CN101431980B - 发酵物组合物、化妆品组合物和它们的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明的发酵物组合物和化妆品组合物含有通过枯草芽孢杆菌使米糠和豆类来源的肽发酵而获得的发酵物，以及肽和维生素A类中的至少1种。而且，本发明的制造方法具有将通过枯草芽孢杆菌使米糠和豆类来源的肽发酵而获得的发酵物与肽和维生素A类这两种物质中的至少1种混合的混合步骤。

Description

发酵物组合物、化妆品组合物和它们的制造方法

技术领域

本发明涉及发酵物组合物、化妆品组合物和它们的制造方法。更具体的是，本发明涉及一种安全性高，且骨胶原合成作用等优异的发酵物组合物。而且，本发明还涉及含有该发酵物组合物的化妆品组合物。进而，本发明还涉及上述发酵物组合物和化妆品组合物的制造方法。

背景技术

以前已知含有使米糠等发酵而获得的发酵物的皮肤外用剂等化妆品等。例如，专利文献1中公开了含有发酵糠类的化妆品组合物和采用这种组合物的化妆品。专利文献1中记载了，该化妆品保湿性好，涂布在皮肤上时的刺激少，难以发生炎症，很舒适。而且，专利文献2中公开了通过枯草芽孢杆菌使米糠和大豆肽发酵，然后通过纯化处理获得的皮肤外用剂原料的制造方法。专利文献2中记载了该皮肤外用剂原料安全性高，可以提高皮肤的活性。

专利文献1：特开2004-262829号公报

专利文献2：特开平8-104647号公报

发明内容

发明要解决的问题

通过在皮肤外用剂等化妆品中配合专利文献1和2记载的发酵物产生的功能多。例如，配合了该发酵物的皮肤外用剂等化妆品可以抑制皱纹、斑点、松弛等，冻伤、皲裂和皮肤变粗糙等。而且，在配合了该发酵物的皮肤外用剂等化妆品中，获得了创伤治疗和烧伤等症状的改善等效果。

本发明的目的在于提供安全性高，且骨胶原合成作用等优异的发酵物组合物。而且，本发明的目的在于通过含有该发酵物组合物的化妆品组合物。进而，本发明的目的在于提供上述发酵物组合物和化妆品组合物的制造方法。

用于解决问题的方法

本发明为以下内容。

〔1〕一种发酵物组合物，其特征在于含有：

通过枯草芽孢杆菌使米糠和豆类来源的肽发酵而获得的发酵物，以及

肽和维生素A类中的至少1种。

〔2〕上述〔1〕记载的发酵物组合物，上述肽为大豆蛋白质经水解获得的肽和丝素蛋白(Silk fibroin)中的至少1种。

〔3〕一种化妆品组合物，其特征在于其含有上述〔1〕记载的发酵物组合物。

〔4〕一种发酵物组合物的制造方法，其特征在于该方法具有将通过枯草芽孢杆菌使米糠和豆类来源的肽发酵而获得的发酵物与肽和维生素A类中的至少1种相混合的混合步骤。

〔5〕一种化妆品组合物的制造方法，其特征在于该方法具有将通过枯草芽孢杆菌使米糠和豆类来源的肽发酵而获得的发酵物与肽和维生素A类中的至少1种相混合的混合步骤，以及通过将该混合步骤中获得的发酵物组合物制剂化获得化妆品组合物的步骤。

发明的效果

本发明的发酵物组合物以天然物作为原料。因此，本发明的发酵物组合物安全性高，且具有优异的骨胶原合成作用和细胞增殖作用等。

而且，上述肽为大豆蛋白质被水解而形成的肽和丝素蛋白(Silkfibroin)中的至少1种时，更容易获得，而且可以形成具有充分的骨胶原合成性等的发酵物组合物。

本发明的化妆品组合物由于具有上述构成，因此起到优异的骨胶原合成作用和细胞增殖作用。

如果按照本发明的发酵物组合物和化妆品组合物的制造方法，就可以通过使用可以容易获得的枯草芽孢杆菌，使之发酵来制造。因此，可以通过小型的制造设备安全且容易地制造具有上述优异作用的本发明的发酵物组合物等。

用于实施发明的最佳方式

以下，详细说明本发明。

(1)发酵物组合物

本发明的发酵物组合物的特征在于含有通过枯草芽孢杆菌使米糠和豆类来源的肽发酵而获得的发酵物，以及肽和维生素A类这两种物质中的至少1种。

作为上述“米糠”，可以列举，例如，米糠、脱脂米糠、米胚芽和脱脂米胚芽。可以单独使用这些中的1种，也可以同时使用2种以上。上述米糠不限于市售的米糠等，可以使用各个种类的米糠。

上述“豆类来源的肽”如果是豆类中所含的肽或豆类中所含蛋白质来源的肽，其具体种类和结构没有特别的限定。上述“豆类来源的肽”不限于市售的豆类来源的肽，可以使用各种豆类来源的肽。作为上述豆类来源的肽，可以列举例如，大豆肽、小豆肽、豌豆肽和蚕豆肽。作为上述豆类来源的肽，优选大豆肽。上述豆类来源的肽可以单独使用1种，也可以同时使用2种以上。

