JP5948374B2 - 高麗人参果実アギタケ発酵液を含有する化粧料組成物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、高麗人参果実アギタケ発酵液を有効成分として含有する化粧料組成物の製造方法に関し、より具体的には、高麗人参果実抽出物をアギタケ菌糸体で発酵させて製造される発酵液を有効成分として含有する化粧料組成物の製造方法に関する。

皮膚の老化は、内因性老化（intrinsic, chronological aging）と光老化（photoaging）との２つに分けられる［Gilchrest BA:J. Am. Acad. Dermatol., 21, 610-613(1989)］。内因性老化は、年齢が増えるにつれて生体の生理的な機能が低下し、自然に引き起こされる老化現象である［Braverman IM等:J. Invest. Dermatol., 78, 434-443(1982)］。光老化は、皮膚が光に繰り返し露出し、皮膚の外見または機能が変わることを意味する［Ｒidder GM等:J. Am. Acad. Dermatol., 25, 751-760(1991)］。これ以外にも、皮膚の老化は、紫外線、ストレス、病態、環境因子、傷、加齢による活性酸素種の活性化により引き起こされ、このような状態が酷くなる場合、生体内に存在する抗酸化防御網を破壊し、細胞及び組織を損傷し、成人病及び老化を促進するようになる。さらに具体的には、皮膚の主要構成物質である脂質、タンパク質、多糖類、及び核酸等が酸化し、皮膚細胞及び組織が破壊され、結果として皮膚の老化現象が生じることである。特に、タンパク質の酸化は、皮膚の結合組織であるコラーゲン、ヒアルロン酸、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン等が切断され、酷い過多炎症反応が起こり、皮膚の弾力に支障を与え、これがさらに酷くなると、ＤＮＡの変異により突然変異、癌の誘発、免疫機能低下にまで至ってしまう。

そのため、身体の代謝過程中に発生する活性酸素種や紫外線照射、炎症反応による活性酸素種を消去し、細胞膜を保護し、また、既に損傷した細胞は、活発な新陳代謝により再生させ、細胞を増殖させなければ、皮膚が回復されず、健康な皮膚を維持することができない。老化には、活性酸素種だけでなく、ＭＭＰ(matrix metalloproteinase)という酵素が関与するが、生体内におけるコラーゲンのような細胞外気質の合成と分解は、適宜調節され、または老化が進行するにつれてその合成が減少し、コラーゲンを分解する酵素である基質金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）の発現が促進し、皮膚の弾力が低下し、しわが形成される。また、このような分解酵素は、紫外線露出により活性化することもある。そのため、細胞内において紫外線により活性化が誘導されるＭＭＰの発現を調節し、またはその活性を抑制することができる物質の開発が要求されている。しかしながら、これまで、化粧品の素材として用いられた原料は、分解酵素（ＭＭＰ）の活性のみを単純抑制することが殆どであった。

一方、メラニンは、色素細胞内に存在するチロシナーゼの作用により、チロシンからドーパ、ドーパキノンに変換され、ドーパクロム等を経て生成する。メラニンは、皮膚に存在し、紫外線等から身体を保護し、体内ホルモン分泌の調節に重要な機能を果たす。しかしながら、メラニンが過剰生産されると、しみ、そばかす等が生じ、皮膚の老化を促進し、皮膚癌の誘発に重要な作用をするものと知られており、メラニン過剰生産を予防するための研究開発が、現在、活発に進行している。既に、アスコルビン酸（特許文献１）、ヒドロキノン（特許文献２）、コウジ酸（特許文献３）、アルブチン（特許文献４）、及び植物抽出物等がチロシナーゼ阻害活性を示し、美白化粧料として用いられている。しかしながら、これらの成分は、化粧品の剤形のうち、安定性が悪く、分解し着色され、異臭が生じ、生体水準での効能、効果が不明であり、または安定性が問題となり、その使用が制限されている。

一方、人体において、皮膚は、外部環境から生体を保護する保護膜の機能をする器官であって、人体内の生体成分、すなわち、水や電解質等の損失を防ぐとともに、有害物質が外部から人体内に進入しないようにする役割をする。このような皮膚は、表皮層、真皮層、及び皮下脂肪層に大別される。表皮層は、角質細胞とメラニン細胞で構成されるが、皮膚の最外郭の角質細胞層は、外部環境と直接接触するので、物理的、化学的、または物質の透過への強い抵抗性が要求され、人体から外部へ水分が損失することを防ぐとともに、そのものも適当な水分を有することにより、柔軟性を維持しなければならない。

一般に、皮膚の水分量は、真皮層では約７０％であるが、表皮層に行くほど減少し、角質細胞層では、約１０〜３０％となる。真皮層から供給された水は、主に手動的拡散により、角質層の上部に移動し、最終的には外部に排出される。これを経皮水分損失（Trans Epidermal Water Loss：ＴＥＷＬ）といい、このような経皮水分損失を適切な水準に維持させることが、角質細胞層の脂質膜成分である皮脂成分と表皮脂質であると知られている。

