KR102129430B1 - 기능성 펩타이드와 콜라겐 발효물을 포함하는 피부 노화 완화용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기능성 펩타이드와 콜라겐 발효물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콜라게나제 활성을 저해하고 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하며, 피부탄력 증진 및 보습 효과를 나타내는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

기능성 펩타이드와 콜라겐 발효물을 포함하는 피부 노화 완화용 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising functional peptides and fermented products}

본 발명은 기능성 펩타이드와 콜라겐 발효물을 포함하는 피부 노화 완화용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콜라게나제 활성을 저해하고 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하며, 피부탄력 증진 및 보습 효과를 나타내는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장료의 가장 큰 관심 분야 중 하나는 노화와 관련된 노화, 색소침착, 탄력감소, 피부건조화, 탈모, 모발의 윤기 부족 등이다. 피부는 노화를 통해 다양한 변화를 맞게 된다. 먼저 피부의 구성 성분인 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아지고 피부에 탄력을 주는 세포외 기질(Extracellular matrix; ECM) 성분이 변화하게 되는데 그 중 세포외 기질의 70~80%를 차지하는 콜라겐은 나이가 들면서 그 생성이 급격하게 저하되어 노화 생성과 밀접한 관계를 가지게 되고, 피부결합조직을 이루고 있는 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 프로티오글리칸(proteoglycans), 글루코스아미노글리칸(glucosaminoglycan), 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin) 등은 산화되어 그 기능을 잃어버림으로써 피부가 탄력을 잃고 노화이 과도하게 형성되면서 노인성 피부로 변화되어 간다.

세포외 기질의 결합조직섬유에는 아교섬유(교원섬유, collagen fiber), 세망섬유(reticular fiber), 탄력섬유(탄성섬유, elastic fiber)가 있으며, 이 중 피부결합조직의 70% 정도를 차지하고 있는 콜라겐은 피부의 섬유아세포(fibroblast)에서 대부분 형성된다. 나이가 들면서 피부결합조직 내의 콜라겐 함량이 줄어드는데 이는 콜라겐 합성의 저하와 분해의 촉진에 의한 것이다. 따라서 콜라겐 생합성의 저하와 콜라겐 분해 촉진은 피부노화 형성의 가장 큰 원인이라 할 수 있다.

콜라겐 생합성 과정은 전사 수준(Transcription level)과 해독 후 수준(Post-translation level)에 관여하는 많은 인자(Factor)들에 의해 조절을 받아 변화를 일으키며, 콜라겐 분해는 자외선 등에 의해 콜라겐을 분해하는 콜라게나아제(Collagenase)와 같은 기질금속단백질 분해효소들(Matrix metalloproteases; MMP)의 발현의 촉진으로 콜라겐 분해가 촉진되어 콜라겐 함량이 줄어든다. 아울러 외부 환경에 의해 콜라겐의 변형이 가속화되면서 피부는 노화이 많아지고 깊어지게 된다. 결과적으로 피부노화 현상은 세포의 비균질화, 엘라스틴의 소실, 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소 및 지연 등에 의해 나타난다. 따라서 피부노화 현상은 피부 표피에서도 일어나지만 이보다는 진피에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다.

이러한 피부노화에 대한 문제점을 해결하기 위한 다양한 화장료 조성물이 연구되고 있고, 피부의 노화완화 효과는 일부에서 가시적인 성과를 보이고 있다. 예컨대, 피부노화 및 기미, 색소침착 개선을 위해 널리 사용되고 있는 레티노이드류, 그 중에서도 레티놀(retinol)에 대한 피부노화 제거 임상 결과들이 다양하게 보고되고 있고, 레티놀을 함유한 화장료는 일광에 의해 형성된 피부노화살이나 피부처짐, 탄력감소 등을 효과적으로 개선하였다.

최근 들어 인간의 수명이 길어지고 삶의 수준이 향상됨에 따라, 건강하고 아름다워지고자 하는 사람들의 관심이 매우 증대 되고 있으며 이는 피부노화와 관련된 기능성화장품 및 기능성식품, 미용분야의 시장이 최근에 급격히 증가하는 것으로 잘 알 수 있다.

내 피부 노화 관련 기술은 선진국과 기술격차가 큰 편이며, 한국노화학회를 중심으로 진행 중인 노화 연구는 대부분 노화 기전 등 기초 연구로서 항산화 활성 억제에 초점을 맞추고 있으며

항 노화과학 분야의 전반적인 경쟁력 수준은 세계 최고 기술보유국(미국) 대비 75% 수준이며, 기술격차는 4.5년으로 나타났고 기술경쟁력 수준이 가장 높은 분야는 노화제어 기술개발 분야이며 세계 최고 기술보유국 대비 74.5% 수준, 국내 노화연구 분야는 매우 다양하며, 이중 뇌신경, 혈관, 관절, 인식 및 지각, 암, 당뇨 및 비만 등의 분야가 활발한 연구영역으로 자리잡고 있으나, 피부 관련 노화 연구는 다른 연구 분야에 비해 관심도와 투자 및 연구가 미흡한 상황이며 노화라는 관점에서 체계적이고 통합적인 연구가 부재한 실정이어서 이에 대한 개선이 필요한 상황이다.

