KR101825803B1

KR101825803B1 - 마가목추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부노화방지 및 피부주름개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101825803B1
Application number: KR1020160018279A
Authority: KR
Inventors: 이충우
Original assignee: 주식회사 씨앤비코스메틱
Priority date: 2016-02-17
Filing date: 2016-02-17
Publication date: 2018-03-22
Also published as: KR20170096712A

Abstract

본 발명은 마가목의 꽃과 잎의 추출물을 발효한 발효물을 포함하는, 피부노화방지 및 피부주름개선용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 인간의 피부섬유모세포(HDF: Human Dermal Fibroblast)에서 섬유아세포 증식 촉진, 콜라겐 합성 증대 및 엘라스타아제 저해 활성을 통한 피부 노화방지 및 주름개선효과를 나타내며, 동시에 멜라닌 합성 억제 활성 및 티로시나아제 억제 활성을 통한 피부미백 효과를 가진다. 특히, 본 발명의 마가목 발효추출물은 종래의 마가목추출물과 비교하여 개선된 피부노화방지 및 주름개선 효과를 나타내며 피부의 주름개선 및 피부미백을 효과적으로 개선할 수 있어 기능성 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

마가목추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부노화방지 및 피부주름개선용 화장료 조성물 {Cosmetic Anti aging composition of mountain-ash's ferment}

본 발명은 피부노화방지 및 피부주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마가목의 꽃과 잎을 추출하여 발효한 발효물을 함유하는 피부노화방지 및 피부주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

한국은 가장 빠른 고령사회 진입 예정국으로서 노령 인구의 비중이 증가함에 따른 노화 관련 시장 및 다양한 산업의 증대가 예상되며, 노화 관련 시장이 20~30대의 젊은 세대부터 중장년층까지 관심이 확대되고 있다.

피부노화는 크게 두 종류로 나눌 수 있다. 그 중 하나는 내인성 노화 (intrinsic aging)로서 세월이 흘러감에 따라 피할 수 없는 노화 현상을 말한다. 두 번째는 광노화 (photoaging)로서 오랫동안 햇빛에 노출된 얼굴, 손등, 목뒤 등의 피부에서 관찰되는 노화현상을 말하는 것으로 내인성 노화 현상과 자외선에 의한 영향이 합쳐진 결과로 발생한다.

모공은 얼굴 피부에 전체적으로 분포하나, 특히 코와 볼 부위는 육안으로 식별할 수 있고, 모공의 양상은 성별, 유전적, 노화, 여드름, 만성 자외선 노출 등의 내인성과 외인성 요인에 의해 개인차가 있다. 모공이 넓어지는 이유는 피지가 과도하게 분비되거나 피부노화가 시작되면서 모공 벽을 지지하고 있던 콜라겐 섬유와 탄력 섬유가 변성, 감소함에 따라 피부 탄력이 없어지고 쳐지기 때문이다.

이러한 피부 노화의 원인은 콜라겐 및 탄력섬유 등의 기질단백질이 손상되어 피부 내 콜라겐의 양이 부족해지고, 탄력 섬유가 변성되어 나타난다고 알려져 있다. 또한, 피부 노화가 진행되는 과정 중에는 다양한 신호전달 경로를 거쳐 콜라겐의 합성이 감소되고, 콜라겐을 비롯한 세포 외 기질단백질의 분해 효소인 매트릭스 메탈로프로테아나제 (matrix metalloproteinases: MMPs)의 발현이 증가된다고 알려졌다. 이와 같이 콜라겐은 피부노화와 관련된 주요 인자로 인식되어져 있으며, 콜라겐의 합성 증진 및 분해 억제는 피부노화 억제 및 피부 미용과 관련하여 중요한 지표가 되고 있다.

이렇듯 콜라겐 합성을 증진하고, 그 분해를 억제하여 피부 미용을 개선하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있으며, 특히, 화합물에 비하여 상대적으로 피부에 대한 안전성이 뛰어난 천연물이 관심을 받고 있다.

