성 피부염 마우스 (개체당 체중 30 g의 6주령 수컷, 중앙실험동물) 모델을 구입하여 기류식 무균 실험대에 수용하여 자율급식하며 1주일간 사육하였다. 모든 시험약물들은 소량의 DMSO에 용해시켜 최종 농도를 0.3 %로 하여 시험에 사용하였고 양성대조군인 덱사메타손은 DMSO에 용해시켜 0.15 %의 농도로 사용하였다. 각 대조군 및 시험군은 4마리의 마우스로 구성하였다. DNFB에 피부 가려움증과 아토피성 염증을 일으키기 위해 등의 털을 제모한 후 첫날 아세톤-올리브유(부피비 3:1) 혼합용매에 용해시킨 0.15 % 농도의 DNFB를 도포하고 5일째 다시 0.15 % DNFB 도포 후, 9일째에 0.2 %의 DNFB를 도포한 후 시험약물을 처치하였고 30일째까지 이틀마다 0.2 %의 DNFB를 도포한 후 시험약물을 처치하였다. 그 이후 실시예 1에서의 방법과 동일하게 마우스들의 피부세포를 취하여 4 % 파라포름알데히드(pH 7.4)로 고정하였고, 조직 시료들을 5 um의 두께로 세절하여 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)로 염색한 후 광학현미경으로 조직을 관찰하였다 (도 12). 도 12는 DNFB 도포를 통하여 염증을 일으킨 부위에 AA-M6 조성물과 AA-M9 조성물을 처리하고, 피부조직의 절편을 H&E 염색 후 조직절편을 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12에서, A, B, C, D, E, 및 F는 0.2% DNFB를 처리한 마우스, 0.2% DNFB 도포 후 DMSO 용매만 처리한 마우스, 양성대조군, 0.2% DNFB 도포 후 0.15% 덱사메타손을 처리한 마우스, 0.2% DNFB 도포 후 0.3% AA-M6 조성물을 처리한 마우스, 0.2% DNFB 도포 후 0.3% AA-M7 조성물을 처리한 마우스, 및 0.2% DNFB 도포 후 0.3% AA-M9 조성물을 처리한 마우스를 각각 나타낸다. 도 12는 각 그룹별 4 마리 마우스 각각의 H&E 염색 조직병리 현미경 사진을 나타낸 것이다
도 12의 A 및 B에서 나타낸 바와 같이, 정상조직(Control)에 비하여 염증유발군 (0.2 % DNFB)과 DNFB 및 DMSO 처리군에서는 표피면에 상대적으로 두터운 케라틴층과 표피층에서 가시세포증(Acnathosis)과 염증세포들이 표피부위에서 상대적으로 진한 푸른색 라인이나 작은 반점들의 집합체로 관찰되었다. 도 12의 C에 나타낸 바와 같이, 양성대조군인 덱사메타손 처리군에서는 표피면의 케라틴이 얇게 분포하고 가시세포증이 거의 나타나지 않았고 염증세포들이 매우 적은 수로 관찰되어 염증과 가려움증이 매우 호전된 조직형태를 관찰할 수 있었다. 시험약물군의 경우는, 도 12의 D(AA-M6 처리군) 및 E(AA-M7 처리군)에 나타낸 바와 같이, 덱사메타손 처리군에 비해서 두터운 케라틴 층과 그 바로 아래쪽에서 가시세포증 양상이 관찰되어 약한 효능을 나타낸 반면, 도 12의 F에서와 같이 AA-M9 처리군은 비교적 얇게 분포하는 케라틴 층과 적은 가시세포증이 관찰되어 AA-M6와 AA-M7에 비하여 우수한 염증 증상 호전 효과를 나타내었다.
시험예 6: 에틸아세테이트 추출물 및 에틸아세테이트 추출 후 남은 잔사의 에탄올 추출물의 효능
실시예1의 4절 "4. 용매를 달리한 추출물의 제조"에 따라 한국산 개똥쑥의 에틸아세테이트 추출물(이하 'AAE1'라 함) 및 에틸아세테이트 추출 후 남은 잔사를 90% 에탄올로 추출한 90% 추출물(이하 'AAEM1'라 함)을 얻었다.
다음으로, AAE1 및 AAEM1 추출물의 존재하에서 피부각질세포 HaCaT 세포주를 배양하고, 항염증 지표인 인터루킨-1β(IL-1β)의 수준을 측정하였다.
시료들이 시험에 사용하는 세포에 독성이 있는지를 측정하기 위하여 MTT 분석을 이용한 세포독성 측정을 수행하였다. HaCaT 세포를 96 well plate에 3×104 cell/㎖의 농도가 되도록 조절하여 분주하고 24 시간 배양하여 부착화 및 안정화를 시행하였다. 24 시간의 배양이 끝난 후 추출물을 10, 50, 및 100 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고 24 시간 CO2 배양기에 배양하였다. 24 시간 배양 후 배지를 제거하였고 MTT 용액(0.5 ㎎/㎖ in PBS) 100 ㎕씩을 가해주고 다시 37 ℃와 5 % 이산화탄소의 습윤 배양기에서 1 시간 동안 반응하여 MTT가 환원되도록 하였다. MTT 시약 제거 후, DMSO 200 ㎕로 잘 녹여서 microplate reader (Bio-Rad, USA)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하여 약물 미처리군(Negative Control) 대비 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, 시험에 사용한 농도에서 모든 추출물이 80 % 이상의 세포생존율을 나타내어 모든 시험 시료들이 주목할만한 세포독성은 없는 것으로 확인되었다.
IL-1β분비량 측정을 위해 HaCaT 세포를 6×104/mL로 48 well에 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 추출물을 농도별로 처리하고 한 시간 뒤에 TNF-α(10 ng/mL)와 IFN-γ(10 ng/mL)로 활성화시킨 후 24 시간 동안 CO2 배양기에 배양하였다. 배양액을 얻어 ELISA KIT를 통해 제조사의 지시에 따라 ELISA를 시행하였다. Cytokine 분비량은 450 nm 파장에서 마이크로 스펙트로포토미터로 분석하였다.
도 22는 AAE1 및 AAEM1 추출물이 세포에서 IL-1β의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 22에 나타낸 바와 같이, AAEM1 추출물은 AAE1 추출물에 비하여 IL-1β의 발현을 현저하게 감소시켜 항염증 작용이 있었다. 도 22에서, Ctrl은 음성 대조군으로서, 배지만을 사용한 것이며, TNF-a/INF-r은 양성 대조군으로서 배지 중에서 TNF-α/INF-r를 각각 10 ng/ml의 농도로 첨가한 것이다.
또한, AAE1 및 AAEM1 추출물의 존재하에서 피부각질세포 HaCaT 세포주를 오토파지 유도 조건에서 배양하고, 오토파지 마커인 LC3의 수준을 측정하였다. 배양은 시험예 4에서, 상기 추출물 10 ug/ml을 배지 중에 포함하는 것을 제외하고 오토파지 분석을 위하여 HaCAT 세포를 배양한 것과 동일한 조건에서 수행하였다. LC3의 측정은 웨스턴 블롯에 의하여 수행하였다.
도 23은 AAE1 및 AAEM1 추출물이 세포에서 LC3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 23에 나타낸 바와 같이, AAEM1 추출물은 AAE1 추출물에 비하여 LC3의 발현을 현저하게 증가시켜 세포보호 작용이 있었다. 도 23에서, Ctrl은 음성 대조군으로서, 배지만을 사용한 것이다. Tub는 tubulin으로 LC3 수준 측정을 위한 기준값을 나타낸다.