一方、角質細胞層には、天然保湿成分（Natural Moisturizing Factor：ＮＭＦ）という親水性の水分保有能を有した物質が存在し、皮膚の保湿に重要な役割を果たすものと知られている。正常の角質細胞層は、水分が１０〜３０%程度に維持されると、皮膚は滑らかで柔らかく、身体保護機能を正常に発揮するようになる。しかし、角質細胞層の水分含量が１０%以下となると、皮膚は荒れ、身体の保護機能を失い、老化現象が生じる。例えば、乾性皮膚の場合は、角質細胞の結集力が弱化し、皮膚表面から白く鱗片のように角質細胞が剥けてしまうスケーリング現象が生じてしまう。このように皮膚が乾性するのは、角質細胞層の水分含量が正常皮膚よりも少ないからである。それ以外に、健康な皮膚であっても、厳しい外部環境、すなわち、風、寒さ、日光、洗顔、シェービング等により、水分不足の現象が生じ、皮膚状態が悪くなったりする。

したがって、皮膚の角質細胞層の水分含量を適宜維持することは極めて重要である。このため、化粧品には、皮脂と類似した成分やＮＭＦ成分またはポリオールのような保湿剤等が添加されて用いられている。例えば、水溶性ポリオールとして、水酸基（ОＨ基）が３つ以上であるグリセリン、ソルビトール等は、優れた保湿力を示すが、べたつきが酷く、使用時に不快感を感じさせ、水酸基（ОＨ基）が２つであるプロピレングリコール、１，３‐ブチレングリコール等は、皮膚の副作用が生じる。また、他の天然保湿成分であるピロリドンカルボン酸ナトリウム（ＰＣＡ−Ｎａ）、乳酸ナトリウム（Sodium lactate）、ヨウ素等は、電解性が強く、化粧料の乳化安定性を損なうという問題点があった。アミノ酸、コラーゲン、エラスチン等も保湿能力があるが、保湿能力に限界があった。

角質層の水分を保有する能力は、皮脂成分とアミノ酸、乳酸、ヨウ素、及び無機塩からなる天然保湿成分（ＮＭＦ）により調節されるが、皮膚外用剤における天然保湿成分のように安全であるとともに、使用性に優れ、保湿効果の高い物質の開発が、化粧品において重要な研究課題の一つである。

一方、近年、様々な化学物質等による皮膚への刺激を減らすために、天然物を用いた化粧品が多く開発されている。天然材料は、皮膚に副作用が少ないだけでなく、天然材料を用いた化粧品に対する消費者のニーズが高まるにつれ、化粧品原料としての開発価値が一層増えている。例えば、特許文献５には、高麗人参果実抽出物を含有する皮膚外用剤組成物に関し、高麗人参果実抽出物を有効成分として含有することを特徴とする化粧品が記載されている。

特開平４‐９３２０号公報 特開平６‐１９２０６２号公報 特開昭５６‐７７１０号公報 特開平４‐９３１５０号公報 大韓民国特許登録番号第１００８８７６３１号

本発明の課題は、皮膚化粧料に適用可能で、人体に無害、且つ安全性が極めて高い高麗人参の果実を利用した化粧料組成物を提供することである。

本発明者は、様々な天然物における化粧品としての応用の可能性を研究した結果、高麗人参果実抽出物をアギタケ菌糸体で発酵して製造された抽出物において、抗酸化、抗炎症、コラーゲン合成促進、皮膚のしわ改善、美白、保湿、皮膚の障壁機能の改善、アトピー改善効果を確認し、本発明を完成するに至った。即ち、上述した課題を達成するために、本発明は、高麗人参果実抽出物をアギタケで発酵させて得た高麗人参果実アギタケ発酵液を有効成分として含有する化粧料組成物を提供する。

また、上述した本発明の化粧料組成物は、一例として、抗酸化用、抗炎症用、皮膚のしわ改善用、皮膚美白用、皮膚保湿用、及びアトピー改善用のうち、いずれか一つであってもよい。

また、上述した本発明の化粧料組成物において、前記高麗人参果実抽出物は、水、炭素数１〜４個の無水または含水低級アルコール、アセトン、エチルアセテート、ブチルアセテート、及び１，３‐ブチレングリコールよりなる群から選ばれるいずれか一つの抽出溶媒を用いて抽出されたものであってもよい。

また、上述した本発明の化粧料組成物において、前記発酵液は、化粧料組成物の全重量に対して０．０００１〜３０．０重量％添加されることが好ましい。

本発明による高麗人参果実アギタケ発酵液は、高麗人参果実の単純抽出物に比べて、抗酸化、抗炎症、コラーゲン合成促進、皮膚のしわ改善、美白、保湿、皮膚の障壁機能改善、アトピー改善の効果が顕著に増加することが確認できた。

