KR102139471B1 - 피부노화방지 및 피부주름개선용 메셈브리안테뭄속 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물, 발효 용해물의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부노화방지 및 피부주름개선용 메셈브리안테뭄속 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물, 발효 용해물의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비-발효원료와 비교해 피부노화 및 피부주름 개선 효능이 증대된 아이스플랜트 및 콜라겐의 복합 발효물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 아이스플랜트 및 콜라겐 혼합 발효물 및 발효 용해물은 비-발효물과 비교하여 현저히 향상된 피부노화방지 효과 및 피부주름개선 효과를 나타내어 기능성 화장품 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

피부노화방지 및 피부주름개선용 메셈브리안테뭄속 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물, 발효 용해물의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물{Fermented composition of ice plant and collagen for anti-aging and anti-wrinkle, method for preparing the same and cosmetic composition comprising the same}

본 발명은 피부노화방지 및 피부주름개선용 메셈브리안테뭄속 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물, 발효 용해물의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비-발효원료와 비교해 피부노화 및 피부주름 개선 효능이 증대된 아이스플랜트 및 콜라겐의 복합 발효물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

발효는 미생물이 가지고 있는 효소가 원재료를 변화시켜 이로운 성분을 만들어내는 과정을 뜻한다. 발효 과정 중에는 유효 성분들이 추출되며 기능성 물질의 함량이 증가한다.

그리고 발효기술은 생물전환, 생합성, 생촉매 등의 용어와 의미상 중복성을 가지며, 미생물이 갖고 있는 효소적 기능을 이용하여 전구물질로부터 원하는 산물을 제조하는 기술을 말을 의미한다, 따라서 생체기능을 세포 또는 효소단계에서 이용하는 발효 기술은 유용물질 생산을 주요 목적으로 하여 현재의 생물공업을 구성하는 주요한 공정과정이라 할 수 있다. 발효 식품이 자연적으로 발생하는 미생물을 활용하는 1차원적인 발효 기술을 활용했다면 발효 화장품은 더 앞선 기술을 필요로 하며, 단순히 전통적인 발효방법을 이용한 것이 1세대 발효라면 2세대 발효는 효능물질의 실용화 기술개발이었고 유용한 생리활성 물질만을 대량으로 생산할 수 있는 고도의 발효생산기술을 통하여 화장품 기능성 소재산업의 기틀을 마련한 생물전환 발효 기술이 3세대 발효기술로 자리매김하고 있다.

우리나라 국민들은 김치, 된장 등 발효식품을 많이 이용하기 때문에 발효라는 개념이 매우 친숙하며 발효 원료를 이용한 화장품 역시 거부감 없이 사용하고 있다. 그리고 일반 대중에게도 발효기술을 이용하여 새로운 소재를 개발할 경우 기존 소재와 완전히 새로운 효능을 보이거나 유해한 많은 성분들이 안전한 성분으로 변화된다고 알려져 있어 발효 화장품에 대한 선호도가 높으며 이에 따른 기술개발도 타 선진국에 비해 뒤지지 않는 수준이지만 하지만 현재 화장품에 적용되는 많은 발효소재들이 천연발효 또는 자연 숙성에 가까운 발효 방법을 사용하는 것으로 알려져 있다.

최근 국내 발효 기술의 연구 트랜드는 천연발효 또는 자연숙성에 가까운 발효 방법을 사용하는 것으로 알려져 있으며 자연발효란 가공하지 않은 다양한 원료를 있는 그대로 두고 물과 바람, 대지, 계절 등 자연의 힘을 이용하여 피부에 유용한 성분을 자연스럽게 생산하는 방식으로 비록 시간이 오래 걸리지만 다양한 물질들을 얻을 수 있어 보습과 항산화, 주름개선, 세포활성, 피부결 개선 등의 효과를 얻을 수 있다는 것이 강점이지만 천연발효 또는 자연숙성 방식의 발효는 생산 batch 별로 일정한 품질의 발효생성물을 얻기 어려우며, 품질의 관리도 어려운 단점이 있다.