발효는 미생물을 이용하여 소재를 재가공할 수 있는 효율적인 방법인데, 소재를 선택적으로 변환하여 유용한 산물을 대량 생산할 수 있게 한다. 258조원의 바이오 시장에서 발효 제품은 약 73조원으로 전체 바이오 시장의 약 28%를 차지하고 있을 정도로 발효는 대단히 중요한 식품 가공 기술이다.

최근 화장품 분야에서도 발효기술이 활발히 이용되고 있고, 발효 한방 화장품이라는 별도의 제품군을 형성할 정도로 선풍적인 인기를 끌고 있다. 2015년 국내 발효화장품 시장규모는 7,000억원대로 추정되며, 매년 40%씩 성장하는 추세다. 또한 발효 화장품의 시장규모는 발효 기술 개발 및 항노화 시장의 성장에 따라서 더욱 크게 증대될 것으로 사료된다.

본 발명의 목적은 생체에 부작용이 없으면서 효과적으로 피부노화방지 및 피부주름개선을 할 수 있는 기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 과제를 달성하기 위하여, 본 발명자들은 안전성이 우수한 천연물을 대상으로 피부노화를 억제하고, 피부주름을 개선할 수 있는 다양한 활성물질들을 검색한 결과, 놀랍게도 마가목의 꽃과 잎을 유산균의 발효를 통해 얻은 발효추출물이 우수한 피부 미백, 피부노화방지 및 피부주름개선 효과를 나타내는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다. 마가목은 영문명이 Mountain-ash이며, 학명은 Sorbus commixta로 봄이나 여름동안 잎이나 줄기도 예쁘지만 가을에 달리는 빨간 열매나 고운 단풍잎은 일품이다. 마가목은 맹아력이 매우 강하다. 봄에 돋아나는 새순은 힘찬 용기와 생동감을 한자로 마아목(馬牙木)이라고 쓰는데 튀어나오는 새순이 말 이빨처럼 힘차게 돋아난다 하여 붙여진 이름이다.

이에, 본 발명은 마가목의 꽃과 잎을 탈염 용암해수로 추출한 추출물을 유산균인 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) 균주의 발효를 통해 얻은 발효추출물을 포함하는 피부 미백, 피부노화방지 및 피부주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 유산균은, 바람직하게는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플렌타럼(Lactobacillus plantarum) 및 이들의 혼합 균주로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 발효하여 얻어진 발효추출물이며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 조성물은 섬유아세포 증식 촉진, 콜라겐 합성 증대 및 엘라스타아제 저해 활성을 통해 주름개선 효과를 가질 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 합성 억제 활성 및 티로시나아제 억제 활성을 통해 피부미백 효과를 가질 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 시료 농도별 처리에 따른 섬유아세포의 증식 효과를 나타낸 것이다.

도 2는 시료 농도별 처리에 처리에 따른 엘라스타아제 활성 저해능을 나타낸 것이다.

도 3은 시료 농도별 처리에 따른 멜라닌 합성 억제 활성을 나타낸 것이다.

도 4는 실시예 2의 마가목 발효추출물을 함유한 영양크림을 이용한 임상을 통해 주름개선 효과에 대한 다중안면검사카메라시스템을 실시한 결과이다.

도 5는 실시예 2의 마가목 발효추출물을 함유한 영양크림을 이용한 임상을 통해 색소침착 개선 효과에 대한 다중안면검사카메라시스템을 실시한 결과이다.

도 6은 실시예 2의 마가목 발효추출물을 함유한 영양크림을 이용한 임상을 통해 주름개선 및 피부톤 개선 효과에 대한 피실험자 설문조사 결과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 실시예 2의 마가목 발효추출물을 함유한 영양크림을 이용한 임상에서 주름개선 및 피부톤 개선 효과에 대한 2인의 전문의의 임상소견을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 마가목의 꽃과 잎의 추출물을 발효한 발효물을 포함하는, 피부노화방지 및 피부주름개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 마가목추출물의 발효물은 마가목의 꽃과 잎의 추출물에 유산균을 첨가 후 발효시켜 제조될 수 있고, 상기 유산균은, 바람직하게는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플렌타럼(Lactobacillus plantarum) 및 이들의 혼합 균주로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 발효하여 얻어진 발효추출물이며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 마가목추출물은 탈염 용암해수를 이용한 마가목 열수추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 용암해수는 바닷물이 투수성이 좋은 화산 암반층에 의해 자연 여과되면서 육지 지하로 흘러든 지하 해수로서, 주로 제주 동부지역에 주로 매장되어 있으며, 연안으로부터 최대 8km까지 흘러 화산 암반층을 통과해 들어오는 것으로 알려져 있다. 상기 용암해수는 담수 지하수와의 밀도 차이에 의해 서로 섞이지 않으며, 담수 층 아래에 존재한다.