したがって、本発明は、上述した優れた機能性を有する化粧料組成物を提供することができるという優れた効果を奏する。

製造例１から得られた高麗人参果実抽出物及び実施例１、比較例１〜４から得られた高麗人参果実発酵液の濃度別（０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．０１％）のフリーラジカル捕捉活性能を比較したグラフである。図１において、「ＥＧＣＧ」は没食子酸エピガロカテキン（Epigallocatechin gallate）で、「ａ」は製造例１の高麗人参果実抽出物であり、「ｂ」は実施例１の高麗人参果実アギタケ発酵液であり、「ｃ」は比較例１の高麗人参果実マツタケ発酵液であり、「ｄ」は比較例２の高麗人参果実コウタケ発酵液であり、「ｅ」は比較例３の高麗人参果実メシマコブ発酵液であり、「ｆ」は比較例４の高麗人参果実マンネンタケ発酵液である。 製造例１から得られた高麗人参果実抽出物及び実施例１、比較例１〜４から得られた高麗人参果実発酵液の濃度別（０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．０１％）の５‐リポキシゲナーゼ阻害活性を比較したグラフである。「ＮＤＧＡ」はノルジヒドログアイヤレチン酸（Nordihydroguaiaretic acid）を意味し、「ａ」は製造例１の高麗人参果実抽出物であり、「ｂ」は実施例１の高麗人参果実アギタケ発酵液であり、「ｃ」は比較例１の高麗人参果実マツタケ発酵液であり、「ｄ」は比較例２の高麗人参果実コウタケ発酵液であり、「ｅ」は比較例３の高麗人参果実メシマコブ発酵液であり、「ｆ」は比較例４の高麗人参果実マンネンタケ発酵液である。 製造例１から得られた高麗人参果実抽出物及び実施例１、比較例１〜４から得られた高麗人参果実発酵液の濃度別（０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．０１％）のコラーゲン合成増加率を測定した結果である。図３において、「Ｌ−ＡＡ」はＬ−アスコルビン酸（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）で、「ａ」は製造例１の高麗人参果実抽出物であり、「ｂ」は実施例１の高麗人参果実アギタケ発酵液であり、「ｃ」は比較例１の高麗人参果実マツタケ発酵液であり、「ｄ」は比較例２の高麗人参果実コウタケ発酵液であり、「ｅ」は比較例３の高麗人参果実メシマコブ発酵液であり、「ｆ」は比較例４の高麗人参果実マンネンタケ発酵液である。 製造例１から得られた高麗人参果実抽出物及び実施例１、比較例１〜４から得られた高麗人参果実発酵液の濃度別（０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．０１％）のＭＭＰ‐１阻害活性を測定した結果である。図４において、「ｒｅｔｉｎｏｌ」はレチノールで、「ａ」は製造例１の高麗人参果実抽出物であり、「ｂ」は実施例１の高麗人参果実アギタケ発酵液であり、「ｃ」は比較例１の高麗人参果実マツタケ発酵液であり、「ｄ」は比較例２の高麗人参果実コウタケ発酵液であり、「ｅ」は比較例３の高麗人参果実メシマコブ発酵液であり、「ｆ」は比較例４の高麗人参果実マンネンタケ発酵液である。 製造例１から得られた高麗人参果実抽出物及び実施例１、比較例１〜４から得られた高麗人参果実発酵液の濃度別（０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．０１％）のチロシナーゼ阻害能を測定した結果である。図５において、「Ｋｏｊｉｃ ａｃｉｄ」はコウジ酸で、「ａ」は製造例１の高麗人参果実抽出物であり、「ｂ」は実施例１の高麗人参果実アギタケ発酵液であり、「ｃ」は比較例１の高麗人参果実マツタケ発酵液であり、「ｄ」は比較例２の高麗人参果実コウタケ発酵液であり、「ｅ」は比較例３の高麗人参果実メシマコブ発酵液であり、「ｆ」は比較例４の高麗人参果実マンネンタケ発酵液である。

本発明において用いる高麗人参果実（Panax ginseng C. A. Meyter）は、ジンセンベリーともいい、１年のうち、７月中旬頃の約一週間だけ、４年生以上の高麗人参になる実である。現在まで、高麗人参果実抽出物は、様々な用途として多用されているが、本発明におけるように、アギタケで発酵して単純抽出物形態よりも顕著に高い抗酸化、抗炎症、コラーゲン合成促進、皮膚のしわ改善、美白、保湿、皮膚の障壁機能の改善、アトピー改善の効果を確認した研究はなかった。

一方、アギタケ（Pleurotus ferulae Lanzi.）は、担子菌類のヒラタケとヒラタケ属に属するキノコの一種であり、中国の新疆地方の阿魏という木の根で野生するのでアギタケと呼ばれ、１９８３年から人工栽培をしている。アギタケは、１８６３年、イタリアのシチリア島のＭａｄｏｎｉｃ山において最初に採取されたという由来が伝えられてきている。アギタケは、栄養の宝庫と知られており、ほのかに漂う松の香りが一品であるアギタケは、中国では昔から、胃と腎臓障害及び咳を止め、炎症を除去し、婦人科疾患を防除する医薬的効能に優れたものと知られている。

本発明者は、高麗人参果実に対して多様なキノコを原料として発酵させてみたが、アギタケ菌糸体で発酵した発酵液において、抗酸化、抗炎症、コラーゲン合成促進、皮膚のしわ改善、美白、保湿、皮膚の障壁機能の改善、アトピー改善等の効果に優れたことを発見し、本発明を完成した。

