KR20230013710A - 콜라겐 분해효소 생성능을 나타내는 바실러스 투링기엔시스 nis-1 균주 및 이의 용도 - Google Patents
콜라겐 분해효소 생성능을 나타내는 바실러스 투링기엔시스 nis-1 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 콜라겐 분해효소 생성능을 나타내는 바실러스 투링기엔시스 NIS-1 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콜라겐을 분해하여 GPH(Gly-Pro-Hyp) 함량이 높은 콜라겐 펩타이드를 생성하는 콜라겐 분해효소 생성능을 나타내는 바실러스 투링기엔시스 NIS-1 균주, 이로부터 분리된 콜라겐 분해효소, 이를 이용한 콜라겐 펩타이드 제조방법 등에 관한 것이다.
본 발명의 신균주가 생성하는 콜라겐 분해효소는 GPH 함량이 매우 높은 콜라겐 펩타이드 제조가 가능하여 피부 주름개선, 피부 탄력개선 및 피부 보습 효능이 매우 뛰어난 화장료 및 식품 조성물 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 신균주가 생성하는 콜라겐 분해효소는 GPH 함량이 매우 높은 콜라겐 펩타이드 제조가 가능하여 피부 주름개선, 피부 탄력개선 및 피부 보습 효능이 매우 뛰어난 화장료 및 식품 조성물 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 콜라겐 분해효소 생성능을 나타내는 바실러스 투링기엔시스 NIS-1 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콜라겐을 분해하여 GPH(Gly-Pro-Hyp) 함량이 높은 콜라겐 펩타이드를 생성하는 콜라겐 분해효소 생성능을 나타내는 바실러스 투링기엔시스 NIS-1 균주, 이로부터 분리된 콜라겐 분해효소, 이를 이용한 콜라겐 펩타이드 제조방법 등에 관한 것이다.
일반적으로 콜라겐(Collagen)은 경단백질 또는 교원질(膠原質)이라고도 하며 무척추동물이나 척추동물 등의 다세포동물에 널리 분포하며 양적으로도 가장 많이 발견되는 경단백질이다. 포유류에서는 전체 단백질의 약 1/4을 차지하며 동물의 결합조직을 구성하고 있는 주요한 섬유 모양의 장력이 매우 강한 경단백질로서 힘줄이나 인대에서 힘을 손실 없이 전달한다. 콜라겐의 기본적 구조단위는 분자량 약 30만의 트로포콜라겐(母膠原質)이다. 이 분자는 3가닥의 폴리펩티드사슬이 오른쪽꼬임의 3중 나선구조로 되어 있다. 트로포콜라겐분자는 회합하여 콜라겐섬유(교원섬유)를 형성하는데 각 분자는 축방향으로 1/4씩 어긋나게 배열되어 64㎚ 간격의 독특한 줄무늬를 형성하면서 동물의 생장과 함께 분자 사이에 다리 걸친 구조가 생겨 불용성으로 된다. 그러나 콜라겐을 열수나 희산 또는 묽은 알칼리에서 오래 끓이면 물에 녹는 유도단백질 젤라틴으로 변한다. 콜라겐 펩타이드는 아미노산 중에서 유황을 함유한 아미노산은 적은 편이며 글리신, 프롤린, 히드록시프롤린, 글루타민산 등으로 구성된 섬유성 단백질의 일종으로 1,000여개의 아미노산이 모여 가늘고 긴 띠의 형상을 지닌 경단백질로서 사람의 몸에서 장기를 감싸는 막, 관절 연골, 눈의 각막, 뼈와 피부 등에 주로 존재하고, 특히 피부 속 진피층의 구성 성분으로 매우 중요한 역할을 하고 있다. 콜라겐의 주된 기능은 피부의 견고성, 조직의 저항력과 결합력, 세포접착의 지탱 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 고령화 및 자외선 조사에 의한 광노화로 인하여 피부의 두께가 얇아지고 이러한 현상은 피부의 주름 형성에 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다.