제주도에서는 1980년대부터 용암해수의 저온성과 청정성 등의 특성을 활용하여 넙치 양식장의 사육수로 사용하여 왔으며, 건강, 미용 등의 측면에서 사우나 등의 용수로 사용되면서, 크게 각광을 받고 있다. 제주도에서도 동부지역(구좌읍, 성산읍 및 표선면)에만 분포하는 용암해수는 청정하고 수온이 연중 일정한 특성을 갖고 있으며 일반 염지하수나 해수에서 볼 수 없는 다양한 미네랄을 다량으로 함유하고 있는데, 상기 미네랄 함량에 대해 본 문헌에서 상세히 기술하지는 아니하나, 기존 문헌(등록특허 제10-1402025 외 다수)에 이미 공지된 바 있다. 특히, 용암해수 내 미량으로 포함되어 있는 바나듐은 인슐린 분비를 안정시키는 작용이 있다고 알려져 있고, 게르마늄은 혈액순환 촉진, 면역력 증강, 항암 작용 등에 효과가 있고, 셀레늄은 지방의 산화작용 억제, 항산화활성, 항암, 불임, 노화 억제, 및 콜레스테롤 수치의 개선 효과가 있다고 보고된 바 있다.

상기 탈염 용암해수는 용암해수를 탈염시켜 얻어진 수득물로서, 일부 탈수된(수분이 일부 제거된) 농축된 액상이거나 완전히 탈수된 분말상일 수 있다. 상기 탈염 용암해수의 상(phase)은 특별히 제한되지 아니하며, 미네랄 성분들을 함유하는 조성물이면 족하다.

본 발명에서 용어, "추출물(extract)"은 천연물로부터 분리된 활성성분을 의미하며, 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합 용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기 용매를 사용하여 추출하는 경우, 에탄올, 1,3-부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 마가목의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출 할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약재의 유효성분의 추출 정도와 손실 정도가 차이날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 및 환류 추출 등이 있다.

상기 용매 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위하여 추출물을 여과시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 거르거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

추출액을 농축할 경우에는, 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 마가목추출물의 발효물은 바람직하게는 마가목 열수추출물에 글루코스 및 탈지분유를 각각 1.0% 첨가하여 pH를 4.0-5.0로 조정하고 121도시에서 15분 동안 멸균하여 배양액을 준비하였다. 멸균된 배양액에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 를 10⁷-10⁸CFU/mL 농도가 되도록 첨가한 후, 30도시 내지 35도시 온도에서 48시간 내지 72시간 발효시켜 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 마가목 발효추출물에 추가로 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 향료, 계면활성제, 보존제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명에 의한 마가목 발효추출물은 피부 미백, 피부 노화억제, 피부 주름개선, 피부 보습용 식품, 의약품 및 화장품으로 제형화 될 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예

< 실시예 1> 마가목 (꽃, 잎) 발효추출물의 제조

건조하여 세절한 마가목의 꽃과 잎에 10배 양의 80도시 탈염 용암해수를 첨가하여 30분 내지 60분간 추출하여 상온까지 자연 냉각시킨다. 냉각된 마가목 열수추출물에 글루코스 및 탈지분유를 각각 1.0% 첨가하여 pH를 4.0-5.0로 조정하고 121도시에서 15분 동안 멸균하여 배양액을 준비하였다. 멸균된 배양약액에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 를 10⁷-10⁸CFU/mL 농도가 되도록 첨가한 후, 30도시 내지 35도시 온도에서 48시간 내지 72시간 발효하였다. 발효를 종료하기 위해 80도시 에서 10분간 열을 가하여 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 발효물은 50도시 이하에서 감압농축 및 동결건조하였다. 감압농축물 및 동결건조물이 0.001 내지 40.0중량% 함유되게 탈염 용암해수, 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매로 용해하여 마가목 발효추출물을 제조하였다.