피부 노화 관련 화장품업계 연구 동향으로는 피부 노화 신소재 개발을 위한 연구에 있어 줄기세포를 포함한 천연추출물의 성분연구가 활발히 진행되고 있으며, 생명공학과 합성기술을 이용한 신물질로 레티놀 유도체, 화이트젠 등을 합성 화장품에 적용하고 있음. 감성공학을 이용, 차별화시킨 제형으로 편리성과 사용감을 높이고 있으며, 나노기술과 액정, 리포좀, DDS 등을 이용하여 자극은 최소화시키고 효능은 높이는 안정화를 위한 제형 연구가 이루어지고 있다

특히 최근 20대 후반의 젊은 여성까지 항노화 제품 사용이 확대되면서 이들을 항노화제품을 적극적으로 개발, 출시하고 있는 상황이다. 특히 화장품 업계에서 소비자의 다양한 욕구를 충족시키고자, 화장품분야에 한정되지 않고 뉴트리코스메틱스, 영양보조제, 에스테틱, 고기능성화장품, 미용시술 등으로 영역을 확대하고 있음. 노화 기전에 관한 연구부터, 고령자의 사회, 의학 및 복지 관련 정책 개발 지원 등 정책 연구까지 노화를 주제로 한 광범위한 연구를 수행을 하고 있으며 특히 발효와 관련한 항노화 기술 개발 및 제품화에 많은 인력과 제화를 투자하고 있는 상황이다.

피부노화 및 노화을 효과적으로 방지 또는 개선하기 위해서는, 효능이 정확하게 검증된 원료를 이용한 신규 노화 개선 조성물 개발이 필요하며 효능의 검증은 분자생물학적 메카니즘으로 규명되고 인체 대상 임상시험으로 검증하는 것이 중요하다.

본 발명자들은 다양한 메카니즘을 가진 화장품 항노화 기능성 원료의 조합을 통해 주름 개선, 피부 보습, 탄력 개선 및 피부노화 개선 효과가 매우 우수한 조성물을 제공하고자 한다.

따라서, 본 발명의 목적은 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드-67 팔미테이트, 팔미토일 펜타펩타이드-4, 카퍼트리펩타이드-1, 트리펩타이드-29, 콜라겐 발효물 및 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물로 이루어진 군에서 선택된 5종 이상을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전체 조성물에 대하여 상기 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드-67 팔미테이트, 팔미토일 펜타펩타이드-4, 카퍼트리펩타이드-1 또는 트리펩타이드-29는 각각 0.005 내지 0.1%(w/v)로 포함이 되며, 상기 콜라겐 발효물 또는 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 1 내지 10%(v/v)로 포함된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 콜라겐 발효물은 락토바실러스속 미생물로 발효된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 바실러스속 미생물 또는 락토바실러스속 미생물로 발효된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화장료 조성물은 콜라게나제 저해, 콜라겐 생성 촉진, 피부탄력 개선 및 보습 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드-67 팔미테이트, 팔미토일 펜타펩타이드-4, 카퍼트리펩타이드-1, 트리펩타이드-29, 콜라겐 발효물 및 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물로 이루어진 군에서 선택된 5종 이상을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 화장료 조성물에 포함되는 각 원료들은 모두 다른 메카니즘을 통해 피부에 작용하여 피부 노화 완화에 도움을 줄 수 있다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 전체 조성물에 대하여 상기 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드-67 팔미테이트, 팔미토일 펜타펩타이드-4, 카퍼트리펩타이드-1 또는 트리펩타이드-29는 각각 0.005 내지 0.1%(w/v)로 포함이 되며,

상기 콜라겐 발효물 또는 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 1 내지 10%(v/v)로 포함될 수 있다.

바람직하게는 상기 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드-67 팔미테이트, 팔미토일 펜타펩타이드-4, 카퍼트리펩타이드-1 또는 트리펩타이드-29는 각각 0.005 내지 0.05%(w/v)로 포함이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.05%(w/v)로 포함이 될 수 있다.

또한, 상기 콜라겐 발효물 또는 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 바람직하게는 5 내지 10%(v/v)로 포함이 될 수 있다.

본 발명에서 상기 “콜라겐 발효물”은 락토바실러스속 미생물로 발효된 콜라겐인 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 이전 연구를 통하여 락토바실러스속 미생물을 이용할 경우 저분자화된 콜라겐을 효과적으로 제조할 수 있음을 확인한 바 있다.

