CN113855718A - 青蒿提取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了具有抗炎、抗敏、抗刺激和/或止痒作用的青蒿提取物，其中，所述青蒿提取物采用溶剂提取法制备。本发明还涉及包含青蒿提取物的组合物，所述组合物是药品、保健食品或皮肤外用剂。青蒿提取物采用水作为溶剂，采用索氏提取法制备。本发明所述的抗炎、抗敏、抗刺激和/或止痒作用通过抑制透明质酸酶、抑制胸腺基质淋巴生成素TSLP、和/或促进丝聚蛋白FLG基因表达实现。
Description
技术领域
本发明属于植物化学领域，具体涉及青蒿提取物、其制备方法以及该提取物在药品、保健食品或皮肤外用剂中的应用。
背景技术
近年来，随着工业发展带来的新型环境污染，空气污染PM2.5的问题加剧，加之生活方式的影响，尘螨、花粉、宠物毛发、食品添加剂等诱发免疫过敏反应的各种过敏原的机率越来越高，如特异性皮炎/湿疹、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、敏感皮肤等过敏性问题发生率随之增高，引起了各方关注。
目前治疗湿疹的药物繁多。西药类药物主要采用抗过敏治疗，没有根治的疗效，易复发且或多或少有激素成份，具有副作用。当下人们更加追随健康与天然，一些源自天然的活性成分备受欢迎，比如中草药、植物等，但大多数为多种中草药/植物的复合物或中草药与化合物的组合搭配，比如CN 104887785 A，公开了一种治疗皮肤慢性湿疹的药物，由以下重量份的原料药制成：地榆20-30份、紫草20-30份、青蒿30-40份、茯苓20-30份、忍冬10-20份、马齿苋10-20份、白术10-20份、细辛20-30份、蛇床子5-10份、苦参10-20份；CN108498625 A，公开了一种蝉蜕止痒剂包含青蒿在内的治疗湿疹的药物；CN102883732A公开了包含青蒿提取物和胺化合物的组合物及用所述组合物治疗皮肤的方法。另CN 109939105A、CN 105213321 B虽公开了包含青蒿、青蒿素或青蒿衍生物在特异性皮炎/湿疹、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、敏感皮肤等方面的作用，但均是以最终整个配方/制剂的整体作用，并无相关机理或实验数据能够证明其功效是由青蒿本身带来的作用，无法判定是否仅为青蒿成分所起到的关键或核心效果。
研究认为，湿疹的发病机制可能与T细胞亚群(Th1/Th2)平衡失调有关。Th2细胞因子异常分泌与湿疹的发生、发展以及预后密切相关。另外，胸腺基质淋巴生成素(thymicstromal lymphopoietin，TSLP)和IL-33也与Th2炎症因子密切相关。TSLP首次被Friend等从胸腺基质细胞中发现，在湿疹的发病机制中起重要作用。TSLP是一种上皮细胞衍生因子，为IL-7类似物，参与Th2免疫应答失衡，是Th2型免疫应答关键“引发剂”，主要表达于上皮细胞和角质形成细胞。TSLP不但与过敏性哮喘和鼻炎、过敏性在特应性皮炎、接触性皮炎等变态反应性皮肤病中发挥重要作用，也与玫瑰痤疮、银屑病等多种炎症性皮肤病相关，同时TSLP参与的Periostin/TSLP/IL-31信号通路介导的Th2免疫反应在慢性瘙痒中可能发挥重要作用。TSLP能够强烈激活树突状细胞(dendritic cells，DC)和包括肥大细胞、自然杀伤T细胞的天然免疫细胞。一方面，TSLP激活后，能促进幼稚CD4+T细胞增殖分化为炎症性Th2细胞闷。另一方面，TSLP直接作用于天然免疫细胞，刺激肥大细胞产生一系列炎症因子促进过敏反应发生。
皮肤屏障的一个主要功能就是防止机体水分经皮肤散发到周围环境，水作为角质层的重要成分，也是有关酶水解皮肤脂质和其他成分所必需的，具有维持皮肤角质层柔韧性的作用。皮肤屏障除了防止水分的丢失，还可以有效地阻止外界化学物质和微生物等因素的侵害。皮肤屏障功能的缺失导致抗原更易经皮致敏，从而诱导炎症，炎症又能加剧皮肤屏障的破坏。丝聚合蛋白在表皮屏障功能中起关键作用，在人表皮最外层的终末分化角质细胞中表达。FLG在表皮屏障形成中，作用于皮肤的表皮层，尤其是其最外层的角质层(Stratum Corneum，SC)，FLG可以降解形成天然保湿因子，是机体与外界环境之间的第一道防线，主要防止外界物质进入人体及表皮内水分的丢失。有学者对特应性皮炎儿童的皮肤屏障功能进行研究，发现特应性皮炎的患儿皮肤屏障功能相关蛋白表达下降，提示皮肤屏障功能受损，并有相关研究表明婴幼儿湿疹(AD)皮肤屏障功能障碍，主要表现为FLG基因突变导致皮肤屏障的角质形成细胞连接异常。