< 비교예 1> 마가목 (꽃, 잎) 추출물

건조하여 세절한 마가목의 꽃과 잎에 10배 양의 95% 에탄올 수용액을 첨가하여 2시간씩 2회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50도시 이하에서 감압농축 및 동결 건조하였다. 감압농축물 및 동결건조물이 0.001 내지 40.0중량% 함유되게 탈염 용암해수, 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매로 용해하여 마가목 추출물을 제조하였다.

< 비교예 2> 마가목 (줄기 및 수피) 추출물

건조하여 세절한 마가목의 줄기와 수피에 10배 양의 95% 에탄올 수용액을 첨가하여 2시간씩 2회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50도시 이하에서 감압농축 및 동결 건조하였다. 감압농축물 및 동결건조물이 0.001 내지 30.0중량% 함유되게 탈염 용암해수, 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매로 용해하여 마가목 추출물을 제조하였다.

< 실시예 2> 마가목 발효추출물의 함량 분석

본 실시예는 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2에서 수득한 샘플의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량 변화를 확인하기 위해 다음과 같이 수행하였다.

< 실시예 2-1> 총 폴리페놀(Total polyphenol , TPC ) 함량 분석

총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu reagent가 발효물 및 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다. 즉, 각 추출물 100㎕에 2% Na₂CO₃용액 2mL를 가한 후 3분간 방치하고 50% Folin-Ciocalteu reagent 100㎕를 가해 30분 후 반응액의 흡광도 값을 700nm에서 spectrophotometer로 측정하였다. 표준물질로 garlic acid(SigmaChemical Co.)를 사용하여 총 폴리페놀 함량은 보정선 (y=0.0018x-0.0327; R²=0.9991)을 작성한 후 시료 g중의 mg gallic acid equivalents로 나타내었다.

그 결과, 표 1에서 보이는 거와 같이 실시예 1인 마가목 발효추출물의 총 폴리페놀 함량이 1.159mg/g으로 비교예 1 및 비교예 2에 비해서 상대적으로 높을 것을 확인 할 수 있다.

샘플	총 폴리페놀(mg GAE/g)
실시예 1	1.159
비교예 1	0.618
비교예 2	0.841

샘플의 총 폴리페놀(TPC)의 함량

< 실시예 2-2> 총 플라보노이드(Total flavonoid content, TFC )함량 분석

총 플라보노이드 함량은 발효물 및 추출물 250에 증류수 1mL과 5% NaNO₂ 75㎕를 가한 다음 5분 후 10% AlCl₃6H₂O 150㎕를 가하여 6분간 방치하고 1N NaOH 500㎕를 가하였다. 11분 후 반응액의 흡광도 값을 500nm에서 spectro-photometer로 측정하였다. 표준물질로 (+)-catechin(SigmaChemical Co.)를 사용하여 총 플라보노이드 함량은 보정선(y=0.004x0.0912; R²=0.9993)을 작성한 후 시료 g중의 mg catechin equivalents로 나타내었다.

그 결과, 표 2에서 보이는 거와 같이 실시예 1인 마가목 발효추출물의 총 플라보노이드 함량이 0.505mg/g으로 비교예 1 및 비교예 2에 비해서 상대적으로 높을 것을 확인 할 수 있다.

샘플	총 플라보노이드(mg CE/g)
실시예 1	0.505
비교예 1	0.098
비교예 2	0.112

샘플의 총 플라보노이드(TFC)의 함량

< 실시예 3> 마가목 발효추출물을 함유한 영양크림 제조

본 발명의 마가목 발효추출물을 함유한 영양크림을 아래의 성분비로 통상적인 방법으로 제조하였다.