소득수준이 높아지고 노령화사회로 접어 들면서 피부 노화에 대한 광범위한 연구가 진전되어 콜라겐의 피부에 대한 기능이 밝혀지고 있다. 그 중에서 콜라겐의 합성 촉진에 의해 콜라겐 대사가 활발해지면 진피 메트릭스의 성분이 증가되어 주름개선, 탄력증진, 피부강화 및 상처치유의 효과를 기대할 수 있다는 주장에 따라 콜라겐합성 촉진물질인 레티논산(retinoic acid), TGF(transforming growth factor), 동물유래 태반(placenta), 베투린산(betulinic acid), 클로렐라추출물 등을 피부강화용 화장료 조성물로 사용한 제품들이 많이 출시되었으나 크게 각광을 받지 못하였다. 또한 콜라겐을 피부 보호용 화장품 조성물로 하는 콜라겐을 배합한 제품들이 다수 판매되고 있으나, 피부 표면에 도포하는 화장품은 고분자인 콜라겐의 경피흡수가 어려워 피부의 보습작용을 기대하기 어렵다는 한계가 있다.
한편, 저분자 콜라겐은 콜라겐 분해효소 등에 의해 분해되어 분자량 5,000으로 저분자화 된 것으로 콜라겐 펩타이드라고 불리기도 하며, 이 저분자 콜라겐이 인체에 들어오면 인체내 단백질 분해효소에 의해 더욱 분해되어 최종적으로 아미노산 형태로 인체에 흡수된다. 대부분의 단백질이 분자량이 12,000~70,000인데 비하여 콜라겐의 분자량은 300,000으로 매우 커서 흡수되기가 더욱 어렵기 때문에, 저분자 콜라겐으로 인체내 소화, 흡수가 용이하도록 추출, 분리, 정제과정을 거친 후 분해과정을 거쳐 분자량이 5,000 이하인 펩타이드 형태로 만든 것이다.
콜라겐 트리펩타이드란 아미노산 3개(글라이신-x-y)가 연결되어 있는 작은 콜라겐(분자량이 보통 200~500)을 말하며, 분자량이 작아 피부를 쉽게 투과하는 것으로 알려져 있다. 한편, 아미노산이 4개 이상 연결되어 있으면 분자구조가 커서 피부를 투과하지 못한다. 콜라겐 트리펩타이드는 피부투과 후 곧바로 서로 다시 연결됨으로써 손상된 콜라겐 조직을 복구하는 시간을 단축시키는데 기여한다. 또한, 섭취하였을 때에도 저분자 콜라겐보다 체내 흡수율이 높아 콜라겐의 생체 효능을 극대화시킬 수 있는 장점이 있다.
콜라겐 트리펩타이드 중 GPH(Gly-Pro-Hyp) 조합의 펩타이드 함량이 주목을 받고 있는데, GPH는 배양된 활막세포에서 섬유아세포에 화학주성으로 작용하고, 히알루론산의 생산을 촉진한다고 알려진 유효물질이다(Korean J. Food Sci. Technol. 41: 441-445 (2009)). 트리펩타이드 GPH는 Sprague-Dawley rat의 위액에서 2시간 동안 분해되지 않았고 소장의 세포층을 가로질러 전신순환계로 흡수된다는 것이 보고된 바 있다(J. Pept. Sci. 13: 468-474 (2007)).