获得上述豆类来源的肽的方法没有特别的限定。例如，上述豆类来源的肽可以通过用溶剂(水、热水、醇(乙醇等)有机溶剂或水-有机溶剂混合溶剂)提取豆类(例如，大豆、小豆、豌豆和蚕豆等1种或2种以上)来获得。在该过程中，根据需要可以进行分级和纯化等。进而，通过用蛋白酶、酸或碱进行水解处理，可以对获得的豆类来源的肽或豆类蛋白质进一步片段化。进而，上述豆类来源的肽也可以是通过使氨基酸之间以化学方式肽结合，或通过公知的基因步骤方法人工合成的肽。

上述豆类来源的肽的形态没有特别的限定。上述豆类来源的肽，可以在上述提取后，通过干燥等形成固体化的固体物质(例如，粉状物或粒状物等)。而且，作为上述豆类来源的肽，可以使用上述提取物自身。也就是说，本发明中，可以使用含有上述豆类来源的肽的提取物(豆类提取物，尤其是大豆提取物等)作为上述豆类来源的肽。例如，本发明中，作为上述豆类来源的肽，可以使用通过用溶剂(水、热水、醇(乙醇等)等有机溶剂或水-有机溶剂混合溶剂)提取豆类(例如，大豆、小豆、豌豆和蚕豆等中的1种或2种以上)而获得的提取物。本发明中，可优选使用尤其是含有大豆肽的提取物(大豆提取物)等。

用于获得含有上述豆类来源的肽的提取物的提取方法，就提取条件而言并没有特别的限定。例如，作为提取原料的豆类，可以是未粉碎的，也可以是粉碎的。而且，只要可以维持提取物的品质，也可以进行除去杂质等的前处理。而且，作为提取溶剂，除了水或热水之外，还可以使用甲醇和乙醇等醇、醋酸乙酯等酯、正己烷等有机溶剂、和这些有机溶剂与水或热水的混合溶剂等。作为上述提取溶剂，优选水或热水、醇(甲醇和乙醇等)、和水或热水与醇的混合溶剂。上述热水的温度通常为40～100℃，优选50～80℃，更优选50～70℃。而且，提取时提取溶剂的pH通常为3～7，优选4～6，更优选4～5。之所以优选，是因为通过将pH调整在上述范围内，可以保持提取原料中所含的各种成分的稳定性。提取温度没有特别的限制，但优选常温或加热提取。加热提取时，作为加热温度，通常在40～100℃、优选50～80℃、更优选50～70℃。之所以优选是因为通过将加热温度调整至这个范围，可以有效提取。

上述米糠和上述豆类来源的肽的比例没有特别的限定。通常，在上述豆类来源的肽为100质量份时，上述米糠的比例为1～20质量份，优选5～20质量份，更优选8～18质量份。上述米糠如果在上述范围，则可以获得具有充分的骨胶原合成作用等的发酵物。

上述”枯草芽孢杆菌”(Bacillus subtilis)是好氧性孢子形成细菌的代表种类。上述枯草芽孢杆菌的种类只要安全性得到保证，则没有特别的限定。作为上述枯草芽孢杆菌，可以使用例如，纳豆菌(Bacillus natto)等。作为上述枯草芽孢杆菌，优选容易获得又便宜的纳豆菌。而且，作为上述枯草芽孢杆菌，可以使用市售的一般的枯草芽孢杆菌。而且，只要可以获得具有骨胶原合成作用等的发酵物，作为上述枯草芽孢杆菌，可以使用自然的或用亚硝基胍等化学物质、X线和紫外线等人为变异手段生成的菌学性质发生了变异的变异株。

上述“发酵物”，可以通过枯草芽孢杆菌使上述米糠和上述豆类来源的肽发酵而获得。上述发酵物，通常可以通过在含有上述米糠和上述豆类来源的肽的培养基中摄取枯草芽孢杆菌，在适当条件下发酵培养获得。用于获得上述“发酵物”的发酵培养条件没有特别的限定。发酵培养通常通过通气搅拌来进行。而且，就上述培养基而言，只要上述枯草芽孢杆菌可以增殖，就没有特别的限定。上述培养基通常是液体培养基，但也可以是固体培养基。而且，上述培养基的pH(尤其是发酵时)通常在5.5～8.5、优选6.0～8.0，更优选6.5～7.5。之所以优选，是因为如果该pH位于上述范围内，就可以保持提取原料中所含的各种成分的稳定性。进而，就培养温度而言，只要可以进行发酵，则没有特别的限定。该培养温度通常在15～50℃，优选20～45℃，更优选30～45℃，更优选35～43℃。而且，还可以在培养基中添加糖等各种营养素和用于调整pH的酸和碱等。进而，上述发酵可以是混合发酵，也可以是连续发酵。