本发明意外地发现，青蒿提取物具有抑制TSLP的作用，动物止痒实验也证实了其具有良好的止痒作用，并同时发现其具有提高丝聚蛋白(FLG，皮肤保湿和屏障相关)基因mRNA表达的作用。
发明内容
一方面，本发明提供了具有抗炎、抗敏、抗刺激和/或止痒作用的青蒿提取物，其中，所述青蒿提取物采用溶剂提取法制备。在优选的实施方式中，所述青蒿提取物采用索氏提取法制备。在优选的实施方式中，所述青蒿提取物采用水作为溶剂提取。在优选的实施方式中，所述抗炎、抗敏、抗刺激和/或止痒作用通过抑制透明质酸酶、抑制胸腺基质淋巴生成素TSLP、和/或促进丝聚蛋白FLG基因表达实现。
另一方面，本发明提供了包含所述青蒿提取物的组合物，其中所述组合物是药品、保健食品或皮肤外用剂。在优选的实施方式中，所述组合物具有抗炎、抗敏、抗刺激和/或止痒功效。在优选的实施方式中，所述抗炎、抗敏、抗刺激和/或止痒作用通过抑制透明质酸酶、抑制胸腺基质淋巴生成素TSLP、和/或促进丝聚蛋白FLG基因表达实现。在优选的实施方式中，所述组合物用于改善特异性皮炎、湿疹、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性接触性皮炎、荨麻疹、皮肤干燥或它们的组合。
在优选的实施方式中，所述组合物用作皮肤外用剂时，青蒿提取物的用量为0.001-100重量％。在优选的实施方式中，所述组合物用作药品时，青蒿提取物的用量至少≥0.01重量％。在优选的实施方式中，所述组合物用作保健食品时，青蒿提取物的用量至少≥1重量％。
附图简要说明
图1显示了透明质酸酶抑制实验的结果。
图2显示了炎症因子TSLP检测的结果。
图3显示了基因检测的结果。
具体实施方式
本发明涉及青蒿提取物的制备及其应用，在研究中发现了其具有TSLP分泌抑制和促进丝聚蛋白FLG基因表达的作用，同时在动物模型上表现出了显著的止痒作用。因此，青蒿提取物可用于缓解过敏性相关疾病和/或用于皮肤护理。青蒿提取物可以作为功效添加剂，用于制备药品、保健食品或皮肤外用剂，以帮助改善特异性皮炎、湿疹、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性接触性皮炎、荨麻疹、皮肤干燥等问题。
为了提供更简明的描述，本文给出的一些数量表述没有用术语“约”修饰。应当理解，无论是否明确地使用了术语“约”，本文所给出的每个量都意在指代实际的给定值，并且还意在指代由本领域的普通技术人员可合理推测出的这些给定值的近似值，包括这些给定值的由实验和/或测量条件所引起的近似值。
为了提供更简洁的描述，本文中一些数量表述被叙述为约X量至约Y量的范围。应当理解，当叙述范围时，该范围并不限制于所叙述的上下界限，而应包括约X量至约Y量的整个范围或它们之间的任何量。
青蒿提取物
青蒿为菊科植物黄花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分，别名蒿子、臭蒿、香蒿、苦蒿、臭青蒿、香青蒿、细叶蒿、细青蒿、草青蒿、草蒿子。《中国药典》记录，青蒿清热解暑，除蒸，截疟。用于暑邪发热，阴虚发热，夜热早凉，骨蒸劳热，疟疾寒热，湿热黄疸。现代药理学研究，多集中在对于青蒿素一类药物的抗疟疾作用。
青蒿提取物作为功效活性物应用于药品、保健食品或皮肤外用剂中，具有修复肌肤、修护强韧屏障、焕新肌底、舒缓镇定、凉润修护、安全舒敏，修复新生、舒爽止痒、改善泛红刺痛、缓解肌肤瘙痒脱屑、缓解干敏脆弱肌肤、改善干燥等作用。
本发明意外地发现，青蒿提取物具有抑制TSLP的作用，动物止痒实验也证实了其具有良好的止痒作用，并同时发现其具有提高丝聚蛋白(FLG，皮肤保湿和屏障相关)基因mRNA表达的作用。
作为提取方法，可采用通常的溶剂提取方法，例如热提、冷浸和渗滤等，本领域技术人员可以根据实际情况选用合适的提取方法。
在对青蒿进行溶剂提取时，应当选择具有以下特性的提取溶剂：①溶解性能好，即溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质的溶解度要小，或反之；②惰性，即溶剂不能与植物成分发生化学反应，即使反应也属于可逆性的；③操作简便，在提取的提取物后能够方便地将溶剂与提取物分离，或者能直接将溶于溶剂中的提取物用于下一步骤；④经济安全，即在选择溶剂时要考虑经济易得，毒性小，便于回收和反复使用，并具有一定的安全性，对环境污染小。