성분	함량 (%)
마가목 발효추출물	5.00
글리세린	3.00
디소듐이디티에이	0.02
폴리글리세릴-3-메틸글루코스 디스테아레이트	1.50
세테아릴알코올	0.50
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	7.00
폴리아크릴아마이드 & C13-14이소파라핀 & 라우레스-7	0.60
방부제	적량
정제수	to 100

영양크림 제조 처방

< 실시예 4> 주름개선 효과 측정

상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 마가목 발효추출물의 주름개선 효과를 확인하기 위하여, 섬유아세포 증식촉진 및 콜라겐 합성 촉진 효과를 측정하였다.

< 실시예 4-1> 섬유아세포(Fibroblast) 증식율 측정

피부에 노화가 진행되면 진피의 변화가 현저하게 나타나며, 70세 이후 나타나는 진피위축은 대표적인 노화현상이다. 진피의 변화는 섬유아세포(Fibroblast)의 숫자와 이들의 합성 능력의 감소로 인하여 세포 외 기질 중 큰 분자량을 가진 물질들의 변화로 발생된다. 본 실험에서는 주름개선 효과를 측정하기 위해 인간의 피부 섬유아세포인 HDF-N 세포를 이용하여 섬유아세포 증식능을 측정하였다. 섬유아세포 HDF-N을 96월 마이크로 플레이트의 각 웰에 5x10³ cell의 농도가 되도록 섬유아세포를 분주하고 우태아 혈청(FBS)이 함유된 DMEM 배지에 24시간 동안 37도시에서 배양시켰다. 상기 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2를 농도별(0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%)로 준비한 후 섬유아세포 배양 배지에 100 첨가한 후 CO2 인큐베이터에서 37도시의 조건으로 72시간 배양한 후, 0.2% MTT용액을 각 웰에 50 씩 첨가하여 4시간동안 정치하였다. 이후 상층액을 제거하고 150㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가한 후 10분간 진탕하여 포르마잔(formazan)을 녹였다. 이후 DMSO에서 녹은 포르마잔(formazan)을 마이크로 플레이트 판독기(Microplate reader)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 이를 대조군의 흡광도와 비교하여 섬유아세포 증식 촉진 효과를 나타내었다.

세포증식효과(%)=(실험군의 흡광도-대조군의 흡광도)/대조군의 흡광도

그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 실시예1, 비교예1 및 비교예2 모두 섬유아세포에 세포 증식 효과를 보였으며, 그 중 실시예1이 5% 농도 처리군에서 섬유아세포의 세포증식률이 대조군에 비하여 약 25% 이상의 세포증식률을 보이며 비교예1, 비교예2에 비해 가장 높은 증식률을 확인 할 수 있었다.

< 실시예 4-2> 콜라겐 합성량 측정

콜라겐은 피부를 구성하는 주요성분으로 피부, 골, 인대, 연골 및 치아 등을 구성하는데 필요하다. 또한, 콜라겐은 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포분할과 분화의 유도 등 다양한 기능을 한다. 또한 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다. 따라서 본 실험에서는 실시예 1, 비교예 2, 비교예 3을 농도별(0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%)로 준비하여 각각을 PBS 완충용액에 녹인 후, 상기 실시예<4-1>에서 기술한 조건과 동일한 과정으로 배양된 HDF-N 세포주의 배지를 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지로 교체한 다음 최종농도가 0-50ug/ml 되도록 HDF-N 세포배양 플레이트에 첨가하고 24시간, 48시간 동안 배양하였다. 배양한 후 각각의 세포배양액을 채취하고 콜라겐 단백질 측정 키트 (Takara Shuzo Co., Ltd, 일본국)를 사용하여 채취한 배양액에 존재하는 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드의 양을 측정함으로서 콜라겐 생성 증가효과를 조사하였다. 1차 콜라겐 항체를 96 웰 마이크로 플레이트에 도포시킨 후 각각의 채취된 HDF-N 세포배양액을 넣고 37도시에서 3시간 동안 반응시키고, 세포배양액을 제거한 후 PBS 완충용액을 사용하여 3회 세척하였다. 각 웰(well)에 발색시약을 첨가한 후 상온에서 15분간 반응시킨 후 1N 황산용액을 가해 반응을 중지시키고, ELISA reader를 이용하여 450nm 에서 흡광 값을 측정하였다. 표준용액으로부터 얻어진 표준곡선에 상기의 방법으로 얻어진 흡광 값을 대입하여 각 시료가 첨가된 HDF-N 세포배양액에서의 콜라겐 생성량을 산출하였다. 콜라겐 생성 합성률은 아래의 계산식으로부터 얻었으며, 그 결과는 하기 표 4에서 나타내었다.