上述发酵物的形态没有特别的限定。上述发酵物可以是通过发酵培养获得的发酵液或该发酵液经过过滤而获得的原液。而且，上述发酵物，可以是对上述发酵液，根据需要进行灭菌处理或pH调整，或利用离子交换树脂、活性炭柱或透析膜等进行除臭、脱色等后处理的发酵液。进而，上述发酵物可以是对该发酵液进行了浓缩的浓缩液或膏状物。除此之外，上述发酵物还可以是通过冷冻干燥等公知方法对该发酵液除去了溶剂的固体物和粉末化的粉末物。进而，上述发酵物还可以作为在水或乙醇、丙二醇和1，3-丁二醇等有机溶剂或这些溶剂的混合溶剂中添加了上述发酵液或上述固体物质和粉末物的溶液或分散液。

上述“肽”是氨基酸通过肽结合而结合的多肽。而且，上述氨基酸通常为L-氨基酸，但也可以是D-氨基酸，或二者的混合物。也就是说，构成上述肽的氨基酸可以是L-氨基酸、D-氨基酸和二者的混合物中的任一种。

上述肽的种类，来源和结构没有特别的限定。例如，上述肽可以是植物中所含的植物来源的肽，也可以是动物中所含的动物来源的肽。而且，上述肽的结构不仅为直链构造，还可以含有二硫结合。作为上述肽，具体而言，可以列举例如，通过水解大豆蛋白质(大豆中所含的蛋白质)而获得的肽和丝素蛋白等丝肽(通过水解丝中所含的肽和丝中所含的蛋白质而获得的肽)等。如果使用这些肽，就可以获得具有优异的骨胶原合成作用和细胞增殖作用等的发酵物组合物。

获得上述肽的方法没有特别的限定。上述肽通常可以通过用蛋白酶、酸、或碱等水解各种蛋白质来获得。当然，具体的水解方法和条件并没有特别的限定。其中，上述蛋白质的种类没有特别的限定。作为上述蛋白质，可以列举，例如大豆蛋白质和丝中所含的丝蛋白质。而且，作为上述肽，还可以使用通过化学地使氨基酸之间发生肽结合，或通过公知的基因工程方法人工合成的肽。

上述肽的氨基酸数和分子量没有特别的限定。上述肽的氨基酸数的下限可以为例如2、3或4。而且，上述肽的氨基酸数的上限可以为例如，100、80、60或40。上述肽的分子量的下限可以为例如，50、100或200。而且，作为上述肽的分子量的上限，可以为例如，300000、200000、100000、50000或30000。尤其是，以细胞增殖作用作为目的时，作为上述肽，优选使用高分子量的肽、例如，分子量为40000以上的肽。而且，上述肽的分子量可以通过公知的各种方法测定。上述肽的分子量可以通过例如通过SDS-PAGE进行的电泳法和通过HPLC和柱进行的凝胶过滤层析等来测定。上述肽的氨基酸数和分子量可以通过用蛋白酶、酸、或碱等水解蛋白质或肽来适当调节。

作为上述肽，优选为(1)分子量在200～200000的肽、(2)氨基酸数为4～40且分子量为220～8000的肽、和(3)氨基酸数为2～3且分子量为100以下，100～250和250～500的分子量不同的肽的混合物。而且，作为这些(1)～(3)的肽，更优选丝素蛋白。通过使之含有这些肽和上述发酵物，与只含有发酵物时相比，可以获得具有更为优异的骨胶原合成作用和细胞增殖作用等的发酵物组合物。

而且，作为上述肽，可以是大豆蛋白质经水解获得的，优选氨基酸数在2～6，且分子量为100～1200的肽。通过使之含有采用了这种大豆蛋白质的肽和发酵物，与只含有发酵物时相比，可以获得具有更优异的骨胶原合成作用和细胞增殖作用等的发酵物组合物。

上述肽可以单独使用1种，也可以使用2种以上。例如，作为上述肽，可以只使用上述各种肽中的1种，也可以使用2种以上。而且，作为上述肽，可以含有氨基酸数和/或分子量不同的2种以上的肽。进而，作为上述肽，还可以同时使用像大豆蛋白质经水解而获得的肽和丝素蛋白等丝肽等种类不同的2种以上的肽。

上述“维生素A类”是具有类异戊二烯型多烯醇作为基本骨架的化合物和该化合物的衍生物。作为上述维生素A类，具体而言，可以列举例如，维生素A1(视黄醇)、维生素A2、维生素A3和3，4-二氢视黄醇和这些物质被氧化的醛(视黄醛等)和羧酸(视黄酸)等。而且，在上述“维生素A类”中还包括药学上可允许的盐和药学上可允许的衍生物。作为上述衍生物，可以列举例如，上述视黄醇等的羧酸酯。作为上述衍生物，更具体的，可以列举，例如，视黄醇醋酸酯和视黄醇棕榈酸酯等C1～C30酯等。而且，本发明中，上述维生素类既可以单独使用1种，也可以同时使用2种以上。

