KR102344704B1

KR102344704B1 - 고 기능성 물질의 함유량이 향상된 천연 발효물의 제조 방법 및 용도

Info

Publication number: KR102344704B1
Application number: KR1020190120613A
Authority: KR
Inventors: 강상문; 이기영; 전용승; 신은진; 차상주
Original assignee: 에이앤펩주식회사
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2021-12-30
Also published as: KR20210038019A

Abstract

인삼열매에서 높은 단백질과 펩타이드를 함유하고 있음을 밝히고,인삼열매 발효물에 있어 펩타이드 또는 단백질 함량을 증대시킬 수 있는 방법이 개시된다. 본 발명은 인삼열매 추출물을 포함하는 발효 배지에 바실러스 속 균주를 접종 및 발효하여 수득되는 발효물을 용매 분획하여 펩타이드 또는 단백질 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

Description

고 기능성 물질의 함유량이 향상된 천연 발효물의 제조 방법 및 용도{PREPARING METHOD OF NATURAL FERMENTATION EXTRACTS AND USE HAVING IMPROVED CONTENTS OF HIGH FUNCTIONAL METERIALS}

본 발명은 천연 발효물의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고 기능성 물질의 함유량이 향상된 천연 발효물의 제조 방법에 관한 것이다.

발효는 미생물이 가지고 있는 효소가 원재료를 변화시켜 이로운 성분을 만들어내는 과정을 뜻한다. 발효 과정 중에는 유효 성분들이 추출되며 기능성 물질의 함량이 증가한다. 그리고, 발효기술은 생물전환, 생합성, 생촉매 등의 용어와 의미상 중복성을 가지며, 미생물이 갖고 있는 효소적 기능을 이용하여 전구물질로부터 원하는 산물을 제조하는 기술을 의미한다. 따라서, 생체기능을 세포 또는 효소 단계에서 이용하는 발효 기술은 유용물질 생산을 주요 목적으로 하여 현재의 생물공업을 구성하는 주요한 공정과정이라 할 수 있다.

발효 식품이 자연적으로 발생하는 미생물을 활용하는 1차원적인 발효 기술을 활용했다면 발효 화장품은 더 앞선 기술을 필요로 한다. 또한, 단순히 전통적인 발효방법을 이용한 것이 1세대 발효라면 2세대 발효는 효능물질의 실용화 기술개발이었고, 유용한 생리활성 물질만을 대량으로 생산할 수 있는 고도의 발효생산기술을 통하여 화장품 기능성 소재산업의 기틀을 마련한 생물전환 발효 기술이 3세대 발효기술로서 자리매김하고 있다.

우리나라 국민들은 김치, 된장 등 발효식품을 많이 이용하기 때문에 발효라는 개념이 매우 친숙하며 발효 원료를 이용한 화장품 역시 거부감 없이 사용하고 있다. 그리고 일반 대중에게도 발효기술을 이용하여 새로운 소재를 개발할 경우 기존 소재와 완전히 새로운 효능을 보이거나 유해한 많은 성분들이 안전한 성분으로 변화된다고 알려져 있어 발효 화장품에 대한 선호도가 높으며, 이에 따른 기술개발도 타 선진국에 비해 뒤지지 않는 수준이다. 하지만, 현재 화장품에 적용되는 많은 발효소재들이 천연발효 또는 자연숙성에 가까운 발효 방법을 사용하는 것으로 알려져 있다.

최근 국내 발효 기술의 연구 트랜드는 천연발효 또는 자연숙성에 가까운 발효 방법을 사용하는 것으로 알려져 있으며, 자연발효란 가공하지 않은 다양한 원료를 있는 그대로 두고 물과 바람, 대지, 계절 등 자연의 힘을 이용하여 피부에 유용한 성분을 자연스럽게 생산하는 방식으로, 비록 시간이 오래 걸리지만 다양한 물질들을 얻을 수 있어 보습과 항산화, 주름개선, 세포활성, 피부결 개선 등의 효과를 얻을 수 있다는 것이 강점이다. 그러나, 천연발효 또는 자연숙성 방식의 발효는 생산 배치(batch) 별로 일정한 품질의 발효생성물을 얻기 어려우며, 품질의 관리도 어려운 단점이 있다.