一方、本発明による化粧料組成物の有効成分である高麗人参果実抽出物において、抽出物は、当業界に公知の方法により、すなわち、通常の温度と圧力の条件下で、通常の溶媒を用いて製造されてもよい。一例として、本発明による組成物の有効成分である高麗人参果実抽出物は、水、炭素数１〜４個の無水または含水低級アルコール、アセトン、エチルアセテート、ブチルアセテート、及び１，３‐ブチレングリコールよりなる群から選ばれる溶媒を用いて抽出するか、前記溶媒を用いて高麗人参果実を抽出した後、これを混合して製造することができる。このとき、前記溶媒は、好ましくはアルコールがよく、さらに好ましくはエタノールがよいが、エタノールは、さらに好ましくは７０％エタノールがよい。前記抽出溶媒の好適な添加量は、高麗人参果実の乾燥重量の１〜１５倍であり、さらに好ましくは５〜１０倍であり、最も好ましくは７倍である。

一方、本発明による高麗人参果実アギタケ発酵液は、上述した抽出法による抽出物だけでなく、通常の精製過程を経た抽出物も含む。例えば、一定の分子量カットオフ値を有する限外ろ過膜を用いた分離、多様なクロマトグラフィ（大きさ、電荷、疎水性または親和性による分離のために作製されたもの）による分離等、追加的に実施された多様な精製方法から得られた画分も、本発明の高麗人参果実アギタケ発酵液に含まれると解釈する。

また、本発明による高麗人参果実アギタケ発酵液は、発酵液を減圧蒸留及び凍結乾燥または噴霧乾燥等のような追加の過程により、粉末状態で製造されたものを含んでもよい。

一方、本発明の好適な実施例によれば、本発明の化粧料組成物に添加される高麗人参果実アギタケ発酵液の含量は、好ましくは化粧料組成物の全重量に対して０．０００１〜１００．０重量％であり、より好ましくは０．００１〜９０．０重量％であり、最も好ましくは０．１〜８５．０重量％である。

一方、下記の実験によると、本発明の高麗人参果実アギタケ発酵液は、優れた抗酸化効果（参照：実験例１）、優れた抗炎症効果（参照：実験例３）、優れたコラーゲン合成効果（参照：実験例４）、優れたしわ改善効果（参照：実験例５）、優れた美白効果（参照：実験例６）を示す。

また、このような効果を有する高麗人参果実アギタケ発酵液を有効成分として含有して製造した化粧料組成物の場合、皮膚の保湿機能改善効果（参照：実験例７）、皮膚の障壁機能改善効果（参照：実験例８）、アトピー改善効果（参照：実験例９）に優れたものと表れた。

一方、本発明による化粧料組成物において、化粧料組成物は、一例として溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石けん、界面活性剤‐含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション、及びスプレーよりなる群のうちいずれか一つの剤形を有するものであってもよいが、必ずしもこれらの剤形に限定されるものではない。

一方、本発明による組成物は、化粧分野において通用する補助剤、例えば、親水性または親油性ゲル化剤、親水性または親油性活性剤、保存剤、抗酸化剤、溶媒、芳香剤、充填剤、遮断剤、顔料、吸臭剤、及び染料をさらに含有してもよい。これらの多様な補助剤の量は、当該分野において通用する量であり、例えば、化粧料組成物の全重量に対して０．０００１〜１００．０重量％である。但し、いずれの場合も、補助剤及びその比率は、本発明による化粧料組成物の好適な性質に悪影響を与えないように選択される。

≪実施例≫
以下、本発明の好適な実施例について詳述するが、これは本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の権利範囲が下記の実施例にのみ限定されるものではない。

［製造例１：高麗人参果実抽出物の製造］
高麗人参果実を精製水で洗浄し、乾燥してから、全て粉砕した後、１００メッシュの篩を用いて微細に作った。高麗人参果実の粉砕物を１５０ｇ／Ｌとなるように、７０％エタノールを加え、５時間ずつ３回還流抽出し、冷浸した。その後、ワットマン＃３ろ過紙でろ過した後、５０℃以下で減圧濃縮及び凍結乾燥した。

［実施例１：高麗人参果実アギタケ発酵液の製造］
前記製造例１で製造した高麗人参果実減圧濃縮物５ｇに炭素源としてブドウ糖１〜４％を加え、ペプトン０．２〜０．５％をさらに加えた後、滅菌した。ここに、２５ｇ／Ｌとなるように、アギタケ（Pleurotus ferulae Lenzi.）菌株培養液を接種して培養した。培養は、５Ｌ発酵槽を用い、７日間、３７℃、ｐＨ５〜７に維持して培養した。培養後、培養液を遠心分離し、培養菌を１次除去した後、これ以上培養されないように滅菌（１℃、１５分、１．５気圧）した。

発酵後、培養菌を１次除去した高麗人参果実発酵物を最終７０％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液となるように、エタノールを加え、５時間ずつ３回還流抽出し、冷浸した後、ワットマン＃３ろ過紙でろ過した。ろ過が完了すると、前記抽出段階から得られた抽出液を濃縮槽に移送し、５０℃以下で減圧濃縮または凍結乾燥した。

［比較例１：高麗人参果実マツタケ発酵液の製造］
本比較例１では、製造例１から得られた高麗人参果実抽出物をマツタケ菌糸体で発酵させ、高麗人参果実マツタケ発酵液を製造した。マツタケを除いた残りの実験方法は、実施例１と同一であった。