일반적으로 콜라겐은 주로 소, 돼지, 생선, 오징어 등을 원료로 하며, 효소에 의해 가수분해되어 콜라겐 펩타이드 조성물을 얻을 수 있다. 그러나 일반적으로 사용되어지는 단백질 분해효소에 의해서는 트리펩타이드의 함량이 매우 낮아 고함량 트리펩타이드 조성물을 얻기에는 어려움이 있었다. 따라서 트리펩타이드, 구체적으로는 GPH를 고함량으로 포함하는 콜라겐 펩타이드 조성물을 제조하기 위한 효율적인 제조 방법이 꾸준히 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자는 콜라겐으로부터 GPH가 고함량으로 포함된 콜라겐 펩타이드를 제조할 수 있는 콜라겐 분해효소를 개발하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 토양 샘플에서 분리된 신규한 바실러스 투링기엔시스 균주가 GPH 생성능이 매우 뛰어난 콜라겐 분해효소를 생산한다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 콜라겐 분해효소를 생산하는 바실러스 투링기엔시스 NIS-1 (Bacillus thuringiensis NIS-1, 기탁번호 KCCM13010P)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신균주로부터 분리된 콜라겐 분해효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 상기 신규 균주를 배지에서 배양하고 배양액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양액으로부터 콜라겐 분해효소를 분리하는 단계를 포함하는, 콜라겐 분해효소 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 콜라겐 또는 젤라틴을 포함하는 조성물에 상기 신균주 또는 상기 신균주로부터 분리된 콜라겐 분해효소를 처리하는 단계; 및 (b) 20 내지 60℃에서 반응시키는 단계를 포함하는 콜라겐 펩타이드 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 콜라겐 펩타이드 제조방법에 따라 제조된 콜라겐 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 콜라겐 펩타이드를 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콜라겐 분해효소를 생산하는 바실러스 투링기엔시스 NIS-1 (Bacillus thuringiensis NIS-1, 기탁번호 KCCM13010P)을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 신균주로부터 분리된 콜라겐 분해효소를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 상기 신규 균주를 배지에서 배양하고 배양액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양액으로부터 콜라겐 분해효소를 분리하는 단계를 포함하는, 콜라겐 분해효소 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 콜라겐 또는 젤라틴을 포함하는 조성물에 상기 신균주 또는 상기 신균주로부터 분리된 콜라겐 분해효소를 처리하는 단계; 및 (b) 20 내지 60℃에서 반응시키는 단계를 포함하는 콜라겐 펩타이드 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 콜라겐 펩타이드 제조방법에 따라 제조된 콜라겐 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 콜라겐 펩타이드를 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 콜라겐 분해효소를 생산하는 바실러스 투링기엔시스 NIS-1 (Bacillus thuringiensis NIS-1, 기탁번호 KCCM13010P) 을 제공한다.
본 발명이 제공하는 상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 염기서열을 갖으며, 콜라겐을 분해하여 GPH 함량이 매우 높은 콜라겐 펩타이드를 제조하는 콜라겐 분해효소를 생성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에서, 본 발명자는 토양으로부터 콜라겐 분해효소 생성능을 나타내는 상기 신균주를 분리 및 동정하고 이의 활성을 확인한 후 이의 16s rRNA 염기서열을 분석한 결과 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis)와 99%의 서열 상동성을 나타내는 것으로 확인되었다. 이에, 상기 균주를 바실러스 투링기엔시스 NIS-1로 명명하고 이를 기탁번호 KCCM13010P로 기탁하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서, 본 발명자는 토양으로부터 분리된 다양한 바실러스 투링기엔시스들 중에서 본 발명에 따른 상기 신균주가 GPH 함량이 현저히 높은 콜라겐 펩타이드를 제조할 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 상기 바실러스 투링기엔시스 NIS-1로부터 분리된 콜라겐 분해효소를 제공한다.
본 발명의 상기 콜라겐 분해효소는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조가 되는 것을 특징으로 할 수 있다:
(a) 바실러스 투링기엔시스 NIS-1 (Bacillus thuringiensis NIS-1, 기탁번호 KCCM13010P)를 배지에서 배양하고 배양액을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 배양액으로부터 콜라겐 분해효소를 분리하는 단계.
본 발명에서, 상기 "배양액"은 상기 균주를 배양한 세포 배양 상등액을 지칭한다. 상기 배양액은 바실러스 투링기엔시스 NIS-1의 배양 과정에서 세포로부터 분비되는 여러가지 생리활성 물질을 함유하고 있으며, 이에는 콜라겐 분해효소가 포함된다.