발효물은 크게 발효여과물(Ferment Filtrate)과 발효용해물(Ferment Lysate)로 분류될 수 있는데, 발효여과물은 발효가 완료된 후 여과장치를 통해 미생물을 제거한 상등액(supernatant)을 활용하는 것이고, 발효용해물은 발효 완료 후 미생물을 열, pH, 효소(Lysozyme), 고압 등을 이용, 균을 사멸시켜 활용하는 방법이다.

한편, 인삼(Panax ginseng C.A.Meyer의 뿌리)은 전 세계적으로 각종 질병에 상용되는 전통적인 약재중의 하나로, 최근에는 항스트레스, 면역기능증강, 활력증진 그리고 항암작용을 하는 약재로 사용되고 있으며M 인삼의 대표적인 약리성분은 배당체의 하나인 사포닌(ginsenoside)으로, 현재까지 30여 가지의 진세노사이드가 있는 것으로 알려져 있다.

최근 인삼의 항산화 효과, 항주름 효과, 피부노화 억제 효과가 있음이 알려지면서 현재에는 다양한 기능성을 가진 인삼 관련 미용관련 제품이 고가로 판매되고 있으며 그 수요도 점차 증가되고 있으나, 인삼은 그 세대기간이 4~6년으로 길며 6년을 재배하여야 1뿌리 당 100~150 g(fresh weight)의 수삼이 수확되고 연작이 불가능하다고 알려져 있다.

인삼 화장품의 경우 국내 소비자의 인삼에 대한 높은 선호도를 기반으로 오랜 기간동안 다양한 업체에서 해당 제품을 생산하여 왔고, 가장 대표적인 인삼화장품 제조 기업으로는 아모레퍼시픽사(상표명 설화수)과 한국담배인삼공사(상표명 동인비)가 대표적으로 손꼽히며, 각자 독자적인 제품군을 구축하여 소비자들의 좋은 반응을 받고 있다. 이들 기업들은 과거 인삼, 홍삼 추출액 등을 주요 성분으로 활용하였으나, 최근에는 사포닌이나 진세노사이드의 성분 만을 분리하여 처방하는 방식을 통해 품질을 개량하고 있으며, 국내의 소비자 외에 해외 수출을 통해 해외 고객들의 요구도 충족시키고 있다.

인삼 부산물의 일종인 인삼열매(Ginseng berry)는 인삼에 비해 저렴한 가격으로 쉽게 구할 수 있는 원자재이나, 인삼 자체에 비해 뒤지지 않는 효능과 높은 함량으로 유효성분들이 함유되어 있다.

인삼열매가 주목을 받기 시작한 것은 '진세노사이드 Re'라는 인삼 열매의 독특한 사포닌이 당뇨병과 비만을 예방한다는 미국 시카고의대의 연구 결과가 2002년 미국 의학학술지 '당뇨병(Diabetes)'에 발표되면서이다. 연구팀이 당뇨병에 걸리게 조작한 쥐에게 인삼 열매를 투여하자 공복 시 혈당 수치가 유의하게 감소됐다. 또한, 실험용 쥐의 콜레스테롤 수치와 체중이 감소했고 에너지 소비율은 증가함을 확인하였다.

인삼열매는 주름을 개선하고 피부 탄력을 높이는 효과도 확인되었다. 인삼열매 내에는 항산화 효과가 뛰어난 비타민 E와 안토시아닌 성분이 풍부하게 함유돼 있어 노화 방지 효과가 인삼 뿌리보다 더 우수한 것으로 밝혀졌으며, 인삼열매 사포닌의 주 성분인 진세노사이드 Re는 식물성 에스트로겐과 비슷한 역할을 해 여성 갱년기 증상을 완화하는 데도 도움을 준다고 알려져 있다.

인삼열매의 경우 유효성분을 다량 함유해 국내외에서 미용 재료, 제약 원료, 사료 첨가제 등으로 활용가능하며, 인삼 생산량 증가로 부산물 역시 증가 추세이고, 친환경 인삼 재배와 발효 기술 등이 발달하고, 부산물 활용의 제약 요인인 안전성 기준 완화로 산업 소재화 가능성이 증대하고 있는 상황이다. 인삼 부산물의 산업적 이용 가치를 고려해 다양한 용도와 응용방법 개발이 필요하며, 특히 기존에 잘 알려진 진세노사이드 계열 뿐만 아니라, 인삼열매내에 기능성 펩타이드에 대한 연구를 통해 인삼 부산물인 인삼열매의 효용성을 확대하는 연구의 필요성이 절실하다.