Claims (20)

  1. 개똥쑥 식물체(Artemisia annua)를 저극성 용매에 접촉시켜 상기 저극성 용매 중에 개똥쑥 식물체 성분을 추출시키는 단계;
    상기 접촉 후 얻어진 혼합물로부터 상기 저극성 용매를 제거하고 잔여물을 얻는 단계; 및
    상기 잔여물을 친수성 용매에 접촉시켜 상기 개똥쑥 식물체 성분을 상기 친수성 용매 중에 추출시키는 단계를 포함하는 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법으로서,
    상기 저극성 용매는 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C6의 알칸, 알켄, 또는 알킨, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C5 내지 C12의 시클로알칸, 또는 시클로알켄, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C5의 알킬을 갖는 알킬아세테이트, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C12의 에테르, 또는 케톤, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C6의 설폭시드, 아세토니트릴, 테트라히드로퓨란, 액체 이산화탄소, 또는 이들의 조합이고,
    상기 치환기는 F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고,
    상기 친수성 용매는 C1 내지 C6의 알코올, 물 또는 이들의 조합인 것인 방법에 따라 제조된 개똥쑥 식물체 추출물을 포함하는, 개체의 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 저극성 용매는 세스퀴테르펜 락톤(sesquiterpene lactone)이 용해 또는 추출될 수 있는 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 저극성 용매는 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C6의 알칸, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C5 내지 C12의 시클로알칸, 비치환된 C1 내지 C5의 알킬을 갖는 알킬아세테이트, 비치환된 C1 내지 C12의 에테르, 또는 케톤, 액체 이산화탄소, 또는 이들의 조합인 것이고, 상기 치환기는 청구항 1에 정의된 바와 동일한 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 친수성 용매는 오르니틴(ornithine), 피니톨(pinitol), 뮤코-이노시톨(muco-inositol), 키로-이노시톨(chiro-inositol), 베타인(betaine), 클로로겐산(chlorogenic acid), α-리놀렌산(α-linolenic acid), 리놀레산(linoleic acid), 및 팔미트산(palmitic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 용해 또는 추출시킬 수 있는 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 저극성 용매는 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C3의 알칸인 것이고, 상기 치환기는 청구항 1에 정의된 바와 동일한 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 상기 추출물을 분획화 용매에 접촉시켜 분획화하는 단계를 더 포함하는 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 분획화는 크로마토그래피 매질에 상기 추출물을 접촉시켜 결합시키고 분획화 용매로 용출시키는 단계를 포함하는 것인 조성물.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 분획화 용매는 친수성 용매로서, 상기 친수성 용매는 물, C1 내지 C6의 알코올, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 저극성 용매는 디클로로메탄, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 아세톤, 액체 이산화탄소, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 분획화는 분획화 용매 총 부피에 대하여 20 이상 내지 40 미만, 40 이상 내지 60 미만, 60 이상 내지 100 미만, 및 100 부피%의 알코올로 용출하는 것인 조성물.
  11. 삭제
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 세스퀴테르펜 락톤을 0.01 %(w/w) 이하로 포함하거나, 또는 포함하지 않는 것인 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 오르니틴, 피니톨, 뮤코-이노시톨, 키로-이노시톨, 베타인, 및 클로로겐산으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상을 포함하는 것인 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 추출물은 리놀레산, 팔미트산, 및 α-리놀렌산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것인 조성물.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 상기 추출물을 분획화 용매에 접촉시켜 분획화하는 단계를 더 포함하고, 상기 분획화는 분획화 용매 총 부피에 대하여 20 이상 내지 40 미만, 40 이상 내지 60 미만, 60 이상 내지 100 미만, 및 100 부피%의 알코올로 용출하는 것으로서,
    상기 추출물은 분획화 용매 총 부피에 대하여 알코올이 20 이상 내지 40 미만 부피%인 용매에 의해 분획된 분획물 및 100 부피%인 용매에 의해 분획된 분획물의 조합인 조성물.