우리나라 발효화장품 시장은 최근 3~4년간 40%씩 고공성장을 거듭하고 있는 중이며 2012년에는 약 4500억 원, 2013년 약 6500억 원, 2014년 약 1조 원(추정치) 규모를 달성할 것으로 전망하고 있다

발효물은 크게 발효여과물 (Ferment Filtrate)과 발효용해물 (Ferment Lysate)로 분류될 수 있는데 발효여과물은 발효가 완료된 후 여과장치를 통해 미생물을 제거한 상등액 (supernatant)를 활용하는 것이고 발효용해물은 발효 완료 후 미생물을 열, pH, 효소 (Lysozyme) 고압 등을 활용하여 균을 사멸하여 활용하는 방법이다.

일반적으로 화장품에 활용되는 발효물들은 발효여과물 (Ferment Filtrate)이 많이 사용되는데 발효용해물(Ferment Lysate)에 비해 제조공정이 단순하며 비용적으로도 저렴하기 때문이다. 반면에 발효용해물은 원료의 효능적인 면에서는 발효 미생물 내 유용한 다양한 성분들이 발효물 내 포함되어 우수하지만 추가 공정의 번거로움과 추가 비용문제로 많이 사용되지 않는 추세다.

세포외 기질의 70~80%를 차지하는 콜라겐은 나이가 들면서 그 생성이 급격하게 저하되어 주름 생성과 밀접한 관계를 가지게 되고, 피부결합조직을 이루고 있는 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 프로티오글리칸 (proteoglycans), 글루코스아미노글리칸(glucosaminoglycan), 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin) 등은 산화되어 그 기능을 잃어버림으로써 피부가 탄력을 잃고 주름이 과도하게 형성되면서 노인성 피부로 변화되어 간다. 세포외 기질의 결합조직섬유에는 아교섬유(교원섬유, collagen fiber), 세망섬유(reticular fiber),탄력섬유(탄성섬유, elastic fiber)가 있으며, 이 중 피부결합조직의 70% 정도를 차지하고 있는 콜라겐은 피부의 섬유아세포(fibroblast)에서 대부분 형성된다. 나이가 들면서 피부결합조직 내의 콜라겐 함량이 줄어드는데 이는 콜라겐 합성의 저하와 분해의 촉진에 의한 것이다. 따라서 콜라겐 생합성의 저하와 콜라겐 분해 촉진은 피부주름 형성의 가장 큰 원인이라 할 수 있다. 콜라겐 생합성 과정은 전사 수준(Transcription level)과 해독 후 수준(Post-translation level)에 관여하는 많은 인자(Factor)들에 의해 조절을 받아 변화를 일으키며, 콜라겐 분해는 자외선 등에 의해 콜라겐을 분해하는 콜라게나아제(Collagenase)와 같은 기질 금속 단백질 분해효소들(Matrix metalloproteases; MMP)의 발현의 촉진으로 콜라겐 분해가 촉진되어 콜라겐 함량이 줄어든다. 아울러 외부 환경에 의해 콜라겐의 변형이 가속화되면서 피부는 주름이 많아지고 깊어지게 된다. 결과적으로 피부노화 현상은 세포의비균질화, 엘라스틴의 소실, 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소 및 지연 등에 의해 나타난다. 따라서 피부노화 현상은 피부 표피에서도 일어나지만 이보다는 진피 에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다.

이에, 본 발명자는 우수한 피부노화방지 및 피부주름개선 효과를 나타내는 천연물 유래의 발효물을 개발하기 위하여 예의 노력을 기울인 결과, 메셈브리안테뭄(Mesembryanthemum)속 다육식물인 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합물을 바실러스속 미생물 또는 락토바실러스속 미생물로 발효한 혼합 발효물 및 이의 발효 용해물이 매우 우수한 피부노화방지 효과 및 피부주름개선 효과를 나타낸다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 바실러스(Bacillus)속 미생물 또는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물을 이용하여 발효된 아이스플랜트 및 콜라겐의 혼합 발효물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 혼합 발효물은 발효 용해물인 것을 특징으로 하는 혼합 발효물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 혼합 발효물은 피부노화방지 및 피부주름개선 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 혼합 발효물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 아이스플랜트 및 콜라겐의 혼합 발효물 제조방법을 제공하는 것이다:

(1) 아이스플랜트 추출물을 제조하는 단계; 및

(2) 상기 아이스플랜트 추출물과 콜라겐을 혼합한 후 바실러스속 미생물 또는 락토바실러스속 미생물을 접종하여 발효를 진행하는 단계.