본 발명의 상기 (a) 단계에서 균주를 배양하는 다양한 조건들, 예를 들어 배지의 종류, 배지의 첨가물, 배지의 pH, 배양 온도, 배양 기간 등은 특별히 제한되지 않으며, 상기 균주가 생존하여 콜라겐 분해효소를 생산할 수 있는 배양 조건은 통상의 기술자가 반복적인 실험을 통해 용이하게 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일양태에서, 상기 (a) 단계의 배양은 20 내지 40
및 pH 5 내지 9에서 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 20 내지 30
및 pH 6 내지 8에서 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 수득한 배양액을 원심분리하여 상등액을 수집한 후 이를 제균, 여과하여 농축하거나 또는 크로마토그래피를 수행하여 콜라겐 분해효소를 분리할 수 있으나, 그 방법은 이에 제한되는 것은 아니며 배양액으로부터 효소 등 단백질을 분리/정제하기 위해 당업계에서 사용되는 일반적인 방법이라면 모두 본 발명의 상기 (b) 단계에 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 콜라겐 또는 젤라틴을 포함하는 조성물에 바실러스 투링기엔시스 NIS-1 또는 바실러스 투링기엔시스 NIS-1로부터 분리된 콜라겐 분해효소를 처리하는 단계; 및 (b) 20 내지 60℃에서 반응시키는 단계를 포함하는 콜라겐 펩타이드 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 콜라겐 펩타이드란 고분자량의 콜라겐을 가수분해하여 생성된 저분자량의 콜라겐 가수분해물을 의미하는 것으로, 평균 분자량 500 내지 2,000의 펩타이드를 의미하는 것일 수 있다. 본 발명이 제공하는 상기 콜라겐 펩타이드 제조방법에 따르면 GPH(Gly-Pro-Hyp)를 포함하는 콜라겐 펩타이드가 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 (a) 단계에서 상기 콜라겐 또는 젤라틴은 동물성, 식물성 또는 해양성 생물로부터 추출된 것을 특징으로 할 수 있다. 동물성, 식물성 또는 해양성 생물로부터 콜라겐을 추출하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 동물성, 해양성 또는 식물성 생물을 전처리, 열탕처리, 지육분리, 탈취(활성탄처리)하는 단계를 수행함으로써 콜라겐 또는 젤라틴을 수득할 수 있다.
본 발명에서 상기 해양성 생물 유래 콜라겐은 어류, 어류 비늘, 어피, 연체동물 및 갑각류 등으로부터 추출하여 얻을 수 있다. 해양성 생물 유래 콜라겐은 특유의 비린 냄새를 내고 보관 중에 쉽게 변질되면서 악취를 내므로 제조 과정에서 활성탄, 아황산(Meta-Bisulfite) 또는 오존(Ozone)으로 탈취하여 원료로 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에서 상기 식물성 생물 유래 콜라겐은 당근, 홍삼, 솔잎, 참깨, 팽이버섯, 느타리버섯 등으로부터 추출하여 얻을 수 있다.
본 발명에서 상기 동물성 생물 유래 콜라겐은 돈피, 우피, 돈골 및 우골 등으로부터 추출하여 얻을 수 있다.
본 발명의 콜라겐 펩타이드 제조방법은 콜라겐 또는 젤라틴을 포함하는 배지 또는 수용액에 바실러스 투링기엔시스 NIS-1를 접종하여 배양하거나 또는 바실러스 투링기엔시스 NIS-1로부터 분리된 콜라겐 분해효소를 접종하여 반응시킴으로써 콜라겐 펩타이드가 제조될 수 있다.
상기 (b) 단계에서 반응은 20 내지 60℃에서 1시간 내지 3일간 수행될 수 있다.
상기 (a) 단계에서 콜라겐 또는 젤라틴을 포함하는 조성물에 바실러스 투링기엔시스 NIS-1를 처리한 경우에는 20 내지 40℃, 바람직하게는 20 내지 35℃, 보다 더 바람직하게는 25 내지 35℃, 가장 바람직하게는 28 내지 35℃의 온도 조건에서 반응이 진행될 수 있다.
상기 (a) 단계에서 콜라겐 또는 젤라틴을 포함하는 조성물에 바실러스 투링기엔시스 NIS-1로부터 분리된 콜라겐 분해효소를 처리한 경우에는 40 내지 60℃, 바람직하게는 45 내지 60℃, 보다 더 바람직하게는 45 내지 55℃, 가장 바람직하게는 47 내지 53℃의 온도 조건에서 반응이 진행될 수 있다.
