KR102404748B1 - 피부 진피층으로 투과율 및 체내 흡수율이 개선된 나노 사이즈 저분자 콜라겐 펩타이드의 제조방법 - Google Patents
피부 진피층으로 투과율 및 체내 흡수율이 개선된 나노 사이즈 저분자 콜라겐 펩타이드의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 발효, 가수분해 효소처리, 및 초고압 호모게나이저 처리를 통해 나노 콜라겐 펩타이드를 효과적으로 제조할 수 있는 어류 유래의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 어류 유래 나노 콜라겐 펩타이드 제조방법은 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 및 엔테로코커스 패슘 J9의 2종 균주로 발효하여 어류 유래 콜라겐 특유의 불쾌취를 현저하게 개선하였으며, 발효, 가수분해 효소처리, 및 초고압 호모게나이저의 순차적 처리를 통해 1~3nm의 균일한 크기와 분자량 212 ~ 250 Da에 해당하는 나노 콜라겐 분말을 효과적으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 천연상태에서 존재하는 어류 콜라겐 단백질을 몽고 치즈 및 청국장에서 동정한 2종 균주로 발효 처리하여 인체에 매우 안전할 뿐만 아니라, 안정성도 매우 탁월하다.
본 발명의 어류 유래 나노 콜라겐 펩타이드 제조방법은 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 및 엔테로코커스 패슘 J9의 2종 균주로 발효하여 어류 유래 콜라겐 특유의 불쾌취를 현저하게 개선하였으며, 발효, 가수분해 효소처리, 및 초고압 호모게나이저의 순차적 처리를 통해 1~3nm의 균일한 크기와 분자량 212 ~ 250 Da에 해당하는 나노 콜라겐 분말을 효과적으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 천연상태에서 존재하는 어류 콜라겐 단백질을 몽고 치즈 및 청국장에서 동정한 2종 균주로 발효 처리하여 인체에 매우 안전할 뿐만 아니라, 안정성도 매우 탁월하다.
Description
본 발명은 나노 사이즈 저분자 콜라겐 펩타이드의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 2종 균주 발효, 가수분해 효소처리, 및 초고압 호모게나이저 처리 단계를 통해 1~3nm의 균일한 크기와 분자량 212 ~ 250 Da에 해당하고, 피부 진피층으로 투과율 및 체내 흡수율이 개선된 나노 사이즈 저분자 콜라겐 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.
대표적인 구조단백질인 콜라겐은 몸속에서 녹은 상태로 있지 않고 섬유 상태로 존재하며, 동물의 몸이나 장기를 지탱하거나, 결합하거나, 경계를 만들거나, 지지하는 역할을 한다. 이러한 콜라겐 단백질은 글리신, 히드록시 프롤린, 프롤린의 3종 아미노산이 규칙적으로 배열된 트리플 헬릭스(Triple helix) 형태의 3차원 구조 단백질이다. 콜라겐 단백질은 이러한 구조적 특징에 기인하여 단단하고, 산 가용성이며, 흡수력이 굉장히 낮다.
인체 단백질의 대략 1/3 정도가 콜라겐 단백질이며, 콜라겐 단백질이 부족할수록 우리 몸에는 여러 가지 문제가 발생하게 된다. 일반적으로 알려진 바에 의하면, 인간이 20세가 되면 콜라겐 단백질이 1년에 1% 정도로 줄어들게 되고, 40대가 되면 20대의 절반 수준으로 저하되게 된다. 또한, 진피층의 콜라겐 단백질의 함량이 줄어들게 되면 탄력이 떨어지고 느슨해져 굴곡이 지며, 피부 표피의 주름살이 늘게 되어 피부 노화를 촉진하게 된다.
