KR20190034121A - 재조합 효모 균주 - Google Patents

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KR20190034121A
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leu
glu
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KR1020180113807A
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리신 다이
크리스틴 루블링-자스
데이비드 토마스 윌리엄슨
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모던 메도우 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 유전자 조작된 효모 균주 및 재조합 단백질(예컨대, 콜라겐)을 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 단백질은 재조합되거나 조작된 콜라겐을 함유하는 생제작된 가죽 또는 가죽-유사 특성이 있는 물질을 생성하기 위하여 사용된다. 효모 균주가 아스코르베이트를 생성하고 및/또는 α 케토글루타레이트의 생성 증가를 위해 사용된다.

Description

재조합 효모 균주{RECOMBINANT YEAST STRAINS}
관련출원의 상호 참조
본 출원은 미국 특허 출원 제15/433,566호 명칭 Biofabricated Material Containing Collagen Fibrils, 제15/433,650호 명칭 Method for Making a Biofabricated Material Containing Collagen Fibrils, 제62/526,912호 명칭 Recombinant Yeast Strains, 및 제62/539,213호 명칭 Yeast Strains and Method for Controlling Hydroxylation of Recombinant Collagen과 관련있으며, 제62/562,109호, 2017.9.22. 출원, 명칭 Recombinant Yeast Strains에 대한 우선권을 주장한다. 이들 출원의 모든 내용은 참조문헌으로 수록된다.
발명의 분야
본 발명은 효모의 유전자 조작된 균주 및 재조합 단백질과 탄수화물 생성 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 여기서 생제작된 가죽 물질, 생제작된 물질을 포함하는 물품, 및/또는 재조합되거나 조작된 콜라겐을 함유하는 가죽-유사 특성을 갖는 물질을 생성하기 위하여 사용될 수 있는 효모의 유전자 조작된 균주 및 재조합 콜라겐 생성 방법을 제공한다. 효모 균주는 예컨대 GDP-L-Gal 포스포릴라제, 이노시톨-포스페이트 포스파타제, GDP-만노스-3,5-에피머라제 및/또는 L-굴로노-1,4-락톤옥시다제, 알도노락토나제, 글루쿠로노 락톤리덕타제, D-글루쿠로네이트 리덕타제, 우로노락토나제, D-글루쿠로노 키나제, 글루쿠로네이트-1-포스페이트 우리딜일트란스퍼라제, UDP-D-글루코오스 데하이드로제나제, UTP- 글루코오스-1-포스페이트 우리딜일트란스퍼라제, 포스포글루코뮤타제, 및/또는 헥소키나제를 활성화시키는 아스코르베이트 합성 경로를 가능하게 하는 α 케토글루타레이트 수송체 (kgtP) 및/또는 하나 이상의 폴리펩티드의 사용을 통한 수산화 반응을 향상시킴으로써 증가된 양의 수산화된 단백질(예컨대, 콜라겐) 및 탄수화물을 생성하도록 조작된다.
관련 기술의 설명
가죽(leather)은 가구 덮개, 의류, 신발, 여행 가방, 핸드백 및 액세서리, 그리고 자동차 용품을 포함하여 매우 다양한 응용분야에서 사용된다. 가죽의 예상 세계 무역 가치는 연간 약 1,000억 달러이며(Future Trends in the World Leather Products Industry and Trade, 유엔 산업 개발기구, 비엔나, 2010) 가죽 제품에 대한 수요가 지속적으로 증가하고 있다. 전통적인 가죽 생성은 동물 가죽 및 화학물질과 관련하여 낭비적이다. 가죽 제품에 대한 지속적이고 증가하는 수요에 발맞춰 동물 가죽에 대한 수요가 증가함에 따라 점점 더 긴장된 식품 공급원에 대한 추가 압력이 가중되는 한편, 화학 폐기물은 계속해서 우리의 침식 환경 조건에 기여한다. 따라서, 이러한 요구를 충족시키는 새로운 방법이 가죽 생성의 경제적, 환경적 및 사회적 비용 측면에서 필요하다. 기술적 및 미적 경향에 발맞춰, 가죽 제품의 생산자 및 사용자는 우수한 강도, 균일성, 가공성 및 자연 구성 요소를 통합하는 세련되고 매력적인 미적 속성을 나타내는 새로운 물질을 찾는다.
인구 증가와 지구 환경을 감안할 때, 가죽-유사 미학과 향상된 기능성을 가진 대체 물질이 필요하다. 가죽은 동물 가죽이며 거의 전적으로 콜라겐으로 이루어져 있다. 생제작된 물질에 내포될 수 있는 콜라겐의 새로운 원료에 대한 필요성이 제기되고 있다.
재조합-발현 콜라겐을 이용한 생제작된 물질의 생성은 콜라겐을 다양한 상업적 응용에 필요한 형태와 양으로 효율적으로 생성하는 방법의 필요성을 포함하여 많은 어려움에 직면해 있다. 일부 응용품의 경우, 더욱 부드럽고 침투성이 좋은 콜라겐 성분이 바람직하며; 다른 것들은 더욱 단단하고, 더욱 저항력이 있고 내구성이 있는 콜라겐 성분이 필요하다.
본 발명자들은 α 케토글루타레이트 수송체를 제공하는 kgtP 유전자 및/또는 재조합 효모 세포가 아스코르베이트를 생성하도록 작용하는 아스코르베이트 합성 경로를 가능하게 하는 하나 이상의 유전자에 의해 재조합 효모를 조작함으로써 이러한 과제를 해결하고자 하였다.
발명의 개요
본 발명의 하나의 양상은 α 케토글루타레이트 수송체를 함유하는 변형된 효모 세포에 관한 것이다. 변형은 효모가 α 케토글루타레이트 수송체를 제조할 수 있게 하는 효모로 kgtP 유전자를 형질전환시키는 것을 포함한다. 효모 세포는 또한 프롤린 및/또는 라이신 잔기를 수산화시켜 하이드록시프롤린, 3-하이드록시프롤린(Hyp) 및 하이드록시라이신(Hyl)을 산출하고, 하이드록시라이실 잔기의 글리코실화를 야기하는 단백질을 발현 및/또는 과발현하도록 변형될 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 본 발명은 효모 내 수산화된 단백질(예컨대, 콜라겐)과 같은 단백질 또는 탄수화물의 생성을 향상시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 kgtP 유전자, 단백질용 DNA 또는 프로모터용 탄수화물 및 DNA, 터미네이터, 및 마커를 효모에 삽입(예컨대, 형질전환 또는 유전적으로 통합)시켜 상기 효모가 α 케토글루타레이트 수송체 및 상기 단백질 또는 탄수화물을 생성하도록 하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 프롤린 및/또는 라이신 잔기를 수산화시키는 단백질을 발현하는 유전자를 삽입시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 아스코르베이트를 생성하는 변형된 효모 세포에 관한 것이다. 변형은 아스코르베이트 합성 경로가 작동하도록 하는 유전자를 삽입하는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 아스코르베이트를 생성하는 변형된 효모 세포 생성 방법을 제공한다. 상기 방법은 기능성 아스코르베이트 합성 경로를 완결하는데 필요한 유전자를 삽입하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에서, 효모 세포에 공급된 아스코르베이트 경로 전구체의 하류에서 아스코르베이트 합성 경로의 일부분을 위한 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 삽입하는 것만이 필요하다는 것을 알 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 배지에서 변형된 효모 세포를 성장시키는 것을 포함하여 효모 세포에서 세포내 아스코르베이트를 생성하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 일정한 양의 세포내 아스코르베이트를 갖는 변형된 효모 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 α 케토글루타레이트 수송체를 함유하고 아스코르베이트를 생성하는 변형된 효모 세포에 관한 것이다. 효모 세포는 또한 프롤린 및/또는 라이신 잔기를 수산화시켜 하이드록시프롤린, 3-하이드록시프롤린(Hyp) 및 하이드록시라이신(Hyl)을 산출하고, 하이드록시라이실 잔기의 글리코실화를 야기하는 단백질을 발현 및/또는 과발현하도록 변형될 수 있다. 상기 방법은 기능성 아스코르베이트 합성 경로를 완결하는데 필요한 유전자 및 α 케토글루타레이트 수송체를 효모에 삽입하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 프롤린 및/또는 라이신 잔기를 수산화시키는 단백질을 발현하는 유전자를 삽입시키는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 배지에서 변형된 효모 세포를 성장시키는 것을 포함하여 효모 세포에서 세포내 아스코르베이트를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 본 발명은 아스코르베이트를 생성하는 α 케토글루타레이트 수송체를 함유하는 예컨대 수산화된 콜라겐과 같은 단백질 또는 탄수화물의 효모 내 생성을 향산시키는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에서 설명되고 예시되는 바와 같이, 효모 세포(예컨대, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris ))는 상이한 수산화도를 갖는 재조합 유형 III 소의 콜라겐(recombinant Type III bovine collagen)을 발현하는데 사용될 수있다. 재조합 콜라겐의 수산화(Hydroxylation)는 소의 P4HA(bovine P4HA) 및 소의 P4HB(bovine P4HB)의 동시-발현에 의해 수행되며, 이들은 각각 알파 및 베타 서브유닛 소의 프롤릴-4-하이드록실라제를 인코딩한다. 그렇지만, 본 발명은 유형 III 콜라겐의 생성물 및 발현에 한정되지 않고 또 다른 단백질 또는 탄수화물, 또 다른 종류의 콜라겐의 서브유닛을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해서 뿐만 아니라 프롤린 잔기, 라이신 잔기, 또는 프롤린 및 라이신 잔기 둘 모두를 수산화시키는 효소에 의해 수행될 수 있다. 유형 III 트로포콜라겐은 호모트리머이다. 그렇지만, 일부 구체예에서 콜라겐은 예컨대 2개의 프로- α1(I) 사슬 및 1개의 프로-α2(I) 사슬로 최초 구성된 유형 I 콜라겐과 같은, 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성된 헤테로트리머를 구성할 것이다.