本发明中，上述维生素A类的含有形态没有特别的限定。可以使本发明的发酵物组合物中含有上述维生素A类自身，其也可以与其它物质一起合用而包含于上述组合物中。例如，上述维生素A类，作为使之包合于环糊精等主体化合物的包合物，可以使之包含于本发明的发酵物组合物中。而且，上述维生素A类，作为含有上述维生素A类的组合物或混合物，可以使之包含于本发明的发酵物组合物中。例如，上述维生素A类，作为含有肝油等上述维生素A类的组合物，可以使之包含于本发明的发酵物组合物中。进而，上述维生素A类，作为溶解或分散了上述维生素A类的溶液或分散液，可以使之包含于本发明的发酵物组合物中。例如，可以使上述维生素A类溶解于动物油或植物油中，使该溶液包含于本发明的发酵物组合物中。

本发明的发酵物组合物中，上述发酵物与上述肽和上述维生素A类之间比例没有特别的限定。上述发酵物与上述肽和上述维生素A类总计为100质量％时，上述发酵物的比例通常为0.1～99.9质量％、优选10～80质量％、更优选40～60质量％。本发明中，由于含有上述发酵物和1种或2种以上的上述肽和上述维生素A类，因此骨胶原合成作用等提高。本发明中，由于上述发酵物与1种或2种以上选自于上述肽和上述维生素A类中的物质的各个含量没有显著差异时，即上述发酵物的质量比例为40～60质量％时，骨胶原合成作用等进一步提高，因而优选。

本发明的发酵物组合物可以用于各种用途。该用途没有特别的限定。本发明的发酵物组合物可以在例如，皮肤外用剂等化妆品、化妆品材料、饮食品、饮食品用添加剂和沐浴液等中使用。

本发明的发酵物组合物可以在化妆品和饮食品等中配合。在化妆品中配合时，本发明的发酵物组合物的配合量没有特别的限定。该配合量可以根据化妆品的种类等适量配合。本发明的发酵物组合物的配合量，在化妆品为100质量％时，可以为0.001～100质量％、尤其是0.001～50质量％。本发明的发酵物组合物的含有量如果在上述范围内，则可以制成具有优异的骨胶原合成作用等的化妆品。

可以配合本发明的发酵物组合物的化妆品的种类没有特别的限定。作为该化妆品，可以列举例如，冷冻干燥物、剥撕式面膜(pack)、片状面膜(pack sheet)、敷面剥落式面膜(peeling)、粉、化妆水、化妆用粉、固体化妆用粉、口红、固体腮红、粉底、乳液、化妆水、护体乳、洗面奶、洗面膏、护肤霜、染发液、洗发液、眼影和眉笔等。而且，这些化妆品中，根据其种类，根据需要，还可以添加其它成分，例如，植物提取物、维生素、维生素类物质、矿物质、低级醇类、多价醇类、油脂类、表面活性剂、抗氧化剂、紫外线吸收剂、增粘剂、色素、防腐剂和香料等。

作为配合本发明的发酵物组合物的化妆品，尤其可以列举皮肤外用剂。本发明的发酵物组合物具有优异的骨胶原合成作用等。因此，本发明的发酵物组合物在涂布于皮肤上使用的化妆品中特别有用。含有本发明的发酵物组合物作为有效成分的皮肤外用剂可以使用本发明的发酵物组合物和可以在皮肤外用剂中使用的其它配合剂来制备。作为上述其它的配合剂，可以列举例如液体油(角鲨烯和藿藿芭油(Jojoba oil)等)、固体油(蜂蜡和鲸蜡醇等)、各种活性剂、和保湿剂(甘油和1，3一丁二醇等)。该皮肤外用剂的剂型没有特别的限定。该皮肤外用剂可以形成例如，化妆水、乳霜和乳液等适于目的的各种剂型。在这种皮肤外用剂中，本发明的发酵物组合物的配合量没有特别的限定。本发明的发酵物组合物的配合量，在皮肤外用剂为100质量％时，可以为0.001～100质量％，尤其是0.001～50质量％。本发明的发酵物组合物的含量如果在上述范围内，则可以形成具有优异的骨胶原合成作用等的皮肤外用剂。

含有本发明的发酵物组合物的饮食品，可以通过例如，本发明的发酵物组合物与其它食品原料一起混合，或者在预先混合的食品原料混合物中配合本发明的发酵物组合物，然后用一般的方法加工来制造。含有本发明的发酵物组合物的饮食品，可以通过例如，使本发明的发酵物组合物溶解于油脂、乙醇、丙二醇、甘油或它们的混合物中，将其配合于饮料或固体食品中来制造。而且，含有本发明的发酵物组合物的饮食品，可以通过将本发明的发酵物组合物与阿拉伯树胶和糊精等结合剂相混合从而制成粉末或颗粒等，再将其配合于饮料或固体食品中来制造。含有本发明的发酵物组合物的饮食品可作为健康食品和功能性食品等提供。