진세노사이드는 인삼의 주요 성분으로 의약품이나 건강기능 식품, 그리고 화장품의 기능성 성분으로 많이 활용되어 왔지만, 최근의 연구결과에 따르면 일부 진세노사이드에서 강한 세포독성이 발견되었다는 사실이 확인되면서 유해성 논란에 휩싸이게 되었다. 또한, Jin-Ho Chung 등(Food and Chemical Toxicology 118 (2018) 645.652)은 Rg3 배양액에 쥐의 평활근(내장의 벽을 구성하는 근육) 세포를 배양해 독성을 확인하였으며, Rg3 농도가 10 μM 이상인 배양액에서 심장 평활근 세포의 세포사(apoptosis)를 유발하였으며, 그 보다 농도가 낮은 1 μM에서도 평활근의 활동에 부정적인 영향을 확인하였으며, 그 메카니즘은 Rg3가 평활근 세포의 근육 수축·이완을 담당하는 'F-actin' 단백의 결합 상태를 무너뜨리고, F-actin에 결합한 'Bmf' 단백도 분리하여 유리된 Bmf 단백은 세포의 미토콘드리아로 이동하고, 미토콘드리아 내 에너지 생산활동을 방해해 세포사를 유도하게 되는 것으로 확인하였다. 따라서, 항암 효과가 있다고 알려진 Rg3에는 상당히 강한 세포 독성이 있으며, 암세포만을 선택적으로 죽이지 않고 정상 세포도 함께 파괴한다는 점을 논문을 통해 확인하였다.

물론 인삼 내에는 Rg3 외에 다양한 진세노사이드가 존재하며 이들 모두의 독성을 확인한 것이 아니기 때문에 인삼이 인체에 유해하다고 생각할 수 없지만 현재 진세노사이드 일변도인 인삼유효 성분에서 벗어나 인삼의 다른 성분에 대한 연구가 필요한 것도 사실이다.

인삼 혹은 인삼의 부산물에는 진세노사이드 외에 다양한 기능성 성분들이 있으며, 특히 인삼 다당체(Polysaccharides)의 면역 기능성에 대해서는 많은 연구가 이루어져 있다. 건강기능식품에서 인삼 다당체 추출물이 개별인증되어 활용되고 있으나, 인삼의 단백질이나 펩타이드에 대해서는 연구가 많이 부족한 것이 현실이며 인삼의 효능을 발휘하는 성분으로 파악되지 않은 상태이다.

본 발명은 인삼열매에서 높은 단백질과 펩타이드를 함유하고 있음을 밝히고,인삼열매 발효물에 있어 펩타이드/단백질 함량을 증대시킬 수 있는 방법과, 그 방법으로 제조되는 발효물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 인삼열매 추출물을 포함하는 발효 배지에 바실러스 속 균주를 접종 및 발효하여 수득되는 발효물을 용매 분획하여 펩타이드 또는 단백질 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 상기 발효물은 피부주름 개선 및 항염증의 복합 효능을 가지는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacullus subtilis) 균주인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 용매 분획으로 수득된 분획물에 대하여 컬럼 정제 공정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 분획물은 상기 발효물에 대하여 헥산(n-hexane), 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 부탄올(n-BuOH)로 순차 분획 후 수득되는 물 분획물인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 컬럼의 충진제는 실리카인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 컬럼의 이동상은 디클로로메탄(CH₂Cl₂):메탄올(MeOH) 용매 시스템인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

상기 또 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 방법에 따라 펩타이드 또는 단백질 함량이 증가된 발효물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 상기 화장료 조성물의 제형은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 세럼, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 엣센스, 팩, 헤어토닉, 헤어트리트먼트, 샴푸 및 린스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 인삼의 부산물 중 인삼열매에서 가장 높은 단백질과 펩타이드를 함유하고 있다는 것과 바이오컨버젼을 통해 단백질과 펩타이드의 패턴이 전환되는 것을 확인한 것으로부터, 인삼열매 추출물 발효에 이용되는 미생물로서 바실러스 속 균주를 선택하고, 용매 분획을 통해 펩타이드/단백질 함량을 증대시킴으로써 피부주름 개선 및 항염증의 복합 효능이 현저히 개선된 인삼열매 발효물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 2 및 3에서 발효물을 순차 용매 분획 및 컬럼 정제를 통한 정제 진행 과정을 나타낸 도면,
도 2는 본 발명의 실시예 3에서 인삼열매 발효 정제물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프,
도 3은 본 발명의 실시예 4에서 인삼열매 발효 정제물의 자외선에 유도되는 피부노화 개선 효능을 확인한 결과를 나타낸 그래프,
도 4는 본 발명의 실시예 5에서 인삼열매 발효 정제물의 콜라젠 생성 촉진 효능을 확인한 결과를 나타낸 그래프,
도 5는 본 발명의 실시예 6에서 인삼열매 발효 정제물의 항염증 효능을 확인한 결과를 나타낸 그래프,