상기 (b) 단계 이후에 콜라겐 분해효소를 불활성화 시키는 단계가 추가로 수행될 수 있으며, 효소를 불활성화 시키는 방법은, 예를 들어 고온의 열처리 등 공지의 방법이 제한없이 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법에 따라 제조된 콜라겐 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 콜라겐 펩타이드를 포함하는 피부 주름개선, 피부 탄력개선 또는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 "피부 주름개선” 및 “피부 탄력개선"과 관련하여, 주로 진피 속의 탄력섬유, 결합직섬유, 근육섬유의 퇴화 등 노화에 의해 피부 탄력이 떨어지고 피부가 접히는 현상을 주름이라고 하며, 이를 방지하기 위해 콜라겐 합성 촉진 등을 통해 이미 생성된 피부 주름을 개선시키거나 또는 주름 생성을 방지하는 것을 의미한다.
상기 "보습"은 피부에 수분을 더하고 유지시켜주는 것을 의미한다.
본 발명의 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태일 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다. 상기 화장료 조성물은 제형에 따라서 통상적으로 사용되는 성분을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 콜라겐 펩타이드에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제, 세정제 등과 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 상기 콜라겐 펩타이드를 포함할 수 있을 것이다. 반면, 유효성분이 장기간 동안 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림, 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 콜라겐 펩타이드를 포함해도 무방할 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 한 구체예에서, 상기 조성물은 상기 콜라겐 펩타이드를 전체 조성물 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 10 중량%(바람직하게는 0.01 중량% 내지 5 중량%)로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물이 상기 콜라겐 펩타이드를 0.001 중량% 미만으로 포함할 경우에는 충분한 피부 노화, 피부 주름, 탄력 저하 및 피부 내 수분 저하 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 없고, 10 중량%를 초과하여 포함할 경우에는 알러지 등 원치 않는 반응이 발생하거나 피부 안전성에 문제가 있을 수 있으므로 이를 방지하기 위한 것이다.
또한 본 발명의 화장료 조성물은 콜라겐 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 화장품으로 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 콜라겐 펩타이드를 포함하는 피부 주름개선, 피부 탄력개선 또는 피부 보습용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 건강기능식품(health functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강 식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강 식품으로는 상기 콜라겐 펩타이드를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 콜라겐 펩타이드와 주름개선, 항노화, 피부탄력 증진 및 피부 보습효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 콜라겐 펩타이드를 첨가하여 제조할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 상기 콜라겐 펩타이드 및 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는 건강기능식품(health functional food)을 제공한다. 본 발명에서 정의되는 건강기능식품은 2008년 개정된 건강기능식품에 관한 법률을 통하여 새롭게 정의된 인체에 대한 기능성 및 안전성이 충분하게 확립되어 식품의약품안전청 식약청 고시 제2008-72호에 규정된 건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정에 수재된 건강기능식품임을 의미한다.
이러한 건강기능식품은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강보조식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 침제, 액제, 엑스제, 껌, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제로는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
또한 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 더 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 단당류(예: 포도당, 과당 등), 이당류(예: 말토즈, 수크로즈 등), 다당류(예: 덱스트린, 시클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 함유될 수 있다. 또한, 향미제로서 천연 향미제(예: 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예: 사카린, 아스파탐 등)를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 콜라겐 펩타이드를 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 콜라겐 펩타이드의 바람직한 함량은 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 90 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량% 범위로 함유될 수 있다.
본 발명의 신균주가 생성하는 콜라겐 분해효소는 GPH 함량이 매우 높은 콜라겐 펩타이드 제조가 가능하여 피부 주름개선, 피부 탄력개선 및 피부 보습 효능이 매우 뛰어난 화장료 및 식품 조성물 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 선별된 신규 균주의 GPH 생성능을 HPLC를 이용해 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명에서 선별된 신규 균주의 동정 결과 바실러스 투링기엔시스와 99%의 서열상동성을 나타낸다는 것을 확인한 결과이다.
도 3은 토양에서 분리된 다양한 바실러스 투링기엔시스 균주들 중에서 본 발명에서 선별된 균주(2번)가 GPH 생성능이 가장 우수하다는 것을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에서 선별된 신규 균주를 희석배수가 서로 다른 LB 배지에서 배양한 후 콜라겐 분해효소의 발현량을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에서 선별된 신규 균주를 다양한 온도 조건에서 배양한 후 콜라겐 분해효소의 발현량을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 선별된 신규 균주를 다양한 pH 조건에서 배양한 후 콜라겐 분해효소의 발현량을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에서 선별된 신규 균주로부터 콜라겐 분해효소를 분리하고 정제하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 선별된 신규 균주의 동정 결과 바실러스 투링기엔시스와 99%의 서열상동성을 나타낸다는 것을 확인한 결과이다.