可采用惰性溶剂和反应溶剂进行提取的方法。所述惰性溶剂，是指与植物成分不起任何化学反应的溶剂，可以是水、乙醇、甲醇、苯、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等。所述反应溶剂，是指可增加植物中酸性和碱性成分在极性溶剂中的溶解度的溶剂，可以是稀酸或稀碱的水溶液或醇溶液，如盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、酒石酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠的溶液。
在本发明的一些实施方式中，采用水(例如，去离子水)进行提取。在本发明的一些实施方式中，采用乙醇进行提取。在本发明的一些实施方式中，可使用体积浓度40％～100％的乙醇，优选使用60％～98％的乙醇，更优选使用70％～95％，最优选使用95％的乙醇。
本发明的青蒿提取物可以通过微波提取进行制备。例如，可以采用水辅助微波方法进行提取。
本发明的青蒿提取物可以通过超声提取进行制备。例如，可以采用乙醇(例如，70体积％的乙醇)辅助超声方法进行提取。
本发明的青蒿提取物可以通过索氏提取进行制备。索氏提取法，又名连续提取法，是从固体物质中萃取化合物的一种方法。利用溶剂回流和虹吸原理，使固体物质每一次都能为纯的溶剂所萃取，所以萃取效率较高。例如，可以采用水作为溶剂，通过索氏提取制备青蒿提取物。
本发明的青蒿提取物可以通过回流提取进行制备。例如，可以采用乙醇(例如，50体积％的乙醇)辅助回流方法进行提取。
含青蒿提取物的药品、保健食品或皮肤外用剂
本发明的青蒿提取物可以作为功效添加剂应用于药品、保健食品或皮肤外用剂中。
在一些实施方式中，所述药品选自：片剂、胶囊、乳剂、混悬剂、粉末剂、颗粒剂、溶液剂、以及本领域已知的各种药品剂型。根据剂型的不同类型添加不同的用量。
保健食品亦称功能性食品。它具有调节人体功能的作用，但不以治疗疾病为目的，适于特定人群食用。在一些实施方式中，所述保健食品可以是粉末剂型。
在一些实施方式中，所述皮肤外用剂选自：洁面乳、化妆水、乳液、膏霜、啫喱、面膜。根据制剂的不同类型添加不同的用量。
所述皮肤外用剂是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆品组合物。所述化妆品组合物中可以是基础化妆品、面部妆容化妆品、身体用化妆品、头发护理用化妆品等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。所述化妆品组合物中根据剂型和目的的不同还含有不同的化妆品学层面允许的介质或基质赋形剂。
皮肤外用剂含有皮肤学上可接受的载体或媒介物(例如，洗液、面霜、软膏、清洁剂等等)。本领域普通技术人员能够根据本领域公知常识，选择能够以上文所述的浓度溶解或分散这些组分的载体。当使用一种载体时，该载体应当不会导致青蒿提取物的灭活，而且在使用时不会在皮肤上带来任何相反的作用。
本领域普通技术人员能够根据公知常识和它们以最适用于处理时活性组分的浓度而溶解或分散在活性组分中的能力来选择适宜的载体，所述载体例如包括水、醇类、油等。
本发明的皮肤外用剂可以是局部施用产品的形式，其能够从外部施用在皮肤上，并能够以本领域公知的那些普通技术制备。载体可以具有各种实际的形式，例如面霜，敷料，凝胶，洗液，软膏或者液体，其包括敷用和清洗掉的组合物，以及用本领域公知的方法将它们加入到例如干的或湿的涂抹物，水凝胶基质，或粘性(或非粘性)贴片的材料载体中。优选地，载体是一种凝胶或增加水分的洗剂，或者以干或湿的形式的涂抹物。
典型的载体包括包含水和/或醇和润肤剂的乳剂，其中润肤剂是例如烃的油和蜡，硅油，透明质酸，植物、动物或海洋生物的脂肪或油，甘油酯衍生物，脂肪酸、或脂肪酸酯或醇或醇醚，羊毛脂及其衍生物，多元醇或酯，蜡酯，甾醇，磷脂等等，一般还有乳化剂(非离子的，阳离子的或阴离子的)，尽管一些润肤剂本身具有乳化特性。另外，可以利用其组分的不同比例和/或通过掺入例如树胶或其他形式的亲水胶体的增稠剂将这些相同组分配制成面霜、凝胶、或固体棒。
本发明的皮肤外用剂可以包含在皮肤护理组合物中通常能找到的附加组分，例如润肤剂、皮肤调节剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、香料、螯合剂等，只要它们与皮肤外用剂中其他的组分在物理上和化学上相容、且不影响本发明的青蒿提取物的效果即可。