  16. 개똥쑥 식물체(Artemisia annua)를 저극성 용매에 접촉시켜 상기 저극성 용매 중에 개똥쑥 식물체 성분을 추출시키는 단계;
    상기 접촉 후 얻어진 혼합물로부터 상기 저극성 용매를 제거하고 잔여물을 얻는 단계; 및
    상기 잔여물을 친수성 용매에 접촉시켜 상기 개똥쑥 식물체 성분을 상기 친수성 용매 중에 추출시키는 단계를 포함하는 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법으로서,
    상기 저극성 용매는 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C6의 알칸, 알켄, 또는 알킨, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C5 내지 C12의 시클로알칸, 또는 시클로알켄, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C5의 알킬을 갖는 알킬아세테이트, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C12의 에테르, 또는 케톤, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C6의 설폭시드, 아세토니트릴, 테트라히드로퓨란, 액체 이산화탄소, 또는 이들의 조합이고,
    상기 치환기는 F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고,
    상기 친수성 용매는 C1 내지 C6의 알코올, 물 또는 이들의 조합인 것인 방법에 따라 제조된 개똥쑥 식물체 추출물을 포함하는, 개체의 염증성 피부질환을 예방 또는 개선하기 위한 화장용 조성물.
  17. 개똥쑥 식물체(Artemisia annua)를 저극성 용매에 접촉시켜 상기 저극성 용매 중에 개똥쑥 식물체 성분을 추출시키는 단계;
    상기 접촉 후 얻어진 혼합물로부터 상기 저극성 용매를 제거하고 잔여물을 얻는 단계; 및
    상기 잔여물을 친수성 용매에 접촉시켜 상기 개똥쑥 식물체 성분을 상기 친수성 용매 중에 추출시키는 단계를 포함하는 개똥쑥의 추출물을 분리하는 방법으로서,
    상기 저극성 용매는 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C6의 알칸, 알켄, 또는 알킨, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C5 내지 C12의 시클로알칸, 또는 시클로알켄, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C5의 알킬을 갖는 알킬아세테이트, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C12의 에테르, 또는 케톤, 비치환되거나 하나 이상의 치환기로 치환된 C1 내지 C6의 설폭시드, 아세토니트릴, 테트라히드로퓨란, 액체 이산화탄소, 또는 이들의 조합이고,
    상기 치환기는 F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고,
    상기 친수성 용매는 C1 내지 C6의 알코올, 물 또는 이들의 조합인 것인 방법에 따라 제조된 개똥쑥 식물체 추출물을 포함하는, 개체의 염증성 피부질환을 예방 또는 개선하기 위한 식품용 조성물.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 피부 소양증, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 피부건조증, 두드러기, 여드름, 건선, 탈락 피부염, 한선염, 아토피성 피부염, 약물알레르기, 당뇨병성 피부염, 세균성 피부염, 진균성 피부염, 한선염, 알레르기성 피부염, 및 신경성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 조성물.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 피부 소양증, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 피부건조증, 두드러기, 여드름, 건선, 탈락 피부염, 한선염, 아토피성 피부염, 약물알레르기, 당뇨병성 피부염, 세균성 피부염, 진균성 피부염, 한선염, 알레르기성 피부염, 및 신경성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 조성물.
  20. 청구항 1에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 피부 소양증, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 피부건조증, 두드러기, 여드름, 건선, 탈락 피부염, 한선염, 아토피성 피부염, 약물알레르기, 당뇨병성 피부염, 세균성 피부염, 진균성 피부염, 한선염, 알레르기성 피부염, 및 신경성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 조성물.
KR1020170152391A 2016-11-15 2017-11-15 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환을 개선시키기 위한 조성물 및 그 제조방법 KR101991894B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2017/012958 WO2018093150A2 (ko) 2016-11-15 2017-11-15 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환을 개선시키기 위한 조성물 및 그 제조방법
EP17871096.8A EP3542810B1 (en) 2016-11-15 2017-11-15 Composition containing artemisia annua extract as effective ingredient for alleviating skin disease and preparation method therefor