콜라겐. 콜라겐은 가죽의 주된 구성요소이다. 피부, 또는 동물 가죽은 상당한 양의 콜라겐, 섬유질 단백질을 함유한다. 콜라겐은 적어도 28개의 구별되는 콜라겐 유형의 패밀리에 대한 일반적인 용어이며; 다른 유형의 콜라겐이 유형 III 콜라겐을 비롯한 가죽을 형성하는데 사용될 수 있지만 동물 피부는 일반적으로 유형 I 콜라겐이다. 용어 "콜라겐"은 처리되지 않은 것(예컨대, 프로콜라겐) 뿐만 아니라 번역-후 변형되고 단백질분해된 삼중 나선 구조를 갖는 콜라겐을 포함한다.
콜라겐은 아미노산의 반복적인 삼중항 -(Gly-X-Y)n- 으로 특징지어지며, 콜라겐의 아미노산 잔기의 약 1/3은 글리신이다. X는 종종 프롤린이며 Y는 종종 하이드록시프롤린이지만, 최대 400개의 가능한 Gly-X-Y 삼중항이 있을 수 있다. 상이한 동물은 콜라겐의 상이한 아미노산 조성을 생성할 수 있으며, 이는 결과적인 가죽의 상이한 특성 및 차이를 초래할 수 있다.
콜라겐의 구조는 길이가 다른 세 개의 얽힌 펩티드 사슬로 구성될 수 있다. 콜라겐 삼중 나선(또는 모노머)은 약 1,050개의 아미노산 길이의 알파-사슬로부터 생성될 수 있으므로, 삼중 나선은 약 300 nm 길이의 막대 형태로 약 1.5 nm의 직경을 갖는다.
콜라겐 섬유는 동물 가죽의 종류에 따라 다양한 직경을 가질 수 있다. 유형 I 콜라겐 이외에도, 피부(가죽)는 유형 III 콜라겐(레티쿨린), 유형 IV 콜라겐, 및 유형 VII 콜라겐을 비롯한 콜라겐의 다른 유형을 포함할 수 있다. 다양한 유형의 콜라겐이 포유동물 몸 전반에 존재한다. 예를 들어, 피부와 동물 가죽의 주요 성분이 되는 것 이외에, 유형 I 콜라겐은 또한 연골, 힘줄, 혈관 합자, 장기, 근육, 및 뼈의 유기 부분에 존재한다. 콜라겐을 동물 피부 또는 가죽뿐만 아니라 포유동물 몸의 여러 부위에서 분리하기 위한 성공적인 노력이 이루어졌다. 수십 년 전에, 연구진은 중성 pH에서, 산-가용화 콜라겐이 원래의 조직에서 관찰된 동일한 교차-줄무늬 모양으로 구성된 피브릴에 자기 조립된다는 것을 발견했다; Schmitt F.O. J. Cell. Comp Physiol. 1942;20:11). 이것은 조직 공학 및 다양한 생의학 응용분야에서 콜라겐의 사용을 유발하였다. 최근 몇 년 동안, 콜라겐은 재조합 기술을 사용하여 박테리아와 효모로부터 수확되었다.
콜라겐은 예컨대 염 다리결합, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 쌍극자-쌍극자 힘, 분극력, 소수성 상호작용, 및 효소 반응에 의해 종종 촉매 작용을 받는 공유 결합과 같은 정전기 상호작용을 포함하는 물리적 및 화학적 상호작용의 조합을 통해 형성되고 안정화된다. 다양한 별개의 콜라겐 유형이 소, 양, 돼지, 닭, 및 인간 콜라겐을 비롯한 척추동물에서 확인되었다.
일반적으로, 콜라겐 유형은 로마 숫자로 번호가 매겨지며, 각 콜라겐 유형에서 발견되는 사슬은 아라비아 숫자로 식별된다. 자연적으로 발생하는 콜라겐의 다양한 상이한 유형의 구조 및 생물학적 기능에 대한 상세한 설명은 당해 기술 분야에서 이용 가능하다; 참조, 예컨대, Ayad et al. (1998) The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press, San Diego, CA; Burgeson, R E., 및 Nimmi (1992) "Collagen types: Molecular Structure and Tissue Distribution" in Clin. Orthop. 282:250-272; Kielty, C. M. et al. (1993) "The Collagen Family: Structure, Assembly And Organization In The Extracellular Matrix," Connective Tissue And Its Heritable Disorders, Molecular Genetics, And Medical Aspects, Royce, P. M. and B. Steinmann eds., Wiley-Liss, NY, pp. 103-147; 및 Prockop, D.J- and K.I. Kivirikko (1995) "Collagens: Molecular Biology, Diseases, and Potentials for Therapy," Annu.Rev. Biochem., 64:403-434.)
유형 I 콜라겐은 생물체의 총 콜라겐의 약 80-90%를 구성하는 뼈와 피부의 주요 피브릴라 콜라겐이다. 유형 I 콜라겐은 다세포 생물체의 세포외 기질에 존재하는 주요 구조 거대분자이며 총 단백질 질량의 약 20%를 차지한다. 유형 I 콜라겐은 각각 COL1A1 및 COL1A2 유전자에 의해 인코딩된 2개의 α1(I) 사슬 및 1개의 α2(I) 사슬을 포함하는 헤테로트리메틱 분자이다. 생체 내에서, 유형 I 콜라겐 피브릴, 섬유, 및 섬유 다발의 조립은 발달 중에 이루어지며 조직에 기계적 지지를 제공하면서 세포 운동성 및 영양소 수송을 허용한다. 또 다른 콜라겐 유형은 유형 I 콜라겐보다 덜 풍부하며 상이한 분포 패턴을 나타낸다. 예를 들어, 유형 II 콜라겐은 연골과 유리액(vitreous humor)에서 지배적인 콜라겐이며, 한편 유형 III 콜라겐은 혈관 내에서 높은 수준에서 발견되며 피부에서는 더 적게 나타난다.
유형 II 콜라겐은 COL2A1 유전자에 의해 인코딩된 3개의 동일한 al(II) 사슬을 포함하는 호모트리머 콜라겐이다. 정제된 유형 II 콜라겐은 해당 업계에서 공지된 방법, 예를 들어 Miller and Rhodes (1982) Methods In Enzymology 82:33-64에 개시된 과정에 의해 조직으로부터 생성될 수 있다.
유형 III 콜라겐은 피부와 혈관 조직에서 발견되는 주요 피브릴라 콜라겐이다. 유형 III 콜라겐은 COL3A1 유전자에 이해 인코딩된 3개의 동일한 α1(III) 사슬을 포함하는 호모트리머 콜라겐이다. COL3A1 유전자는 숙주 세포, 예를 들어 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(SEQ ID NO: 10)에서의 발현을 위해 최적화 될 수 있다. 조직으로부터 유형 III 콜라겐을 정제하는 방법은 예를 들어, Byers et al. (1974) Biochemistry 13:5243-5248; 및 Miller and Rhodes, supra.에서 찾을 수 있다.
유형 IV 콜라겐은 피브릴보다는 시트 형태로 기저막(basement membrane)에서 발견된다. 가장 일반적으로, 유형 IV 콜라겐은 2개의 α1(IV) 사슬과 1개의 α2(IV) 사슬을 포함한다. 유형 IV 콜라겐을 포함하는 특정 사슬은 조직-특이적이다. 유형 IV 콜라겐은 예를 들어, Furuto and Miller (1987) Methods in Enzymology, 144:41-61, Academic Press에 개시된 과정을 사용하여 정제될 수 있다.