도 3은 토양에서 분리된 다양한 바실러스 투링기엔시스 균주들 중에서 본 발명에서 선별된 균주(2번)가 GPH 생성능이 가장 우수하다는 것을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에서 선별된 신규 균주를 희석배수가 서로 다른 LB 배지에서 배양한 후 콜라겐 분해효소의 발현량을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에서 선별된 신규 균주를 다양한 온도 조건에서 배양한 후 콜라겐 분해효소의 발현량을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 선별된 신규 균주를 다양한 pH 조건에서 배양한 후 콜라겐 분해효소의 발현량을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에서 선별된 신규 균주로부터 콜라겐 분해효소를 분리하고 정제하는 과정을 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: GPH를 고효율로 생산하는 콜라겐 분해효소를 보유한 신균주 선별
경상북도 고령 지역 토양 샘플을 채취하여 토양 30 g을 270 ml의 멸균된 생리식염수에 넣고 충분히 섞어 1차 희석액을 제조하였다. 상등액 1 ml을 9 ml의 멸균된 생리식염수에 넣고 충분히 섞어 2차 희석액을 제조하고, 다시 동일 작업을 반복하여 3차, 4차, 5차, 6차 희석액을 제조하였다.
준비된 2~6차 희석액 200 μl를 1.5% 한천(agar)이 포함된 LB (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) 고체배지에 도말하여 30℃에서 48시간 배양한 다음, 모양과 색이 다른 콜로니들을 확보하였다.
확보한 균주들을 0.5% 젤라틴과 1.5% 한천이 포함된 LB 고체배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 다음, 30% trichloroacetic acid를 처리하였을 때 투명환(clear zone)이 생기는 콜로니를 선별하였다.
선별된 균주들을 LB 액체 배지에 접종하여 30℃에서 180 rpm으로 24시간 배양한 후 상등액을 취하여 GPH 생산효소의 활성을 확인하였다.
활성 확인 방법은 다음과 같다. 멸균된 젤라틴 1%를 포함한 버퍼 (50 mM Tris-HCl(pH7.4), 5 mM CaCl2)에 채취한 배양 상등액을 최종 20%가 되도록 넣고 50℃에서 130 rpm으로 1시간 반응한 다음, 80℃에서 5분간 끓여 반응을 정지하였다. 반응물의 분석은 High-performance liquid chromatography(시세이도)를 이용하였으며, YMC-Pack Pro C18 (250 X 4.6 mml.D. S-5 μm, 12 nm) 컬럼, 이동상(A: 0.1% TFA, B: ACN), 유속 0.5 ml/min의 조건에서 진행하였으며, 이를 통해 GPH의 생산능을 확인하였다(도 1).
그 중, GPH 생산능이 가장 우수한 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석을 통해 균주를 동정하였다. 16S rRNA 염기서열 분석 결과(서열번호 1) 상기 균주는 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis)와 99%의 상동성을 나타내었으며(도 2), 바실러스 투링기엔시스 종에 속하는 다수의 다른 미생물과 비교하였을 때, 본 발명에서 선별된 균주(2번 균주)가 현저히 향상된 효소 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 2: 신규 콜라겐 분해효소의 발현조건 확립
상기 실시예 1에서 선별한 바실러스 투링기엔시스 유래 콜라겐 분해효소의 최적 발현 조건을 확립하고자 하였다.
최적 배지 조건을 확인하기 위해 LB 배지를 희석하여 배양을 진행한 다음 상등액의 효소 활성을 확인하였다. 도 4에서 도시된 바에 같이, 실험 결과 0.75X LB(0.75% tryptone, 0.375% yeast extract, 0.75% NaCl)에서 효소 발현량이 가장 많은 것으로 확인되었다.
최적 온도를 확인하기 위해 25~37℃의 온도에서 배양을 진행한 다음 상등액의 효소 활성을 확인하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 실험 결과 25℃에서 효소 발현량이 가장 많은 것으로 확인되었다.