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160152229 2016-11-15
KR20160152229 2016-11-15
KR2017007500 2017-07-13
KRPCT/KR2017/007500 2017-07-13

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190067418A Division KR102168095B1 (ko) 2016-11-15 2019-06-07 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환을 개선시키기 위한 조성물 및 그 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180054501A KR20180054501A (ko) 2018-05-24
KR101991894B1 true KR101991894B1 (ko) 2019-09-30

Family

ID=62296634

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170152391A KR101991894B1 (ko) 2016-11-15 2017-11-15 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환을 개선시키기 위한 조성물 및 그 제조방법
KR1020190067418A KR102168095B1 (ko) 2016-11-15 2019-06-07 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환을 개선시키기 위한 조성물 및 그 제조방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190067418A KR102168095B1 (ko) 2016-11-15 2019-06-07 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환을 개선시키기 위한 조성물 및 그 제조방법

Country Status (2)

Country Link
KR (2) KR101991894B1 (ko)
CN (1) CN109952108A (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102162134B1 (ko) * 2018-12-13 2020-10-06 박서영 개똥쑥 추출물을 이용한 맛과 약효를 극대화한 건강보조식품제조방법
CN113855718A (zh) * 2021-09-30 2021-12-31 上海家化联合股份有限公司 青蒿提取物及其应用
KR102576088B1 (ko) * 2021-11-09 2023-09-08 주식회사 씨앤비바이오 개똥쑥 추출물부터 분리된 신규 화합물을 함유한 화장료 조성물