而且，配合了本发明的发酵物组合物的配合物还可以作为化妆品材料、沐浴液、和饮食品用添加剂等来使用。

(2)化妆品组合物，细胞活化用皮肤外用剂组合物和化妆品原料

本发明的化妆品组合物，细胞活化用皮肤外用剂组合物和化妆品原料的特征在于含有本发明的发酵物组合物。本发明的化妆品组合物，细胞活化用皮肤外用剂组合物和化妆品原料中所含的上述发酵物组合物适用已经说明的内容。

本发明的化妆品组合物，细胞活化用皮肤外用剂组合物和化妆品原料中上述发酵物组合物的比例没有特别的限定。上述发酵物组合物的比例，在例如，本发明的化妆品组合物，细胞活化用皮肤外用剂组合物和化妆品原料总体为100质量％时，可以为0.001～100质量％，尤其是0.001～50质量％。上述发酵物组合物的比例如果在上述范围内，则可以形成具有优异的骨胶原合成作用等的化妆品组合物，细胞活化用皮肤外用剂组合物和化妆品原料。

本发明的化妆品组合物的种类没有特别的限定。作为上述化妆品组合物，可以列举例如，冷冻干燥物、剥撕式面膜(pack)、片状面膜(pack sheet)、敷面剥落式面膜(peeling)、化妆用粉、固体化妆用粉、口红、固体腮红、粉底、乳液、化妆水、护体乳、洗面奶、洗面膏、护肤霜、染发液、洗发液、眼影和眉笔。而且，本发明的化妆品组合物中，根据其种类，根据需要还可以添加其它成分(例如，植物提取物、维生素、维生素类物质、矿物质、低级醇类、多价醇类、油脂类、表面活性剂、抗氧化剂、紫外线吸收剂、增粘剂、色素、防腐剂和香料)。

作为本发明的化妆品组合物，更具体的可以列举，尤其是皮肤外用剂。上述发酵物组合物具有优异的骨胶原合成作用等。因此，本发明的发酵物组合物在涂布于皮肤上使用的化妆品中特别有用。上述皮肤外用剂可以使用上述发酵物组合物和可以在皮肤外用剂中使用的其它配合剂来制备。作为上述其它的配合剂，可以列举例如例如，液体油(角鲨烯和藿藿芭油(Jojoba oil)等)、固体油(蜂蜡和鲸蜡醇等)、各种活性剂、和保湿剂(甘油和1，3-丁二醇等)。该皮肤外用剂的剂型没有特别的限定。该皮肤外用剂可以形成化妆水、乳霜和乳液等适于目的的各种剂型。在这种皮肤外用剂中，上述发酵物组合物的配合量没有特别的限定。上述发酵物组合物的配合量，在皮肤外用剂为100质量％时，可以为0.001～100质量％，尤其是0.001～50质量％。发酵物组合物的含量如果在上述范围内，则可以形成具有优异的骨胶原合成作用等的皮肤外用剂。

本发明的细胞活化用皮肤外用剂含有上述发酵物组合物。上述发酵物组合物具有优异的骨胶原合成作用等。因此，上述发酵物组合物在涂布于皮肤上使用的化妆品中配合时特别有用。本发明的细胞活化用皮肤外用剂其本身可适用上述皮肤外用剂的说明。

本发明的化妆品原料可以在例如，冷冻干燥物、剥撕式面膜(pack)、片状面膜(pack sheet)、敷面剥落式面膜(peeling)、粉、化妆水、化妆用粉、固体化妆用粉、口红、固体腮红、粉底、乳液、化妆水、护体乳、洗面奶、洗面膏、护肤霜、染发液、洗发液、眼影和眉笔中配合使用。

(3)发酵物组合物等的制造方法

本发明的发酵物组合物、化妆品组合物、细胞活化用皮肤外用剂组合物和化妆品原料的制造方法的特征在于具有将通过枯草芽孢杆菌使米糠和豆类来源的肽发酵而获得的发酵物与肽和维生素A类这两种物质中的至少1种相混合的混合步骤。

上述“米糠”、上述“豆类来源的肽”、上述“枯草芽孢杆菌”、上述“肽”和上述“维生素A类”，可适用本发明的发酵物组合物中说明的内容。

上述“发酵物”，通常可以通过在含有米糠和豆类来源的肽的培养基中接种枯草芽孢杆菌使之发酵的发酵步骤获得。上述“发酵步骤”中的上述“培养基”含有米糠和豆来源的肽，可以是通过枯草芽孢杆菌增殖可以进行发酵培养的培养基。上述培养基的种类和组成没有特别的限定。上述培养基通常是液体培养基，也可以是固体培养基。而且，上述培养基的pH(尤其是发酵时)，通常为5.5～8.5、优选6.0～8.0、更优选6.5～7.5。而且，上述培养基中，为了将pH和营养条件等调整到优选范围，可以添加葡萄糖等糖类、蛋白酶等酶、纯化水等水等。