본 발명의 다른 목적은 상기 (2) 단계 이후에 발효물을 용해하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합 발효물 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화장료 조성물은 피부노화방지 및 피부주름개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 바실러스(Bacillus)속 미생물 또는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물을 이용하여 발효된 아이스플랜트 및 콜라겐의 혼합 발효물을 제공한다.

본 발명에서 상기 아이스플랜트는 메셈브리안트뭄(Mesembryanthemum)속의 다육식물로서 발아율이 낮고 성장속도가 느리다. 원산지는 남아프리카의 나미브 사막이며 주요 분포 지역은 아프리카 남부, 동서부, 북부, 오스트레일리아 남서부,아메리카의 서쪽 건조지역이다. 표면에 있는 투명한 결정체(블러더 세포)에는 이노시톨류, 베타카로틴과 같은 인체에 유용한 성분과 각종 미네랄을 함유하고 있다. 줄기와 잎의 블러더 세포는 얼음결정과 같은 모양을 가지고 있어 `아이스플랜트'라 불린다. 특히, 아이스플랜트에는 혈당치를 낮추는 피니톨(pinitol)과 중성지방을 억제하는 마이요이노시톨(myoinosito)을 많이 함유하고 있기 때문에 잎과 줄기를 생식하거나 즙액으로 사용하면 당뇨병 환자에 적합한 힐링 푸드롤 각광을 받고 있다. 특히 사막에 자생하고 있는 식물은 물이 부족한 환경에 적응하기 위해 식물 내부에 수분을 잘 보호 할 수 있는 보습성분을 다량 보유하고 있는 데 화장품 업계에서는 이점을 착안하여 다양한 보습 및 항산화 소재로 활용하고 있으며 아이스플랜트 또한 사막에서 자라는 식물로 식물 내부에 다양한 종류의 보습 성분을 함유하고 있다.

본 발명에서 상기 바실러스속 미생물은 B. 서브틸리스(subtilis), B. 세레우스(cereus), B. 쑤린지엔시스 97-27(thuringiensis 97-27), B. 웨이헨스테판넨시스(weihenstephanensis) 및 B. 아밀로리퀴파시엔스(amyloliquefaciens)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에서 상기 락토바실러스속 미생물은 락토바실러스 애시도필러스(acidophilus), 락토바실러스 퍼멘텀(fermentum), 비피도박테리움 비피덤(bifidum) 락토바실러스 카세이(casei), 락토바실러스 루테리(reuteri), 락토바실러스 비피덤(bifidum), 락토바실러스 가세리(gasseri), 락토바실러스 플란타룸(plantarum), 락토바실러스 존소니(johnsonii), 락토바실러스 람노수스(rhamnosus), 락토바실러스 파라카세이(paracasei) 및 락토바실러스 크리스파투스(crispatus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에서 상기 혼합 발효물은 발효 용해물인 것을 특징으로 할 수 있다.

발효물은 크게 발효 여과물(Ferment Filtrate)과 발효 용해물(Ferment Lysate)로 분류될 수 있는데 발효 여과물은 발효가 완료된 후 여과장치를 통해 미생물을 제거한 상등액(supernatant)을 활용하는 것이고 발효 용해물은 발효 완료 후 미생물을 열, pH, 효소 (Lysozyme) 고압 등을 활용하여 균을 사멸하여 활용하는 것을 의미한다.

본 발명에서 상기 혼합 발효물은 피부노화방지 및 피부주름개선 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 단계를 포함하는 아이스플랜트 및 콜라겐의 혼합 발효물 제조방법을 제공한다.