콜라겐 합성 합성률 (%)=[(Ax100)/B]-100

(A: 시료를 첨가한 배양액의 콜라겐 생성량, B: 시료가 첨가되지 않은 배양액의 콜라겐 생성량)

농도(%) 시료	0.1	0.5	1.0	2.0	5.0	10.0
실시예1	41.04	48.54	50.56	51.21	56.07	58.04
비교예1	37.25	39.55	46.21	48.28	49.51	51.55
비교예2	44.12	48.52	52.12	53.55	54.11	53.28

시료의 농도에 따른 콜라겐 합성률

상기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 실시예1, 비교예1 및 비교예2 모두 농도 의존적으로 콜라겐 생성 합성률이 증가하고 있지만, 비교예2의 경우 농도 10%처리에서 오히려 콜라겐 생성 합성률이 저해되는 것을 확인하였다. 또한 5% 농도로 처리하였을 때 실시예1이 콜라겐 생성 합성률이 56.07%로 가장 높은 것을 확인 할 수 있었다.

< 실시예 4-3> 엘라스타아제 활성 저해능

엘라스타아제(elastase)는 엘라스틴(elastin)을 분해하는 효소로서 엘라스타아제가 과잉 생성되면 엘라스틴을 과도하게 분해시켜 피부가 처지면서 주름이 생성되기 때문에 엘라스타아제의 활성을 억제함으로써 피부노화를 방지할 수 있다. 따라서 본 실험에서는 주름개선 효과를 확인 하기 위하여 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 처리에 따른 엘라스타아제 활성 억제(저해) 정도를 측정하였다. 엘라스타아제 활성 저해는 porcine pancreas elastase (돼지췌장 엘라스타아제, Sigma Co., Ltd 미국)와 기질인 N-succinyl-(L-Ala)3--nitroanilide (Sigma Co., Ltd 미국)를 사용한 효소반응에 의해 조사하였다. 자세하게는 실시예 1, 비교예 2, 비교예 3을 농도별(0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%)로 준비한 시료를 0.5ml 씩 시험관에 넣고 100mM Tris-HCl 완충용액 (pH 8.0)에 녹인 porcine pancreas elastase (1U/ml) 용액 0.5 ml을 가한 후 DMSO에 녹여 준비된 3.2uM N-succinyl-(L-Ala)3--nitroanilide를 0.1 ml 씩 첨가하여 잘 섞은 후 실온에서 20분간 반응시켰다. 엘라스타아제 활성은 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 분광광도계를 이용하여 410nm에서 측정함으로서 조사하였다. 엘라스타아제 활성 저해능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다. 그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 상기의 실시예1의 0.1% 농도로 처리한 실험군에서 약 23%의 엘라스타아제 저해 효과를 보였다. 특히 실시예1는 비교예에 비해 2% 이상의 농도로 처리한 실험군에서 약 58~68%의 엘라스타아제 저해 활성이 나타나 그 효과가 매우 높아지는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> 피부미백 활성 측정