上述发酵时的培养温度只要是可以进行发酵，则没有特别的限制。该培养温度通常为15～50℃，优选为20～45℃，更优选30～45℃，更优选为35～43℃。发酵培养通常通过通气搅拌进行。

通过上述发酵步骤获得的上述发酵物的形态没有特别的限制。上述发酵物的形态适用本发明的发酵物组合物中说明的内容。

上述“混合步骤”中，上述发酵物与上述肽和维生素A类这两种物质中的至少1种相混合的方法没有特别的限定。发酵物和肽，可以根据各自形态、和各自的质量比例等，用均质混合器(Homomixer)等混合器等适当的装置混合。而且，混合时的温度没有特别的限定，优选根据发酵物和肽各个种类等设定。发酵物和肽，可以根据需要在5～20℃的范围内一边冷却一边混合，还可以根据需要在35～85℃的范围内一边加热一边混合。

本发明的制造方法还可以再具备其它的步骤。作为这种其它的步骤，可以列举例如，对上述发酵物进行纯化处理的步骤等。通过发酵步骤获得的发酵物可与原先的肽混合，或者也可以对该发酵物进行纯化处理，然后再与肽混合。这种纯化处理的方法没有特别的限定。例如，通过压榨发酵液，再过滤，可以纯化上述发酵物。而且，也可以通过对发酵液进行压榨，再过滤，然后通过活性炭等进行除臭、脱色处理，和/或除去沉淀物的处理，然后，通过再次过滤，纯化上述发酵物。

通过对上述发酵物组合物制剂化从而获得化妆品组合物和细胞活化用皮肤外用剂组合物的步骤的内容只要可以获得化妆品组合物和细胞活化用皮肤外用剂组合物，在没有特别的限定。通常，通过将上述发酵物组合物和构成化妆品组合物和细胞活化用皮肤外用剂组合物的其它原料相混合，制成片剂或液剂等制剂，可以获得化妆品组合物和细胞活化用皮肤外用剂组合物。当然，还可以将上述发酵物组合物按原样，或通过制成片剂或液剂等制剂，制成化妆品组合物和细胞活化用皮肤外用剂组合物。

实施例

下面，通过实施例具体说明本发明。

发酵物组合物的制造

混合3kg米糠、0.4kg大豆肽、0.5kg葡萄糖、0.01kg碱性蛋白酶和50kg纯化水，制备培养基。然后，将培养基的pH调整到6.0～8.0，然后，接种纳豆菌，于37℃培养38小时进行发酵。然后，压榨并过滤发酵液，然后，用活性炭脱色、除臭。然后通过再次过滤发酵液进行纯化，从而制备出发酵物。

含有丝素蛋白(Silk fibroin)的发酵物组合物的评价

将上述[1]中制备的发酵物，维生素C(和光纯药工业社制)和丝素蛋白(Silk fibroin)(Eaudeleman公司制、商品名“Fibroin Sheet”)溶解于缓冲液(PBS)中，使得各物质的固体成分浓度达到2％(质量/体积)。然后，用0.22μm的过滤器过滤该溶液。然后，通过稀释并混合该溶液使得各成分达到表1和表2中记载的浓度，从而制备实验例2～15的试样溶液。而且，实验例1使用上述缓冲液(PBS)作为试样溶液。

在2个96孔板(表中称为“P1”和“P2”。)上，每1孔均接种5000个人皮肤成纤维细胞。然后，在添加了5％FBS的MEM培养基中培养3天。通过在添加了5％FBS的MEM培养基中添加实验例1～15的试样来制备试样添加培养基。该试样添加培养基中实验例1～15的试样溶液的浓度为1％(质量/体积，但除去上述PBS的质量。)(因此，培养基中发酵物组合物中各成分的最终浓度为试样溶液中的浓度的1/100。)。而且，将孔中的上述添加了5％FBS的MEM培养基更换成上述试样添加培养基，再培养3天。

接着，使用“骨胶原染色试剂盒”(骨胶原技术研究会制)，按照试剂盒附带的手册测定骨胶原合成量(μg)。板1(P1)和板2(P2)中骨胶原合成量的平均值示于表1和表2。而且，实验例1的骨胶原合成量作为1，求出实验例2～8的骨胶原合成量的相对值。同样，实验例9的骨胶原合成量作为1，求出实验例10～15的骨胶原合成量的相对值。其结果合计于表1和表2中。而且，在表1和表2中，“VC”是指维生素C，“SF”是指丝素蛋白(Silk fibroin)。

表1

表2

根据表1和表2，清楚了在同时使用丝素蛋白和发酵物的实验例5～8和13～15中，与只使用发酵物的实验例3和11和丝素蛋白的实验例4和12相比，其骨胶原合成作用优异。