(1) 아이스플랜트 추출물을 제조하는 단계; 및

(2) 상기 아이스플랜트 추출물과 콜라겐을 혼합한 후 바실러스속 미생물 또는 락토바실러스속 미생물을 접종하여 발효를 진행하는 단계.

본 발명에서 상기 아이스플랜트 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6인 알코올, 헥산, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것일 수 있다. 본 발명의 추출물은 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 6인 알코올 및 이들의 혼합용매에서 선택된 용매로 추출한 것일 수 있으며, 또는 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올 수용액일 수 있다. 상기 알코올 수용액의 농도는 10 내지 100%(v/v)일 수 있으며, 바람직하게는 70 내지 100%(v/v)일 수 있다. 본 발명의 추출 용매는 가장 바람직하게는 95%(v/v)의 에탄올 수용액일 수 있다.

본 발명에서의 아이스플랜트 추출방법은 당업계에 공지된 것이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 냉침, 열수 추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 방법이 있으나 여기에 국한되는 것은 아니다. 바람직하게는 열수 추출일 수 있다.

상기 방법으로 제조된 추출물은 여과하여 여액을 모으고, 다시 잔사에 원료 중량의 4 내지 7배의 추출 용매, 예컨대 물을 가하여 환류냉각 추출 조건으로 4시간 동안 재추출하고 여과하여 이전의 여액과 혼합함으로써 추출 효율을 높일 수 있다. 본 발명의 추출물이 추출의 횟수에 한정되는 것은 아니다.

상기와 같이 추출한 후 합한 여액은 40 내지 60℃에서 감압농축하여 추출물 중에 잔존하는 용매를 제거하고, 감압농축된 농축물 중량의 25 내지 50배의 물로 2 내지 3회 공비 농축한 후 재차 동량의 물을 가하여 균질하게 현탁시킨 후 최종 추출물은 추가적으로 더욱 정제할 수도 있고, 동결건조 등의 방법에 의해 건조시켜 용매를 제거하여 고형화하거나 분말 형태로 제조할 수 있다.

상기 아이스플랜트 추출물을 콜라겐과 혼합한 후 바실러스속 미생물 또는 락토바실러스속 미생물을 접종하여 발효하는 단계를 진행한다.

상기 아이스플랜트 추출물과 콜라겐을 혼합하는 비율은 특별히 제한되지 않으며 1:0.001~5의 비율로 혼합할 수 있다.

또한 상기 미생물을 아이스플랜트 추출물 및 콜라겐 혼합물에 접종하는 농도, 발효온도, 발효시간 등은 당업계에서 공지된 일반적인 방법을 적용할 수 있다.

본 발명은 상기 (2) 단계 이후에 발효물을 용해하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합 발효물 제조방법을 제공할 수 있다.

상기 방법에 의해 혼합 발효물의 발효 용해물을 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 화장료 조성물은 피부노화방지 효과 또는 피부주름개선 효과를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 젤 타입, 스킨 타입, 크림 타입, 연고 타입 등으로 적용될 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 상기의 조성물은 그것의 타입에 따라 적절한 통상의 연화제, 유화제, 증점제 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 물질들을 첨가하여, 공지의 방법에 의해 적절하게 제조될 수 있다.

상기 젤 타입 조성물은 트리메틸올프로판, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세린 등의 연화제, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 이소세틱알콜 등의 용매, 정제주 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 스킨 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 부틸렌 글라이콜, 글리세린, 알란토인, 메틸 파라벤, 이디티에이-2-소디움, 잔탄검, 디메티콘, 폴리 에틸렌 글라이콜-60 하이드로제네이트 카스톨 오일, 폴리 소르베이트 60 및 정제수 등을 첨가하여 제조 할 수 있다.

상기 크림 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 소프파티질세린, 소프파티딜이노시톨 등의 리피드, 이들의 유도체, 글리세릴 스테아레이트, 소르비탄 팔미테이트, 소리비탄 스테아레이트 등의 유화제, 아보카도 오일, 살구 오일, 바바수 오일, 유리지치 오일, 동백 오일 등의 천연 지방 또는 오일, 프로필렌글리콜 등의 용매 및 정제수 등을 첨가하여 제조 할 수 있다.