［比較例２：高麗人参果実コウタケ発酵液の製造］
本比較例２では、製造例１から得られた高麗人参果実抽出物をコウタケ菌糸体で発酵させ、高麗人参果実コウタケ発酵液を製造した。コウタケを除いた残りの実験方法は、実施例１と同一であった。

［比較例３：高麗人参果実メシマコブ発酵液の製造］
本比較例３では、製造例１から得られた高麗人参果実抽出物をメシマコブ菌糸体で発酵させ、高麗人参果実メシマコブ発酵液を製造した。メシマコブを除いた残りの実験方法は、実施例１と同一であった。

［比較例４：高麗人参果実マンネンタケ発酵液の製造］
本比較例４では、製造例１から得られた高麗人参果実抽出物をマンネンタケ菌糸体で発酵させ、高麗人参果実マンネンタケ発酵液を製造した。マンネンタケを除いた残りの実験方法は、実施例１と同一であった。

［実験例１：高麗人参果実抽出物と発酵液のＤＰＰＨ法を用いた抗酸化評価］
製造例１から得られた高麗人参果実抽出物粉末及び実施例１、比較例１〜４から得られた高麗人参果実発酵液粉末を、精製水に懸濁し、濃度別（０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．０１％）のフリーラジカル捕捉活性（free radical scavenging activity）を評価した。

ＤＰＰＨ（２，２‐ジフェニル‐１‐ピクリルヒドラジル）測定法は、抑制剤が安定したラジカルＤＰＰＨ（２，２‐ジフェニル‐１‐ピクリルヒドラジルラジカル）を消去して脱色する程度を、５４０ｎｍにおいて吸光度を測定する方法である。用いた試料は、下記の表１のように試験し、下記の数学式１を用いてフリーラジカル捕捉活性を測定した。対照群は、エピガロカテキン没食子酸塩（ＥＧＣＧ、Epigallocatechin gallate）とした。エピガロカテキン没食子酸塩（Epigallocatechin gallate、ＥＧＣＧ、没食子酸塩‐３‐エピガロカテキン）またはカテキンは、緑茶葉の抽出物であるポリフェノールの一種であり、強力な抗酸化作用をするものと知られている。

［数１］
捕捉活性（％）＝［（Ｃ−Ｄ）-(Ａ−Ｂ)］／（Ｃ−Ｄ）×１００
Ａ：Abs of experimental group
Ｂ：Abs blank of experimental group
Ｃ：Abs of control group
Ｄ：Abs of blank of control group

図１の結果から分かるように、高麗人参果実発酵液（実施例１、比較例１〜４）が高麗人参果実抽出物（製造例１）に比べて、全ての濃度においてフリーラジカル捕捉活性に優れた。図１において、「ａ」は製造例１の高麗人参果実抽出物であり、「ｂ」は実施例１の高麗人参果実アギタケ発酵液であり、「ｃ」は比較例１の高麗人参果実マツタケ発酵液であり、「ｄ」は比較例２の高麗人参果実コウタケ発酵液であり、「ｅ」は比較例３の高麗人参果実メシマコブ発酵液であり、「ｆ」は比較例４の高麗人参果実マンネンタケ発酵液である。

一方、キノコ発酵液のうち、特にアギタケ発酵液（実施例１）が最も高いフリーラジカル捕捉活性を示した。フリーラジカル捕捉活性が高いほど、抗酸化効果に優れたものであるので、高麗人参果実アギタケ発酵液が高麗人参果実抽出物よりも抗酸化効果が高いことがわかった。

［実験例２：高麗人参果実抽出物と発酵液の細胞生存率評価］
前記製造例１から得られた高麗人参果実抽出物及び実施例１、比較例１〜４から得られた高麗人参果実発酵液が、細胞に与える毒性を測定した。製造例１から得られた高麗人参果実抽出物粉末及び実施例１、比較例１〜４から得られた高麗人参果実発酵液粉末を、精製水に懸濁し、濃度別（０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．０１％）で組成した後、下記の方法により細胞生存率を測定した。

細胞毒性は、ＭＴＴ{3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide}試薬を用い、細胞生存率を測定するモスマンの方法を変形して実施した。

ＨＤＦ（Human Dermal Fibroblast）を９６‐ウェルプレートに１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で株分けし、３７℃、５％のＣＯ_２で２４時間培養した。培養培地を除去し、試料を濃度別に処理した培地に２４時間培養した後、培地を除去し、ＰＢＳ（Phosphate buffered saline)で２回ずつ洗浄した。ＭＴＴを５ｍｇ／ｍＬでＰＢＳに溶かし、５０Ｌ添加し、３７℃、５％のＣＯ_２で２時間培養した。ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を１ウェル当たり１００Ｌ入れ、１０分間攪拌した後、５４０ｎｍにおいて吸光度を測定した。

測定の結果、各試料の全ての濃度において、細胞毒性は示さなかった（図示せず）。このことから、本発明の高麗人参果実アギタケ発酵液は、人体に無害であり、安全性に極めて優れていることが確認できた。