또한, 현존하는 콜라겐 단백질은 타입별 종류가 28가지인데, 타입 I 콜라겐 단백질이 피부에 관여하고, 어류 콜라겐 단백질이 이에 해당한다. 한편, 육류 콜라겐 단백질의 경우에는 아프리카 돼지열병, 구제역 등 감염병 전염의 우려가 있으며 분자량이 매우 커서 산 분해성이 낮고, 흡수율도 지극히 낮으며, 원료 가공성이 낮은 단점이 있다.
한편, 타입 I 콜라겐 단백질의 발현 수준을 조절하는 것은 피부 광 노화를 예방하는데 가장 중요한 인자이다. UVB 조사는 TGF-β/Smad 신호전달 체계의 억제를 통해 피부 섬유아세포에서 콜라겐 전구체인 프로콜라겐(procollagen)의 발현을 감소시키게 된다. 또한, TGF-β1 신호전달 체계는 인간 피부 섬유아세포에서 세포외 기질의 합성을 조절하는 중요한 인자의 하나이다.
따라서, AP-1 및 MAPKs 인자에 의해 조절되는 활성산소종(ROS)의 생성, 및 MMPs, ILs, TGF-β, 및 타입 I 프로콜라겐의 발현은 피부 광노화 연구에 있어서 유용한 마커로 작용한다. 이와 같이 콜라겐 감소를 저해하여 피부 주름 개선에 효과가 있는 천연물질을 탐색하고자 하는 여러 다양한 시도가 있었다.
콜라겐의 주름 개선 효과를 이용하기 위하여 화장품 또는 연고 등과 같은 피부외용제 조성물에 콜라겐을 배합한 제품들이 출시되었으나, 이들 제품은 콜라겐 자체를 피부 표면에 도포하는 것으로 고분자 물질인 콜라겐의 경피 흡수가 어려워 본질적인 주름개선 효과를 나타낼 수 없었고, 최근 사용되고 있는 어류 유래의 콜라겐 제품들은 어류 특유의 불쾌취가 있어 장기간 복용하기 어려우므로 시장에서 소비자들에게 외면받는 실정이다.
이러한 문제를 해결하기 위하여 콜라겐 합성촉진 물질에 대한 관심이 높아지고 있으며, 종래 알려진 콜라겐 합성 촉진물질로는 비타민C, 레티노익산, 형질전환생장인자(transforming growth factor, TGF), 동물태반 유래의 단백질(JP8-231370), 베툴린산(betulinic acid, JP8-208424), 클로렐라 추출물(JP9-40523, JP10-36283, 섬유아세포 증식 촉진작용) 등이 있다. 그러나 상기 물질은 피부 적용시 자극과 발적 등 안전성 문제로 사용량에 제한이 있거나 그 효과가 미미하여 실질적으로 주름 개선 효과를 기대할 수 없다는 문제점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 어류 콜라겐 특유의 불쾌취를 제거하면서도 피부에 흡수가 용이한 콜라겐 제품을 개발하기 위해 예의 연구노력하였고, 이 과정에서 어류 유래 콜라겐 단백질을 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 및 엔테로코커스 패슘 J9의 2종 균주로 발효하고, 가수분해 및 초고압 호모게나이즈 처리를 수행하는 경우, 1~3nm의 균일한 크기와 분자량 212 ~ 250 Da에 해당하는 불쾌취가 제거된 어류 유래 나노 콜라겐 분말을 효과적으로 제조할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 어류 유래의 나노 콜라겐 펩타이드의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 어류 콜라겐을 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주 및 엔테로코커스 패슘 J9 균주로 발효하여 콜라겐 발효액을 준비하는 단계; 상기 콜라겐 발효액을 플레이버자임(Flavorzyme) 효소로 가수분해하여 가수분해 콜라겐 용액을 제조하는 단계; 상기 가수분해 콜라겐 용액을 초고압 호모게나이저로 분쇄하여 나노 콜라겐을 제조하는 단계;를 포함하는 어류 유래의 나노 콜라겐 펩타이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명자들은 28종의 콜라겐 타입 중 인간 피부와 유사한 타입 I 콜라겐 단백질에 해당하는 어류 유래의 콜라겐 단백질을 원료로 사용하여 피부조직 관련성을 높일 수 있는 콜라겐 제품을 개발하기 위해 예의 연구노력하였고, 이 과정에서 어류 특유의 불쾌취를 제거하기 위하여 몽고 치즈에서 분리 동정한 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주와 청국장 유래 미생물인 엔테로코코스 패슘(Enterococcus faecium) 균주를 이용하여 어류 특유의 부패취 또는 불쾌취를 해소하는 방안을 고안해냈으며, 가수분해 단계 및 초고압 호모게나이징 단계를 적용하여 균일한 나노 크기의 콜라겐 펩타이드를 제조하는 방법을 완성하였다. 본 발명에 따른 어류 유래의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드는 인체 피부 흡수성이 현저하게 개선된 콜라겐 펩타이드로 식품, 화장품 등 다양한 분야에 이용될 수 있는 장점이 있다.