상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 마가목 발효추출물의 피부미백 활성을 확인하기 위하여, 멜라닌 합성 저해 활성 및 티로시나제 억제 활성을 측정하였다. 멜라닌의 주요한 기능은 유해 라디칼을 제거하여 이에 의한 손상으로부터 피부를 보호하는 것이다. 멜라닌은 자외선에 의해 멜라닌 형성세포에서 티로신이 티로시나제(tyrosinase)라는 효소에 의해 도파, 도파크롬으로 변환된 뒤 복잡한 산화와 축합반응을 거쳐 생성된다. 생성된 멜라닌은 피부 세포에 전달되고 표피 박리와 함께 멜라닌이 상실되어 소멸하는 순환 작용을 보인다. 이러한 멜라닌 생성 과정은 자연적으로 일어나는 현상으로서, 정상 상태의 사람피부에서는 멜라닌의 과다 생성이 일어나지 않는다. 하지만, 피부가 외부의 자극, 예컨대, 자외선, 환경오염 또는 스트레스 등에 반응하면 멜라닌이 과다 생성된다. 과다 생성된 멜라닌이 피부 밖으로 배출되지 못하고 피부 속에 남아있게 되면 색소침착이 일어나게 된다. 이러한 멜라닌 생성 메커니즘의 가장 큰 특징은 티로시나아제라는 단 한 개의 효소가 관여한다는 것으로, 상기 티로시나아제 활성을 억제하여 멜라닌 생성을 방지하게 되면 미백 효과를 기대할 수 있다. 따라서 본 실험에서는 먼저 마가목 발효추출물이 멜라닌 합성(생성)을 억제하는 효과가 있는지를 측정하였으며, 이러한 멜라닌 합성 억제 효과가 실제로 티로시나아제 효소 활성을 억제하는 과정을 통하여 이루어지는지를 확인하였다.

< 실시예 5-1> 멜라닌 합성 억제 활성

본 발명의 마가목 발효추출물이 피부미백에 활성이 존재하는지 확인하기 위해 멜라닌 합성 억제 활성(Melanin synthesis inhibition activity) 실험을 하였다. 실험 쥐 유래 멜라닌세포(melanocyte)인 Clone-M3세포는 멜라닌을 생성한다. 멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 멜라닌세포 내의 소기관인 멜라노좀(melanosome)에서 생합성되며 이는 가시광선 영역대의 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교할 수 있다. Clone-M3세포 접종 후 3일간 각각의 농도별로 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2를 처리하고 배지를 제거한 다음 세포를 PBS로 세척하고, 각 웰당 1의 1N NaOH를 첨가한 후 교반하여 세포막을 융해함으로써 멜라닌 성분을 녹여 나오게 하여, 가시광선 영역대 중 가장 파장이 짧은 푸른색 가시광선 영역인, 400에서 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교하였다. Clone-M3 세포에 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2를 농도별로 처리하고 24 시간이 지난 후, 멜라닌 생성 저해율을 측정하였다. 그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 실시예1, 비교예1 및 비교예2 모두 농도 의존적으로 멜라닌 합성 저해율이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5-2> 티로시나아제( Tyrosinase ) 억제 활성

상기 실시예<4-1>을 통해 본 발명의 마가목 발효추출물이 멜라닌 합성 억제 활성을 가지는 것을 알 수 있었는데, 본 실험에서는 이러한 멜라닌 합성 억제 활성이 피부 멜라닌 색소의 생성을 촉진시키는 효소로 잘 알려진 티로시나아제 활성 억제를 통해 이루어지는 것인지를 확인하였다.

티로시나아제 억제효과는 도파크롬(dopachrome)방법을 이용하여 측정하였다. 150㎕의 머쉬룸티로시나아제(Mushroom Tyrosinase), 225㎕의 2.5mM L-티로신, 225㎕의 0.4M hepesbuffer(pH 6.8), 그리고 300의 에탄올 용액 혹은 시료 (1/)용액을 섞은 후 배양 전과 15분간 배양 후 각각의 흡광도를 475에서 측정하여 억제되는 정도를 살펴보았다. 티로시나아제의 억제 정도는 다음과 같이 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 5에서 나타내었다.

티로시나아제 억제(%)=(D-C)-(B-A)/(D-C)

(A와 B는 각각 시료가 첨가된 용액의 배양 전과 배양 후의 흡광도이며, C와 D는 각각 시료를 넣지 않은 용액 [기준 용액]의 배양 전과 배양 후의 흡광도이다. 이들 티로시나아제 억제효과는 100으로 나타날 때 완전한 억제를 의미하며, 0일 때 전혀 억제를 하지 못하는 것을 의미한다.)