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명자들은 인삼열매에서 높은 단백질과 펩타이드를 함유하고 있다는 것과 바이오컨버젼을 통해 단백질과 펩타이드의 패턴이 전환되는 것을 확인하였고, 인삼열매 추출물 발효에 이용되는 미생물로서 바실러스 속 균주를 선택하고, 용매 분획을 통해 펩타이드/단백질 함량을 증대시킴으로써 피부주름 개선 및 항염증의 복합 효능이 현저히 개선시킬 수 있음을 발견하고 본 발명에 이르게 되었다.

따라서, 본 발명은 일 양태로서 인삼열매 추출물을 포함하는 발효 배지에 바실러스 속 균주를 접종 및 발효하여 수득되는 발효물을 용매 분획하여 펩타이드 또는 단백질 함량을 증대시키는 방법을 개시한다.

상기 발효 배지 성분 중 상기 인삼열매 추출물은 발효물의 원료로서 건조 상태의 인삼열매를 분쇄 후 용매 추출된 것이 사용될 수 있다. 상기 추출 방식에 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 에탄올 추출물이 사용될 수 있고, 예컨대, 인삼열매 건조물은 20 메쉬 이하로 조분쇄한 시료에 10~1,000 배, 바람직하게는 50~200 배 중량의 에탄올을 넣어 1~5 일간, 바람직하게는 2~4 일간 추출한 후 여과 및 농축하여 수득될 수 있다.

상기 인삼열매 추출물 외에 발효 배지 성분으로 글루코오스(glucose), 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)을 더 포함할 수 있으며, 발효 균주로 사용되는 바실러스 속 균주 또는 락토바실러스 속 균주의 발효 적합성 및 발효 효율을 고려하여, 상기 발효 배지 성분 조성은 인삼열매 에탄올 추출물 1~10 중량%, 글루코오스(glucose) 0.1~2 중량%, 효모 추출물(yeast extract) 0.1~2 중량% 및 소이톤(soytone) 0.02~1 중량%를 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 인삼열매 에탄올 추출물 3~7 중량%, 글루코오스(glucose) 0.2~1.5 중량%, 효모 추출물(yeast extract) 0.1~1 중량% 및 소이톤(soytone) 0.05~0.5 중량%를 포함할 수 있고, 더욱 더 바람직하게는 인삼열매 에탄올 추출물 4~6 중량%, 글루코오스(glucose) 0.4~0.8 중량%, 효모 추출물(yeast extract) 0.2~0.5 중량% 및 소이톤(soytone) 0.05~0.3 중량%를 포함할 수 있으며, 이는 실험 결과를 통해 확인되었다.

본 발명에서는 인삼열매 추출물 발효에 이용되는 미생물로서 바실러스 속 균주를 선택하며, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacullus subtilis) 균주가 선택되어 인삼열매 추출물을 이용한 발효물의 복합 효능을 극대화할 수 있다.

상기 바실러스 서브틸리스(Bacullus subtilis) 균주로서, 본 발명에서는 특히 Bacullus subtilis Apep Microorganism Jeju 170201 균주가 복합 효능 개선에 특이적인 것을 확인하였다.

인삼열매 추출물을 이용한 발효물의 복합 효능 극대화를 위해서는 특정의 배양방법을 통해 배양된 발효 미생물을 사용하는 것이 바람직하며, 본 발명에서는 상기 바실러스 속 균주로서, NB(nutrient broth) 배지에서 35~39℃ 및 18~30 시간, 바람직하게는 36~38℃ 및 20~28 시간 진탕 배양된 균주가 특히 적합한 것을 확인하였다.