본 발명에서 상기 락토바실러스속 미생물은 락토바실러스 애시도필러스(acidophilus), 락토바실러스 퍼멘텀(fermentum), 비피도박테리움 비피덤(bifidum) 락토바실러스 카세이(casei), 락토바실러스 루테리(reuteri), 락토바실러스 비피덤(bifidum), 락토바실러스 가세리(gasseri), 락토바실러스 플란타룸(plantarum), 락토바실러스 존소니(johnsonii), 락토바실러스 람노수스(rhamnosus), 락토바실러스 파라카세이(paracasei) 및 락토바실러스 크리스파투스(crispatus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이생의 미생물을 이용함으로써 타 유산균 균주를 이용할 경우에 비해 콜라겐 저분자화가 매우 우수하여 콜라겐 발효에 가장 적합할 수 있다. 바람직하게는 상기 미생물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)일 수 있다.

본 발명의 상기 콜라겐 발효물은 다음과 같은 방법에 의해 제조된 것일 수 있다: 예컨대, 락토바실러스속 미생물이 10⁷~10¹⁰cfu/㎖으로 포함된 배지를 0.5~5중량부 접종시켜 35~39℃에서 1~5일간 배양하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 10⁸~10⁹cfu/㎖의 배양액으로 0.5~2중량부 접종시켜 36~38℃에서 2~4일간 배양하여 수행될 수 있다. 이때 배양에 사용되는 배지는 펩톤, 아세트산 나트륨 수화물, 황산 마그네슘 수화물, 황산 망간 수화물, 트윈 80, 시트르산 아암모늄, 인산 이칼륨 및 증류수를 포함하여 구성될 수 있고, 여기에 상기 배지 100중량부에 대하여 1~10중량부, 바람직하게는 2~5중량부의 콜라겐을 혼합하여 사용될 수 있다.

발효물은 크게 발효 여과물(Ferment Filtrate)과 발효 용해물(Ferment Lysate)로 분류될 수 있는데 발효 여과물은 발효가 완료된 후 여과장치를 통해 미생물을 제거한 상등액(supernatant)을 활용하는 것이고 발효 용해물은 발효 완료 후 미생물을 열, pH, 효소 (Lysozyme) 고압 등을 활용하여 균을 사멸하여 활용하는 것을 의미한다. 본 발명에서 상기 발효 콜라겐은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 발효 여과물일 수 있다.

본 발명에서 발효 콜라겐 제조에 사용되는 콜라겐은 중량평균분자량이 50,000~500,000인 것이 사용될 수 있고, 활용 미생물을 고려하여 중량평균분자량이 100,000~300,000인 것이 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 아이스플랜트는 메셈브리안트뭄(Mesembryanthemum)속의 다육식물로서 발아율이 낮고 성장속도가 느리다. 원산지는 남아프리카의 나미브 사막이며 주요 분포 지역은 아프리카 남부, 동서부, 북부, 오스트레일리아 남서부,아메리카의 서쪽 건조지역이다. 표면에 있는 투명한 결정체(블러더 세포)에는 이노시톨류, 베타카로틴과 같은 인체에 유용한 성분과 각종 미네랄을 함유하고 있다. 줄기와 잎의 블러더 세포는 얼음결정과 같은 모양을 가지고 있어 `아이스플랜트'라 불린다. 특히, 아이스플랜트에는 혈당치를 낮추는 피니톨(pinitol)과 중성지방을 억제하는 마이요이노시톨(myoinosito)을 많이 함유하고 있기 때문에 잎과 줄기를 생식하거나 즙액으로 사용하면 당뇨병 환자에 적합한 힐링 푸드롤 각광을 받고 있다. 특히 사막에 자생하고 있는 식물은 물이 부족한 환경에 적응하기 위해 식물 내부에 수분을 잘 보호 할 수 있는 보습성분을 다량 보유하고 있는 데 화장품 업계에서는 이점을 착안하여 다양한 보습 및 항산화 소재로 활용하고 있으며 아이스플랜트 또한 사막에서 자라는 식물로 식물 내부에 다양한 종류의 보습 성분을 함유하고 있다.

본 발명에서 상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 (1) 아이스플랜트 추출물을 제조하는 단계; 및 (2) 상기 아이스플랜트 추출물과 콜라겐을 혼합한 후 바실러스속 미생물 또는 락토바실러스속 미생물을 접종하여 발효를 진행하는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조된 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 아이스플랜트 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6인 알코올, 헥산, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것일 수 있다. 본 발명의 추출물은 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 6인 알코올 및 이들의 혼합용매에서 선택된 용매로 추출한 것일 수 있으며, 또는 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올 수용액일 수 있다. 상기 알코올 수용액의 농도는 10 내지 100%(v/v)일 수 있으며, 바람직하게는 70 내지 100%(v/v)일 수 있다. 본 발명의 추출 용매는 가장 바람직하게는 95%(v/v)의 에탄올 수용액일 수 있다.