유형 V 콜라겐은 주로 뼈, 힘줄, 각막, 피부, 및 혈관에서 발견되는 피브릴라 콜라겐이다. 유형 V 콜라겐은 호모트리머 및 헤테로트리머 형태 둘 모두로 존재한다. 유형 V 콜라겐의 하나의 형태는 2개의 α1(V) 사슬 및 1개의 α2(V) 사슬의 헤테로트리머이다. 유형 V 콜라겐의 또 다른 형태는 α1(V), α2(V), 및 α3(V) 사슬의 헤테로트리머이다. 유형 V 콜라겐의 또 다른 형태는 α1(V)의 호모트리머이다. 천연 자원으로부터 유형 V 콜라겐을 분리하는 방법은 예를 들어, Elstow and Weiss (1983) Collagen Rel. Res. 3:181-193, 및 Abedin et al. (1982) Biosci. Rep. 2:493-502에서 찾을 수 있다.
유형 VI 콜라겐은 작은 삼중 나선 영역과 두 개의 큰 비-콜라겐 잔기 부분을 가지고 있다. 유형 VI 콜라겐은 α1(VI), α2(VI), 및 α3(VI) 사슬을 포함하는 헤테로트리머이다. 유형 VI 콜라겐은 많은 결합 조직에서 발견된다. 천연 자원으로부터 유형 VI 콜라겐을 정제하는 방법의 설명은 예를 들어, Wu et al. (1987) Biochem. J. 248:373-381, 및 Kielty et al. (1991) J. Cell Sci. 99:797-807에서 찾을 수 있다.
유형 VII 콜라겐은 특정 상피 조직에서 발견되는 피브릴라 콜라겐이다. 유형 VII 콜라겐은 3개 α1(VII) 사슬의 호모트리머 분자이다. 조직으로부터 유형 VII 콜라겐을 정제하는 방법의 설명은 예를 들어, Lunstrum et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:9042-9048, 및 Bentz et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3168-3172에서 찾을 수 있다. 유형 VII 콜라겐은 각막의 데스메막(Descemet's membrane)에서 발견될 수 있다. 유형 VIII 콜라겐은 2개 α1(VIII) 사슬 및 1개 α2(VIII) 사슬을 포함하는 헤테로트리머이며, 한편 또 다른 사슬 조성이 보고되었다. 자연으로부터 유형 VIII 콜라겐의 정제 방법은 예를 들어, Benya and Padilla (1986) J. Biol. Chem. 261:4160-4169, 및 Kapoor et al. (1986) Biochemistry 25:3930-3937에서 찾을 수 있다.
유형 IX 콜라겐은 연골과 유리액에서 발견되는 피브릴-관련 콜라겐이다. 유형 IX 콜라겐은 α1(IX), α2(IX), 및 α3 (IX) 사슬을 포함하는 헤테로트리머 분자이다. 유형 IX 콜라겐은 비-삼중 나선 도메인에 의해 분리된 몇 개의 삼중 나선 도메인을 처리하는, FACIT (단속성 삼중 나선을 갖는 피프릴 관련 콜라겐(Fibril Associated Collagens with Interrupted Triple Helices)) 콜라겐으로 분류되었다. 유형 IX 콜라겐을 정제하는 과정은 예를 들어, Duance, et al. (1984) Biochem. J. 221:885-889; Ayad et al. (1989) Biochem. J. 262:753-761; 및 Grant et al. (1988) The Control of Tissue Damage, Glauert, A. M., ed., Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp. 3-28에서 찾을 수 있다.
유형 X 콜라겐은 α1(X) 사슬의 호모트리머 화합물이다. 유형 X 콜라겐은 예를 들어, 성장판에서 발견되는 비대성 연골로부터 분리되었다; 참조, 예컨대, Apte et al. (1992) Eur J Biochem 206 (1):217-24.
유형 XI 콜라겐은 유형 II 및 유형 IX 콜라겐과 관련된 연골 조직, 및 신체의 다른 부위에서 발견될 수 있다. 유형 XI 콜라겐은 α1(XI), α2(XI), 및 α3(XI) 사슬을 포함하는 헤테로트리머 분자이다. 유형 XI 콜라겐을 정제하는 방법은 예를 들어, Grant et al., supra에서 찾을 수 있다.
유형 XII 콜라겐은 주로 유형 I 콜라겐과 관련하여 발견되는 FACIT 콜라겐이다. 유형 XII 콜라겐은 3개 α1(XII) 사슬을 포함하는 호모트리머 분자이다. 유형 XII 콜라겐 및 그 변이체의 정제 방법은 예를 들어, Dublet et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:13150-13156; Lunstrum et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20087-20092; 및 Watt et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20093-20099에서 찾을 수 있다. 유형 XIII은 예를 들어, 피부, 장, 뼈, 연골, 및 가로무늬근에서 발견되는 비-피브릴라 콜라겐이다. 유형 XIII 콜라겐의 상세한 설명은 예를 들어, Juvonen et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 24700-24707에서 찾을 수 있다.
유형 XIV는 α1(XIV) 사슬을 포함하는 호모트리머 분자로서 특징되는 FACIT 콜라겐이다. 유형 XIV 콜라겐을 분리하는 방법은 예를 들어, Aubert- Foucher et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:15759-15764, 및 Watt et al., supra에서 찾을 수 있다.
유형 XV 콜라겐은 구조에 있어서 유형 XVIII 콜라겐과 상동성이다. 천연 유형 XV 콜라겐의 구조 및 분리에 대한 정보는 예를 들어, Myers et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10144-10148; Huebner et al. (1992) Genomics 14:220- 224; Kivirikko et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:4773-4779; 및 Muragaki, J. (1994) Biol. Chem. 264:4042-4046에서 찾을 수 있다.
유형 XVI 콜라겐은 예를 들어, 피부, 폐 섬유아세포, 및 각질형성세포(keratinocyte)에서 발견되는 피브릴-관련 콜라겐이다. 유형 XVI 콜라겐 및 유형 XVI 콜라겐을 인코딩하는 유전자의 구조에 관한 정보는 예를 들어, Pan et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6565-6569; 및 Yamaguchi et al. (1992) J. Biochem. 112:856-863에서 찾을 수 있다.
유형 XVII 콜라겐은 수포성 유사천포창 항원(bullous pemphigoid antigen)으로 또한 알려져 있는 반결합 횡단막(hemidesmosal transmembrane) 콜라겐이다. 유형 XVII 콜라겐 및 유형 XVII 콜라겐을 인코딩하는 유전자의 구조에 관한 정보는 예를 들어, Li et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(12):8825-8834; 및 McGrath et al. (1995) Nat. Genet. 11(1):83-86에서 찾을 수 있다.
유형 XVIII 콜라겐은 유형 XV 콜라겐과 구조적으로 유사하고 간으로부터 분리될 수 있다. 천연 자원으로부터 유형 XVIII 콜라겐의 구조 및 분리에 대한 설명은 예를 들어, Rehn and Pihlajaniemi (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:4234- 4238; Oh et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:4229-4233; Rehn et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13924-13935; 및 Oh et al. (1994) Genomics 19:494-499에서 찾을 수 있다.
유형 XIX 콜라겐은 FACIT 콜라겐 패밀리의 또 다른 구성원인 것으로 여겨지며, 횡문근육종 세포 (rhabdomyosarcoma cells)로부터 분리된 mRNA에서 발견되었다. 유형 XIX 콜라겐의 구조 및 분리에 대한 설명은, 예를 들어, Inoguchi et al. (1995) J. Biochem. 117:137-146; Yoshioka et al. (1992) Genomics 13:884-886; 및 Myers et al., J. Biol. Chem. 289:18549-18557 (1994)에서 찾을 수 있다.
유형 XX 콜라겐은 FACIT 콜라겐 패밀리의 신규하게 발견된 구성원이며, 병아리 각막(chick cornea)에서 확인되었다. (참조, 예컨대, Gordon et al. (1999) FASEB Journal 13:A1119; 및 Gordon et al. (1998), IOVS 39:S1128.)
용어 "콜라겐"은 전술한 콜라겐 유형 I 내지 XX을 비롯한 공지된 콜라겐 유형 중 어느 하나뿐만 아니라, 천연, 합성, 반-합성, 또는 재조합된 또 다른 콜라겐을 의미한다. 여기에 설명된 모든 콜라겐, 변형된 콜라겐 및 콜라겐-유사 단백질이 포함된다. 상기 용어는 또한 프로콜라겐 및 콜라겐-유사 단백질 또는 모티프 (Gly-X-Y)n을 포함하는 콜라겐성 단백질을 포함하고, 여기서 n은 정수이다. 콜라겐 및 콜라겐-유사 단백질의 분자, 콜라겐 분자의 트리머, 콜라겐의 피브릴, 및 콜라겐 피브릴의 섬유가 포함된다. 상기는 또한 피브릴화될 수 있는 화학적, 효소적 또는 재조합으로-변형된 콜라겐 또는 콜라겐-유사 분자뿐만 아니라 나노섬유로 조립될 수 있는 콜라겐, 콜라겐-유사 분자 및 콜라겐성 분자의 단편을 의미한다. 천연 또는 조작된 재조합 콜라겐 분자는 여기에 설명된 바와 같이 일반적으로 반복된 -(Gly-X-Y)n- 서열을 포함한다.