또한, 본 발명에서 발효 조건에 있어서도 인삼열매 추출물을 이용한 발효물의 복합 효능 극대화를 위해 특정의 발효 조건을 설정하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 발효 공정을 35~39℃에서 1~5 일간, 바람직하게는 36~38℃에서 2~4일간의 조건으로 수행하는 것이 특히 적합하며, 이 경우 분획 전 발효물의 펩타이드/단백질 함유량을 24 mg/ml 이상, 바람직하게는 25 mg/ml 이상까지 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서는 발효물 내 펩타이드/단백질의 함량을 증대시키기 위해 바실러스 속 균주를 접종 및 발효하여 수득되는 발효물을 용매 분획을 통해 정제하는 공정을 수행한다.

발효물은 여러 고분자 물질들을 포함한 단백질류, 다당류, 단당류, 여러 유리아미노산, 유기산 등 많은 물질들이 함유되어 있다. 따라서, 본 발명에서는 불순물을 제거하고 펩타이드/단백질의 함량을 증대시켜 효능을 높이기 위해 분획을 진행하여 분리가 용이하도록 하였다. 분획이란 추출물을 물에 녹인후, 물과 섞이지 않는 같은 양의 유기 용매를 넣어서 분액깔대기에서 분획하는 방법으로, 극성을 이용한 분리방법이다. 이 분획분리법을 통해 인삼열매 발효물을 극성별로 분획하여 1차적인 분리를 진행한다.

본 발명에서 분획 공정은 상기 제조되는 발효물을 순차적으로 계통분리하여 용매 분획물로 수득될 수 있다. 본 발명에서는 최종 분획물에서의 펩타이드/단백질 함량을 증대시키기 위해 특정 용매를 순차로 이용하는데, 분획물은 상기 발효물에 대하여 헥산(n-hexane), 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 부탄올(n-BuOH)로 순차 분획 후 수득될 수 있으며, 최종 물 분획물에서 펩타이드/단백질 함량이 극대화되는 것을 확인하였다.

본 발명에서 용매 분획은 예컨대, 발효물에 헥산(n-hexane)을 첨가 및 교반하여 분획이 완료되면 헥산층 및 물층을 분리하고, 헥산층은 감압농축 후 잔류 헥산용매를 제거하여 헥산 분획물을 수득할 수 있으며, 물 분획은 분획여두에서 다시 디클로로메탄(CH₂Cl₂)로 분획 과정이 수행되며, 이후, 에틸아세테이트(EtOAc) 및 부탄올(n-BuOH)을 이용하여 동일한 과정을 순차적으로 수행하여 다른 용매에 대한 분획물을 수득할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 분획한 인삼열매 발효물 내 펩타이드/단백질의 함량을 더욱 증대시켜 복합 효능을 극대화하기 위해 컬럼 정제 공정을 수행할 수 있다.

여기서, 분획층 중에 펩타이드/단백질 함량이 가장 높은 물 분획물에 대해 다양한 컬럼 정제 조건으로 실험한 결과, 컬럼은 실리카(silica) 컬럼을 사용하고, 이동상은 조건별 실험을 통해 디클로로메탄(CH₂Cl₂):메탄올(MeOH) 용매 시스템일 경우 가장 이상적으로 분리되는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면 상기 제조되는 펩타이드/단백질 함량이 증대된 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선 및 항염증의 복합 효능을 가진 화장료 조성물이 개시된다. 여기서, 상기 발효물은 발효여과물(Ferment Filtrate) 또는 발효용해물(Ferment Lysate)의 형태일 수 있으며, 전술한 바와 같이 발효여과물은 발효가 완료된 후 여과장치를 통해 미생물을 제거한 상등액(supernatant) 상태의 발효물이고, 발효용해물은 발효 완료 후 미생물을 열, pH, 효소(Lysozyme), 고압 등을 이용, 균을 사멸시킨 상태의 발효물이다.

상기 화장료 조성물에는 유효성분으로서 상기 발효물이 0.1~90중량% 함유될 수 있고, 상기 발효물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함될 수 있으며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체가 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 세럼, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 엣센스, 팩, 헤어토닉, 헤어트리트먼트, 샴푸, 린스 등의 제형으로 제조될 수 있다.

이때, 상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한, 상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

또한, 상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

또한, 상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 상기제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

실시예 1: 인삼열매 발효물의 제조

발효물의 원료인 인삼열매 건조물을 20 mesh 이하로 조분쇄하여, 시료 100 g에 대해 100 배의 70 중량% 에탄올을 넣어 72 시간 동안 추출한 후, 여과(Whatman No 2, Maidstone, England)하였다. 여과한 에탄올 추출액을 감압농축(N1000S-WD, Eyela Co., Tokyo, Japan) 후 동결건조(FDU-1100, Eyela Co., Tokyo, Japan)하여 에탄올 추출물을 제조하였다.