含有其它丝原料来源的肽的发酵物组合物的评价

将上述[1]中制造的发酵物，维生素C(和光纯药工业社制)，丝素蛋白和下述丝肽(a)和(b)溶解于缓冲液(PBS)中，使得各物质的固体成分浓度分别达到2％(质量/体积)。然后，通过稀释并混合该溶液使得各成分达到表3～表5中记载的浓度，从而制备实验例17～19、24～28、和33～35的试样溶液。并且，通过在体积上等量混合实验例17～19、24～28和33～35的试样溶液，制备出实验例20～22、29～31和36的试样溶液。而且，在实验例16、23和32中使用上述缓冲液(PBS)作为试样溶液。

维生素C和丝素蛋白与上述[2]中使用的相同。而且，作为丝肽(a)和(b)，使用以下物质。而且，丝肽(a)和(b)是任意一种液体，用缓冲液稀释至作为固体成分浓度的终浓度为1％(质量/体积)，再使用。

丝肽(a)；Cosmo食品社制、商品名“丝肽M-500”

丝肽(b)；Cosmo食品社制、商品名“丝肽M-500#60”

通过与上述[2]相同的方法，测定实验例16～36的骨胶原合成量(μg)。板1(P1)和板2(P2)中的骨胶原合成量的平均值示于表3～表5。而且，实验例16、23和32的各骨胶原合成量作为1，求出其它实验例的骨胶原合成量的相对值。其结果合计于表3～表5中。而且，在表3～表5中，“VC”是指维生素C，“SF”是指丝素蛋白，“SP”表示丝肽。

表3

表4

表5

根据表3～5的结果，在同时使用丝素蛋白和发酵物的实验例22、29和36中，与只使用发酵物的实验例18、25和34，以及只使用丝素蛋白的实验例19、26和35相比，与前述同样具有更优异的骨胶原合成作用。而且，还清楚了，在同时使用丝肽和发酵物的实验例30和31，与丝素蛋白的情况一样，具有更优异的骨胶原合成作用。而且，根据实验例17，24和33，清楚了维生素C具有骨胶原合成作用。但是，在同时使用发酵物和维生素C的实验例20以及同时使用维生素C和丝素蛋白的实验例21中，没有发现由于同时使用而产生的协同效果，或者这种效果极小。因此，清楚了同时使用发酵物和肽所产生的协同效果大。

含有大豆肽的发酵物组合物的评价

将上述[1]中制备的发酵物，维生素C(和光纯药工业社制)，丝素蛋白和下述大豆肽(a)～(c)溶解于缓冲液(PBS)中，使得各物质的固体成分浓度均达到2％(质量/体积)。然后，用0.22μm的过滤器过滤该溶液。然后，通过稀释并混合该溶液使得各成分达到表6和表7中记载的浓度，从而制备实验例38～43和49～54的试样溶液。而且，通过按体积等量混合实验例38～43和49～54的试样溶液，制备实验例44～47和55～56的试样溶液。而且，在实验例37和48中，使用上述缓冲液(PBS)作为试样溶液。

维生素C和丝素蛋白与上述[2]中使用的相同。而且，作为大豆肽(a)～(c)，使用以下物质。而且，大豆肽(a)、(b)和(c)是任意一种液体，用缓冲液稀释至作为固体成分浓度的终浓度为1％(质量/体积)，再使用。

大豆肽(a)；不二制油社制、商品名“ハイニユ—トSMP”

大豆肽(b)；不二制油社制、商品名“ハイニユ—トR”

大豆肽(c)；不二制油社制、商品名“ハイニユ—トDC5”

通过与上述[2]相同的方法，测定实验例37～47的骨胶原合成量(μg)。板1(P1)和板2(P2)中的骨胶原合成量的平均值示于表6。而且，实验例37的骨胶原合成量作为1，求出其它实验例的骨胶原合成量的相对值。其结果合计于表6中。而且，在表6中，“VC”是指维生素C，“SF”是指丝素蛋白，“SBP(a)～(c)”是指大豆肽(a)～(c)。

表6

在2个96孔板上，每1孔均散布2000个人皮肤成纤维细胞。然后，在添加了5％FBS的MEM培养基中培养3天。然后，更换成无血清MEM培养基，再培养1天。通过在添加了5％FBS的MEM培养基中添加实验例48～56的试样来制备试样添加培养基。该试样添加培养基中上述实验例48～56的试样溶液的浓度为1％(质量/体积，但除去上述PBS的质量。)(因此，培养基中发酵物组合物中各成分的最终浓度为在试样溶液中的浓度的1/100。)。而且，将孔中的上述无血清MEM培养基更换成上述试样添加培养基，再培养4天。

然后，基于同仁堂“细胞计数试剂盒8”，以WST-8四唑盐作为发色底物，在450nm的波长下测定通过活细胞内的脱氢酶还原而生成的水溶性甲臜(Formazan)，测定吸光度(活细胞数与当该吸光度的值成比例。)。而且，以实验例48的活细胞数作为1，计算其它实验例的活细胞量的相对值，评价细胞增殖作用。结果合计于表7中。而且，表7中，“VC”是指维生素C，“SF”是指丝素蛋白(Silkfibroin)，“SBP(a)～(c)”是指大豆肽(a)～(c)。而且，表7中细胞增殖率这—项的平均值为上述吸光度值的平均值。