콜라겐 조성물 중 콜라겐은 콜라겐 분자의 단일 유형, 예컨대 100% 소의 유형 I 콜라겐 또는 100% 유형 III 소의 콜라겐을 균일하게 포함할 수 있거나, 또는 콜라겐 분자 또는 콜라겐-유사 분자의 상이한 종류의 혼합물, 예컨대 소의 유형 I 및 유형 III 분자들의 혼합물을 포함할 수 있다. 이러한 혼합물은 상기 개별적인 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질 성분들의 >0%, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 또는 <100%를 포함할 수 있다. 상기 범위는 모든 중간 값(intermediate value)을 포함한다. 예를 들어, 콜라겐 조성물은 30%의 유형 I 콜라겐 및 70%의 유형 III 콜라겐을 포함할 수 있거나, 또는 33.3%의 유형 I 콜라겐, 33.3%의 유형 II 콜라겐, 및 33.3%의 유형 III 콜라겐을 포함할 수 있고, 여기서 콜라겐의 퍼센트는 조성물 중 콜라겐의 전체 질량 또는 콜라겐 분자의 분자 퍼센트에 기반한다.
"콜라겐 피브릴"은 트로포콜라겐(tropocollagen)(콜라겐 분자의 삼중 나선)으로 이루어진 나노섬유이다. 트로포콜라겐은 또한 삼중 나선 구조를 나타내는 트로포콜라겐-유사 구조를 포함한다. 본 발명의 콜라겐 피브릴은 1 nm 내지 1 μm 범위의 직경을 가질 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 콜라겐 피브릴은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 nm(1 μm) 범위의 평균 또는 개별 피브릴 직경을 가질 수 있다. 상기 범위는 모든 중간 값 및 하위범위(subranges)를 포함한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 콜라겐 피브릴은 네트워크를 형성할 것이다. 콜라겐 피브릴은 밴드된 패턴을 나타내는 피브릴로 결합할 수 있고, 또한 이들 피브릴은 피브릴의 더 큰 응집체로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서 상기 콜라겐 또는 콜라겐-유사 피브릴은 소(bovine) 또는 또 다른 종래 가죽의 탑 그레인 또는 표면 층에서와 유사한 직경 및 배향을 가질 것이다. 다른 구체예에서, 상기 콜라겐 피브릴은 종래 가죽의 탑 그레인 및 진피 층을 포함하는 직경을 가질 수 있다.
"콜라겐 섬유(collagen fiber)"는 단단하게 패킹되고, 섬유의 방향으로 높은 정렬 정도를 나타내는 콜라겐 피브릴로 이루어진다. 이는 1 μm 내지 10 μm 초과, 예를 들어 >1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 μm 또는 그 이상의 직경에서 다양할 수 있다. 본 발명의 콜라겐 피브릴의 네트워크의 일부 구체예들은 5 μm 초과의 직경을 갖는 콜라겐 섬유의 실질적 함량을 포함하지 않는다. 가죽의 그레인 표면의 조성은 그 더욱 내부 부분, 예컨대 더 거친 섬유 다발들을 포함하는 진피와 다를 수 있다.
"피브릴화(Fibrillation)"는 콜라겐 피브릴을 생성하는 방법을 의미한다. 이는 콜라겐 용액 또는 현탁액의 pH를 올리거나 또는 염 농도를 조정함으로써 실시될 수 있다. 피브릴화된 콜라겐의 형성에서, 콜라겐이 1분 내지 24시간 및 모든 중간 값을 포함하여 임의의 적당한 기간 동안 피브릴을 형성하기 위해서 배양될 수 있다.
여기에 개시된 피브릴화된 콜라겐은 일반적으로, 평면 시트, 곡선 형태/시트, 원통형, 실, 및 복합 형태를 포함하여 임의의 적당한 형태 및/또는 두께로 형성될 수 있다. 이들 시트 및 기타 형태는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,80, 90 mm; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 200, 500, 1,000, 1,500, 2,000 cm 또는 그 이상의 두께, 너비 또는 높이를 포함하는 거의 모든 선형 치수를 가질 수 있다.
피브릴화된 콜라겐은 임의의 또는 임의의 실질적 양의 더욱 고차원 구조가 결여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 콜라겐 피브릴은 개별화(unbundled)될 것이고 동물 피부에서 발견되는 거대 콜라겐 섬유를 형성하지 않을 것이며 생제작된 가죽에 강하고 균일한 비-이방성 구조를 제공할 것이다.
다른 구체예에서, 일부 콜라겐 피브릴은 더욱 고차 구조로 다발화(bundle)되거나 또는 정렬될 수 있다. 생제작된 가죽에서 콜라겐 피브릴은 0, >0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, <1.0, 또는 1.0 범위의 지향성 지수(orientation index)를 나타내고, 여기서 0의 지향성 지수는 다른 피브릴과의 정렬이 결여된 콜라겐 피브릴을 나타내고 1.0의 지향성 지수는 완전하게 정렬된 콜라겐 피브릴을 나타낸다. 상기 범위는 모든 중간 값 및 하위범위 (subranges)를 포함한다. 해당 분야의 통상의 지식을 가진 자는 상기 지향성 지수와 친숙하며, Sizeland, et al., J. Agric. Food Chem. 61: 887-892 (2013) 또는 Basil-Jones, et al., J. Agric. Food Chem. 59: 9972-9979 (2011)는 참조로 수록된다.
생제작된 가죽은 동물의 특정 종 또는 품종 또는 특정 조건하에 사육된 동물에 의해서 생성된 콜라겐 피브릴의 특성과 유사하거나 또는 이를 모방하는 콜라겐 피브릴을 함유하도록 피브릴화되고 가공될 수 있다.
그 대신에, 피브릴화 및 가공 조건이 예를 들면 천연 가죽의 피브릴과 비교하여 피브릴 직경, 정렬 정도, 또는 가교결합 정도를 감소 또는 증가시킴으로써, 자연에서 발견되는 것과 구별되는 콜라겐 피브릴을 제공하도록 선택될 수 있다.
가끔 하이드로겔(hydrogel)로 불리는 콜라겐의 가교결합된 네트워크가 콜라겐이 피브릴화될 때 형성될 수 있거나, 또는 피브릴화 후에 네트워크를 형성할 수 있고; 일부 변형에서, 콜라겐을 피브릴화하는 방법은 또한 겔-유사 네트워크를 형성한다. 일단 형성되면, 피브릴화된 콜라겐 네트워크는 크롬, 아민, 카르복실산, 설페이트, 설파이트, 설포네이트, 알데히드, 하이드라지드, 설프하이드릴, 디아자린, 아릴-, 아지드, 아크릴레이트, 에폭사이드, 또는 페놀을 포함하는 디-, 트리- 또는 다관능성 반응기를 갖는 분자들을 도입시킴으로써 더욱 안정화될 수 있다.
피브릴화된 콜라겐 네트워크는 또한 다른 제제(예컨대, 중합할 수 있는 폴리머 또는 다른 적당한 섬유)와 중합될 수 있고, 이는 매트릭스를 더욱 안정화시키고 원하는 최종 구조를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 아크릴아마이드, 아크릴산, 및 그 염에 기반한 하이드로겔이 역상 현탁 중합(inverse suspension polymerization)을 사용하여 생성될 수 있다. 여기에 개시된 하이드로겔은 극성 모노머로부터 생성될 수 있다. 사용된 하이드로겔은 천연 폴리머 하이드로겔, 합성 폴리머 하이드로겔, 또는 이들 둘의 조합일 수 있다. 사용된 하이드로겔은 그라프트 중합, 가교결합 중합, 수용성 폴리머로 형성된 네트워크, 방사선 가교결합 (radiation crosslinking) 등을 사용하여 수득될 수 있다. 소량의 가교결합제가 중합을 증강시키기 위해서 하이드로겔 조성물로 첨가될 수 있다.
평균 또는 개별 콜라겐 피브릴 길이는 생제작된 가죽의 전체 두께 전반에서 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000 (1 μm); 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000 μm (1 mm)의 범위일 수 있다. 이들 범위는 모든 중간 값 및 하위범위를 포함한다.
피브릴은 그 길이의 50, 100, 200, 300, 400, 500 μm 또는 그 이상에 걸쳐서 또 다른 피브릴과 정렬될 수 있거나 또는 거의 또는 전혀 정렬을 나타내지 않을 수 있다. 다른 구체예에서, 일부 콜라겐 피브릴은 더욱 고차 구조로 다발화(bundle)되거나 또는 정렬될 수 있다.