본 발명에서 상기 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주는 어류 유래 콜라겐 단백질의 불쾌취를 개선하고자, 본 발명자들에 의해 분리동정된 균주로, 몽고 치즈에서 YM Agar 배지를 이용하여 희석 배양으로 분리되었고, 식품에서 유래하여 인체에 안전한 균주이며, 균주 특유의 방향성 성분을 생산하는 특징으로 인해 어류 콜라겐의 불쾌취를 마스킹할 수 있는 장점이 있다. 동 균주는 2021년 5월 4일 한국미생물보존센터에 기탁된 균주(기탁번호: KCCM12983P)이다. 또한, 상기 엔테로코코스 패슘(Enterococcus faecium) 균주는 청국장에서 분리 동정된 균주로 2015년 7월 23일 미생물 기탁기관인 한국 미생물 보존센터에 기탁되어, 기탁번호 KCCM 11735P를 부여받은 균주로, 특허등록 제10-1786626호에 공개된 균주이다.
본 발명의 어류 유래의 나노 콜라겐 펩타이드의 제조방법에서, 상기 콜라겐 발효액을 준비하는 단계는 상기 어류 콜라겐 용액 100 중량부 대비 0.5 ~ 2 중량부의 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주 배양액 및 엔테로코커스 패슘 J9 균주 배양액을 접종하여 발효하되, 상기 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주 배양액과 엔테로코커스 패슘 J9 균주 배양액이 1:0.5 내지 1.5의 중량비로 혼합되어 접종될 수 있다.
또한, 본 발명의 어류 유래의 나노 콜라겐 펩타이드의 제조방법에서, 상기 콜라겐 발효액을 준비하는 단계의 발효는 호기 및 혐기 조건을 1 내지 3시간 간격으로 교대하면서 수행하여 총 6 내지 10 시간 동안 발효처리 과정을 수행하되, 호기 조건의 발효는 0.7 내지 0.9VVM 조건으로 에어레이션 하는 방식으로 수행될 수 있다.
구체적으로 효모의 일종인 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주를 접종하고 20 내지 28 시간 동안 배양한 균주 배양액과, 유산균의 일종인 엔테로코커스 패슘 J9 균주를 접종하고 20 내지 28 시간 동안 배양한 균주 배양액은 1:0.5 내지 1.5의 중량비로 혼합될 수 있고, 상기 균주의 확대 배양 과정에서 초기 생육에 필요한 탄소 영양원을 보충하기 위해 단당류인 포도당을 배지 전체 중량 대비 1~8 중량% 비율로 첨가하여 생육 활성화를 기할 수 있다.