在本发明的皮肤外用剂的一些实施方式中，可使用一种或多种防腐剂。适宜的防腐剂包括对羟基苯乙酮、C1-C4对羟基苯甲酸烷基酯和苯氧基乙醇。基于组合物总重量，防腐剂的用量为大约0.5至大约2重量％，优选大约0.5至1重量％。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种抗氧化剂。适宜的抗氧化剂包括丁化羟基甲苯(BHT)、抗坏血酸棕榈酸酯(BHA)、丁羟茴醚、苯基-α-萘基胺、氢醌、没食子丙酯、去甲二氢愈创木酸、维生素E或维生素E的衍生物、维生素C及其衍生物、泛酸钙、绿茶提取物和混合的多酚，以及上面所述的物质的混合物。所使用的抗氧化剂是组合物总重量的大约0.02至0.5重量％，更最优选的是从大约0.002至0.1重量％的用量范围。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种润肤剂，通过其保持在皮肤表面上或在角质层中的能力，起到润滑剂的作用，以减少剥落，改善皮肤的外观。典型的润肤剂包括脂肪酯、脂肪醇、矿物油、聚醚硅氧烷共聚物等等。适宜的润肤剂的例子非限定地包括，聚丙二醇(“PPG”)-15十八烷基醚，PPG-10十六烷基醚，Steareth-10，Oleth-8，PPG－4十二烷基醚，维生素E醋酸酯，羊毛脂，鲸蜡醇，鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯，十六十八醇，甘油硬脂酸酯，羟基硬脂酸辛脂，二甲基聚硅氧烷，以及它们的组合。鲸蜡醇，鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯，十六十八醇，甘油硬脂酸酯以及它们的组合是优选的。使用时，润肤剂是基于组合物总重量的大约0.1至大约30重量％，优选大约1至大约30重量％的用量范围。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用本发明的青蒿提取物以外的一种或多种保湿剂。保湿剂也称为湿润剂，其有助于提高润肤剂的效果，减少剥落，刺激组成的鳞皮的去除和提高皮肤触感。可使用多元醇作为保湿剂，包括但并不限于，甘油，聚亚烷基二醇，亚烷基多元醇及其衍生物，包含丁二醇、丙二醇、双丙二醇，聚丙三醇，聚乙二醇及其衍生物，山梨醇，羟丙基山梨醇，己二醇，1,3－二丁二醇，1,2,6-己三醇，乙氧基化甘油，丙氧基化甘油，以及它们的组合。使用时，基于组合物的总重量，保湿剂的用量为大约0.1至大约20重量％，优选是大约1至大约15重量％。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种乳化剂。乳化剂可在有效稳定量的范围内使用。优选地，在组合物总重量的基础上，以大约1.0至大约10.0重量％，更优选的是大约3.0至大约6.0重量％的用量来使用乳化剂。可以使用任何与组合物中的组分相容的乳化剂。适宜的乳化剂包括硬脂酸，鲸蜡醇，甘油硬脂酸酯，卵磷脂，十八烷醇，Steareth-2，Steareth-20，丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物，以及它们的组合。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种pH调节剂。本发明的皮肤外用剂中有益的pH调节剂包括氨丁三醇。使用时，基于组合物的总重量pH调节剂的用量为大约0.1至大约2重量％，优选是大约0.1至大约1重量％。
在本发明的一个具体实施方式中，皮肤外用剂包含丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、甘油、对羟基苯乙酮、甘油硬脂酸酯和卵磷脂、十六/十八醇、鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯、氨丁三醇或它们的组合。
在本发明的一些实施方式中，皮肤外用剂中青蒿提取物的用量为0.001％-20％(w/w)，优选的重量百分比为0.01％-20％(w/w)，更优选的重量百分比为0.01％-10％(w/w)，最优选的重量百分比为0.1％-5％(w/w)。
在本发明的一个具体实施方式中，皮肤外用剂中青蒿提取物的用量为0.3-2.2重量％。
实施例