생제작된 가죽에서 콜라겐 피브릴은 0, >0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, <1.0, 또는 1.0 범위의 지향성 지수(orientation index)를 나타내고, 여기서 0의 지향성 지수는 다른 피브릴과의 정렬이 결여된 콜라겐 피브릴을 나타내고 1.0의 지향성 지수는 완전하게 정렬된 콜라겐 피브릴을 나타낸다. 상기 범위는 모든 중간 값 및 하위범위 (subranges)를 포함한다. 해당 분야의 통상의 지식을 가진 자는 상기 지향성 지수와 친숙하며, Sizeland, et al., J. Agric. Food Chem. 61: 887-892 (2013) 또는 Basil-Jones, et al., J. Agric. Food Chem. 59: 9972-9979 (2011)는 참조로 수록된다.
생제작된 가죽의 콜라겐 피브릴 밀도는 약 1 내지 1,000 mg/cc, 바람직하게 5 내지 500 mg/cc의 범위일 수 있고, 모든 중간 값, 예컨대 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 및 1,000 mg/cc를 포함한다.
생제작된 가죽에서 콜라겐 피브릴은 단봉형 (unimodal), 이봉형 (bimodal), 삼봉형 (trimiodal), 또는 다중형태(multimodal) 분포를 나타낼 수 있고, 예를 들어, 생제작된 가죽은 2개의 상이한 피브릴 제제(preparation)로 이루어질 수 있고 각각은 2개의 상이한 모드 중 하나 주위에 정렬된 피브릴 직경의 상이한 범위를 가질 수 있다. 이러한 혼합물은 상이한 직경을 갖는 피브릴에 의해서 부여된 생제작된 가죽에 물리적 특성들의 부가적, 상승적 또는 균형을 부여하도록 선택될 수 있다.
천연 가죽 제품은 가죽 제품의 중량에 기반하여 150-300 mg/cc 콜라겐을 함유할 수 있다. 생제작된 가죽은 생제작된 가죽의 중량에 기반하여 종래 가죽과 유사한 함량의 콜라겐 또는 콜라겐 피브릴, 예컨대 100, 150, 200, 250, 300 또는 350 mg/cc의 콜라겐 농도를 포함할 수 있다.
가끔 하이드로겔로 불리는 피브릴화된 콜라겐은 그 최종 용도에 기반하여 선택된 두께를 가질 수 있다. 피브릴화된 콜라겐의 제제(preparation)의 두께가 더 두꺼워지거나 또는 농도가 더 높아지면, 일반적으로 더 두꺼운 생제작된 가죽을 생성한다. 생제작된 가죽의 최종 두께는 가교결합, 탈수 및 윤활에 의한 수축 이전에 상기 피브릴 제제의 단지 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%일 수 있다.
"가교결합(Crosslinking)"은 콜라겐 분자들 사이 내에 화학결합의 형성(또는 재형성)을 의미한다. 가교결합 반응은 콜라겐 구조를 안정화시키고 일부 사례에서 콜라겐 분자들 사이에 네트워크를 형성한다. 해당 분야에 알려져 있는 임의의 적당한 가교결합제가 사용될 수 있으며, 비제한적으로, 미네랄 염 예컨대 크롬, 포름알데히드, 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 글루타르알데히드, 폴리에폭시 화합물, 감마 방사선, 및 리보플라빈에 의한 자외선 조사에 기반한 것을 포함한다. 가교결합은 임의의 공지된 방법에 의해 실시될 수 있으며; 참조, 예컨대, Bailey et al., Radiat. Res. 22:606-621 (1964); Housley et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 67:824-830 (1975); Siegel, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71:4826-4830 (1974); Mechanic et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 45:644-653 (1971); Mechanic et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 41:1597-1604 (1970); 및 Shoshan et al., Biochim. Biophys. Acta 154:261-263 (1968) 이들 각각은 참조로 수록된다.
가교결합제는 이소시아네이트, 카르보디이미드, 폴리(알데히드), 폴리(아지리딘), 미네랄 염, 폴리(에폭시), 효소, 티이란, 페놀성화물, 노볼락, 레졸(resole) 뿐만 아니라 예컨대 라이신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 하이드록실프롤린, 또는 하이드록시라이신과 같은 아미노산 곁사슬과 반응하는 화학물질을 갖는 기타 화합물을 포함한다.
콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질은 콜라겐 피브릴들 사이에 화학적 및/또는 물리적 가교결합을 촉진하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다. 콜라겐 분자 상의 예컨대 라이신, 글루탐산, 및 하이드록실기와 같은 반응기가 콜라겐의 막대형 피브릴 구조로부터 돌출되기 때문에 화학적 가교결합이 가능할 수 있다. 상기 기들을 포함하는 가교결합은 콜라겐 분자가 스트레스 하에 서로 슬라이딩되는 것을 방지하여 콜라겐 섬유들의 기계적 강도를 증가시킨다. 화학적 가교결합 반응의 예로는 비제한적으로 라이신의 ε-아미노기와의 반응, 또는 콜라겐 분자의 카르복실기와의 반응을 포함한다. 트란스글루타미나제와 같은 효소가, 글루탐산과 라이신 사이의 가교결합을 생성하여 안정한 γ-글루타밀-라이신 가교결합을 형성하는데 또한 사용될 수 있다. 이웃하는 콜라겐 분자의 작용기들 사이의 가교결합을 유도하는 것은 해당 분야에 공지되어 있다. 가교결합은 피브릴화된 콜라겐 하이드로겔-유도된 물질로부터 수득된 물리적 특성을 조정하기 위해서 여기서 실시될 수 있는 또 다른 단계이다.
피브릴화 또는 피브릴화된 콜라겐이 또한 가교결합되거나 윤활될 수 있다. 콜라겐 피브릴은, 네트워크 형성 이전, 네트워크 형성 도중, 또는 네트워크 겔 형성에서 크롬 또는 적어도 하나의 알데히드기를 함유하는 화합물, 또는 식물성 탄닌으로 처리될 수 있다. 가교결합은 피브릴화된 콜라겐 가죽을 더욱 안정화한다. 예를 들어, 아크릴 폴리머로 사전-처리되고 이어서 식물성 탄닌, 예컨대 아카시아 몰리스시마(Acacia Mollissima)로 처리된 콜라겐 피브릴은 증가된 수열 안정성(hydrothermal stability)을 나타낼 수 있다. 다른 구체예에서, 글리세르알데히드가 가교결합제로 사용되어 피브릴화된 콜라겐의 열 안정성, 단백질분해 저항성(proteolytic resistance), 및 기계적 특성, 예컨대 영률(Young's modulus) 및 인장 응력(tensile stress)을 증가시킬 수 있다.
콜라겐 피브릴의 네트워크를 포함하는 생제작된 물질은 종래 가죽에 사용되는 태닝제를 포함하여 가교결합제의 0, >0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20% 또는 그 이상을 함유할 수 있다. 가교결합제는 생제작된 물질의 콜라겐 피브릴 또는 또 다른 성분들에 공유적으로 결합되거나 또는 이들과 비-공유적으로 결합될 수 있다. 바람직하게, 생제작된 가죽은 가교결합제를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10% 이하로 함유할 것이다.
"윤활 (Lubricating)"은 윤활제, 예컨대 지방 또는 또 다른 소수성 화합물 또는 탈수(dehydration) 중에 피브릴-피브릴 결합을 조절 또는 제어하는 임의의 물질을 콜라겐을 포함하는 가죽 또는 생제작된 제품에 적용하는 과정을 나타낸다. 상기 가죽 미관의 원하는 특성은 물질의 강성(stiffness) 또는 핸드(hand)이다. 이러한 특성을 달성하기 위해, 피브릴들 및/또는 섬유들 사이의 수-매개 수소 결합(water-mediated hydrogen bonding)이 윤활제의 사용을 통해 가죽에서 제한된다. 윤활제의 예로는 지방, 생물학적, 미네랄 또는 합성 오일, 코드 오일(cod oil), 설폰화된 오일, 폴리머, 유기작용성 실록산, 및 기타 소수성 화합물 또는 종래 가죽을 유화가지화(fatliquoring)하기 위해 사용된 제제뿐만 아니라 이들의 혼합물을 포함한다. 윤활은 일부 측면에서 천연 가죽을 유화가지화하는 것과 유사하지만, 생제작된 제품은, 그 제조 방법, 더욱 균질한 조성 및 덜 복잡한 조성으로 인해서 윤활제로 더욱 균일하게 처리될 수 있다.
또 다른 윤활제는 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양이온성 폴리머 계면활성제, 음이온성 폴리머 계면활성제, 양친매성 폴리머, 지방산, 개질된 지방산, 비이온성 친수성 폴리머, 비이온성 소수성 폴리머, 폴리아크릴산, 폴리 메타크릴, 아크릴, 천연 고무, 합성 고무, 수지, 양친매성 음이온성 폴리머 및 코폴리머, 양친매성 양이온성 폴리머 및 코폴리머 및 그 혼합물, 뿐만 아니라 물, 알코올, 케톤, 및 기타 용매 중의 이들의 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다.
윤활제는 콜라겐 피브릴을 포함하는 생제작된 물질에 첨가될 수 있다. 윤활제는 피브릴 이동을 촉진하거나 또는 가죽-유사 특성 예컨대 가요성, 취성(brittleness) 감소, 내구성, 또는 내수성(water resistance)을 부여하는 임의의 양으로 포함될 수 있다. 윤활제 함량은 생제작된 가죽의 약 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 및 60 중량%의 범위일 수 있다.