또한, 산소 공급에 있어서 생육조건이 서로 다른 혐기성 효모와 호기성 유산균의 특성을 고려하여 1시간 내지 3시간 간격으로, 가장 바람직하게는 2시간 간격으로 호기 조건과 혐기 조건을 번갈아 가며 배양할 수 있다. 호기 조건에서는 0.3~1.0VVM(aeration volume/medium volume/minute)의 에어레이션(aeration) 조건을 유지할 수 있고, 혐기 조건을 위해 에어 공급은 “0”으로 에어레이션(aeration)을 차단하여 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주와 엔테로코커스 패슘 J9 균주의 공배양을 6 내지 10 시간 동안 발효할 수 있다.
상기와 같은 발효 과정에서 어류 특유의 부패취 또는 불쾌취의 주된 원인이 되는 암모니아 성분이 제거되게 된다. 암모니아는 2가지의 기본형태로 존재할 수 있는데, 하나는 유리 암모니아 형태이고, 다른 하나는 암모늄 이온(NH4 +)의 형태이다. 상기 암모니아 이온은 용액 내의 양성자가 암모니아와 결합할 때 형성된다(NH3 + H+ -> NH4 +). 따라서, 용액 내의 pH 수준이 낮을수록 양성자가 더 많이 존재하고, 실제로 하나의 pH 단위가 떨어지면 양성자 수가 10배 증가하게 된다. 따라서, 효모 및 유산균 균주를 이용한 발효 과정에서 pH 수준이 낮아지게 되면 H+ 이온이 다량 생성되게 되고, 암모니아 성분들은 암모니아 형태에서 암모늄 이온 형태로 전환되게 되며, 이취 제거에 도움이 된다. 또한, 상기 본 발명의 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주와 엔테로코커스 패슘 J9 균주는 그 자체로 생육을 위한 대사 활동 과정에서 암모늄 이온을 흡수하여 어류 특유의 부패취 또는 불쾌취를 제거하는 역할을 한다.
본 발명의 어류 유래의 나노 콜라겐 펩타이드의 제조방법에서, 상기 가수분해 콜라겐 용액을 제조하는 단계는 pH 7.0 조건에서 콜라겐 발효액 100 중량부 대비 0.1~1 중량부의 플레이버자임(Flavorzyme) 효소를 사용하여 6 내지 10시간 동안 가수분해 처리하여 수행될 수 있다.
원료 성분인 어류 유래의 콜라겐 단백질은 아미노산 1,000개 유닛이 일렬로 배열되어 하나의 체인을 만들고, 다시 아미노산 1,000개 유닛으로 구성된 체인 3개가 꽈배기 모양으로 α-헬릭스 형태로 결합하여 하나의 단백질 콜라겐 섬유를 형성한다. 상기 단백질 콜라겐 섬유의 분자량(molecular weight)은 300,000Da 정도이며, 하나의 체인이 1,000개의 아미노산 유닛으로 구성되므로, 하나의 아미노산은 대략 94~100Da 정도이다. 또한, 어류 유래의 원료 콜라겐 분자의 길이는 300nm, 굵기는 15nm 정도이다.
상기와 같은 어류 유래의 고분자 콜라겐 단백질을 나노 사이즈로 분해하기 콜라겐 단백질을 분해 가능한 어떠한 단백분해 효소도 사용이 가능하나, 바람직하게는 플레이버자임(Flavorzyme) 효소를 사용하는 것이 분해 효율과 콜라겐 펩타이드의 변질 방지의 관점에서 바람직하며, 플레이버자임(Flavorzyme) 효소를 사용하는 경우에는 pH 7.0 조건에서 콜라겐 발효액 100 중량부 대비 0.1~1 중량부의 플레이버자임(Flavorzyme) 효소를 첨가하여 6시간 내지 10시간 동안 가수분해효소 반응을 수행할 수 있다. 효소 반응이 완료된 이후에는 플레이버자임(Flavorzyme) 효소의 생물학적 기능을 없애기 위해 실활 처리하게 된다.