본 발명에서의 아이스플랜트 추출방법은 당업계에 공지된 것이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 냉침, 열수 추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 방법이 있으나 여기에 국한되는 것은 아니다. 바람직하게는 열수 추출일 수 있다.

상기 방법으로 제조된 추출물은 여과하여 여액을 모으고, 다시 잔사에 원료 중량의 4 내지 7배의 추출 용매, 예컨대 물을 가하여 환류냉각 추출 조건으로 4시간 동안 재추출하고 여과하여 이전의 여액과 혼합함으로써 추출 효율을 높일 수 있다. 본 발명의 추출물이 추출의 횟수에 한정되는 것은 아니다.

상기와 같이 추출한 후 합한 여액은 40 내지 60℃에서 감압농축하여 추출물 중에 잔존하는 용매를 제거하고, 감압농축된 농축물 중량의 25 내지 50배의 물로 2 내지 3회 공비 농축한 후 재차 동량의 물을 가하여 균질하게 현탁시킨 후 최종 추출물은 추가적으로 더욱 정제할 수도 있고, 동결건조 등의 방법에 의해 건조시켜 용매를 제거하여 고형화하거나 분말 형태로 제조할 수 있다.

상기 아이스플랜트 추출물을 콜라겐과 혼합한 후 바실러스속 미생물 또는 락토바실러스속 미생물을 접종하여 발효하는 단계를 진행한다.

상기 아이스플랜트 추출물과 콜라겐을 혼합하는 비율은 특별히 제한되지 않으며 1:0.001~5의 비율로 혼합할 수 있다.

또한 상기 미생물을 아이스플랜트 추출물 및 콜라겐 혼합물에 접종하는 농도, 발효온도, 발효시간 등은 당업계에서 공지된 일반적인 방법을 적용할 수 있다.

본 발명에서 상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물을 제조하기 위해 사용되는 락토바실러스속 미생물은 전술한 바와 같으며, 바실러스속 미생물은 바실러스 서브틸리스(subtilis), 바실러스 세레우스(cereus), 바실러스 쑤린지엔시스 97-27(thuringiensis 97-27), 바실러스 웨이헨스테판넨시스(weihenstephanensis) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(amyloliquefaciens)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 (2) 단계 이후에 발효물을 용해하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합 발효물 제조방법을 제공할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명에서 상기 혼합 발효물은 이러한 용해단계를 거친 발효 용해물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 사람 유래의 세포에 독성을 나타내지 않아 피부 노화 완화용 조성물로서 활용도가 매우 높다. 본 발명에 따르면, 100 ng/ml-1000 μg/ml의 농도로 HaCat 세포 및 NIH3T3 세포에 해당 조성물을 처리한 결과, 현저한 세포 독성은 측정되지 않았으며 육안으로 세포의 형태를 확인하였을 때도 큰 변화는 관찰되지 않았다(도 2,3).

본 발명의 상기 화장료 조성물은 50℃ 온도에서도 우수한 열안정성을 나타내며, 일광조건에서도 안정함을 확인하였다(도 3,4).

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 조성물이 처방된 크림과 무처방 크림을 비교한 결과 본 발명의 조성물이 처방된 크림에서 무처방된 크림에 비해 임상조건에서 눈가 노화 개선 효능, 보습효능, 피부탄력 효능, 피부리프팅 효능, 진피 친밀도 증가 등이 우수함을 확인하였다(표 3,4,5,6 도 6)

따라서, 본 발명은 콜라게나제 저해 , 콜라겐 생성 촉진, 피부탄력 개선 및 보습 효과가 매우 우수한 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 상기 펩타이드는 2 내지 6개의 아미노산 잔기로 구성되어 매우 분자량이 작아 피부 침투율이 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 도포하는 경우 높은 피부 침투율로 인해 피부 노화 완화 효과를 달성할 수 있다. 본 발명의 조성물은 콜라게나제를 억제하므로 노화 완화에 효과가 있으며 피부 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하여 안티에이징에도 효과적이다. 또한 사람을 대상으로 한 임상시험에서 눈가 노화 개선 효능, 보습효능, 피부탄력 효능, 피부리프팅 효능, 진피 친밀도 증가 개선에도 효과적이다.

본 발명에 따른 상기 펩타이드, 콜라겐 발효물 함유 조성물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 젤 타입, 스킨 타입, 크림 타입, 연고 타입 등의 화장료 조성물에 적용될 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 상기의 조성물은 그것의 타입에 따라 적절한 통상의 연화제, 유화제, 증점제 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 물질들을 첨가하여, 공지의 방법에 의해 적절하게 제조될 수 있다.