表7

根据表6，清楚了，在同时使用丝素蛋白和发酵物的实验例44，与只使用发酵物的实验例39和丝素蛋白的实验例40相比，具有更为优异的骨胶原合成作用。而且，在同时使用发酵物和大豆肽的实验例45～47，与丝素蛋白的情况—样，具有更为优异的骨胶原合成作用。

根据表7，清楚了同时使用发酵物和大豆肽(c)的实验例56，与只使用发酵物的实验例50相比，其细胞增殖作用进—步提高。而且，在同时使用发酵物和丝素蛋白的实验例55，细胞增殖作用也同样提高。

含有维生素A类的发酵物组合物的评价

将上述[1]中制备的发酵物，维生素C(和光纯药工业社制)和环糊精包合视黄醇(商品名“CAVAMAXW8/RetinolComplex”シクロヶム社制)溶解于缓冲液(PBS)中，使得各物质的固体成分浓度分别达到2％(质量/体积)。然后，用0.22μm的过滤器过滤该溶液。然后，通过稀释该溶液使得各成分达到表8中记载的浓度，制备出实验例58～66的试样溶液。而且，实验例57中，使用上述缓冲液(PBS)作为试样溶液。

用与上述[2]和[4]记载的方法相同的方法，测定实验例57～66的骨胶原合成量(μg)和细胞增殖率。其平均值示于表8。而且，以实验例57的骨胶原合成量和活细胞量作为1，求出其它实验例的骨胶原合成量和活细胞量的相对值。该结果合计于表8。而且，在表8中，“VC”是指维生素C，“CDR”是指环糊精包合视黄醇。而且，表8中细胞增殖率这一项的平均值为吸光度值的平均值。

【表8】

根据表8，清楚了同时使用视黄醇和发酵物的实验例64～66，与只使用发酵物的实验例59和只使用视黄醇的实验例60～63相比，具有更为优异的骨胶原合成作用和细胞增殖作用。

含有肽和维生素A类的发酵物组合物的评价

将上述[1]中所制备的发酵物，上述丝素蛋白，上述大豆肽(A)和上述环糊精包合视黄醇溶解于缓冲液(PBS)中，使得各物质的固体成分浓度均达到2％(质量/体积)。然后，用0.22μm的过滤器过滤该溶液。然后，通过稀释并混合该溶液使得各成分达到表9和表10中记载的浓度，从而制备实验例68、69、71和72的试样溶液。而且，在实验例67和70中，使用上述缓冲液(PBS)作为试样溶液。

通过与上述[2]和[4]相同的方法，测定实验例67～72的骨胶原合成量(μg)和细胞增殖率。其平均值示于表9和表10。而且，以实验例67和70的骨胶原合成量和活细胞量作为1，求出其它实验例的骨胶原合成量和活细胞量的相对值。其结果合计于表9和表10中。而且，表9和表10中，“SF”是指丝素蛋白、“SBP”是指大豆肽，“CDR”是指环糊精包合视黄醇。而且，在表9和表10中细胞增殖率这一项的平均值为吸光度值的平均值。

根据表10，清楚了同时使用视黄醇和肽的发酵物的实验例69和72具有优异的骨胶原合成作用和细胞增殖作用。

而且，本发明不限于上述具体的实施例。本发明根据目的，用途，可以在本发明的范围内进行各种变化。

工业上利用的可能性

本发明的发酵物组合物安全性好，具有骨胶原合成作用等。本发明的发酵物组合物可以在皮肤外用剂等各种化妆品和健康食品以及功能性食品等各种饮食品等中配合使用。也就是说，本发明可以在化妆品和饮食品等领域中使用。

Claims (4)

1.一种发酵物组合物，其特征在于含有：

通过枯草芽孢杆菌使米糠和大豆肽发酵而获得的发酵物，以及

维生素A类，

所述维生素A类选自维生素A1、维生素A2、以及这些物质的药学上允许的盐或被氧化的醛或羧酸中的1种或2种以上。

2.一种化妆品组合物，其特征在于其含有权利要求1所述的发酵物组合物。

3.一种发酵物组合物的制造方法，其特征在于该方法具有将通过枯草芽孢杆菌使米糠和大豆肽发酵而获得的发酵物与

维生素A类相混合的混合步骤，

所述维生素A类选自维生素A1、维生素A2、以及这些物质的药学上允许的盐或被氧化的醛或羧酸中的1种或2种以上。

4.一种化妆品组合物的制造方法，其特征在于该方法具有将通过枯草芽孢杆菌使米糠和大豆肽发酵而获得的发酵物与

维生素A类相混合的混合步骤，以及通过将该混合步骤中获得的发酵物组合物制剂化获得化妆品组合物的步骤，

所述维生素A类选自维生素A1、维生素A2、以及这些物质的药学上允许的盐或被氧化的醛或羧酸中的1种或2种以上。