본 발명의 어류 유래의 나노 콜라겐 펩타이드의 제조방법에서, 상기 나노 콜라겐을 제조하는 단계는 22,000 ~ 28,000 Psi 압력으로 400μm 구간 및 100μm 구간의 미세 오피리스 모듈 구간을 통과시키는 과정을 2회 내지 4회 반복하여 초고압 호모게나이저로 분쇄하는 방식으로 수행될 수 있다.
초고압 호모게나이저는 오리피스 모듈(orifice module)의 원리를 이용한 디아셀(diacell)에서 고압의 유체가 가속되어 발생하는 전단력(shear)과 충격(impact), 케비테이션(cavitation) 현상을 이용하는 장치이다. 초고압 호모게나이저 내의 고압 펌프에서 발생한 압력의 유체를 미세 오리피스 모듈에 통과시키면 압력의 급격한 저하로 유체 내에서 전단력(shear)과 충격(impact), 케비테이션(cavitation) 등의 물리력이 작용하는 초음속 유체가 되게 되며, 유체 내부 에너지에 의해 입자와 입적이 나노 크기로 분쇄되어 미세화되게 되며, 유체 성분이 균질한 상태로 안정된 분산상태를 유지하게 된다.
본 발명의 어류 유래의 나노 콜라겐 펩타이드의 제조방법에서는 가수분해된 어류 유래 콜라겐 펩타이드의 성질을 고려하여 22,000 ~ 28,000 Psi 압력을 적용할 수 있고, 400μm 구간 및 100μm 구간의 미세 오피리스 모듈 구간을 통과시키는 과정을 2회 내지 4회 반복하여 1~3nm의 균일한 크기와 분자량 212 ~ 250 Da에 해당하는 균일한 중량의 어류 유래의 나노 콜라겐 펩타이드를 제조할 수 있음을 확인한 바 있다(도 3 내지 도 5 참조).
상기 초고압 호모게나이저 처리 과정을 통해 본 발명의 어류 유래 나노 콜라겐 펩타이드는 1~3nm의 균일한 크기와 분자량 212 ~ 250Da로 균일하게 분쇄되게 된다.
상기와 같이 나노 사이즈로 분쇄된 어류 유래 콜라겐 펩타이드는 유하는 고체 입자를 제거하기 위해 여과, 예를 들어 나일론 등을 이용해 입자를 걸러내거나 냉동여과법 등을 이용해 여과한 후, 그대로 사용하거나 이를 동결건조, 열풍건조, 분무건조 등을 이용해 건조하여 사용할 수 있다.
상기와 같이 제조된 어류 유래의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드는 어류 특유의 부패취 또는 불쾌취가 거의 없고, 1~3nm 정도의 나노 크기와 200 ~ 300 분자량의 균일한 콜라겐 펩타이드로, 음료 분말 등의 이너뷰티 식품으로 적용 가능하고, 진피층 흡수 효율이 매우 높아 콜라겐 성분을 진피에 도포하여 흡수시키는 화장품 형태 등 다양한 분야에서 이용될 수 있다.
본 발명의 어류 유래의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드가 화장료 조성물로 사용되는 경우, 마스크팩, 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선스크린 크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 어류 유래의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드는 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 어류 유래의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물에서, 어류 유래의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드는 구체적으로는 건조 중량으로, 화장료 조성물 총 중량의 0.0001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로는 0.0005 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서 조성물의 제형이 안정화되는 이점이 있다.
본 발명의 어류 유래의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드는 이를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 “기능성”이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 인간 콜라겐 타입과 동일한 어류 유래 나노 사이즈의 콜라겐 펩타이드를 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나며, 피부 탄력을 증진시키기 위한 보조제로 섭취할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있고, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용하여 사용할 수 있다. 아울러 본 발명의 건강기능식품은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 어류 유래 나노 사이즈의 콜라겐 펩타이드를 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함된다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 어류 유래 나노 콜라겐 펩타이드 제조방법은 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 및 엔테로코커스 패슘 J9의 2종 균주로 발효하여 어류 유래 콜라겐 특유의 불쾌취를 현저하게 개선하였으며, 발효, 가수분해 효소처리, 및 초고압 호모게나이저의 순차적인 처리를 통해 1~3nm의 균일한 크기와 분자량 212 ~ 250Da에 해당하는 나노 콜라겐 분말을 효과적으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 몽고 치즈 및 청국장에서 동정한 2종 균주로 천연상태에서 존재하는 어류 콜라겐 단백질을 발효 처리하여 인체에 매우 안전할 뿐만 아니라, 안정성도 매우 탁월하다.