상기 젤 타입 조성물은 트리메틸올프로판, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세린 등의 연화제, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 이소세틱알콜 등의 용매, 정제주 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 스킨 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 부틸렌 글라이콜, 글리세린, 알란토인, 메틸 파라벤, 이디티에이-2-소디움, 잔탄검, 디메티콘, 폴리 에틸렌 글라이콜-60 하이드로제네이트 카스톨 오일, 폴리 소르베이트 60 및 정제수 등을 첨가하여 제조 할 수 있다.

상기 크림 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 소프파티질세린, 소프파티딜이노시톨 등의 리피드, 이들의 유도체, 글리세릴 스테아레이트, 소르비탄 팔미테이트, 소리비탄 스테아레이트 등의 유화제, 아보카도 오일, 살구 오일, 바바수 오일, 유리지치 오일, 동백 오일 등의 천연 지방 또는 오일, 프로필렌글리콜 등의 용매 및 정제수 등을 첨가하여 제조 할 수 있다.

상기 연고 타입 조성물은 연화제, 유화제 및 마이크로크리스탈린납, 파라핀, 세레신, 밀납, 경납, 바세린 등의 왁스를 첨가하여 제조할 수 있다.

또한 본 발명은 활성 성분으로서 상기 조성물들과 하나 이상의 화장료적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제제로 제공될 수 있다.

따라서, 상기 제제에는 화장료적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 이들의 조합이 필요에 따라 포함될 수 있다. 이들 제제는 생물체 내로 활성 성분의 투여를 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부 투과도가 매우 우수하며, MMP-1 발현을 억제, 피부세포 내 콜라겐 생성을 촉진하여 피부 주름 개선효과를 나타낼 수 있으며, 피부 탄력 및 피부 보습력을 증대시켜 피부의 노화를 완화하는 효과를 나타낸다.

도 1는 본 발명에 따른 조성물의 MMP-1 저해능을 확인한 그래프이다.
도 2은 본 발명에 따른 조성물의 콜라겐 생성 촉진능을 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 조성물의 열 안정성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 조성물의 광 안정성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 조성물의 세포독성을 NIH3T3 세포에서 확인한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 조성물의 세포독성을 HACAT 세포에서 확인한 그래프이다.
도 7은 임상시험을 통해 확인된 눈가 주름 개선 효과를 나타내는 비교사진 자료이다.
도 8은 임상시험을 통해 확인된 피부 보습 개선 효과를 나타내는 비교사진 자료이다.
도 9은 임상시험을 통해 확인된 피부 탄력 개선 효과를 나타내는 비교사진 자료이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<제조예 1>

콜라겐 발효물의 제조

고분자 콜라겐(Mw 100,000~300,000)을 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)를 사용하여 발효하였으며, 상기 락토바실러스 파라카제이는 한국세포주 은행에서 구입하여 사용하였다.

락토바실러스 파라카제이를 선택 배지에 순수 배양하여 균수가 10⁸~10⁹cfu/㎖ 정도 되는 배양액을 1중량% 함량으로 콜라겐 용액에 접종하고, 37℃의 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하여 발효를 진행하였다. 배양에 사용된 배지로는 펩톤 5g, 아세트산 나트륨 3 수화물 2.5g, 황산 마그네슘 7 수화물 0.5㎖, 황산 망간 4 수화물 0.5㎖, 트윈 80 5㎖, 시트르산 이암모늄(diammonium citrate) 1g, 인산 이칼륨(dipotassium phosphate) 1g 및 증류수 480㎖로 구성된 최소 배지에 15g의 콜라겐이 혼합된 배지를 사용하였다.

배양이 완료된 후 배양액을 4,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 유산균과 배양액을 분리한 후 분리된 배양액을 SDS-PAGE를 활용하여 콜라겐의 저분자화를 확인하였다(결과 미첨부).

<제조예 2>

아이스 플랜트 추출물 및 콜라겐 발효 혼합물의 제조

아이스플랜트 열수 추출물과 고분자 콜라겐(Mw 100,000~300,000)을 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)를 사용하여 발효하였으며, 상기 락토바실러스 파라카제이는 한국세포주 은행에서 구입하여 사용하였다.

구체적으로, 상기 락토바실러스 파라카제이 균주를 선택 배지에 순수 배양하여 균수가 10⁸내지 10⁹cfu/ml정도 되는 배양액 1%를 접종하고, 37℃ 인큐베이터에서 72 시간 동안 배양하여 진행하였다. 배양에 사용한 배지는 펩톤 5 g, 아세트산 나트륨 3 수화물 2.5 g, 황산 마그네슘 7 수화물 0.5 ml, 황산 망간 4 수화물 0.5 ml, 트윈 80 5 ml, 시트르산 이암모늄(diammonium citrate) 1 g, 인산 이칼륨(dipotassium phosphate) 1 g, 및 증류수 480 ml로 구성된 최소 배지에 아이스플랜트 열수 추출물과 15g의 콜라겐을 혼합하여 사용하였다.