최적 pH를 확인하기 위해 pH 5~9에서 배양을 진행한 다음 상등액의 효소 활성을 확인하였다. 배지의 적정에는 아세트산과 수산화나트륨이 이용되었다. 도 6에 도시된 바와 같이, 실험 결과 중성 pH에서 효소 발현량이 많았으며, pH를 적정하기 위해 넣은 산과 염기에 의해 효소 발현이 저해되는 양상이 확인되었으므로 별다른 적정없이 배양을 진행하는 것이 바람직하였다.
실시예 3: 신규 콜라겐 분해효소의 정제
상기 실시예 1에서 선별한 바실러스 투링기엔시스 유래 콜라겐 분해효소의 정제를 시도하였다. 전배양한 균주를 0.75X LB에 1% 접종한 다음 25℃에서 공기를 0.5vvm으로 공급하고 120rpm으로 교반하며 18시간동안 배양하였다. 배양액을 원심분리 및 제균한 다음 10 kDa filter를 이용해 한외여과를 수행하여 농축 및 정제하였다(도 7).
본 발명의 신균주가 생성하는 콜라겐 분해효소는 GPH 함량이 매우 높은 콜라겐 펩타이드 제조가 가능하여 피부 주름개선, 피부 탄력개선 및 피부 보습 효능이 매우 뛰어난 화장료 및 식품 조성물 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
<110> NewTree Co., Ltd
<120> Bacillus thuringiensis NIS-1 producing collagenase and uses
thereof
<130> NP21-0035
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1496
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16s rRNA of Bacillus thuringiensis NIS-1
<400> 1
tctgctcagg atgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg aatggattga 60
gagcttgctc tcaagaagtt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat 120
aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga taacattttg aactgcatgg 180
ttcgaaattg aaaggcggct tcggctgtca cttatggatg gacccgcgtc gcattagcta 240
gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg 300
ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360
gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggctt tcgggtcgta 420
aaactctgtt gttagggaag aacaagtgct agttgaataa gctggcacct tgacggtacc 480
taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540
gttatccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggtggt ttcttaagtc tgatgtgaaa 600
gcccacggct caaccgtgga gggtcattgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggaa 660
agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatat ggaggaacac cagtggcgaa 720
ggcgactttc tggtctgtaa ctgacactga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 780
agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc 840
tttagtgctg aagttaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa 900
actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960
acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgaaaac cctagagata gggcttctcc 1020
ttcgggagca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080
gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc catcattaag ttgggcactc 1140
taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc 1200
cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac aaagagctgc aagaccgcga 1260
ggtggagcta atctcataaa accgttctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca 1320
tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380
ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tggggtaacc 1440
tttttggagc cagccgccta aggtgggaca gatgattggg gtgaagtcga aaaggg 1496
Claims (11)
- 콜라겐 분해효소를 생산하는 바실러스 투링기엔시스 NIS-1 (Bacillus thuringiensis NIS-1, 기탁번호 KCCM13010P)
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
- 제1항의 균주로부터 분리된 콜라겐 분해효소.
- (a) 제1항 또는 제2항의 균주를 배지에서 배양하고 배양액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양액으로부터 콜라겐 분해효소를 분리하는 단계를 포함하는, 콜라겐 분해효소 제조방법.
- 제4항에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양은 20 내지 40℃ 및 pH 5 내지 9에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제4항에 있어서, 상기 (b) 단계 이후에 분리된 콜라겐 분해효소를 정제하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- (a) 콜라겐 또는 젤라틴을 포함하는 조성물에 제1항의 균주 또는 제3항의 콜라겐 분해효소를 처리하는 단계; 및 (b) 20 내지 60℃에서 반응시키는 단계를 포함하는 콜라겐 펩타이드 제조방법.
- 제7항에 있어서, 상기 콜라겐 또는 젤라틴은 동물성, 식물성 또는 해양성 생물로부터 추출된 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제7항에 있어서, 상기 (b) 단계 이후에 콜라겐 분해효소를 불활성화 시키는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제7항에 있어서, 상기 콜라겐 펩타이드는 GPH(Gly-Pro-Hyp)를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제7항의 방법에 따라 제조된 콜라겐 펩타이드.
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