도 1은 몽고 발효 치즈에서 순수 분리한 피치아 칵토필라 균주의 계통도이다.
도 2는 어류 콜라겐(베트남산)의 수입 성적서이다.
도 3은 본 발명의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드와 어류 콜라겐 원료 단백질을 위상차 현미경(4,000배 배율)으로 비교 촬영한 사진이다.
도 4는 본 발명의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드의 입자 사이즈를 입도/제타 전위 측정 장비로 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드의 분자량을 MALDITOF-MS 장비를 사용하여 분석한 결과 그래프이다.
도 2는 어류 콜라겐(베트남산)의 수입 성적서이다.
도 3은 본 발명의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드와 어류 콜라겐 원료 단백질을 위상차 현미경(4,000배 배율)으로 비교 촬영한 사진이다.
도 4는 본 발명의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드의 입자 사이즈를 입도/제타 전위 측정 장비로 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 나노 사이즈 콜라겐 펩타이드의 분자량을 MALDITOF-MS 장비를 사용하여 분석한 결과 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 나노 사이즈의 저분자 콜라겐의 제조
1-1. 2종 균주를 이용한 콜라겐 발효액 준비 단계
어류 특유의 부패취를 없애기 위한 미생물 발효과정으로, 몽골 치즈에서 순수 분리한 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주를 YM Agar(Difco, USA) 배지에 평판 도말하고, 35℃에서 24시간 인큐베이팅하여 보관하였다(도 1 참조).
유산균은 본 발명자에 의해 특허등록 제10-1786626호에서 사용되었던 엔테로코커스 패슘 J9 균주(Enterococcus faecium J9 기탁번호 : KCCM 11735P)를 MRS Agar(Difco, USA) 배지에 평판 도말하고, 35℃에서 24시간 인큐베이팅하여 보관하였다.
상기 준비된 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주를 YM Broth 배지에서 24시간 동안 배양하였고, 상기 준비된 엔테로코커스 패슘 J9 균주를 MRS Broth 배지에서 24시간 동안 배양하여 2종의 균주에 대한 배양액을 준비하였다.
또한, 어류 콜라겐(베트남산)을 콜라겐 기질로 하여, 이를 정제수에 15Brix 농도로 희석하였다.
도 2를 참조하면, 상기 어류 콜라겐은 흰색 분말 형태로 평균 분자량은 평균 1,982Da이고, 물에 용해되는 경우 pH 6.31(1% 농도) 값을 갖는다.
상기 준비된 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주와 엔테로코커스 패슘 J9 균주의 배양액을 동등한 비율로 혼합한 후, 상기 어류 콜라겐 용액 100 중량부 대비 0.5 ~ 2 중량부로 접종하였다.
추가적으로, 상기 어류 콜라겐 용액 100 중량부 대비 포도당 1 내지 8 중량부로 첨가하고, 90rpm으로 진탕배양 하였고, 호기(0.8VVM) 및 혐기 조건을 2시간 간격으로 번갈아 가며, 총 8시간 동안 발효하여 콜라겐 발효액을 준비하였다.
| 피치아 칵토필라 균수 | 엔테로코커스 패슘 균수 | pH | |
| 콜라겐 발효액 | 6.2 Log CFU/g | 7.1 Log CFU/g | 4.9 |
발효 종료 시점의 피치아 칵토필라 균주의 균수는 6.2 Log CFU/g, 엔테로코커스 패슘 균주의 균수는 7.1 Log CFU/g로 측정되었고, 최종 pH 값은 pH 4.9로 측정되었다.