下面结合具体实施例，以进一步阐述本发明。有必要在此指出的是，实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。
以下实施例中采用的青蒿均来自安徽亳州，乙醇和丙二醇购自国药试剂，滤纸购自Whatman公司。实施例中采用的大孔树脂包括：非极性树脂，D-101(南开合成科技)，XAD2(罗门哈斯)、HP-20(三菱化学)，HZ-802(华昌聚合物公司)；弱极性树脂，AB-8(南开合成科技)，DM-130(天津海光)、XAD7(罗门哈斯)；极性树脂，DM-301(天津海光)、NKA-9(南开合成科技)，HZ-806(华昌聚合物公司)。
实施例1：青蒿提取物的制备
青蒿50g，用15倍去离子水提取2次，每次1h，筛网过滤(上海宜昌仪器纱筛厂，20目)，滤液浓缩至1倍生药量，加入一定量95％乙醇醇沉，滤纸过滤，浓缩回收至无醇味，最终配制成固含1％溶液，即得。
实施例2：青蒿提取物的制备
青蒿75g，用25倍去离子水微波提取1次，微波45min，温度35℃，功率0.60kw，离心(5000rpm离心10min)过滤，滤液浓缩至1倍生药量，加入一定量95％乙醇醇沉，离心(5000rpm离心10min)过滤，浓缩回收至无醇味，上大孔树脂，洗脱回收乙醇，最终配制成固含1％溶液，即得。
实施例3：青蒿提取物的制备
青蒿125g，用13倍70％乙醇超声提取2次，每次超声20min(室温超声，超声5s，间隙2s)，离心(5000rpm离心10min)过滤，滤液浓缩回收无醇味，配制成固含2％溶液，即得。
实施例4：青蒿提取物的制备
青蒿200g，用10倍去离子水索氏提取(CN63M/STSXT-06型，舟纵横(厦门)流体技术有限公司)2次，每次30min，离心(5000rpm离心10min)过滤，滤液浓缩至1倍生药量，加入一定量95％乙醇醇沉，离心(5000rpm离心10min)过滤，浓缩回收乙醇，过超滤膜(200nm陶瓷膜)缩至固含4％溶液，即得。
实施例5：青蒿提取物的制备
青蒿250g，用20倍50％乙醇60℃回流提取1次，提取1.5h，离心(5000rpm离心10min)过滤，滤液加入适量去离子水和甘油，配制成固含3％溶液，即得。
实施例6：皮肤外用剂的制备
称取56.16质量份的去离子水放入烧杯中，开启搅拌，边搅拌边加入0.2质量份的丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物及12质量份的甘油，开启均质至分散均匀。当温度升至40℃时，加入0.5质量份的对羟基苯乙酮继续搅拌溶解，升温至75-80℃，得到A相。
称取3质量份的甘油硬脂酸酯&卵磷脂、3质量份的十六/十八醇及20质量份的鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯，搅拌加热至75-80℃后，得到B相。
在均质条件下，将B相液体缓慢加入A相中，均质均匀。
另称取0.14质量份的氨丁三醇加入5质量份的去离子水中，完全溶解后，加入A/B相中，搅拌均匀。边搅拌边开始降温。温度降低至常温后，备用。
实施例7：含青蒿提取物的皮肤外用剂的制备
称取56.06质量份的去离子水放入烧杯中，开启搅拌，边搅拌边加入0.2质量份的丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物及12质量份的甘油，开启均质至分散均匀。当温度升至40℃时，加入0.5质量份的对羟基苯乙酮继续搅拌溶解，升温至75-80℃，得到A相。
称取3质量份的甘油硬脂酸酯&卵磷脂、3质量份的十六/十八醇及20质量份的鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯，搅拌加热至75-80℃后，得到B相。
在均质条件下，将B相液体缓慢加入A相中，均质均匀。
另称取0.14质量份的氨丁三醇加入5质量份的去离子水中，完全溶解后，加入A/B相中，搅拌均匀。边搅拌边开始降温。当温度降至50℃时，加入0.1质量份的实施例4青蒿提取物，搅拌均匀，温度降低至常温后，备用。
实施例8：含青蒿提取物的皮肤外用剂的制备
称取55.86质量份的去离子水放入烧杯中，开启搅拌，边搅拌边加入0.2质量份的丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物及12质量份的甘油，开启均质至分散均匀。当温度升至40℃时，加入0.5质量份的对羟基苯乙酮继续搅拌溶解，升温至75-80℃，得到A相。