또 다른 첨가제가 생제작된 가죽 또는 물질의 특성을 변형시키기 위해 첨가될 수 있다. 적절한 첨가제는 비제한적으로 염료, 안료, 향료, 수지, 및 미립자를 포함한다. 수지는 물질의 신축성, 강도, 및 유연성을 변형시키기 위해 첨가될 수 있다. 적절한 수지는 비제한적으로 엘라스토머, 아크릴 코폴리머, 폴리우레탄 등을 포함한다. 적절한 엘라스토머는 비제한적으로 스티렌, 이소프렌, 부타디엔 코폴리머 예컨대 KRAYTON® 엘라스토머, Hycar ® 아크릴 수지를 포함한다. 수지는 (콜라겐의 중량에 기반하여) 약 5% 내지 200%, 또는 약 50% 내지 150%에서 사용될 수 있으며, 이들 범위는 이들 사이의 모든 수치 및 하위범위 예컨대 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 60, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 140 등을 포함한다.
"탈수(Dehydrating)" 또는 "배수(dewatering)"는 예컨대 피브릴화된 콜라겐을 함유하는 수성 용액, 현탁액, 겔, 또는 하이드로겔과 같은, 콜라겐 피브릴 및 물을 함유하는 혼합물로부터 물을 제거하는 과정을 나타낸다. 물은 여과, 증발, 동결-건조, 용매 교환, 진공-건조, 대류-건조, 가열, 조사(irradiating), 또는 마이크로파 조사(microwaving)에 의하거나, 또는 물을 제거하기 위한 또 다른 공지된 방법에 의해서 제거될 수 있다. 또한, 콜라겐의 화학적 가교결합이, 여러 중에서 예컨대 라이신, 아르기닌, 및 하이드록시라이신과 같은 친수성 아미노산 잔기를 소비시킴으로써, 결합된 물을 콜라겐으로부터 제거하는 것이 알려져 있다. 본 발명자들은 아세톤이 콜라겐 피브릴을 빠르게 탈수시키고 또한 수화된 콜라겐 분자에 결합된 물을 제거할 수 있다는 것을 발견하였다. 탈수 후 생제작된 물질 또는 가죽의 수분 함량은 바람직하게는 상기 생제작된 가죽의 60 중량% 이하, 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 50 또는 60 중량% 이하이다. 상기 범위는 모든 중간 값(intermediate value)을 포함한다. 수분 함량은 25 ℃ 및 1 atm에서 65%의 상대 습도에서 평형화(equilibration)로 측정된다.
"그레인 질감(Grain texture)"은 풀 그레인(full grain) 가죽, 탑 그레인(top grain) 가죽, 코렉티드 그레인(corrected grain) 가죽(여기서, 인조 그레인이 적용되었음)의 질감, 또는 더 거친 스플릿 그레인(splitgrain) 가죽 질감과 심미적으로 또는 질감적으로 유사한 가죽-유사 질감을 나타낸다. 유리하게는, 본 발명의 생제작된 물질은 가죽의 표면 그레인과 닮은 파인 그레인(fine grain)을 제공하도록 튜닝될 수 있다.
본 발명의 물품은 풋 웨어, 의류, 장갑, 가구 또는 차량 덮개 및 기타 가죽 상품 및 제품을 포함할 수 있다. 이는 비제한적으로 의류, 예컨대 오버코트, 코트, 자켓, 셔츠, 바지, 팬츠, 반바지, 수영복, 속옷, 유니폼, 엠블렘 또는 레터스, 코스튬, 타이, 스커트, 드레스, 블라우스, 레깅스, 글로브, 벙어리장갑(mittens), 신발, 신발 구성성분 예컨대, 밑창(sole), 쿼터(quarter), 혀(tongue), 커프(cuff), 대다리(welt), 및 카운터 (counter), 드레스 슈즈(dress shoes), 운동화, 런닝화, 캐주얼화, 운동, 런닝 또는 캐주얼 신발 구성성분 예컨대 토 캡(toe cap), 토 박스(toe box), 구두창(outsole), 중창(midsole), 어퍼(upper), 레이스(laces), 아이릿(eyelets), 칼라(collar), 안감(lining), 아킬레스 노치(Achilles notch), 힐(heel), 및 카운터, 패션 또는 여성화 및 이들의 신발 구성성분 예컨대 어퍼, 구두창, 토 스프링(toe spring), 토 박스, 장식, 뱀프(vamp), 안감, 양말, 인솔(insole), 플랫폼(platform), 카운터 및 힐 또는 하이힐, 부츠(boots), 샌달(sandals), 버튼(buttons), 샌달, 모자, 마스크, 헤드기어(headgear), 헤드밴드(headbands), 헤드 랩(head wraps) 및 벨트; 보석류(jewelry) 예컨대 팔찌(bracelets), 시계 밴드(watch bands), 및 목걸이; 장갑(gloves), 우산, 지팡이(walking sticks), 지갑(wallets), 이동전화(mobile phone) 또는 웨어러블 컴퓨터 커버링(wearable computer coverings), 지갑 (purses), 백팩 (backpacks), 수트케이스(suitcases), 핸드백(handbags), 폴리오(folios), 폴더(folders), 박스(boxes) 및 기타 개인 물건; 운동, 스포츠, 사냥 또는 레크레이션 기어(recreational gear) 예컨대 마구(harnesses), 굴레(bridles), 고삐(reins), 재갈(bits), 가죽끈(leashes), 미트(mitts), 테니스 라켓(tennis rackets), 골프 클럽(golf clubs), 폴로(polo), 하키(hockey), 또는 라크로스 기어(lacrosse gear), 체스보드(chessboards) 및 게임 보드(game boards), 메디신 볼(medicine balls), 킥볼(kick balls), 베이스볼(baseballs), 및 다른 종류의 공, 및 장남감(toys); 제본(book bindings), 북커버(book covers), 사진 프레임(picture frames) 또는 아트웍(artwork); 의자, 소파, 문, 시트(seats), 오토만(ottomans), 칸막이(room dividers), 컵받침(coasters), 마우스 패드, 데스크 블로터(desk blotters), 또는 기타 패드, 테이블, 침대, 바닥(floor), 벽 또는 천장 커버, 바닥재를 포함하는 가구 및 홈, 오피스, 또는 다른 내장 또는 외장 퍼니싱(furnishings); 시트, 머리받침대(headrests), 덮개(upholstery), 패널(paneling), 스티어링 휠, 조이스틱(joystick) 또는 컨트롤 커버링(control coverings) 및 기타 랩(wraps) 또는 커버링(coverings)을 포함하는 자동차, 보트, 항공기및 기타 차량 제품을 포함한다.
콜라겐 피브릴 또는 생제작된 가죽의 생제작된 네트워크의 물리적 특성은　콜라겐의 유형, 피브릴화된 콜라겐의 농도의 양, 피브릴화 정도, 가교결합, 탈수 및 윤활을 선택함으로써 선택되거나 튜닝될 수 있다.　　
많은 유익한 특성들이 상기 콜라겐 피브릴의 네트워크 구조와 관련이 있고, 이는 산출된 생제작된물질 또는 가죽에 강하고, 가요성이며 실질적으로 균일한 특성을 제공할 수 있다.　 본 발명에 따른 생제작된 가죽의 바람직한 물리적 특성은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 MPa 범위의 인장 강도(tensile strength), 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30% 또는 그 이상 범위의 파단시 연신율(elongation at break)에 의해서 결정되는 가요성(flexibility), 4, 5, 6, 7, 8 mm 또는 그 이상의 ISO 17235에 의해서 결정되는 연화도(softness), 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1,4, 1,5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9,　2.0 mm 또는 그 이상 범위의 두께(thickness), 및 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000 mg/cc 또는 그 이상, 바람직하게는 100-500 mg/cc의 콜라겐 밀도(콜라겐 피브릴 밀도)를 포함한다.　　 상기 범위는 모든 하위범위 및 중간 값을 포함한다.
두께 (Thickness).　　그 최종 용도에 따라서 생제작된 물질 또는 가죽은 임의의 두께를 가질 수 있다.　 그 두께는 바람직하게 약 0.05 mm 내지 20 mm 뿐만 아니라 상기 범위 내의 임의의 중간 값, 예컨대 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 mm 또는 그 이상의 범위이다.　 생제작된 가죽의 두께는 콜라겐 함량을 조정함으로써 조절될 수 있다.
탄성 모듈러스(Elastic modulus).　　탄성 모듈러스(또한, 영률(Young's modulus)로 알려짐)는 대상 또는 물질에　힘이　가해졌을 때 탄성적 변형에 대한 저항성(즉, 비-영구적임)을　측정하는　수치이다. 대상의 탄성 모듈러스는 탄성 변형 영역에서 그 응력-변형 곡선(stress-strain curve)의　기술기로서　정의된다.　 더욱 강성인 물질은 더욱 높은 탄성 모듈러스를 가질 것이다. 탄성 모듈러스는 질감 분석기(texture analyzer)를 사용하여 측정될 수 있다.