［実験例３：高麗人参果実抽出物と発酵液の抗炎症評価（５‐リポキシゲナーゼ阻害）］
前記製造例１から得られた高麗人参果実抽出物粉末及び実施例１、比較例１〜４から得られた高麗人参果実発酵液粉末を、精製水に懸濁し、濃度別（０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．０１％）の５‐リポキシゲナーゼ阻害活性実験を行い、抗炎症効果を評価しようとした。

リポキシゲナーゼは、生体内における炎症反応やアレルギー反応等に関与する多様な化学的な媒介体の役割をする多様な物質を生成する酵素であるが、リポキシゲナーゼを阻害する物質は、各種の化学媒介体（chemical mediators）の生成を抑制する結果をもたらすので、アレルギーに有効である。すなわち、５‐リポキシゲナーゼ阻害能が高いほど、抗炎症効果がよい。本実験において、リポキシゲナーゼの活性程度の測定は、基質と酵素を用いて過酸化物生成程度を測定して示すことができる。

下記の表２のように、試料を用いて実験しており、前記数学式１を用いて、５‐リポキシゲナーゼ阻害活性を測定した。対照群は、油脂の酸化防止作用が強いノルジヒドログアヤレト酸（ＮＤＧＡ、Nordihydroguaiaretic acid）とした。

表２の結果から分かるように、本発明による高麗人参果実発酵液（実施例１、比較例１〜４）が、高麗人参果実抽出物（製造例１）に比べて５‐リポキシゲナーゼ阻害能に優れた。図２において、「ａ」は製造例１の高麗人参果実抽出物であり、「ｂ」は実施例１の高麗人参果実アギタケ発酵液であり、「ｃ」は比較例１の高麗人参果実マツタケ発酵液であり、「ｄ」は比較例２の高麗人参果実コウタケ発酵液であり、「ｅ」は比較例３の高麗人参果実メシマコブ発酵液であり、「ｆ」は比較例４の高麗人参果実マンネンタケ発酵液である。

一方、発酵液のうち、特にアギタケ発酵液（実施例１）が最も高い５‐リポキシゲナーゼ阻害能を示し、高麗人参果実アギタケ発酵液が高麗人参果実抽出物に比べて抗炎症効果が高く示されることが確認できた。

［実験例４：高麗人参果実抽出物と発酵液のコラーゲン合成量の評価］
前記製造例１から得られた高麗人参果実抽出物及び実施例１、比較例１〜４から得られた発酵液粉末を精製水に懸濁し、濃度別（０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．０１％）のコラーゲン生合成増加率を評価した。

ＨＤＦを２４‐ウェルプレートに５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で株分けし、３７℃、５％のＣＯ_２で２４時間培養し、前記製造例１から得られた高麗人参果実抽出物及び実施例１、比較例１〜４で製造された高麗人参果実発酵液を加えた無血清ＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）培地、及び対象群として高麗人参果実発酵液と高麗人参果実抽出物が含まれていない無血清ＤＭＥＭ培地において、それぞれ２４時間さらに培養した。培養後、各ウェルの上澄み液を集め、コラーゲンキットを用い、プロコラーゲンタイプＩＣペプチド（ＰＩＣＰ）の量を測定し、ｎｇ／ｍｌ換算しており、これにより合成されたコラーゲン量を測定した。コラーゲン生合成増加率（％）は、下記の数学式２により計算し、対象群は、皮膚に対してコラーゲン合成を促進する効果を有するＬ‐アスコルビン酸（L-AA、L-ascorbic acid）とした。

［数２］
コラーゲン生合成増加率（％）
＝実験群のコラーゲン量／対象群のコラーゲン量×１００

図３の結果から分かるように、本発明による高麗人参果実発酵液（実施例１、比較例１〜４）が、全ての濃度において高麗人参果実抽出物（製造例１）よりもコラーゲン合成量が高かった。図２において、「ａ」は製造例１の高麗人参果実抽出物であり、「ｂ」は実施例１の高麗人参果実アギタケ発酵液であり、「ｃ」は比較例１の高麗人参果実マツタケ発酵液であり、「ｄ」は比較例２の高麗人参果実コウタケ発酵液であり、「ｅ」は比較例３の高麗人参果実メシマコブ発酵液であり、「ｆ」は比較例４の高麗人参果実マンネンタケ発酵液である。

一方、発酵液のうち、特にアギタケ発酵液（実施例１）が最も高いコラーゲン合成量を示した。

［実験例５：高麗人参果実抽出物と発酵液のしわ改善の評価］
前記製造例１から得られた高麗人参果実抽出物及び実施例１、比較例１〜４から得られた高麗人参果実発酵液粉末を、精製水に懸濁し、濃度別（０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．０１％）のしわ改善効果を評価した。