称取3质量份的甘油硬脂酸酯&卵磷脂、3质量份的十六/十八醇及20质量份的鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯，搅拌加热至75-80℃后，得到B相。
在均质条件下，将B相液体缓慢加入A相中，均质均匀。
另称取0.14质量份的氨丁三醇加入5质量份的去离子水中，完全溶解后，加入A/B相中，搅拌均匀。边搅拌边开始降温。当温度降至50℃时，加入0.3质量份的实施例4青蒿提取物，搅拌均匀，温度降低至常温后，备用。
实施例9：含青蒿提取物的皮肤外用剂的制备
称取53.96质量份的去离子水放入烧杯中，开启搅拌，边搅拌边加入0.2质量份的丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物及12质量份的甘油，开启均质至分散均匀。当温度升至40℃时，加入0.5质量份的对羟基苯乙酮继续搅拌溶解，升温至75-80℃，得到A相。
称取3质量份的甘油硬脂酸酯&卵磷脂、3质量份的十六/十八醇及20质量份的鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯，搅拌加热至75-80℃后，得到B相。
在均质条件下，将B相液体缓慢加入A相中，均质均匀。
另称取0.14质量份的氨丁三醇加入5质量份的去离子水中，完全溶解后，加入A/B相中，搅拌均匀。边搅拌边开始降温。当温度降至50℃时，加入2.2质量份的实施例4青蒿提取物，搅拌均匀，温度降低至常温后，备用。
实施例10：含青蒿提取物的皮肤外用剂的制备
称取51.16质量份的去离子水放入烧杯中，开启搅拌，边搅拌边加入0.2质量份的丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物及12质量份的甘油，开启均质至分散均匀。当温度升至40℃时，加入0.5质量份的对羟基苯乙酮继续搅拌溶解，升温至75-80℃，得到A相。
称取3质量份的甘油硬脂酸酯&卵磷脂、3质量份的十六/十八醇及20质量份的鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯，搅拌加热至75-80℃后，得到B相。
在均质条件下，将B相液体缓慢加入A相中，均质均匀。
另称取0.14质量份的氨丁三醇加入5质量份的去离子水中，完全溶解后，加入A/B相中，搅拌均匀。边搅拌边开始降温。当温度降至50℃时，加入5质量份的实施例4青蒿提取物，搅拌均匀，温度降低至常温后，备用。
测试例1：透明质酸酶抑制实验
透明质酸酶是Ⅰ型过敏反应的参与者，与炎症、过敏有强相关性。研究报道，一些抗敏、抗炎药物有强抑制透明质酸酶活性，因此，抑制透明质酸酶活性作为研究抗炎抗敏、抗刺激作用的指标。
样品1为实施例4青蒿提取物。取样品1，依次以Buffer(pH3.5乙酸-乙酸钠缓冲液)进行稀释，2倍、4倍和8倍，得到样品2、样品3和样品4。
表1显示了透明质酸酶抑制实验的测试体系。
表1
实验结果：
根据以下公式计算透明质酸酶抑制率：
抑制率(％)＝[1-(C-C0)/(空白-空白对照)]*100％
样品1-4的透明质酸酶抑制率结果如图1所示。实验结果表明，样品1实施例4青蒿提取物的透明质酸酶抑制作用最好，随者浓度降低，抑制率也相应降低，说明具有一定的浓度梯度效应，但即使稀释8倍的样品4也具有接近20％的抑制率。在稀释到2倍时即样品2，其抑制率接近50％。
整体结果都表明了实施例4青蒿提取物的透明质酸酶抑制作用从而反映了其抗炎抗敏、抗刺激作用。
测试例2：基于类湿疹3D皮肤模型的检测
1.试验材料
1.1细胞：皮肤模型为3D表皮皮肤模型
(批号：ES210402)
1.2试剂：
PBS、MTT(Sigma)、DMSO(Sigma)、MEM培养液(Gibco)、Human TSLP ELISA试剂盒(博士德)丙醇(国药)、PolyI:C(Sigma)、脂多糖(E.Coli.Sigma)、AlamarBlue(索莱宝)、RNAisoPlus(TaKaRa)、无水乙醇(国药集团)、DEPC水(Beyotime)、反转录试剂盒(TaKaRa)、荧光染料(TaKaRa)。
1.3主要设备
CO2培养箱(Thermo)、超净工作台(苏净安泰)、倒置显微镜(Olympus)、酶标仪(BioTek)、高速冷冻离心机(长沙湘仪)、普通PCR仪(BIO-RAD)、实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD)、数显恒温水浴锅(常州国华)。