본 발명에서의 발효 공정에 최적화 된 발효 미생물로서 별도 선별된 바실러스 서브틸리스(Bacullus subtilis) 균주인 Bacullus subtilis Apep Microorganism Jeju 170201 균주를 이용하여 발효를 진행하였다. 활용한 미생물에 대한 배양배지의 조성과 미생물의 배양 조건은 nutrient broth(Difco, Detroit, MI, USA), 37℃ 진탕 배양기에서 24시간 배양으로 하였다. 발효 시 사용된 조성은 인삼열매 에탄올 추출물 5 중량%, glucose 0.6 중량%, yeast extract 0.3 중량%, soytone 0.1 중량%로 하였다. 발효 조성에 각 균주를 접종하여 37℃에서 3 일간 진탕 배양하여 발효를 진행하였다. 발효 완료 후 발효물을 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 여과시켜 발효여과물을 수득하였다.

실시예 2: 발효물의 용매 분획 정제

실시예 1에서 확보된 발효물 내 펩타이드/단백질의 함량을 높이기 위해 발효물을 순차 용매 분획을 통해 정제를 진행하였다(도 1 참조).

발효물을 극성이 다른 용매를 이용하여 단계적으로 분획하였다. 발효물과 헥산(n-hexane)을 1 : 1 동량의 중량 비율로 혼합하여 추출 분획한 후 rotatory vacuum evaporator로 농축하여 n-Hexane 분획물을 얻었다. 총 2회에 걸쳐 진행하였으며, 수층 분획은 분획 여두에서 다시 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 부탄올(n-BuOH)로 순차 분획 추출하여 이로부터 각각 CH₂Cl₂, EtOAc, n-BuOH 및 수층 분획물을 얻은 후 농축하였다. 각 분획물에 대하여 하기 방법에 따라 펩타이드/단백질 함량을 측정하고 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[펩타이드/단백질 함량 측정방법]

펩타이드/단백질 함량을 확인하기 위해 bradford assay를 진행하였다. bradford assay는 펩타이드/단백질과 reagent와의 발색 반응을 이용하여 특정한 파장영역의 빛을 발생시켜 UV-Visible spectrophotometer로 흡광도를 측정하여 standard 물질인 BSA(Bovine Serum Albumin)나 BGG(Bovine Gamma Globulin)를 기준으로 자신의 시료에 펩타이드/단백질이 얼마만큼 들어있는지 측정하는 방법이다. 이중 펩타이드/단백질 정량을 위하여 브래포드(Bradford)법을 사용하였다. 브래포드법은 다음과 같이 수행된다. 5x의 protein assay dye(Coomassie ble G-250)를 증류수를 이용하여 1x로 dilution하여 준비 한 후, 10 mg/㎖ 농도의 Albumin 스탠다드 용액을 1 ㎖ 준비한다. 스탠다드의 용액을 이용하여 0.0, 0.2, 0.4, 0.6 및 0.8 mg/㎖의 농도의 Albumin 용액을 1 ㎖ 제조한다. 스탠다드 용액을 각 농도에 맞춰 준비한 Albumin 용액 20 ㎕에 protein assay 1x dye를 1 ㎖ 넣어준 후 vortexing하여 잘 혼합한다. spectrophotometer를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정한 후 Standard curve를 작성하여 희석배수를 곱하여 본래의 시료의 농도를 구하여 펩타이드/단백질 양을 mg/㎖로 나타내었다.

표 1을 참조하면, 용매 층 중에 수층에서 가장 높은 펩타이드/단백질 함량을 보이는 것을 확인할 수 있다.

실시예 3: 발효 분획물의 컬럼 정제

실시예 2에서 분획한 인삼열매 발효물의 물 분획층의 펩타이드/단백질 함량을 높이고, 복합 효능을 증대시키기 위한 추가적인 컬럼 정제를 진행하였다.