배양이 완료된 후 배양액을 4000rpm, 10분 동안 원심분리하여 유산균과 배양액을 분리한 후 배양액을 수득하여 발효 혼합물을 제조하였다.

<제조예 3>

항노화 기능성 원료 조합물의 제조

피부 항노화에 효과가 있다고 알려진 5종의 펩타이드 원료와 상기 제조예 1 및 2에서 제조한 콜라겐 발효물 및 혼합 발효물의 농도를 조정하여 총 23종의 조합을 선정하였으며 선정된 조합 내 성분들의 조성비는 하기 표 1과 같다. 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드-67 팔미테이트, 팔미토일 펜타펩타이드-4, 카퍼트리펩타이드-1 및 트리펩타이드-29는 하기 표 1에 기재된 농도로 물에 용해하였으며(w/v), 콜라겐 발효물 및 아이스플랜트/콜라겐의 혼합 발효물은 상기 제조예 1 및 제조예 2의 방법에 따라 제조한 후 하기 표 1에 기재된 농도로 물에 첨가하여(v/v) 조성물을 제조하였다.

<실시예 1>

콜라게나제 활성 저해능 평가

노화 완화 조성물의 다양한 조합의 피부 주름 개선효과를 확인하기 위해 표 1에 열거한 조합물을 하기와 같이 생체 외(In vitro) 콜라게나아제(collagenase) 활성 제해 실험을 진행하였고, 그 결과를 표2에 나타내었다.

콜라게나아제(collagenase) 활성 저해 시험 방법은 콜라겐을 인산 완충액에 녹여 준비한다(100ppm). 이때 양성 대조군으로 아데노신을 같은 농도로 준비한다. 25mM 시트르산을 400㎕/tube 첨가하여 반응을 종료시킨다. 이후 에틸아세테이트를 1.5㎖/tube 첨가하고, 볼텍싱(vortexing)한 후 상등액을 취하여 황산나트륨 150mg/ep-tube에 옮기고, 볼텍싱 후 원심분리(10,000rpm, 3분)한다. 상등액 300㎕/ep-tube를 취하여 석영 96well 플레이트에 옮긴 후 320nm에서 흡광도를 측정한다.

측정 결과 대다수의 조합에서 대조군인 아데노신에 비해 우수한 콜라게나제 억제능을 확인하였다. 그리고 펩타이드와 발효물의 농도 분포가 균일할수록 효능이 우수하며 특정한 펩타이드와 발효물의 함량이 편중될수록 효능은 낮아지는 것으로 파악되었다.

<실시예 2>

MMP -1 (Matrix Metalloproteinase - 1)활성 저해 실험

콜라게나제 억제능 실험을 통해 선별된 7종의 조합을 MMP-1활성 저해능 시험을 진행 하였다.

사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's media, Sigma)에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Sigma)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 2 X 10⁵ cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 대조군에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 디쉬에는 선정되 7종의 실험군과 대조군으로 레티놀을 10 ug/ml의 농도가 되도록 처리를 하였다. 각각의 디쉬에 시험물질을 가한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여 Matrix Metalloproteinase-1(MMP-1),Human,biotrak,ELISA kit (GE healthcare RPN2610)을 통해 MMP-1의 저해능을 측정하였다.

7 종의 실험군을 농도별로 처리한 뒤 MMP-1 억제효과를 측정하였다. 멜라닌의 양이 대부분의 실험군에서 대조군인 레티놀에 비해 줄어드는 것을 확인하였으며 실험군 내에서도 조성물 내 기능성 원료성분의 조합 및 조성물에 따라 차이가 있는 것으로 확인되었다(도 1). 이러한 결과로부터 피부에 MMP-1생성을 유발하는 UV가 요인으로 적용되었을 때, 단일 원료를 이용한 경우에 비해 다양한 조합물을 혼합하여 사용하는 것이 더 유용한 결과를 나타내어 MMP-1생성을 저해하여 피부의 주름을 억제할 수 있을 것으로 사료된다.

<실시예 3>

세포 내 콜라겐 생성능 시험

MMP-1 저해능 시험에서 선별된 5종의 조합에 대해 세포 내 collagen 생성능 시험을 진행하였다. 시험에 사용할 사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 Medium 106 (cascade biologics, M-106-500) 에 1X LSGS(Low Serum Growth Supplement, cascade biologics S-003-10)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 1X 10⁵ cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 대조군에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 디쉬에는 5여종의 실험군과 대조군으로 TGF를 10μg/ml의 농도가 되도록 처리를 하였다. 각각의 디쉬에 시험물질을 가한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여) Procollagen Type I C-peptide(이하 PIP) EIA kit (takara MK101) 을 통해 Collagen 생성을 측정하였다.