実験のために、抽出物及び発酵液ＵＶ（Ultraviolet）チェンバを用い、ＨＤＦにＵＶＡ（UltravioletA）を５Ｊ／ｃｍ^２のエネルギーを照射する。紫外線照射量と培養時間は、予備実験を通じて、線維芽細胞においてＭＭＰ（Matrix Metalloproteinase）の発現量が最大となる条件を確立した。陰性対照群は、アルミ箔で包み、ＵＶＡの環境に同時間維持した。ＵＶＡ放出量は、ＵＶラジオメータを用いて測定した。ＵＶＡが照射される間の細胞は、以前に株分けされた培地のままであり、ＵＶＡを照射した後、サンプルが入った培地に交換し、２４時間培養後、培地を回収し、９６‐ウェルプレートにコートした。一次抗体（ＭＭＰ‐１（Ａｂ‐５）単一クローン抗体とＭＭＰ‐２（Ａｂ‐３）単一クローン抗体）を処理し、３７℃において６０分反応させた。二次抗体である抗マウスＩｇＧ（whole mouse，alkaline phosphatase conjugated）を約６０分再度反応させた後、アルカリ性ホスファターゼ（1mg/ml-nitrophenyl phosphate in diethanolamine緩衝溶液）を常温で３０分間反応させ、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおいて吸光度を測定した。対照群としては、試料を添加しなかったものを用いた。

図４の結果から分かるように、全ての濃度（０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．０１％）において、本発明による高麗人参果実発酵液（実施例１、比較例１〜４）が高麗人参果実抽出物（製造例１）に比べてＭＭＰ‐１発現阻害能に優れた。図４において、「ａ」は製造例１の高麗人参果実抽出物であり、「ｂ」は実施例１の高麗人参果実アギタケ発酵液であり、「ｃ」は比較例１の高麗人参果実マツタケ発酵液であり、「ｄ」は比較例２の高麗人参果実コウタケ発酵液であり、「ｅ」は比較例３の高麗人参果実メシマコブ発酵液であり、「ｆ」は比較例４の高麗人参果実マンネンタケ発酵液である。

一方、発酵液のうち、アギタケ発酵液（実施例１）が最も高いＭＭＰ‐１発現阻害能を示した。一般に、ＭＭＰ‐１発現阻害能が高いほど、皮膚のしわ改善効果があり、高麗人参果実アギタケ発酵液が高麗人参果実抽出物に比べて皮膚のしわ改善効果が高いものと判断される。

［実験例６：高麗人参果実アギタケ発酵液のチロシナーゼ阻害効果］
本発明による高麗人参果実アギタケ発酵液を含有する化粧料のチロシナーゼ阻害効果を調べるために、以下のように実験した。酵素チロシナーゼ（ＥＣ １．１４．１８．１）を１，１００ｕｎｉｔ／ｍｌ（ｆｉｎａｌ ５５ ｕｎｉｔ）となるように０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、基質であるＬ‐チロシン（Ｃ_９Ｈ_１１ＮＯ_３、１８１．１９）を１．５ｍＭ（ｆｉｎａｌ ２２５ ｕＭ）となるように０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した後、それぞれ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に希釈して反応させ（表３）、３７℃で２０分間反応させてから、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ（Enzyme-Linked Immunos Sorbent Assay）を用い、４９２ｎｍにおいて吸光度を測定した。対照群は、チロシナーゼ活性を抑制し、メラニン生成の抑制に効果のあるコウジ酸（Kojic acid）とした。

［数３］
阻害率（％）＝［（Ｃ−Ｄ）-(Ａ−Ｂ)］／（Ｃ−Ｄ）×１００
Ａ：Abs of experimental group
Ｂ：Abs blank of experimental group
Ｃ：Abs of control group
Ｄ：Abs of blank of control group

図５の結果から分かるように、本発明による高麗人参果実発酵液（実施例１、比較例１〜４）が、全ての濃度（０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．０１％）において、高麗人参果実抽出物（製造例１）に比べてチロシナーゼ阻害能が優れた。図５において、「ａ」は製造例１の高麗人参果実抽出物であり、「ｂ」は実施例１の高麗人参果実アギタケ発酵液であり、「ｃ」は比較例１の高麗人参果実マツタケ発酵液であり、「ｄ」は比較例２の高麗人参果実コウタケ発酵液であり、「ｅ」は比較例３の高麗人参果実メシマコブ発酵液であり、「ｆ」は比較例４の高麗人参果実マンネンタケ発酵液である。チロシナーゼ（ＥＣ １．１４．１８．１）は、メラニン合成経路（melanin synthesis pathway）において多触媒機能を有する重要酵素であるが、一般に、チロシナーゼ阻害能が高いほど、皮膚美白効果だけでなく、メラニン細胞の悪性化による腫瘍であるメラノーマの増殖抑制にも効果がある。

一方、発酵液のうち、特に本発明による高麗人参果実発酵液が高麗人参果実抽出物によりもチロシナーゼ阻害効果（美白効果）に優れたことが確認された。

［剤形例１及び剤形比較例１：高麗人参果実アギタケ発酵液を含有する化粧料の製造］
実施例１の高麗人参果実アギタケ発酵液を３０．０重量％含んだ化粧料組成物を、下記の表４の組成で製造し、これを剤形例１とし、高麗人参果実アギタケ発酵液が含まれていない化粧料組成物を製造し、これを剤形比較例１とした。

［実験例７：高麗人参果実アギタケ発酵液の皮膚保湿力の改善効果］
本発明による高麗人参果実アギタケ発酵液を含有する化粧料の皮膚保湿力の改善効果を調べるために、以下のように実験した。