분획물을 보다 정밀하게 물질 분석하기 위하여 분획물을 농축한 후 컬럼을 이용하여 추가 정제를 진행하였다. 정제에 활용한 컬럼으로 silica 컬럼을 사용하였고, 이동상은 조건별 실험에서 확인한 바 CH₂Cl₂ : MeOH 조건에서 가장 이상적으로 분리 되는 것을 확인하여, CH₂Cl₂:MeOH(9:1~1:9) 부터 MeOH:water(9:1~1:9), water 100%까지 순차적으로 진행하였으며, 각 조건별로 1 ℓ씩 컬럼 진행 후 획득된 fraction(Fr) 별로 TLC로 확인하여 컬럼을 통한 물질 정제 조건을 확인하였다. 총 12 개의 Fr 중 펩타이드/단백질 함량이 높은 Fr.1에서 Fr.4까지의 Fr.을 HPLC를 통해 물질의 순도와 종류를 파악하기 위해, TLC로 분리된 단일 물질로 확인되는 띠를 긁은 후 70% 에탄올 추출, 여과, 감압·건조 과정을 거쳐 성분을 추출한 후, 100% 에탄올에 녹이고 syringe filter(Milipore 0.45 ㎛)를 이용하여 여과하고, 그 여액을 단백질 정량, HPLC, LC/ESI-MS/MS 분석에 이용하였다. HPLC 분석은 2% acetic acid 수용액과 0.5% acetic acid를 함유한 50% acetonitrile 수용액을 이용해 기울기 용리법으로 분석하였고, HPLC 분리조건은 하기 표 2에 나타내었다. 펩타이드/단백질 정량 결과는 상기 표 1에 함께 나타내었고, HPLC 분석 결과는 도 2에 나타내었다.

상기 표 1 및 도 2를 참조하면, Fr.1에서 Fr.4(HPLC Mobile phase ACN(in 0.1%TFA) -> water(in 0.1% TFA) 0~100%, 216nm)까지의 정제물에서 펩타이드/단백질로 추측되는 물질이 포함되어 있으며 물질의 순도 또한 높은 것으로 확인되었다.

¹⁾AA : Acetic acid, ²⁾ACN : Acetonitrile

실시예 4: 발효 정제물의 자외선에 유도되는 피부노화 개선 효능 확인

인삼열매 발효 정제물의 Fr.별 피부 노화 개선 효능과 펩타이드/단백질 함량과의 상관관계를 확인하기 위해 MMP-1 활성 저해능 시험을 진행하였다.

사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's media, Sigma)에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Sigma)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 2×10⁵ cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 대조군에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 디쉬에는 실험군과 대조군으로 레티놀을 10 ㎍/㎖의 농도가 되도록 처리를 하였다. 각각의 디쉬에 시험물질을 가한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여 Matrix Metalloproteinase-1(MMP-1),Human,biotrak,ELISA kit(GE healthcare RPN2610)을 통해 MMP-1의 저해능을 측정하였다. 실험군을 200 ppm 농도로 처리한 뒤 MMP-1 억제효과를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3을 참조하면, MMP-1의 발현량이 대부분의 실험군에서 대조군인 레티놀에 비해 줄어드는 것을 확인하였으며, 실험군 내에서도 조성물 내 기능성 원료성분의 조합 및 조성물에 따라 차이가 있는 것으로 확인되었다. 인삼열매 발효 정제물을 24시간 전처리하였을 때, UV에 의한 MMP-1의 단백질 발현정도를 측정한 결과, 인삼열매 발효 정제물이 MMP-1 단백질 발현을 억제하며, 억제능은 대체적으로 펩타이드/단백질의 함량과 비례하는 것을 확인하였다. 따라서, 인삼열매 발효 정제물의 경우 높은 펩타이드/단백질의 함량으로 인해 콜라젠의 분해 억제능이 일반 발효물에 비해 우수하여 UV에 의한 콜라젠의 감소로 인한 주름생성을 예방할 수 있을 것으로 판단된다.

실시예 5: 발효 정제물의 콜라젠 생성 촉진 효능 확인

Collagen 생합성량 측정은 procollagen type I C-peptide(PIP) ELISA kit를 이용하여 수행되었다. DMEM으로 계대 배양된 인간 섬유모세포를 사용하여 24 Well에 2×10⁵개로 분주하여, 24시간 후에 분획물을 200 ppm 농도로 넣은 후 무혈청 배양액으로 교환하여 24시간 처리하고, 세포배양액을 채취한 뒤 각 well에서 세포 배양액을 PIP collagen assay kit를 이용하여 collagen 생합성량을 측정하였다. 대조군에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 디쉬에는 실험군과 대조군으로 TGF-β을 10 ng/㎖의 농도가 되도록 처리를 하였고, 실험군은 10, 20 및 40 mg/㎖로 각각 처리하였다. 먼저 1차 collagen 항체가 균일하게 도포된 96-well plate에 채취한 세포 배양액 20 ㎕를 넣고, 37℃ 항온조에서 광차단하여 3시간 항원-항체 반응시킨 후 PBS로 4회 washing한 다음, 발색단이 결합된 2차 콜라젠 항체를 kit에 넣고 다시 15분간 반응시킨 후 발색유발 물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1 M의 황산을 넣어 발색을 중지시킨 후 이를 ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. collagen 생합성량 측정결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 참조하면, 인삼열매 발효물의 분획 정제물 Fr.1의 경우 낮은 농도에서도 콜라젠의 분해를 억제시킴으로써 UV에 의한 콜라젠의 감소로 인한 주름생성을 예방할 수 있음이 확인된다.

실시예 6: 발효 정제물의 항염증 효능 확인

최근 염증반응의 중요한 작용인자로 알려진 nitric oxide(NO) 생성저해에 대한 인삼열매 발효물의 분획 정제물의 영향을 확인하였다. NO 측정은 24 well plate에 세포를 5×10⁵ cell/을 seeding한 후, LPS(100 ng/㎖)와 발효물을 농도차를 두어 첨가한 후, 24 h incubator에서 반응시킨 후, 각각 50 ㎕씩 Griess reagent(1% sulfanilamide/0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H₃PO₄)와 반응시킨 후, 파장이 540 nm인 ELISA reader(Bio-Rad Co, USA)를 사용하여 값을 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5를 참조하면, 인삼열매 발효물의 분획 정제물에 대한 NO 생성 저해 효과를 확인한 결과, LPS를 처리한 군(LPS+)에서의 NO inhibition effect 100% 기준으로, 인삼열매 발효 분획 정제물을 5 ㎍/㎖ 이상 처리할 경우 50% 이상의 저해 효과를 보여 우수한 염증 완화 효능을 나타냄을 확인할 수 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 인삼열매 발효물을 유효성분으로 함유한 화장료 조성물의 적용 제조예를 설명하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 유연화장수 제조

실시예 3에 따라 제조된 바실러스 서브틸리스(Bacullus subtilis) 발효 정제물을 포함하며, 하기 표 3의 조성으로 이루어진 유연화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.

제조예 2: 영양크림 제조

실시예 3에 따라 제조된 바실러스 서브틸리스(Bacullus subtilis) 발효 정제물을 포함하며, 하기 표 4의 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 영양크림 제조방법에 따라 제조하였다.

제조예 3: 영양화장수 제조

실시예 3에 따라 제조된 바실러스 서브틸리스(Bacullus subtilis) 발효 정제물을 포함하며, 하기 표 5의 조성으로 이루어진 영양화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.

제조예 4: 엣센스 제조

실시예 3에 따라 제조된 바실러스 서브틸리스(Bacullus subtilis) 발효 정제물을 포함하며, 하기 표 6의 조성으로 이루어진 엣센스를 일반적인 엣센스 제조방법에 따라 제조하였다.

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

Claims

인삼열매 추출물을 포함하는 발효 배지에 바실러스 속 균주를 접종 및 발효하여 수득되는 발효물을 용매 분획하여 펩타이드 또는 단백질 함량을 증대시키는 방법으로서,
상기 바실러스 속 균주는 Bacullus subtilis Apep Microorganism Jeju 170201 균주이고,
상기 용매 분획으로 수득된 분획물은 상기 발효물에 대하여 헥산(n-hexane)을 첨가 및 분획하여 물층을 분리하고, 물 분획에 대하여 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 부탄올(n-BuOH)을 이용하여 동일한 과정으로 순차 분획 후 수득되는 물 분획물인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 발효물은 피부주름 개선 및 항염증의 복합 효능을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 용매 분획으로 수득된 분획물에 대하여 컬럼 정제 공정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제4항에 있어서,
상기 컬럼의 충진제는 실리카인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서,
상기 컬럼의 이동상은 디클로로메탄(CH₂Cl₂):메탄올(MeOH) 용매 시스템인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항, 제2항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항의 방법에 따라 펩타이드 또는 단백질 함량이 증대된 발효물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제8항에 있어서,
상기 화장료 조성물의 제형은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 세럼, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 엣센스, 팩, 헤어토닉, 헤어트리트먼트, 샴푸 및 린스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.