5여 종의 실험군을 농도별로 처리한 뒤 collagen 생성률을 측정하였다. 멜라닌의 양이 대부분의 실험군에서 collagen 생성이 촉진되는 것으로 확인되었으며 실험군 내에서도 조성물 내 기능성 원료성분의 조합 및 조성물에 따라 차이가 있는 것으로 확인되었다(도 2). 이러한 결과로부터 피부에서의 collagen 생성을, 단일 원료를 이용한 경우에 비해 다양한 조합물을 혼합하여 사용하는 것이 더 유용한 결과를 나타내어 collagen 생성을 증가시켜 피부의 주름을 억제 할 수 있을 것으로 사료된다.

<실시예 4>

조성물의 안정성 확인 실험

본 발명의 노화 완화 조성물의 열과 광안정성을 확인하기 위하여, 노화 완화 조성물이 10 mg/mL이 되도록 조성물을 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액에 용해하여 유리 바이알에 분주하여 넣은 후 50 ℃ 에서 7, 14, 21, 28, 35, 42 및 60일 보관하며 열에 의한 조성물 내 펩타이드 성분의 손실을 측정하고 동일한 방법으로 일광 조건에서 안정성 여부를 측정하였다(도 3,4). 열에 의한 펩타이드 손실을 측정하고 일광 조건에서 안정성 여부를 측정한 결과, 60일까지 단지 10% 미만의 펩타이드 손실을 나타내어 열 및 보관기간에 있어 높은 안정성을 갖는다는 것을 확인하였다.

<실시예 5>

조성물의 세포독성 실험

본 발명의 조성물의 대한 각질세포내독성이 있는지의 여부를 확인하기 위하여, 세포 독성 평가는 MTT assay를 이용하여 측정하였다. HACAT세포와 3T3세포를 24 well plate에 각 well당 4 X 10⁴ cells/24well의 세포수가 되도록 seeding 한 후 24 h 동안 37 ℃, 5% CO2조건으로 항온 배양하였다. PBS로 2회 세척 후 배양 후 합성 tranexamic acid dipeptide를 농도별(1mg ~ 1ug/mL)로 처리하여 24 h 동안 항온 배양하였다. 배양 후 MTT 0.5% in DPBS를 배양배지와 1:9(v/v)로 혼합하여 첨가한 후 2h 동안 CO2 incubator에서 배양한 후 생성된 formazan을 DMSO에 녹여 ELISA를 이용하여 570 nm에서 측정하였다. 도 5, 6에서 보는 바와 같이, 각질세포주의 일종인 HaCat 세포, 섬유아세포의 일종인 NIH3T3 세포에 대하여, 저농도에서 고농도까지 투여한 조성물에 의한 세포수의 감소는 관찰되지 않았으며, 세포들의 현미경적인 관찰에서도 별다른 변화가 관찰되지 않았다

이를 통해 본 발명의 노화 완화 조성물은 피부 관련 세포에 독성이 전혀 없음을 알 수 있으며, 이로써 본 노화 완화 조성물을 피부에 처리하여도 큰 영향을 끼치지 않으리라는 것을 예측할 수 있다.

<실시예 6>

눈가 주름 개선 임상 시험

본 노화 완화용 조성물의 임상 시험을 확인하기 위해 공인 인증 기관에 의뢰하여 조성물이 처방된 화장품 제형의 노화 완화 효과를 확인하였다.

In vitro에서 피부 주름개선 효능이 높았던 1종의 화장료 조성물을 선정하여 하기 표6 에서 제시한 크림의 조성에 화장료 조성물을 넣은 크림을 제조하였으며 만 30~50세의 성인 여성을 대상으로 수행하였다. 시험 제품은 안면 부위에 사용방법에 따라 사용하도록 하였으며, 눈가 주름 개선에 대한 효과를 평가하였다. 평가는 센터 내부 지침서(SOP)에 준하여 수행하였으며, 식품의약품안전처 고시에 규정하지 않은 사항은 참고 문헌을 참조하여 수행하였다.

주름 측정은 PRIMOS(Phaseshift Rapid In-vivo Measurement Of Skin)를 이용하여 눈가 부위를 측정하였고, 시험 부위에 대한 정확한 재현성을 위해 기존 측정부위와 새로운 측정부위가 동일할 수 있도록 overlay 기능을 사용하여 측정하였다. PRIMOS는 미세주름을 측정하기 위한 장비로 DMD(Digital Micromirror Device)에서 만들어진 미세한 줄무늬(fringe fraction)가 피부에 투영된다. 투영된 영상은 3차원 profile 정보로 나타나며 필터과정을 통해 PRIMOS프로그램(GFM, Germany)으로 분석된다. PRIMOS 분석 변수로는 Ra와 R3z를 선정하였다.