다만, 상기 2종 균주 발효를 거친 콜라겐 발효액 내에 존재하는 콜라겐의 분자량은 2,000Da 수준으로 발효 전후 과정에서 콜라겐 단백질에 대한 분자량의 변화는 없는 것으로 조사되었다.
1-2. 가수분해 콜라겐 용액 제조 단계
상기 1-1 단계의 2종 균주를 이용한 발효과정을 통해 이취가 제거되고, 향이 개선된 베트남산 콜라겐 발효액에 1.0 N NaOH 용액을 가하여 pH 농도를 7.0 수준으로 준비하였다. 단백분해효소로 플레이버자임(Flavorzyme, Novozyme, Denmark)을 사용하였고, 기질 용액 100 중량부 대비 0.1~1 중량부로 첨가하였다. 효소가 첨가된 반응 용액을 100~250rpm으로 회전시키고, 30℃ ~ 60℃ 온도에서 8시간 동안 진탕시키면서 반응을 수행하였고, 반응 종료 후, 90℃에서 30분간 효소를 실활하여 가수분해 콜라겐 용액을 제조하였다.
1-3. 나노 콜라겐 용액 제조 단계(초고압 호모게나이징)
가수분해한 콜라겐 용액을 초고압 호모게나이저(Picomax MN 300-15, 마이크로녹스, 한국) 장치를 이용하여 25,000 Psi 압력으로 400μm 구간 및 100μm 구간을 순차적으로 통과하게 하고, 이 과정을 3회 반복 실시하여 나노 사이즈의 저분자 콜라겐 용액을 제조하였다.
초고압 호모게나이저 처리된 어류 콜라겐을 위상차 현미경으로 촬영한 사진인 도 3을 참조하면, 초고압 호모게나이저 처리를 통해 어류 콜라겐이 나노 사이즈로 미세하게 분해되고, 이를 통해 용매에 균질하게 분산되는 것을 확인할 수 있다.
상기와 같이 제조된 어류 유래 나노 콜라겐 용액을 진공농축기를 이용하여 농축도를 높이고, 스프레이 드라이기 또는 진공동결건조기를 이용하여 분말화하여 나노 사이즈의 콜라겐 분말을 제조하였다.
실시예 2. 관능 평가
상기 실시예 1에 따라 제조된 어류 유래 나노 콜라겐 분말의 불쾌취 정도를 측정하기 위한 관능시험을 수행하였다. 비교 실험을 위해 실시예 1-1의 2종 균주를 이용한 콜라겐 발효액 준비 단계를 생략한 비교예의 어류 콜라겐 분말을 사용하여 비교 실험하였다.
시험은 훈련된 관능검사 요원 10명을 대상으로 어류 유래 나노 콜라겐 분말의 관능검사를 실시하였다. 관능검사는 불쾌치 항목에 대해 수행하였으며, 10점 척도법에 따라 10점을 만점으로 하여, 하기 평가기준에 의해 점수를 기록한 후 이들의 평균값을 구하여 기록하였다(평가기준: 10점 매우 양호, 8점 양호, 6점 보통, 4점 미흡, 2점 매우 미흡).
| 불쾌취 | |
| 실시예 1의 어류 유래 나노 콜라겐 분말 | 8.2 |
| 비교예(실시예 1-1 발효단계 생략) | 2.8 |
관능평가 결과, 상기 [표 2]에서 나타난 바와 같이, 불쾌취 항목에서 실시예와 비교예의 콜라겐 분말에서 현격한 차이가 나타났으며, 상기 실시예에 따라 제조된 본 발명의 어류 유래 나노 콜라겐 분말은 어류 특유의 암모니아 성분의 불쾌취가 전혀 느껴지지 않는 것으로 평가되었고, 발효처리하지 않은 어류 유래 나노 콜라겐 분말에 비해 선호도가 매우 높은 것으로 평가되었다.