2.实验方法：
2.1测试用液配制
PolyI:C+LPS诱导工作液：取1.44mL 5mg/mL PolyI:C母液和3mL 2mg/mL LPS母液，溶于MEM培养液中，总体积为300mL，使得PolyI:C的终浓度为24μg/mL，LPS的终浓度为20μg/mL。
2.2给药与诱导
准备6孔板，空白BC组加入新鲜正常培养液，模型NC组，空白BC组和样品组(实施例4青蒿提取物0.3％体积给药浓度)均加入诱导工作液；给药孵育完成后，从培养箱中取出6孔板，用无菌PBS清洗皮肤模型底部，并用无菌棉签擦拭PBS残留液，然后将皮肤模型转移至提前准备好的新的6孔板中。结束后，将6孔板置于CO2培养箱(37℃、5％CO2)中孵育24h。
2.3炎症因子TSLP检测
(1)收样：诱导孵育24h结束后，收集模型培养液于EP管中，置于-80℃冰箱保存。
(2)ELISA检测：根据TSLP ELISA检测试剂盒的操作说明书进行检测分析。
2.4基因检测
收样后依据试剂盒(TaKaRa)说明书，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR检测，采用2-△△CT方法进行结果计算。
2.5检测结果统计分析
各组间采用t-test统计分析，p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极显著。
2.6实验结果
表2显示了炎症因子TSLP检测实验的分组情况。
表2
炎症因子TSLP检测的结果如图2所示。与BC组相比，NC组的TSLP数值显著下降(##p<0.05)，说明本次实验有效。实施例4青蒿提取物在0.3％浓度下具有TSLP的抑制作用(**p<0.01)。说明实施例4青蒿提取物具有良好的抑制TSLP的作用。
表3显示了基因检测实验的分组情况。
表3
基因检测实验的结果如图3所示。与BC组相比，NC组的FLG基因表达显著下降(p<0.05)，说明本次实验有效。与NC组相比，实施例4青蒿提取物在0.3％浓度下的FLG基因表达极显著提升(p<0.01)，说明实施例4青蒿提取物具有良好的促进FLG基因表达的作用。
测试例3：青蒿提取物的动物(豚鼠)止痒实验
1.动物：豚鼠30只(上海杰思捷实验动物有限公司，每组10只)体重：300g左右，雌/雄各半
2.磷酸组胺：上海源叶生物科技有限公司LOT:X1759B70455
3.阳性对照：丙酸氯倍他索乳膏(10g:2mg):江苏远桓药业19010701#
4.试验条件：实验室温度：20—25℃相对湿度：60—70％
5.试验方法：
将豚鼠随机分为3组，每组10只。分空白对照组，阳性对照组，样品组(实施例1青蒿提取物5％)。实验前一天，给各组豚鼠右后足背，涂样品一次。实验当天，用粗砂纸擦伤动物右后足背剃毛处，约1平方厘米范围左右，再在该处涂抹样品一次，空白对照组给予等量蒸馏水。待10分钟后，开始在创伤面处滴0.01％磷酸组织胺0.05ml/只，此后每隔3分钟按0.01％,0.02％,0.03％,0.04％……递增浓度，每次均为0.05ml/只。直至出现豚鼠回头舔右后足，以最后出现豚鼠回头舔右后足时所给予的磷酸组胺总量为致痒阈。记录并比较各组的致痒阈。
6.实验结果：
表4显示了青蒿提取物对磷酸组织胺致痒反应的影响。
表4
P值：均与空白对照比较
实施例1青蒿提取物的给药体积浓度5％与空白对照样品比较，具有极显著提高豚鼠致痒阈作用(P<0.01)。
测试例4：含青蒿提取物的皮肤外用剂的动物(豚鼠)止痒实验
1.动物：豚鼠50只(每组10只)体重：300g左右，雌/雄各半
2.磷酸组胺：上海源叶生物科技有限公司LOT:X1759B70455
3.阳性对照：丙酸氯倍他索乳膏(10g:2mg):江苏远桓药业19010701#
4.试验条件：实验室温度：20—25℃相对湿度：60—70％
5.实验方法：
将豚鼠随机分为5组，每组10只。分空白对照组，阳性对照组，和样品组(实施例6-10)。实验前一天，给各组豚鼠右后足背，涂样品一次。实验当天，用粗砂纸擦伤动物右后足背剃毛处，约1平方厘米范围左右，再在该处涂抹样品一次，空白对照组给予等量蒸馏水。待10分钟后，开始在创伤面处滴0.01％磷酸组织胺0.05ml/只，此后每隔3分钟按0.01％,0.02％,0.03％,0.04％……递增浓度，每次均为0.05ml/只。直至出现豚鼠回头舔右后足，以最后出现豚鼠回头舔右后足时所给予的磷酸组胺总量为致痒阈。记录并比较各组的致痒阈。