Ra (Arithmetic roughness average)는 PRIMOS로 측정된 주름의 거칠기 단면 peak에 대한 산술 평균값으로 Ra값이 작아질수록 피부 주름의 깊이가 낮아져 주름이 개선됨을 의미하며, 단위는 ㎛이다.

R3z(Base roughness depth)는 R3z1부터 R3z5까지 5가지의 단일 거칠기 깊이에 대한 산술 평균으로 나타낸다. 단일 거칠기 깊이는 거칠기 단면의 단일 평가 거리(Ir)에서 세번째로 높은 단면 peak과 세번째로 깊은 곡선 사이의 수직거리를 의미한다. R3z의 값이 작아질수록 피부의 주름 깊이가 낮아짐을 의미하며 주름 개선이 되었음을 의미한다.

두 군 간의 눈가 주름 변화 분석 결과, 표3, 4, 5 과 확인한 바와 같이 시험군은 대조군과 비교하여 Ra, R3z에서 제품 사용 8주 후 통계적으로 유의한 수준의 눈가 주름 개선 효과가 있음을 알 수 있었다(도 7)( p <0.05).

<실시예 7>

피부 수분 개선 임상 시험

수분 측정은 Corneometer(CM825, Courage and Khazaka Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 하기 표 6 에서 제시한 크림의 조성에 화장료 조성물을 넣은 크림을 제조하여 임상 시험에 활용하였으며 양성대조군으로 히알루론산 1% 용액이 처방된 동일한 성분의 크림도 활용하였다. 측정은 제품 사용 전,세안 직후, 세안 후 30분 후, 바른 직후 바른 후 10, 20, 30 60 분 후에 측정하였다.

Corneometer로 측정한 3개의 값을 이용해 평균값을 구하였다. 수분량이 높을수록 측정 수치가 높아지며, 측정 계수는 Arbitrary unit(A.U.)이다.

통계분석은 제품 사용 전, 후의 차이 비교를 위해 쌍체 검정(paired t-test)법으로 분석하였다. 모든 통계 결과는 생물학적 통계분석에서 가장 많이 사용하는 유의차 5%(p<0.05)일 때 통계적 유의성이 있다고 간주하였으며, 통계분석은 SPSS 18.0 software를 사용하였다.

실험 결과 노화 완화 조성물이 포함된 실험군에서 유의미하게 피부 보습 개선 효과가 있는 것으로 확인하였으며 대조군으로 활용된 히알루론산 보습제에 비해서도 우수한 효과를 확인할 수 있었다 (도 8).

<실시예 8>

피부 탄력 개선 임상 시험

피부 탄력 측정은 눈가에서 3cm떨어진 부위에 Cutometer(MPA 580, Courage and Khazaka Electronic Co., Germany)를 사용하여 측정하였다. 하기 표 6에서 제시한 크림의 조성에 화장료 조성물을 넣은 크림을 제조하여 임상 시험에 활용하였으며 평가는 3회 실시하였고, 3개의 값에 대한 평균을 사용하였다. 변수로는 R2, R5, R7값을 선정하였으며, 값이 높아질수록 피부 탄력이 개선됨을 의미한다. 이번 시험에서는 변수 R2에 관하여 제품 사용 전(0주)과 제품 사용 4주 후에 값을 측정하였으며, 측정계수는 arbitrary unit(A.U.)이다.

통계분석은 제품의 사용 전, 후 탄력 변화에 대한 측정 결과를 쌍체 검정(paired t-test)법으로 분석하였다. 모든 통계 결과는 생물학적 통계분석에서 가장 많이 사용하는 유의차 5%(p<0.05)일 때 통계적 유의성이 있다고 간주하였으며, 통계분석은 SPSS 18.0 software를 사용하였다.

임상시험 결과 대조군에 비해 유의하게 피부 탄력 개선 효과가 있음을 확인하였다(도 9).

이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (5)

1. 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드-67 팔미테이트, 팔미토일 펜타펩타이드-4, 카퍼트리펩타이드-1, 트리펩타이드-29, 콜라겐 발효물 및 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물이고,
   전체 조성물에 대하여 상기 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드-67 팔미테이트, 팔미토일 펜타펩타이드-4, 카퍼트리펩타이드-1 및 트리펩타이드-29는 각각 0.01 내지 0.05%(w/v)로 포함되고, 상기 콜라겐 발효물 및 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 각각 5 내지 10%(v/v)로 포함된 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 콜라겐 발효물은 락토바실러스속 미생물로 발효된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 바실러스속 미생물 또는 락토바실러스속 미생물로 발효된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 콜라게나제 저해, 콜라겐 생성 촉진, 피부탄력 개선 및 보습 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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