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000046633A (ko) * 1998-12-31 2000-07-25 성재갑 아토피성 피부염 치유용 조성물
KR100377262B1 (ko) * 2000-11-06 2003-03-26 애경산업(주) 쑥 추출물을 함유하는 아토피성 피부용 화장료 조성물
KR101080648B1 (ko) * 2009-02-26 2011-11-09 서울대학교산학협력단 쑥속（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ　ｓｐｅｃｉｅｓ）식물의 추출물로부터 원심향류분배 크로마토그래피를 이용한 고농도 유파티린(Ｅｕｐａｔｉｌｉｎ) 및 자세오시딘（Ｊａｃｅｏｓｉｄｉｎｅ）을 대량으로 분리 및생산하는 방법
KR20110116627A (ko) * 2010-04-20 2011-10-26 허진철 콩으로 부터 추출한 피니톨의 면역억제 활성활성을 가지는 조성물
CN102816065A (zh) * 2012-08-01 2012-12-12 南京师范大学 黄花蒿和黄花蒿工业提取剩余物作为制备咖啡酰奎尼酸原料的应用
CN103054924A (zh) * 2012-12-29 2013-04-24 黄家芬 一种黄花蒿提取物的提取方法
CN103142436A (zh) * 2013-03-21 2013-06-12 上海滇虹药业有限公司 一种黄花蒿止痒沐浴露及其制备方法
KR20150097336A (ko) * 2014-02-18 2015-08-26 광주대학교산학협력단 개똥쑥으로부터 아토피 치료 및 예방 능을 갖는 유효성분 추출방법 및 그 방법으로 추출된 추출물과 그 추출물을 함유하는 아토피 치료 및 예방 능을 갖는 화장료 조성물
KR101835739B1 (ko) * 2014-06-30 2018-03-08 주식회사 에스엘바이젠 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물
KR20160004701A (ko) * 2014-07-04 2016-01-13 호서대학교 산학협력단 개똥쑥 에센셜 오일을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 항산화 및 항비만용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Life Science. 2012. Vol.22. No.6, pp.844-851.*
한자식지. 2008. 제21권제4호, pp.292-298.*

Also Published As

Publication number Publication date
CN109952108A (zh) 2019-06-28
KR102168095B1 (ko) 2020-10-20
KR20190087343A (ko) 2019-07-24
KR20180054501A (ko) 2018-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101625882B1 (ko) 안토시아니딘을 포함하는 조성물 및 이용방법
CN104114176A (zh) 美拉德反应抑制剂
KR102168095B1 (ko) 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환을 개선시키기 위한 조성물 및 그 제조방법
US10130670B2 (en) Composition for treating or preventing inflammatory skin disease, comprising, as active ingredient, immature citrus fruit extract, or synephrine or salt thereof
EP3542810B1 (en) Composition containing artemisia annua extract as effective ingredient for alleviating skin disease and preparation method therefor
Da Silva et al. Chemotherapeutic potential of two gallic acid derivative compounds from leaves of Casearia sylvestris Sw (Flacourtiaceae)
KR101831366B1 (ko) 닥나무 추출물 제조 방법
KR101934794B1 (ko) 고욤잎 및 포도송이 가지의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR102106131B1 (ko) 연산호 큰수지맨드라미 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물
Rozo et al. Two compounds of the Colombian algae Hypnea musciformis prevent oxidative damage in human low density lipoproteins LDLs
KR20140000882A (ko) 홍삼 오일을 유효성분으로 함유하는 피부 보습용 조성물
US10822322B2 (en) Molecule with anti-cancer activity
US11292807B2 (en) Molecules from seaweeds with anti-cancer activity
KR102060427B1 (ko) 초음파 추출법에 의하여 제조되는 연산호 추출물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물
KR20200069616A (ko) 올벚나무를 포함하는 항염증용 조성물
KR101752233B1 (ko) 로즈허브 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 항알러지용 조성물
KR102076808B1 (ko) 갈조류 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증 조성물
KR101323781B1 (ko) 대량강으로부터 추출한 항균 유효성분을 함유하는 항민감성 피부용 화장료조성물
WO2017145958A1 (en) Whitening agent comprising as active agent syzygium polyanthum or an extract thereof
KR20230140011A (ko) 등검은말벌 유래 말벌독을 유효성분으로 포함하는 신경염증의 예방 또는 개선용 조성물
KR20230150712A (ko) 아퀼라리아 말렉센시스 추출물 유래의 후물린-타입 신규 화합물 및 이의 용도
KR101630439B1 (ko) 물오리나무 잎으로부터 분리된 신규 화합물 및 이를 포함하는 항산화용 조성물
BR102017003112A2 (pt) processo de obtenção, isolamento e purificação do isoflavonoide bolusanthol d (4,7,2'-triidroxi-4'-metoxi-isoflavanol), processo de caracterização do bolusanthol d e usos do mesmo
KR20140021181A (ko) 플라티코딘 ｄ 함유 도라지 추출물을 포함하는 알레르기 치료용 조성물
KR20140104886A (ko) N-feruloyltyramine을 함유하는 항산화, 항염증 및 주름 개선용 화장료 및 건강기능식품 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant