JP4945556B2

JP4945556B2 - 細胞賦活用皮膚外用剤組成物

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Publication number: JP4945556B2
Application number: JP2008514485A
Authority: JP
Inventors: 利孝岡田; 賢司藤澤; 寛子 ▲高▼▲橋▼
Original assignee: Toyo Hakko Co Ltd
Current assignee: Toyo Hakko Co Ltd
Priority date: 2006-05-02
Filing date: 2007-05-02
Publication date: 2012-06-06
Anticipated expiration: 2027-05-02
Also published as: CN102225045B; CN101431980A; JPWO2007129674A1; HK1130182A1; JP2011173921A; JP4945692B2; KR101397976B1; CN101431980B; KR20090007726A; CN102225045A; WO2007129674A1

Description

本発明は、細胞賦活用皮膚外用剤組成物に関する。更に詳しくは、本発明は、コラーゲン合成作用等に優れた細胞賦活用皮膚外用剤組成物に関する。

従来より、米ぬか等を発酵させて得られる発酵物を含有する皮膚外用剤等の化粧品等が知られている。例えば、特許文献１には、発酵糠類を含有する化粧品組成物及びそれを用いた化粧品が開示されている。特許文献１において、この化粧品は、保湿性に優れ、皮膚に塗布した際の刺激が少なく、炎症が発生し難く快適であることが記載されている。また、特許文献２には、米ぬかと大豆ペプチドとを枯草菌により発酵させ、その後、精製処理して得られる皮膚外用剤原料の製造方法が開示されている。特許文献２において、この皮膚外用剤原料は安全性が高く、皮膚の活性を高めることができることが記載されている。

特開２００４−２６２８２９号公報特開平８−１０４６４７号公報

特許文献１及び２記載の発酵物を皮膚外用剤等の化粧品に配合することによる効能は多い。例えば、この発酵物を配合した皮膚外用剤等の化粧品は、しわ、しみ、たるみ等を抑えることができ、しもやけ、あかぎれ及び肌荒れ等を予防することができる。また、この発酵物を配合した皮膚外用剤等の化粧品では、創傷治癒及び火傷等の症状の改善等の効能が得られる。

本発明は、安全性が高く、コラーゲン合成作用等に優れた細胞賦活用皮膚外用剤組成物を提供することを目的とする。

本発明は以下のとおりである。
〔１〕米ぬかと豆類由来ペプチドとを枯草菌により発酵させて得られる発酵物と、ビタミンＡ類と、を含有する細胞賦活用皮膚外用剤組成物において、
上記豆類由来ペプチドは、大豆ペプチドであり、
上記ビタミンＡ類は、シクロデキストリン包接レチノールである細胞賦活用皮膚外用剤組成物。
〔２〕上記ビタミンＡ類の含有量は、上記発酵物１００質量部に対して、０．１〜１質量部である上記〔１〕に記載の細胞賦活用皮膚外用剤組成物。

本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物は、天然物を原料としている。よって、本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物は、安全性が高く、且つ優れたコラーゲン合成作用及び細胞増殖作用等を有する。

以下、本発明を詳しく説明する。
本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物は、米ぬかと豆類由来ペプチドとを枯草菌により発酵させて得られる発酵物と、ビタミンＡ類と、を含有し、上記豆類由来ペプチドは、大豆ペプチドであり、上記ビタミンＡ類は、シクロデキストリン包接レチノールであることを特徴とする。

上記「米ぬか」としては、例えば、米ぬか、脱脂米ぬか、米胚芽、及び脱脂米胚芽が挙げられる。これらは１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。上記米ぬかは、市販の米ぬか等に限定されることなく、様々な種類の米ぬかを用いることができる。

上記「豆類由来ペプチド」は、大豆ペプチドである。

上記豆類由来ペプチドを得る方法には特に限定はない。例えば、上記豆類由来ペプチドは、大豆を溶媒（水、熱水、アルコール（エタノール等）の有機溶媒又は水−有機溶媒混合溶媒）で抽出することにより得ることができる。この過程において、必要に応じて分画及び精製等を行うことができる。更に、プロテアーゼ、酸又はアルカリで加水分解処理をすることにより、得られた豆類由来ペプチド又は豆類タンパク質を更に断片化することができる。

上記豆類由来ペプチドの形態には特に限定はない。上記豆類由来ペプチドは、上記抽出後、乾燥等により固形化した固形物（例えば、粉状物又は粒状物等）とすることができる。また、上記豆類由来ペプチドとして、上記抽出物自体を用いることができる。即ち、本発明では、上記豆類由来ペプチドとして、上記豆類由来ペプチドを含有する抽出物（大豆エキス）を用いることができる。例えば、本発明では、上記豆類由来ペプチドとして、大豆を溶媒（水、熱水、アルコール（エタノール等）の有機溶媒又は水−有機溶媒混合溶媒）で抽出することにより得られる抽出物を用いることができる。

上記豆類由来ペプチドを含有する抽出物を得るための抽出方法、抽出条件については特に限定はない。例えば、抽出原料である豆類は未粉砕でも、粉砕したものでもよい。また、抽出物の品質を維持できる限り、不純物除去等の前処理をしてもよい。また、抽出溶媒としては、水又は熱水の他、メタノール及びエタノール等のアルコール、酢酸エチル等のエステル、ｎ−ヘキサン等の有機溶媒、並びにこれらの有機溶媒と水又は熱水との混合溶媒等を用いることができる。上記抽出溶媒としては、水又は熱水、アルコール（メタノール及びエタノール等）、及び水又は熱水とアルコールとの混合溶媒が好ましい。上記熱水の温度は、通常、４０〜１００℃、好ましくは５０〜８０℃、更に好ましくは５０〜７０℃である。また、抽出の際の抽出溶媒のｐＨは通常３〜７、好ましくは４〜６、更に好ましくは４〜５である。ｐＨを上記範囲内とすることにより、抽出原料に含まれている各種成分の安定性を保つことができるので好ましい。抽出温度は特に制限されないが、常温又は加熱抽出が好ましい。加熱抽出の場合、加熱温度としては通常４０〜１００℃、好ましくは５０〜８０℃、更に好ましくは５０〜７０℃である。加熱温度をかかる範囲とすることにより、抽出を効率的に行うことができるので好ましい。

上記米ぬかと上記豆類由来ペプチドとの割合は、上記豆類由来ペプチドを１００質量部とした場合に、上記米ぬかの割合は、好ましくは８〜１８質量部である。上記米ぬかが上記範囲であれば、十分なコラーゲン合成作用等を有する発酵物を得ることができる。

上記「枯草菌」［バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）］は、好気性胞子形成細菌の代表的な種類である。上記枯草菌の種類は、安全性が保証されている限り特に限定されない。上記枯草菌としては、例えば、納豆菌［バチルス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｎａｔｔｏ）］等を用いることができる。上記枯草菌としては、入手が容易であり、且つ安価である納豆菌が好ましい。尚、上記枯草菌としては、市販されている一般的な枯草菌を用いることができる。また、コラーゲン合成作用等を有する発酵物が得られる限り、上記枯草菌としては、自然的に、又はニトロソグアニジン等の化学物質、Ｘ線及び紫外線等により人為的な変異手段により生成し、菌学的性質が変異した変異株も用いることができる。

上記「発酵物」は、上記米ぬかと上記豆類由来ペプチドとを枯草菌により発酵させて得られる。上記発酵物は通常、上記米ぬか及び上記豆類由来ペプチドを含む培地に枯草菌を摂取し、適切な条件で発酵培養することにより得られる。上記「発酵物」を得るための発酵培養は通常、通気攪拌を行うことにより行われる。また、上記培地についても、上記枯草菌が増殖できる限り特に制限はない。上記培地は通常は液体培地であるが、固形培地でもかまわない。また、上記培地のｐＨ（特に発酵時）は、６．０〜８．０、更に好ましくは６．５〜７．５である。このｐＨを上記の範囲内とすると、抽出原料に含まれている各種成分の安定性を保つことができるので好ましい。更に、培養温度は、３５〜３７℃である。また、糖等の各種の栄養素並びにｐＨ調製のための酸及びアルカリ等を培地に添加してもよい。更に、上記発酵は、混合発酵でも連続発酵でもよい。

上記発酵物の形態には特に限定はない。上記発酵物は、発酵培養により得られた発酵液又は該発酵液をろ過したままの液でもよい。また、上記発酵物は、上記発酵液に対し、必要に応じて滅菌処理若しくはｐＨ調整をしたり、又はイオン交換樹脂、活性炭カラム若しくは透析膜等を利用し、脱臭・脱色等の後処理をした発酵液でもよい。更に、上記発酵物は、該発酵液を濃縮した濃縮液又はペースト状物でもよい。その他にも、上記発酵物は、該発酵液を凍結乾燥等の公知の方法により溶媒を除去した固形物及び粉末化した粉末物でもよい。更に、上記発酵物は、上記発酵液又は上記固形物及び粉末物を、水若しくはエタノール、プロピレングリコール及び１，３−ブチレングリコール等の有機溶媒、又はこれらの混合溶媒に添加した溶液又は分散液としてもよい。

上記「ビタミンＡ類」は、シクロデキストリン包接レチノールである。

本発明において、上記シクロデキストリン包接レチノールは、上記シクロデキストリン包接レチノールを含む組成物又は混合物として、本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物に含有させることができる。上記シクロデキストリン包接レチノールは、上記シクロデキストリン包接レチノールが溶解又は分散した溶液又は分散液として、本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物に含有させることができる。例えば、上記シクロデキストリン包接レチノールを動物油又は植物油に溶解させ、当該溶液を本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物に含有させることができる。

本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物において、上記発酵物と上記ビタミンＡ類との割合には特に限定はない。上記発酵物と上記ビタミンＡ類との合計を１００質量％とした場合に、上記発酵物の割合は、通常０．１〜９９．９質量％、好ましくは１０〜８０質量％、更に好ましくは４０〜６０質量％である。本発明では、上記発酵物と上記ビタミンＡ類の１種又は２種以上とを含有することにより、コラーゲン合成作用等が向上する。本発明では、上記発酵物と上記ビタミンＡ類の１種又は２種以上の各々の含有量に大差がない場合、即ち、上記発酵物の質量割合が４０〜６０質量％であるときは、コラーゲン合成作用等がより向上するため好ましい。

本発明の発酵物組成物は、各種の用途に用いることができる。この用途には特に限定はない。本発明の発酵物組成物は、例えば、皮膚外用剤等の化粧品、化粧品素材、入浴剤等に用いることができる。

本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物は、化粧品等に配合することができる。化粧品に配合する場合、本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物の配合量には特に限定はない。該配合量は、化粧品の種類等により適量を配合することができる。本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物の配合量は、化粧品を１００質量％とした場合に、０．００１〜１００質量％、特に０．００１〜５０質量％とすることができる。本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物の含有量が上記範囲内であれば、優れたコラーゲン合成作用等を有する化粧品とすることができる。

本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物を含有することができる化粧品の種類も特に限定はない。該化粧品としては、例えば、フリーズドライ、パック、パックシート、ピーリング、パウダー、化粧水、おしろい、固形おしろい、口紅、固形頬紅、ファンデーションクリーム、乳液、ローション、ボディローション、クレンジングローション、洗顔クリーム、スキンケアクリーム、ヘアーリンス、ヘアーリキッド、アイシャドウ及び眉ずみ等が挙げられる。また、これらの化粧品には、その種類により、必要に応じて、他の成分、例えば、植物エキス、ビタミン、ビタミン様物質、ミネラル、低級アルコール類、多価アルコール類、油脂類、界面活性剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、防腐剤及び香料等を添加することもできる。

本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物を含有する化粧品としては、特に皮膚外用剤が挙げられる。本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物は優れたコラーゲン合成作用等を有する。よって、本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物は、皮膚に塗布して用いる化粧品に特に有用である。本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物を有効成分として含有する皮膚外用剤は、本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物と、皮膚外用剤に用いられる他の配合剤とを用いて調製することができる。上記他の配合剤としては、例えば液体油（スクワラン及びホホバ油等）、固体油（ミツロウ及びセチルアルコール等）、各種の活性剤、並びに保湿剤（グリセリン及び１，３ーブチレングリコール等）が挙げられる。この皮膚外用剤の剤形には特に限定はない。この皮膚外用剤は、例えば、ローション、クリーム及び乳液等、目的に応じて種々の剤形とすることができる。この皮膚外用剤において、本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物の配合量には特に限定はない。本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物の配合量は、皮膚外用剤を１００質量％とした場合に、０．００１〜１００質量％、特に０．００１〜５０質量％とすることができる。本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物の含有量が上記範囲内であれば、優れたコラーゲン合成作用等を有する皮膚外用剤とすることができる。

尚、本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物を配合した配合物を、化粧品素材、入浴剤等として用いることもできる。

本発明の細胞賦活用皮膚外用剤は、優れたコラーゲン合成作用等を有する。よって、上記細胞賦活用皮膚外用剤組成物は、皮膚に塗布して用いる化粧品に配合した場合に特に有用である。本発明の細胞賦活用皮膚外用剤は、上記皮膚外用剤の説明がそのまま適用できる。

本発明の細胞賦活用皮膚外用剤組成物は、米ぬかと豆類由来ペプチド（大豆ペプチド）とを枯草菌により発酵させて得られる発酵物とビタミンＡ類（シクロデキストリン包接レチノール）とを混合する混合工程と、を備える方法により製造することができる。

上記「米ぬか」、上記「豆類由来ペプチド」、上記「枯草菌」、及び上記「ビタミンＡ類」については、本発明の発酵物組成物で説明した内容が適用される。

上記「発酵物」は、通常、米ぬかと豆類由来ペプチドとを含有する培地に枯草菌を接種して発酵させる発酵工程により得られる。上記「発酵工程」における上記「培地」は、米ぬか及び豆由来ペプチドを含有し、枯草菌が増殖して発酵培養をすることができる培地であればよい。上記培地の種類及び組成には特に限定はない。上記培地は、通常、液体培地であるが、固形培地であってもよい。また、上記培地のｐＨ（特に発酵時）は、通常５．５〜８．５、好ましくは６．０〜８．０、更に好ましくは６．５〜７．５である。また、上記培地には、ｐＨ及び栄養条件等を好ましい範囲に調整するため、グルコース等の糖類、プロテアーゼ等の酵素、精製水等の水等を添加することができる。

上記発酵の際の培養温度は、発酵が行われる限り特に制限はない。該培養温度は、３５〜３７℃である。発酵培養は通常、通気攪拌を行うことにより行われる。

上記発酵工程により得られる上記発酵物の形態も特に限定されない。上記発酵物の形態は、本発明の発酵物組成物で説明した内容が適用される。

上記「混合工程」において、上記発酵物とビタミンＡ類とを混合する方法には特に限定はない。発酵物とビタミンＡ類とは各々の形態、及びそれぞれの質量割合等によってホモミキサー等の混合器などの適宜の装置を用いて混合することができる。また、混合時の温度も特に限定されず、発酵物及びビタミンＡ類のそれぞれの種類等によって設定することが好ましい。発酵物とビタミンＡ類とは、５〜２０℃の範囲で必要に応じて冷却しながら混合することができ、３５〜８５℃の範囲で必要に応じて加熱しながら混合することもできる。

本発明の製造方法は、更に他の工程を備えていてもよい。該他の工程としては、例えば、上記発酵物を精製処理する工程等が挙げられる。発酵工程により得られた発酵物はそのままビタミンＡ類と混合してもよく、又は該発酵物を精製処理し、その後、ビタミンＡ類と混合してもよい。この精製処理の方法は特に限定されない。例えば、発酵液を圧搾し、ろ過することにより、上記発酵物を精製することができる。また、発酵液を圧搾し、ろ過し、次いで、活性炭等による脱臭、脱色処理、及び／又は沈殿物の除去処理をし、その後、再度ろ過することにより、上記発酵物を精製することもできる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
［１］発酵物組成物の製造
米ぬか３ｋｇ、大豆ペプチド０．４ｋｇ、グルコース０.５ｋｇ、アルカリ性プロテアーゼ０．０１ｋｇ及び精製水５０ｋｇを混合し、培地を調製した。その後、培地のｐＨを６．０〜８．０に調整し、次いで、納豆菌を接種し、３７℃で３８時間培養して発酵を行った。その後、発酵液を圧搾及びろ過し、次いで、活性炭により脱色、脱臭した。その後、再度発酵液をろ過して精製することにより、発酵物を製造した。

［２］シルクフィブロインを含む発酵物組成物の評価
上記［１］で製造した発酵物、ビタミンＣ（和光純薬工業社製）、及びシルクフィブロイン（オードレマン社製、商品名「フィブロインシート」）を、それぞれ固形分濃度で２％（質量／体積）となるように、緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した。次いで、該溶液を０．２２μｍのフィルタによりろ過した。その後、各成分が表１及び表２に記載の濃度となるように該溶液を希釈して混合することにより、実験例２〜１５の試料溶液を調製した。また、実験例１は、試料溶液として、上記緩衝液（ＰＢＳ）を使用した。

２つの９６穴ウエルプレート（表中では「Ｐ１」及び「Ｐ２」という。）のそれぞれに、１ウエル当たり５０００個のヒト皮膚繊維芽細胞を撒布した。次いで、５％ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地で３日間培養した。５％ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地に対して実験例１〜１５の試料を添加して試料添加培地を調製した。該試料添加培地における実験例１〜１５の試料溶液の濃度は１％（質量／体積、但し、上記ＰＢＳの質量を除く。）である（従って、培地における発酵物組成物中の各成分の最終濃度は試料溶液中の濃度の１／１００である。）。そして、ウエル中の上記５％ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地を上記試料添加培地に交換し、更に３日間培養した。

次いで、「コラーゲンステインキット」（コラーゲン技術研究会製）を用いて、キットに添付されたマニュアルに従ってコラーゲン合成量（μｇ）を測定した。プレート１（Ｐ１）及びプレート２（Ｐ２）におけるコラーゲン合成量の平均値を表１及び表２に示す。また、実験例１のコラーゲン合成量を１として、実験例２〜８のコラーゲン合成量の相対値を求めた。同様に、実験例９のコラーゲン合成量を１として、実験例１０〜１５のコラーゲン合成量の相対値を求めた。この結果を表１及び表２に併記する。尚、表１及び表２において、「ＶＣ」はビタミンＣを意味し、「ＳＦ」はシルクフィブロインを意味する。

表１及び表２より、シルクフィブロインと発酵物とを併用している実験例５〜８及び１３〜１５では、発酵物のみを用いている実験例３及び１１並びにシルクフィブロインのみを用いている実験例４及び１２に比べてコラーゲン合成作用に優れていることが分かる。

［３］他のシルク原料由来のペプチドを含む発酵物組成物の評価
上記［１］で製造した発酵物、ビタミンＣ（和光純薬工業社製）、シルクフィブロイン、及び下記シルクペプチド（ａ）及び（ｂ）を、それぞれ固形分濃度で２％（質量／体積）となるように、緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した。次いで、該溶液を０．２２μｍのフィルタによりろ過した。その後、各成分が表３〜表５に記載の濃度となるように該溶液を希釈して混合することにより、実験例１７〜１９、２４〜２８、及び３３〜３５の試料溶液を調製した。また、実験例１７〜１９、２４〜２８、及び３３〜３５の試料溶液を体積で等量混合することにより、実験例２０〜２２、２９〜３１、及び３６の試料溶液を調製した。尚、実験例１６、２３及び３２では、試料溶液として、上記緩衝液（ＰＢＳ）を使用した。

ビタミンＣ及びシルクフィブロインは、上記［２］で用いたものと同じである。また、シルクペプチド（ａ）及び（ｂ）としては下記のものを用いた。尚、シルクペプチド（ａ）及び（ｂ）はいずれも液体であり、固形分濃度としての終濃度が１％（質量／体積）となるように緩衝液により希釈して用いた。
シルクペプチド（ａ）；コスモ食品社製、商品名「シルクペプチドＭ−５００」
シルクペプチド（ｂ）；コスモ食品社製、商品名「シルクペプチドＭ−５００＃６０」

上記［２］と同じ方法により、実験例１６〜３６のコラーゲン合成量（μｇ）を測定した。プレート１（Ｐ１）及びプレート２（Ｐ２）におけるコラーゲン合成量の平均値を表３〜表５に示す。また、実験例１６、２３及び３２の各コラーゲン合成量を１として、他の実験例のコラーゲン合成量の相対値を求めた。この結果を表３〜表５に併記する。尚、表３〜表５において、「ＶＣ」はビタミンＣを意味し、「ＳＦ」はシルクフィブロインを意味し、「ＳＰ」はシルクペプチドを意味する。

表３〜５の結果によれば、シルクフィブロインと発酵物とを併用している実験例２２、２９及び３６では、発酵物のみを用いている実験例１８、２５及び３４、並びにシルクフィブロインのみを用いている実験例１９、２６及び３５に比べて前記と同様により優れたコラーゲン合成作用を有している。更に、シルクペプチドと発酵物とを併用している実験例３０及び３１も、シルクフィブロインの場合と同様に、より優れたコラーゲン合成作用を有していることが分かる。尚、実験例１７、２４及び３３より、ビタミンＣもコラーゲン合成作用を有していることが分かる。しかし、発酵物とビタミンＣとを併用した実験例２０及びビタミンＣとシルクフィブロインとを併用した実験例２１では、併用による相乗効果はみられないか、又は極く僅かであることが分かる。従って、発酵物とペプチドとの併用による相乗効果が大きいことが分かる。

［４］大豆ペプチドを含む発酵物組成物の評価
上記［１］で製造した発酵物、ビタミンＣ（和光純薬工業社製）、シルクフィブロイン、及び下記大豆ペプチド（ａ）〜（ｃ）を、それぞれ固形分濃度で２％（質量／体積）となるように、緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した。次いで、該溶液を０．２２μｍのフィルタによりろ過した。その後、各成分が表６及び表７に記載の濃度となるように該溶液を希釈して混合することにより、実験例３８〜４３及び４９〜５４の試料溶液を調製した。また、実験例３８〜４３及び４９〜５４の試料溶液を体積で等量混合することにより、実験例４４〜４７及び５５〜５６の試料溶液を調製した。尚、実験例３７及び４８では、試料溶液として、上記緩衝液（ＰＢＳ）を使用した。

ビタミンＣ及びシルクフィブロインは、上記［２］で用いたものと同じである。また、大豆ペプチド（ａ）〜（ｃ）としては下記のものを用いた。尚、大豆ペプチド（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はいずれも液体であり、固形分濃度としての終濃度が１％（質量／体積）となるように緩衝液により希釈して用いた。
大豆ペプチド（ａ）；不二製油社製、商品名「ハイニュートＳＭＰ」
大豆ペプチド（ｂ）；不二製油社製、商品名「ハイニュートＲ」
大豆ペプチド（ｃ）；不二製油社製、商品名「ハイニュートＤＣ５」

上記［２］と同じ方法により、実験例３７〜４７のコラーゲン合成量（μｇ）を測定した。プレート１（Ｐ１）及びプレート２（Ｐ２）におけるコラーゲン合成量の平均値を表６に示す。また、実験例３７のコラーゲン合成量を１として、他の実験例のコラーゲン合成量の相対値を求めた。この結果を表６に併記する。尚、表６において、「ＶＣ」はビタミンＣを意味し、「ＳＦ」はシルクフィブロインを意味し、「ＳＢＰ（ａ）〜（ｃ）」は大豆ペプチド（ａ）〜（ｃ）を意味する。

２つの９６穴ウエルプレートのそれぞれに、１ウエル当たり２０００個のヒト皮膚繊維芽細胞を撒布した。次いで、５％ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地で３日間培養した。その後、無血清ＭＥＭ培地に交換し、更に１日間培養した。０．５％血清添加ＭＥＭ培地に対して実験例４８〜５６の試料を添加して試料添加培地を調製した。該試料添加培地における上記実験例４８〜５６の試料溶液の濃度は１％（質量／体積、但し、上記ＰＢＳの質量を除く。）である（従って、培地における発酵物組成物中の各成分の最終濃度は試料溶液中の濃度の１／１００である。）。そして、ウエル中の上記無血清ＭＥＭ培地を上記試料添加培地に交換し、更に４日間培養した。

その後、同仁堂「セルカウンティングキット８」に基づき、ＷＳＴ−８テトラゾリウム塩を発色基質とし、生細胞内の脱水素酵素により還元されて生成した水溶性ホルマザンを４５０ｎｍの波長で測定することにより、吸光度を測定した（生細胞数は当該吸光度の値に比例する。）。また、実験例４８の生細胞数を１として、他の実験例の生細胞量の相対値を算出し、細胞増殖作用を評価した。結果を表７に併記する。尚、表７において、「ＶＣ」はビタミンＣを意味し、「ＳＦ」はシルクフィブロインを意味し、「ＳＢＰ（ａ）〜（ｃ）」は大豆ペプチド（ａ）〜（ｃ）を意味する。また、表７における細胞増殖率の項の平均値は、上記吸光度の値の平均値である。

表６より、シルクフィブロインと発酵物とを併用している実験例４４は、発酵物のみを用いている実験例３９及びシルクフィブロインのみを用いている実験例４０に比べて、より優れたコラーゲン合成作用を有することが分かる。更に、発酵物と大豆ペプチドとを併用している実験例４５〜４７も、シルクフィブロインの場合と同様に、より優れたコラーゲン合成作用を有することが分かる。

表７より、発酵物と大豆ペプチド（ｃ）とを併用している実験例５６は、発酵物のみを用いている実験例５０に比べて細胞増殖作用がより向上していることが分かる。更に、発酵物とシルクフィブロインとを併用した実験例５５も、同様に細胞増殖作用が向上していることが分かる。

［５］ビタミンＡ類を含む発酵物組成物の評価
上記［１］で製造した発酵物、ビタミンＣ（和光純薬工業社製）、及びシクロデキストリン包接レチノール（商品名「ＣＡＶＡＭＡＸＷ８／ＲｅｔｉｎｏｌＣｏｍｐｌｅｘ」シクロケム社製）を、それぞれ固形分濃度で２％（質量／体積）となるように、緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した。次いで、該溶液を０．２２μｍのフィルタによりろ過した。その後、各成分が表８に記載の濃度となるように該溶液を希釈して混合することにより、実験例５８〜６６の試料溶液を調製した。尚、実験例５７では、試料溶液として、上記緩衝液（ＰＢＳ）を使用した。

上記［２］及び［４］記載の方法と同じ方法により、実験例５７〜６６のコラーゲン合成量（μｇ）及び細胞増殖率を測定した。その平均値を表８に示す。また、実験例５７のコラーゲン合成量及び生細胞量を１として、他の実験例のコラーゲン合成量及び生細胞量の相対値を求めた。この結果を表８に併記する。尚、表８において、「ＶＣ」はビタミンＣを意味し、「ＣＤＲ」はシクロデキストリン包接レチノールを意味する。また、表８における細胞増殖率の項の平均値は、吸光度の値の平均値である。

表８より、レチノールと発酵物とを併用している実験例６４〜６６は、発酵物のみを用いている実験例５９及びレチノールのみを用いている実験例６０〜６３に比べて、優れたコラーゲン合成作用及び細胞増殖作用を有することが分かる。

［６］ペプチド及びビタミンＡ類を含む発酵物組成物の評価
上記［１］で製造した発酵物、上記シルクフィブロイン、上記大豆ペプチド（ａ）、及び上記シクロデキストリン包接レチノールを、それぞれ固形分濃度で２％（質量／体積）となるように、緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した。次いで、該溶液を０．２２μｍのフィルタによりろ過した。その後、各成分が表９及び表１０に記載の濃度となるように該溶液を希釈して混合することにより、実験例６８、６９、７１及び７２の試料溶液を調製した。尚、実験例６７及び７０では、試料溶液として、上記緩衝液（ＰＢＳ）を使用した。

上記［２］及び［４］と同じ方法により、実験例６７〜７２のコラーゲン合成量（μｇ）及び細胞増殖率を測定した。その平均値を表９及び表１０に示す。また、実験例６７及び７０のコラーゲン合成量及び生細胞量を１として、他の実験例のコラーゲン合成量及び生細胞量の相対値を求めた。この結果を表９及び表１０に併記する。尚、表９及び表１０において、「ＳＦ」はシルクフィブロインを意味し、「ＳＢＰ」は大豆ペプチドを意味し、「ＣＤＲ」はシクロデキストリン包接レチノールを意味する。また、表９及び表１０における細胞増殖率の項の平均値は、吸光度の値の平均値である。

表１０より、レチノール及びペプチドと発酵物とを併用している実験例６９及び７２は、優れたコラーゲン合成作用及び細胞増殖作用を有することが分かる。

尚、本発明は、上記具体的実施例に限定されない。本発明は、目的、用途に応じて本発明の範囲内で種々変更することができる。

本発明の発酵物組成物は、安全性に優れ、コラーゲン合成作用等を有する。本発明の発酵物組成物は、皮膚外用剤等の各種の化粧品並びに健康食品及び機能性食品等の各種の飲食物等に配合して用いることができる。即ち、本発明は、化粧品及び飲食物等の分野において利用することができる。

Claims

米ぬかと豆類由来ペプチドとを枯草菌により発酵させて得られる発酵物と、ビタミンＡ類と、を含有する細胞賦活用皮膚外用剤組成物において、
上記豆類由来ペプチドは、大豆ペプチドであり、
上記ビタミンＡ類は、シクロデキストリン包接レチノールである細胞賦活用皮膚外用剤組成物。
上記ビタミンＡ類の含有量は、上記発酵物１００質量部に対して、０．１〜１質量部である請求項１に記載の細胞賦活用皮膚外用剤組成物。