실시예 3. 입자 크기 측정
상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 어류 유래 나노 콜라겐 시료를 입자 측정장치(Anton Paar Litesizer 500 입도/제타 전위 측정장비)를 이용하여 측정하였다.
도 4를 참조하면, 본 발명의 어류 유래 나노 콜라겐 펩타이드는 2.36 ~ 2.42 nm의 균일한 나노 사이즈의 입자 크기를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 분자량 측정
상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 어류 유래 나노 콜라겐 시료를 한국화학연구원에 의뢰하여 MALDITOF-MS(Bruker Autoflex Speed TOF/TOF Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight-Mass Spectrometer) 장비를 사용하여 분자량을 측정하였다.
측정 결과, 도 5를 참조하면, 본 발명의 어류 유래 나노 콜라겐 펩타이드는 212Da ~ 250Da 사이의 균일한 분자량을 갖는 것으로 측정되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 어류 유래 나노 콜라겐 펩타이드는 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 및 엔테로코커스 패슘 J9의 2종 균주로 발효하여 어류 유래 콜라겐 특유의 불쾌취를 현저하게 개선하였으며, 발효, 가수분해 효소처리, 및 초고압 호모게나이저의 순차적인 처리를 통해 1~3nm의 균일한 크기와 분자량 212 ~ 250Da에 해당하는 나노 콜라겐 분말을 효과적으로 제조할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (6)
- 어류 콜라겐을 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주 및 엔테로코커스 패슘 J9 균주로 발효하여 콜라겐 발효액을 준비하는 단계;
상기 콜라겐 발효액을 플레이버자임(Flavorzyme) 효소로 가수분해하여 가수분해 콜라겐 용액을 제조하는 단계; 및
상기 가수분해 콜라겐 용액을 초고압 호모게나이저로 분쇄하여 나노 콜라겐을 제조하는 단계;를 포함하되,
상기 콜라겐 발효액을 준비하는 단계는 상기 어류 콜라겐 용액 100 중량부 대비 0.5 ~ 2 중량부의 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주 배양액 및 엔테로코커스 패슘 J9 균주 배양액을 접종하여 발효하되, 상기 피치아 칵토필라(Phichia cactophila) 균주 배양액과 엔테로코커스 패슘 J9 균주 배양액은 1:0.5 내지 1.5의 중량비로 혼합되어 접종되는 것을 특징으로 하고,
상기 콜라겐 발효액을 준비하는 단계의 발효는 호기 및 혐기 조건을 1 내지 3시간 간격으로 교대하면서 수행하여 총 6 내지 10시간 동안 발효처리 하되, 호기 조건의 발효는 0.7 내지 0.9VVM 조건으로 에어레이션 하는 것을 특징으로 하는,
어류 유래의 나노 콜라겐 펩타이드의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 가수분해 콜라겐 용액을 제조하는 단계는 pH 7.0 조건에서 콜라겐 발효액 100 중량부 대비 0.1~1 중량부의 플레이버자임(Flavorzyme) 효소를 사용하여 6 시간 내지 10시간 동안 가수분해 처리하는 것을 특징으로 하는 어류 유래의 나노 콜라겐 펩타이드의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 나노 콜라겐을 제조하는 단계는 22,000 ~ 28,000 Psi 압력으로 400μm 구간 및 100μm 구간의 미세 오피리스 모듈 구간을 통과시키는 과정을 2회 내지 4회 반복하여 초고압 호모게나이저로 분쇄하는 것을 특징으로 하는 어류 유래의 나노 콜라겐 펩타이드의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 나노 콜라겐은 1~3nm 사이즈 및 분자량 212 ~ 250Da의 나노 콜라겐인 것을 특징으로 하는 어류 유래의 나노 콜라겐 펩타이드의 제조방법.
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