6.试验结果：
对磷酸组织胺致痒反应的影响
表5显示了含青蒿提取物的皮肤外用剂对磷酸组织胺致痒反应的影响。
表5
P值：均与空白对照比较
实施例6不含青蒿提取物的皮肤外用剂组合物与空白对照样品比较，没有止痒作用(p>0.05)。
实施例7含青蒿提取物的皮肤外用剂组合物与空白对照样品比较，不具有显著提高豚鼠致痒阈作用(P>0.05)，实施例8含青蒿提取物的皮肤外用剂组合物与空白对照比较，具有极显著提高豚鼠致痒阈作用(P<0.01)，实施例9含青蒿提取物的皮肤外用剂组合物与空白对照比较，具有极显著提高豚鼠致痒阈作用(P<0.01)，实施例10含青蒿提取物的皮肤外用剂组合物与空白对照比较，不具有显著提高豚鼠致痒阈作用(P>0.05)。
实验结果表明，添加0.3-2.2％实施例4青蒿提取物的皮肤外用剂组合物具有显著的止痒作用，而实施例6为不含青蒿提取物的皮肤外用剂组合物没有止痒作用。因此，并非实施例6不含青蒿提取物的皮肤外用剂组合物带来的作用，则证实了青蒿提取物本身的止痒作用。
本发明所述的青蒿提取物可以作为中间体原料或功效添加剂用于药品、保健食品或皮肤外用剂的制备，所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，包括但不限于面霜、乳液、啫喱、化妆水、精华液、面膜、眼霜、气雾(清洁泡)、喷雾、沐浴露和洗面奶等剂型的产品的制备。
实施例1-5青蒿提取物，在皮肤外用剂中的重量百分比为0.0001％-20％(w/w)。优选的重量百分比为0.001％-10％(w/w)。更优选的重量百分比为0.001％-5％(w/w)。最优选的重量百分比为0.01％-5％(w/w)。
以下是实施例1-5获得青蒿提取物在皮肤外用剂中的具体应用例，以及这些剂型的配方和制备方法。具体应用例如下：
应用例1：胶囊的制备
取实施例1制备的青蒿提取物的固含溶液，浓缩至稠膏，加入麦芽糊精，混匀，制粒，装入胶囊，每粒装0.2g，制成1000粒，即得。
应用例2：中药制剂的制备
将实施例2制备的青蒿提取物的固含溶液，在室温下用超滤膜(200nm陶瓷膜)，截留分子量大于30000，将经过超滤膜的超滤液(分子量小于30000)保存备用。在室温下用纳滤膜过滤分子量小于30000的超滤液，截留分子量大于300的浓缩液备用。将分子量大于300的浓缩液无菌冷冻干燥，制成冻干粉。将冻干粉制成胶囊和粉针剂，获得目标产物一一用青蒿提取物制成的中药制剂。
应用例3：面霜的制备
应用例4：乳液的制备
应用例5：啫喱的制备
应用例6：化妆水的制备
应用例7：精华液的制备
应该例8：面膜的制备
应用例9：眼霜的制备
应用例10：气雾(清洁泡)的制备
应用例11：喷雾的制备
应用例12：沐浴露的制备
应用例13：洗面奶的制备
Claims (11)
1.具有抗炎、抗敏、抗刺激和/或止痒作用的青蒿提取物，其中，所述青蒿提取物采用溶剂提取法制备。
2.如权利要求1所述的提取物，其中，所述青蒿提取物采用索氏提取法制备。
3.如权利要求1或2所述的提取物，其中，所述青蒿提取物采用水作为溶剂提取。
4.如权利要求1或2所述的提取物，其中，所述抗炎、抗敏、抗刺激和/或止痒作用通过抑制透明质酸酶、抑制胸腺基质淋巴生成素TSLP、和/或促进丝聚蛋白FLG基因表达实现。
5.包含如权利要求1所述青蒿提取物的组合物，其中所述组合物是药品、保健食品或皮肤外用剂。
6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述组合物具有抗炎、抗敏、抗刺激和/或止痒功效。
7.如权利要求6所述的组合物，其中，所述抗炎、抗敏、抗刺激和/或止痒作用通过抑制透明质酸酶、抑制胸腺基质淋巴生成素TSLP、和/或促进丝聚蛋白FLG基因表达实现。
8.如权利要求5所述的组合物，用于改善特异性皮炎、湿疹、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性接触性皮炎、荨麻疹、皮肤干燥或它们的组合。
9.如权利要求5所述的组合物，所述组合物用作皮肤外用剂时，青蒿提取物的用量为0.001-100重量％。
10.如权利要求5所述的组合物，所述组合物用作药品时，青蒿提取物的用量至少≥0.01重量％。
11.如权利要求5所述的组合物，所述组合物用作保健食品时，青蒿提取物的用量至少≥1重量％。
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