농도(%) 시료	0.1	0.5	1.0	2.0	5.0	10.0
실시예1	15.21	20.14	27.21	32.58	33.10	34.52
비교예1	12.15	15.54	20.45	26.21	26.55	27.12
비교예2	15.59	22.54	28.45	32.12	33.89	34.99

시료의 농도에 따른 티로시나아제 저해능

상기 표 5에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 마가목 발효추출물은 처리 농도에 의존하여 티로시나아제의 억제 효율이 증대되는 것으로 나타났으며, 최종적으로 약 34%의 저해율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로 마가목 발효추출물이 티로시나아제 효소를 억제함으로써 멜라닌 합성을 효과적으로 억제할 수 있어 피부미백에 유용함을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6> 인체적용시험을 통한 주름 개선 및 피부톤 개선 효과 확인

상기 실시예 2에서 제조한 영양크림을 이용하여 주름개선 및 피부미용 개선 효과에 대한 다중안면검사카메라시스템 Janus(아람휴비스, 한국)와 2인의 전문가의 임상소견과 피실험자 설문조사를 실시하였다. 20~55세까지의 건강한 여성 및 남성 20 명을 대상으로 마가목 발효추출물을 함유한 영양크림을 1일 2회 2주간 사용하도록 하였다. 2주 후 피부주름의 개선정도 및 피부톤 개선 정도 등을 상기 조사를 통해 평가하였다. 피실험자의 피부 주름개선 및 피부톤 개선에 관하여 사용전과 비교하여 개선 없음(+), 약간의 개선(++), 상당한 개선(+++)의 3 단계로 판정하였다.

그 결과를 아래 표 6 및 도 4 내지 7에 나타내었다.

번호	이름	성별	나이	피부타입	주름개선	피부톤개선
1	박	남	24	지성	++	++
2	이	여	26	건성	++	+++
3	최	여	25	지성	++	+++
4	신	여	38	중성	+++	++
5	김	남	29	건성	++	++
6	한	남	22	중성	+	++
7	강	여	31	건성	++	+
8	송	여	36	지성	+++	+++
9	허	여	32	지성	+++	+++
10	장	남	42	중성	+++	+++
11	이	남	29	건성	++	++
12	박	남	30	지성	++	+
13	손	남	35	지성	++	+++
14	심	여	27	건성	++	++
15	황	여	51	건성	+++	+
16	양	여	31	건성	+++	+++
17	이	남	33	지성	++	+++
18	김	여	24	지성	+	++
19	최	남	37	건성	+++	+++
20	이	여	48	건성	+++	++

피실험자의 피부주름개선 및 피부톤 개선 효과

도 4 및 도 5에서 확인되는 바와 같이, 주름감소, 색소침착 감소/피부톤 개선이 관찰되었으며, 위 표 4 및 도 6, 7에서 나타난 바와 같이, 마가목 발효추출물을 함유한 영양크림을 사용시 피부 주름의 감소, 피부톤개선의 모든 설문에 대하여 약 70%의 긍정적 답변을 확인하였다. 그 중 주름개선 부분에 있어 30대 이상의 남녀층 거의 모든 피실험자에게 상당한 개선효과를 보였으며, 이로써, 실시예 1의 마가목 발효추출물이 피부미용 개선 효능을 가짐을 확인할 수 있었다.

Claims

마가목의 꽃과 잎을 추출한 추출물을 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주 중 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 발효한 발효추출물을 유효성분으로 함유하되,
상기 발효추출물은 마가목 열수추출물에 글루코스 및 탈지분유를 첨가하여 pH를 4.0-7.0로 조정하고 120℃ 내지 122℃에서 10분 내지 15분 동안 멸균한 배양액을 냉각 후, 상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 10⁷CFU/mL내지 10⁸CFU/mL 농도가 되도록 접종하여, 30℃ 내지 40℃ 온도에서 24시간 내지 72시간 발효시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 피부미백 및 피부주름개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 용암해수, 탈염 용암해수, 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 및 1,3-부틸렌글라이콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 피부미백 및 피부주름개선용 화장료 조성물.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 섬유아세포 증식 촉진, 콜라겐 합성 증대 및 엘라스타아제 저해 활성을 통해 주름개선 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 피부미백 및 피부주름개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 멜라닌 합성 억제 활성 및 티로시나아제 억제 활성을 통해 피부미백 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 피부미백 및 피부주름개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렝징워터, 팩, 스프레이, 및 파우더로 이루어진 화장료 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부미백 및 피부주름개선용 화장료 조성물.