상기 연고 타입 조성물은 연화제, 유화제 및 마이크로크리스탈린납, 파라핀, 세레신, 밀납, 경납, 바세린 등의 왁스를 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 이의 비제한적인 예시로는 비타민 C, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베튤린산 및 클로렐라 추출물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 아이스플랜트 및 콜라겐 혼합 발효물 및 발효 용해물은 비-발효물과 비교하여 현저히 향상된 피부노화방지 효과 및 피부주름개선 효과를 나타내어 기능성 화장품 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 아이스플랜트 추출조건별 elastase 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 아이스플랜트 추출조건별 MMP-1 활성비교 그래프이다.
도 3은 유산균 종류별 발효 시 미생물 생육 비교 그래프이다.
도 4은 유산균 종류별 발효시 elastase 저해 활성 그래프이다.
도 5은 아이스플랜트, 콜라겐 발효물 별 MMP-1 활성 평가 그래프이다.
도 6은 아이스플랜트, 콜라겐 발효물의 피부 1차 자극 실험 사진이다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

실시예

실시예 1: 아이스 플랜트 추출 조건 확인

식물에서의 항산화활성은 주로 플라보노이드, 폴리페놀, 탄닌, 페놀릭 테르펜 등과 같은 페놀릭 성분에 의해 나타나며, 페놀릭 성분의 용매별 추출 수율은 식물마다 다르게 나타나지만, 식물체에 열처리를 할 경우 결합형 폴리페놀 성분이 유리형으로 되어 활성이 증가한다. 그러므로 열수추출시 다른 유기용매추출방식에 비해 높은 항산화활성 및 tyrosinase 억제능을 보이는 연구가 보고되어 있고 유기용매를 이용한 추출시 pancreatic lipase, a-glucosidase, NO 생성 등을 저해하는 능력이 뛰어나다는 연구가 보고 되어 열수 추출 및 유기 용매를 이용한 추출방법을 이용하여 발효를 하고 효능 평가를 진행하여 가장 효능이 좋은 추출방법 선별을 진행하기로 하였다.

아이스플랜트를 열수추출, 70% 에탄올추출, 병행추출을 진행해여 콜라겐-아이스플랜트 복합 발효를 진행하였다. elastase 저해 활성 및 MMP-1 활성 측정값을 종합한 결과 아이스플랜트의 추출 방법을 병행추출로 공정확립을 진행하였다. (도1, 2)

실시예 2: 아이스 플랜트와 콜라겐 발효 및 발효 산물 확인

앞서 확보된 아이스플랜트 추출물과 고분자 콜라겐 (Mw 100,000~300,000)을 Bacillus속과 Lactobacillus 속 균을 이용 발효 조건을 달리하여 최적의 항노화 효능을 보이는 발효 조건을 확보하기 위해 최소 배지 배양 실험을 실시하였다.

사용한 유산균의 균종은 L.Bacillus Acidophilus, L.Bacillus Plantanum, lactobacillus rhamnosus, lactobacillus Paracasei, Bacillus subtilis 를 사용하였으며 유산균은 모두 한국세포주 은행에서 구입하여 사용하였다.

구체적인 배양 방법은 상기 총 4종의 균주를 선택 배지에 순수 배양하여 각 균주의 균수가 10⁸ 내지 10⁹ cfu/ml 정도 되는 배양액 1%으로 접종하고, 37의 인큐베이터에서 72 시간 동안 배양하여 진행하였다. 배양에 사용한 배지는 펩톤 5 g, 아세트산 나트륨 3 수화물 2.5 g, 황산 마그네슘 7 수화물 0.5 ml, 황산 망간 4 수화물 0.5 ml, 트윈 80 5 ml, 시트르산 이암모늄(diammonium citrate) 1 g, 인산 이칼륨(dipotassium phosphate) 1 g, 및 증류수 480 ml로 구성된 최소 배지에 15g의 콜라겐을 혼합하여 사용하였다.