생제작된 가죽은 적어도 100 kPa의 탄성 모듈러스를 가질 수 있다.　 이는 100 kPa 내지 1,000 MPa, 뿐만 아니라 상기 범위 내의 임의의 중간 값, 예컨대 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 MPa의 범위일 수 있다.　 생제작된 가죽은 그 이완된 상태의 길이로부터 300% 까지, 예를 들어 그 이완된 상태의 길이의 >0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 또는 300 %까지 연신될 수 있다.
인장 강도(Tensile strength)(또한, 최종 인장 강도로 알려짐)는 크기를 감소시키려는 경향의 로드에 견디는 압축 강도와는 반대로, 연신시키려는 경향의 로드를 견디는 물질 또는 구조의　능력이다. 인장 강도는　장력　또는 잡아당기는 것에 저항하는 반면에, 압축 강도는　압축　또는 함께 밀리는 것에 저항한다.　
생제작된 물질의 샘플은 인스트론 장치(Instron machine)를 사용하여 인장 강도에 대해 시험될 수 있다.　 클램프를 샘플의 말단부에 부착하고 파괴될 때까지 샘플을 반대 방향으로 잡아 당긴다.　 샘플이 적어도 1 MPa의 인장 강도를 가질 때 양호한 강도가 입증된다.　 생제작된 가죽은 적어도 1 kPa의 인장 강도를 가질 수 있다.　 이는 1 kPa 내지 100 MPa 뿐만 아니라 상기 범위 내의 임의의 중간 값, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500kPA; 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 MPa의 범위일 수 있다.
인열 강도(Tear strength)　(또한 인열 저항성 (tear resistance)으로 알려져 있음)는 물질이 찢어지는 효과에 얼마나 잘 견딜 수 있는지에 대한　측정치이다. 더욱 구체적으로는 그러나 물질(통상적으로 고무)이 장력 하에 있을 때 임의의 절단의 성장을 얼마나 잘 견디는지이며, 이는 보통 kN/m로 측정된다. 인열 저항성은 ASTM D 412 방법 (인장 강도, 모듈러스 및 연신율을 측정하기 위해서 사용됨)에 의해서 측정될 수 있다. ASTM D 624가 인열의 형성(인열 개시)에 대한 저항성 및 인열의 팽창(인열 진행)에 대한 저항성을 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 둘 중 어느 것이 측정되는지에 관계없이, 상기 샘플이 2개의 홀더 사이에 고정되고 균일한 당기는 힘이 상기한 변형이 발생될 때까지 가해진다. 인열 저항성은 그 후 적용된 힘을 물질의 두께로 나눔으로써 산출된다.　 생제작된 가죽은, 동일한 가교결합제(들) 또는 윤활제들을 사용하여 처리되고 동일한 유형의 콜라겐, 예컨대 소의 유형 I 또는 유형 III 콜라겐을 포함하는 동일한 두께의 종래 탑 그레인 또는 기타 가죽보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150 또는 200% 더 큰 인열 저항성을 나타낼 수 있다. 생제작된 물질은 약 1 내지 500 N 범위의 인열 강도, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500 뿐만 아니라 이러한 범위 내의 임의의 중간 인열 강도를 가질 수 있다.
연화도 (Softness).　　ISO 17235:2015는 가죽의 연화도를 측정하기 위한 비-파괴 방법(non-destructive method)을 서술한다. 이는 모든 비-강성 가죽,　예컨대　신발 어퍼 가죽(upper leather), 덮개 가죽, 가죽 상품 가죽, 및 의류 가죽에 적용가능하다.　　생제작된 가죽은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 mm 또는 그 이상의 ISO 17235에 의해 결정된 연화도를 가질 수 있다.
그레인 (Grain). 가죽의 탑 그레인 표면은 그 부드러운 질감 및 매끄러운 표면으로 인해서 종종 가장 바람직한 것으로 간주된다. 탑 그레인은 콜라겐 피브릴의 고다공성 네트워크이다. 그레인의 강도 및 인열 저항성은 종종 탑 그레인 단독의 실제적인 응용에 대한 제한이며 종래 가죽 제품이 종종 훨씬 더 거친 그레인을 갖는 진피로 배킹(backing)된다. 강하고 균일한 물리적 특성 또는 증가된 두께를 갖도록 생성될 수 있는 여기에 개시된 생제작된 물질은 진피 배킹(backing)에 대한 요구 없이 탑 그레인 유사 제품을 제공하는데 사용될 수 있다.
또 다른 성분들의 함량. 일부 구체예에서, 콜라겐에는 엘라스틴 또는 비-구조적 동물 단백질과 같은 또 다른 가죽 성분들이 존재하지 않는다. 그러나, 일부 구체예에서, 생제작된 가죽 내 액틴(actin), 케라틴(keratin), 엘라스틴(elastin), 피브린(fibrin), 알부민(albumin), 글로불린(globulin), 뮤신(mucin), 무시노이드(mucinoids), 비콜라겐 구조적 단백질(noncollagen structural proteins), 및/또는 비콜라겐 비구조적 단백질(noncollagen nonstructural proteins)의 함량은 생제작된 가죽의 0, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 중량%의 범위일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 액틴, 케라틴, 엘라스틴, 피브린, 알부민, 글로불린, 뮤신, 무시노이드, 비콜라겐 구조적 단백질, 및/또는 비콜라겐 비구조적 단백질의 함량은 생제작된 가죽의 >0, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 중량% 또는 그 이상의 범위의 양으로 생제작된 가죽에 포함될 수 있다. 이러한 성분들은 피브릴화, 가교결합, 탈수 또는 윤활 도중 또는 그 이후에 도입될 수 있다.
콜라겐의 함량. 본 발명에 따르는 생제작된 물질 또는 가죽은 종래 가죽에 비하여 증가된 콜라겐 함량을 함유한다. 본 발명 내에서, 생제작된 물질 또는가죽 내 콜라겐 함량은 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80% 또는 그 이상 내지 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% 또는 그 미만의 범위이며, 인용된 하한 및 상한에 의해 제한되는 모든 범위 및 하위-범위를 포함한다.
"가죽 염료 (leather dye)"는 가죽 또는 생제작된 가죽을 착색시키는데 사용될 수 있는 염료를 나타낸다. 이들은 산성 염료, 직접 염료(direct dyes), 레이크(lakes), 황 염료, 염기성 염료 및 반응성 염료를 포함한다. 염료 및 안료가 또한 생제작된 가죽의 제조 도중 콜라겐 피브릴을 포함하는 현탁액 또는 네트워크 겔과 같은 생제작된 가죽의 전구체에 혼입될 수 있다.
"충전제 (Fillers)". 일부 구체예에서, 생제작된 가죽은 가죽의 성분 이외에 충전제, 예컨대 미소구체(microsphere)를 포함할 수 있다. 탈수된 피브릴 네트워크의 조직을 조절하는 한 가지 방법은 탈수하는 동안 피브릴이 떨어져서 간격을 둘 수 있도록 충전 물질(filling materials)을 포함하는 것이다. 이러한 충전제 물질은 나노입자, 마이크로입자, 또는 다양한 폴리머 예컨대 태닝 산업에서 널리 사용되는 신탄(syntan)을 포함한다. 이러한 충전 물질은 최종 탈수된 가죽 물질의 일부일 수 있거나, 또는 충전 물질이 희생(sacrificial)될 수 있는데, 즉 이들이 분해되거나 또는 용해되어서 더욱 다공성인 피브릴 네트워크를 위한 개방 공간을 남길 수 있다. 이러한 충전제의 형태 및 치수가 또한 탈수된 피브릴 네트워크의 배향을 조절하는데 사용될 수있다.