皮膚疾患のない２０〜４０代の４０名を対象として、１組当たり２０名ずつ２つの組に分け、各組別に前記剤形例１と剤形比較例１の栄養クリームを、毎日２回ずつ、一ヶ月間、顔及び前半部に塗布させた。予め、塗布開始前、恒温、恒湿条件（２４℃、湿度４０％）において、水分測定器（Corneometer，CM820 courage Khazaka electronic GmbH，Germany）を用い、皮膚伝導度を測定して基本値とし、１週間、２週間、４週間経過後の皮膚伝導度増加率（％）を測定し、その増加率を評価した。その結果を下記の表５に示した。

実験の結果、本発明による高麗人参果実アギタケ発酵液を含有する化粧料である剤形例１の場合、剤形比較例１に比べて皮膚伝導度増加率に極めて優れた。一般に、皮膚伝導度は、皮膚水分量に比例するので、本発明による高麗人参果実アギタケ発酵液を含有する化粧料が、そうでない化粧料に比べて、皮膚水分含量を高く維持するものと判断される（図示せず）。

［実験例８：高麗人参果実アギタケ発酵液の皮膚障壁の改善効果］
本発明による高麗人参果実アギタケ発酵液を含有する化粧料の皮膚の障壁機能の改善効果を調べるために、以下のように実験した。

本実験例は、前記剤形例１と剤形比較例１の化粧料を、ヒトを対象として、経皮水分損失量（ＴＥＷＬ：Trans-Epidermal Water Loss)をTewameterr(TM300，Courage and Khazaka Electronic Co., Germany）を用いて比較実験した。２０〜４０代の女性４０名を対象として、右と左の顔に各試料を塗り、目じりから３ｃｍ右側に、１ｃｍ下側に離れた部位を、塗布前と塗布後の１時間、２時間、４時間、６時間の経皮水分損失量をＴｅｗａｍｅｔｅｒｒで３回測定し、平均値を用いて経皮水分損失量を評価した。

経皮水分損失量を測定した結果、表６から分かるように、前記剤形例１で製造されたクリームを塗布した実験者の顔面皮膚において経皮水分損失量が減少したことから、本発明による高麗人参果実アギタケ発酵液を含有する化粧料が、そうでない化粧料よりも皮膚の障壁機能の改善に優れた効果があるものと判断される（図示せず）。

［実験例９：高麗人参果実アギタケ発酵液のアトピー改善効果］
本発明による高麗人参果実アギタケ発酵液を含有する化粧料のアトピー改善効果を調べるために、以下のように実験した。アトピーのある実験者（３〜４０歳）の２０名を対象とし、そのうち１０名にはアトピー皮膚部位に前記剤形例１のクリームを、残りの１０名には剤形比較例１のクリームを、それぞれ１日２回ずつ連続して４週間塗布した。製品塗布前（０週）、製品塗布後の４週間後に、被験者の試験部位のアトピー皮膚炎重症度、ＩｇＥの変化、好酸性白血球（Eosinophil）の変化、水分含有量、皮膚酸性度をそれぞれ測定した。４週間試験に参加した全ての被験者において、異状反応はなかった。

下記の表７に、剤形例１及び剤形比較例１で製造されたクリームを用いた実験者のアトピー改善効果を比較して示した。

実験の結果、アトピー皮膚診断の基準となるアトピー皮膚炎重症度、血液におけるＩｇＥ及び好酸性白血球の変化、水分含有量、皮膚酸性度の改善効果が、本剤形例１の高麗人参果実アギタケ発酵液を含有したクリームを塗布した実験者において優れた。本発明による高麗人参果実アギタケ発酵液を含有する化粧料が、そうでない化粧料よりも優れたアトピー改善に効果があるものと判断される（図示せず）。

Claims (10)

1. 高麗人参果実抽出物をアギタケで発酵させて得られた高麗人参果実アギタケ発酵液を有効成分として配合する化粧料組成物の製造方法。
2. 高麗人参果実抽出物をアギタケで発酵させて得られた高麗人参果実アギタケ発酵液の抽出物を有効成分として配合する化粧料組成物の製造方法。
3. 前記化粧料組成物が、抗酸化用であることを特徴とする請求項１または２に記載の化粧料組成物の製造方法。
4. 前記化粧料組成物が、抗炎症用であることを特徴とする請求項１または２に記載の化粧料組成物の製造方法。
5. 前記化粧料組成物が、皮膚のしわ改善用であることを特徴とする請求項１または２に記載の化粧料組成物の製造方法。
6. 前記化粧料組成物が、皮膚美白用であることを特徴とする請求項１または２に記載の化粧料組成物の製造方法。
7. 前記化粧料組成物が、皮膚保湿用であることを特徴とする請求項１または２に記載の化粧料組成物の製造方法。
8. 前記化粧料組成物が、アトピー改善用であることを特徴とする請求項１または２に記載の化粧料組成物の製造方法。
9. 前記高麗人参果実抽出物が、水、炭素数１〜４個の無水または含水低級アルコール、アセトン、エチルアセテート、ブチルアセテート、及び１，３‐ブチレングリコールよりなる群のうちいずれか一つの抽出溶媒を用いて抽出されたものであることを特徴とする請求項１または２に記載の化粧料組成物の製造方法。
10. 前記発酵液を、化粧料組成物の全重量に対して０．０００１〜１００．０重量％添加することを特徴とする請求項１または２に記載の化粧料組成物の製造方法。