배양이 완료된 후 배양액을 4000rpm, 10분동안 원심분리하여 유산균과 배양액을 분리한 후 분리된 배양액을 SDS-PAGE를 활용하여 콜라겐의 저분자화를 확인하였다.

총 5종의 유산균을 실험한 결과 총 5종의 유산균 균주 중 콜라겐-아이스플랜트을 유산균을 이용하여 발효 한 결과 미생물 생장에 있어서 L.paracasei와 L.rhamonosus가 가장 우수하며 elastase 저해활성 측정 결과 L.paracasei가 발효에 가장 적합한 것으로 파악되었다. (도3, 4)

실시예 3: 발효용해물 제조 및 MMP-1 (Matrix Metalloproteinase - 1)활성 저해 실험

발효 후 발효 용해물을 제조하기 위해 발효가 완료된 발효 원액에 Lysozyme처리와 마이크로플루다이져 (microfluidizer) 처리를 통해 용해물을 제조한 후 0.22um 크기의 필터로 여과하여 잔여 미생물을 완전히 제거하여 발효 용해물을 제조하였다. 이후 용해물의 항노화 효과를 확인하기 위해 콜라게나제 (MMP-1) 발현 저해능 시험을 진행 하였다.

사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's media, Sigma)에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Sigma)을 첨가한 배지로 37, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 2 X 105 cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 대조군에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 디쉬에는 20여종의 실험군과 대조군으로 레티놀을 10 ug/ml의 농도가 되도록 처리를 하였다. 각각의 디쉬에 시험물질을 가한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여 Matrix Metalloproteinase-1(MMP-1),Human,biotrak,ELISA kit (GE healthcare RPN2610)을 통해 MMP-1의 저해능을 측정하였다.(도5)

발효여과물과 발효용해물을 농도별로 처리한 뒤 MMP-1 억제효과를 측정하였다. 이러한 결과로부터 피부에 MMP-1생성을 유발하는 UV가 요인으로 적용되었을 때, 발효용해물이 단순 발효여과물에 비해 더 유용한 결과를 나타내어 MMP-1생성을 저해하여 피부의 주름을 억제할 수 있을 것으로 사료된다.

실시예 4: 아이스플랜트, 콜라겐 발효용해물의 임상시험 승인 및 피험자 모집

1) 임상시험 IRB 신청 및 승인

미백 및 보습 임상시험을 진행하기 위하여 대전대학교 기관생명윤리위원회의 승인을 받았으며(1040647-201704-HR-008-02), 계획에 따라 임상시험을 진행할 예정이다. 시험군 구성을 Lactobacillus 발효제품(아이스 프랜트 With/Without 콜라겐)군, Saccharomyces 발효제품(시중에 판매되는 제품)군, 베이스크림군으로 구성하여 피험자의 얼굴面을 양쪽 두 군데로 나누어 시행할 예정이다.

무작위로 크림을 지급하고 정해진 위치에 각 크림을 아침, 저녁으로 하루에 두 번씩 도포하도록 하고 실험 전, 도포 후 2주, 4주, 6주 및 8주에 육안평가와 기기평가로서 안면에 직접 보습도와 색소침착도를 측정할 것이며 실험 전과 도포 후 8주 후 육안평가와 실내 온도(20~22℃), 상대습도(40~60%)가 유지되는 환경에서 피험자들은 중성 세안제를 이용하여 미온수로 세정 한 후, 실제적인 피부의 회복이 진행된 상태에서의 측정을 위해 10~20분간 안정을 취한 다음피부 측정을 실시하고 카메라를 이용하여 시험부위가 동일 시야에 들어오도록 앵글을 고정시키고, 원거리촬영과 근접촬영을 시행한다. 또한, 시험부위와 렌즈의 거리가 매 회 같아지도록 피험자와 카메라의 위치를 고정하여 사진촬영을 실시할 것이다.

임상시험 IRB는 위 내용을 바탕으로 작성 및 승인 완료되어 임상 시험 참가자 모집에 들어갔다.

2) 임상시험 피험자 모집

임상시험 참가자 모집을 위하여 대전광역시와 충청남도에 거주하고 있는 2050대 여성을 대상으로 피험자를 모집하였다. 2015년 식품의약품안전청에서 발표한 기능성화장품의 유효성 평가를 위한 가이드라인에 따라 실험 및 대조군을 20개(4그룹20개=80개)로 정할 때 모집해야할 최소 표본 크기는 40명(80개/2面=40명) 이었다. 즉 실제 연구 대상자의 탈락률 20%을 감안하여 50명을 모집할 예정이다.

본 연구의 피험자 선정기준은 다음과 같다.

- 자발적으로 연구 참여를 동의한 자로 참가 동의서를 작성하고 서명한 자

- 20세50세 여성으로 현재 기미나 과색소침착으로 고민이 있는 자

- 설문지를 읽고 응답이 가능한 자

- 피부 질환을 포함하는 급,만성 신체 질환이 없는 건강한 자

본 연구의 피험자 제외기준은 다음과 같다.

- 임신 또는 수유중인 여성과 임신 가능성이 있는 여성

- 피부 질환의 치료를 위해 스테로이드가 함유된 피부 외형제를 1개월 이상 사용하는 자

- 동일한 실험에 참가한 뒤 6개월이 경과되지 않은 자

- 민감성, 과민성 피부를 가진 자

- 시료 도포 부위에 점, 여드름, 홍반, 모세혈관확장 등의 피부 이상 소견이 있는 자

- 연구 시작 전 3개월 내에 연구 부위에 동일 또는 유사한 화장품과 의약품을 사용한 자

- 그 외 주시험자의 판단으로 실험에 부적합하다고 생각되는 자

본 연구의 피험자 중도 탈락 기준은 다음과 같다.

- 시료 도포 중 홍반이나 소양감이 발생하는 자

- 실험 진행 중 과도한 자외선 노출

- 주시험자의 판단에 의해 실험에 부적합하다고 생각되는 자로 제외 시 결과 산정에서도 제외함

3) 피부 일차 자극시험

시험설계

. 시험 물질 : 아이스 프랜트 콜라겐 발효물질 / 대조 시험 물질

. 예비실험으로 20-30대여성 6인실시

. 실험 전 피시험자 모두에게 실시

. 얼굴과 유사한 피부조직인 상박 under로 대체

. 색소침착, 점도, pH, 보습, 실내 온도 등 측정

시험 방법(48 hr single patch test)

. 70% 알콜로 닦고 건조시킴

. 일정량(도포량 정한 후)을 patch test chamber (IQ Ultra TM)에 loading

. 피시험자 왼쪽 상박 under에 loading된 chamber를 얹고 microtape으로 고정시킴

. 48시간 후 제거

. 첩포 제거 후 30분 후, 24시간 후 관찰

피부 일차 자극 예비 시험

. 기간: 2017년 4월 26일 ~ 2017년 4월 29일

. 대상자: 20~30대 여성 6인

. 실험군:

아이스 프랜트 콜라겐 발효물질

대조 시험 물질 (positive control)

Base cream (negative control)

4) 결과:

육안관찰 6명 전원 사용 시 문제가 없었으며, 홍반 등 육안으로 관찰되는 문제 없는 것을 확인하였다. (도6)

이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

1. 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei)를 이용하여 발효된 아이스플랜트 및 콜라겐의 혼합 발효물로서,
   상기 혼합 발효물은 피부노화방지 및 피부주름개선 효과를 나타내고, 발효 용해물인 것을 특징으로 하는 혼합 발효물.
2. 삭제
3. 삭제
4. (1) 아이스플랜트 추출물을 제조하는 단계; 및
   (2) 상기 아이스플랜트 추출물과 콜라겐을 혼합한 후 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei)를 접종하여 발효를 진행하는 단계;
   를 포함하는 아이스플랜트 및 콜라겐의 혼합발효물 제조방법으로서,
   상기 (2) 단계 이후에 발효물을 용해하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합 발효물 제조방법.
5. 삭제
6. 제1항의 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 피부노화방지 및 피부주름개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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