일부 구체예에서 충전제는 폴리머성 미소구체(들), 비드(들), 섬유(들), 와이어(들), 또는 유기 염(들)을 포함할 수 있다. 또 다른 물질이 또한 본 발명에 따르는 생제작된 가죽 또는 콜라켄 피브릴의 네트워크로 매립되거나 다른 방식으로 또는 혼입될 수 있다. 이들은 비제한적으로 직포 및 부직포 섬유를 포함하는 1종의 섬유뿐만 아니라 면, 울, 캐시미어, 앙고라, 리넨, 대나무(bamboo), 인피(bast), 대마(hemp), 콩(soya), 시셀(seacell), 우유 또는 우유 단백질로부터 생성된 섬유, 실크, 스파이더 실크(spider silk), 재조합적으로 생성된 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 기타 펩티드 또는 폴리펩티드, 키토산, 균사체(mycelium), 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스, 우드 섬유를 포함하는 우드(wood), 레이온, 리오셀(lyocell), 비코스(vicose), 항미생물 얀(antimicrobial yarn: A.M.Y.), 소브텍(Sorbtek), 나일론, 폴리에스테르, 엘라스토머 예컨대 lycra®, 스판덱스 또는 엘라스탄 및 기타 폴리에스테르-폴리우레탄 코폴리머, 아라미드, 탄소 섬유 및 풀러렌을 포함하는 탄소, 유리 섬유 및 부직포를 포함하는 유리, 실리콘 및 실리콘-함유 화합물, 미네랄 입자 및 미네랄 섬유를 포함하는 미네랄, 및 철, 스틸, 납, 금, 은, 백금, 구리, 아연 및 티타늄을 포함하는 것들을 포함하는 금속 또는 금속 합금을 포함하며, 이는 입자, 섬유, 와이어의 형태, 또는 생제작된 가죽에 혼입되기에 적당한 또 다른 형태일 수 있다. 이러한 충전제는 전기전도성 물질, 자기 물질, 형광 물질, 생물발광 물질, 인광(phosphorescent) 물질 또는 또 다른 광발광성 물질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이들 성분들의 혼합물 또는 블렌드가 또한 예를 들어 여기에 개시된 화학적 및 물리적 특성을 변경하기 위해, 생제작된 가죽에 매립 또는 혼입될 수 있다.
다양한 형태의 콜라겐이 동물계 전반에서 발견된다. 여기에 사용된 콜라겐은 척추동물 및 무척추동물 둘 모두를 포함하는 동물 공급원, 또는 합성 공급원으로부터 회득될 수 있다. 콜라겐은 또한 기존의 동물 처리의 부산물로부터 공급될 수 있다. 동물 공급원으로부터 획득된 콜라겐은 예를 들면 Silva et. Al., Marine Origin Collagens and its Potential Applications, Mar. Drugs, 2014 Dec., 12(12); 5881-5901)과 같이, 해당 분야에 공지딘 표준 실험실 기술을 사용하여 분리될 수 있다.
여기에 개시된 콜라겐은 또한 생물반응기(bioreactor)에서 성장된 세포로부터 획득하는 것을 포함하여 세포 배양 기술에 의해 획득될 수 있다.
콜라겐은 또한 재조합 DNA 기술을 통해서 획득될 수 있다. 비-인간 콜라겐을 인코딩하는 구조체가 효모로 도입되어 비-인간 콜라겐을 생성할 수 있다. 예를 들어, 콜라겐은 또한 숙주로서 효모, 예컨대 한세눌라 폴리모르파 ( Hansenula polymorpha ), 사카로마이세스 세레비시애 ( Saccharomyces cerevisiae ), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 등에 의해 생성될 수 있다. 콜라겐 및 콜라겐-유사 단백질의 재조합 발현이 Bell, EP 1232182B1, Bovine collagen and method for producing recombinant gelatin; Olsen, et al., 미국 특허 제6,428,978호, Methods for the production of gelatin and full-length triple helical collagen in recombinant cells; VanHeerde, et al., 미국 특허 제8,188,230호, Method for recombinant microorganism expression and isolation of collagen-like polypeptides에 의해 보고되었으며, 이들의 개시사항은 참조로 여기에 수록된다. 그렇지만, 재조합 콜라겐은 가죽을 생성하기 위해 사용되지는 않았다.
본 발명에서 유용한 물질은 비제한적으로 생제작된 가죽 물질 천연 또는 합성 직포, 부직포, 편직물(knitted fabrics), 메쉬 패브릭(mesh fabrics), 및 스페이서 패브릭(spacer fabrics)을 포함한다.
콜라겐 피브릴을 보유하는 모든 물질이 본 발명에서 유용할 수 있다. 일반적으로, 유용한 직물은 제곱 인치당 300개의 스레드 내지 제곱 피트 당 1개의 스레드 범위의 메쉬 또는 직경이 약 11μm 이상인 공극 크기를 갖는다. 스펀 레이스(Spun lace) 물질도 또한 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 수용성 직물이 유용하다. 사용될 때, 콜라겐 용액에 노출된 직물의 부분은 용해되어 직물에 공극 또는 구멍을 형성하고, 콜라겐은 공극 또는 구멍을 채운다. 수용성 직물은 전형적으로 폴리비닐 알코올 섬유로부터 형성되며 수지 예컨대 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 옥사이드, 하이드록시알킬셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴아마이드, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴레이트 및 전분(starch)으로 코팅된다. 그 대신에, 공극 또는 구멍은 천연 또는 합성 직포, 부직포, 편직물, 메쉬 패브릭, 및 스페이서 패브릭과 같은 이차 물질로 덮일 수 있다.
그 대신에, 생제작된 가죽 물질은 직물에 공극 또는 구멍을 뚫기 위해 사용될 수 있다. 공극 또는 구멍의 크기는 부여될 디자인에 따라 변할 수 있다. 공극 또는 구멍의 형태는 디자인에 따라 변할 수 있다. 공극 또는 구멍의 적절한 치수는 약 0.1 인치 내지 약 5 미터의 범위일 수 있다. 적절한 형태는 비제한적으로 원형, 사각형, 직사각형, 삼각형, 타원형, 계란형(ovals) 및 브랜드 로고를 포함한다.
일부 물질은 생제작된 가죽 물질의 결합을 향상시키기 위한 전처리에 도움이 된다. 전처리는 콜라겐 코팅, 수지 코팅, 직물의 데보레(devore)(또한 번-아웃 방법으로 알려져 있음), 화학적 처리 또는 이들의 조합을 포함 할 수있다. 예를 들어, 셀룰로오스 섬유로 만든 물질에 대한 화학적 전처리는 과요오드산염(periodate)(산화제) 용액 처리를 포함할 수 있다. 적합한 셀룰로오스 직물은 비스코스, 아세테이트, 리오셀, 대나무 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 산화제는 셀룰로오스에서 설탕 고리를 개방하고 콜라겐이 개방 고리에 결합하도록 한다. 용액 내의 산화제의 농도는 원하는 산화 정도에 달려있다. 일반적으로, 산화제의 농도가 높을수록 또는 반응 시간이 길어질수록 산화 정도가 높아진다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 산화 반응은 원하는 수준의 산화를 달성하기 위해 원하는 시간 동안 수행될 수 있다. 산화 반응은 사용된 산화제의 종류에 따라 다양한 온도에서 수행될 수 있다. 본 발명자는 실온(20℃ 내지 25℃, 바람직하게는 23℃) 또는 주위 온도에서 15 분-24 시간의 시간 범위에 걸쳐 제어된 산화를 사용하는 것이 바람직하다. 그렇지만, 17.5℃ 내지 30℃ 범위의 온도가 또한 사용될 수 있다는 것이 또한 예상된다. 시간과 관련하여, 제어된 산화는 5 분, 10 분, 15, 분, 20, 분, 25 분, 30 분, 45 분, 60 분, 2 시간, 3, 시간, 4, 시간, 5 시간, 6 시간, 12 시간 내지 36 시간, 30 시간, 24, 시간, 20 시간, 18 시간, 15 시간일 수 있는 것이 가능한 것으로 예상되며, 여기서 허용되는 모든 범위 및 하위-범위를 포함한다. 과요오드산 소듐(sodium periodate)의 양은 직물의 중량에 대해 25% 내지 100% 오퍼(offer) 범위이다. 여기에 사용된 바와 같이, 오퍼(offer)는 셀룰로오스의 중량%를 기준으로 한 첨가제의 양을 의미한다. 또 다른 화학적 전처리는 Greg Hermanson의 Bioconjugate Techniques에 개시되며, 이는 참조로 여기에 수록된다.
생제작된 가죽(예컨대, 바이오레더(bioleather)) 용액은 여기에 개시된 바와 같이 여기서 논의된 바와 같이 본원의 효모 균주에 의해 생성된 재조합 콜라겐에 부가하여 또는 이와 결합하여 임의의 적합한 비-인간 콜라겐 공급원을 포함할 수 있다.
여기에 기재된 콜라겐 물질의 형성에서의 시작 단계로서, 출발 콜라겐 물질을 용액 중에 넣고 피브릴화할 수 있다. 콜라겐 농도는 대략 0.5 g/L 내지 10 g/L, 예를 들어 0.75 g/L 내지 8 g/L, 또는 1 g/L 내지 7 g/L, 또는 2 g/L 내지 6 g/L, 또는 2.5 g/L 내지 5 g/L, 또는 3 g/L 내지 4 g/L 범위일 수 있다. 콜라겐 피브릴화는 콜라겐 용액에 염을 도입함으로써 유도될 수 있다. 콜라겐 용액에 대한 예컨대 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 및 소듐 클로라이드와 같은 염 또는 염의 조합의 첨가는 콜라겐 용액의 이온 강도를 변화시킬 수 있다. 콜라겐 피브릴화는 더 큰 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 및 공유 결합을 통해, 정전기 상호작용의 증가 결과로서 일어날 수 있다. 적합한 염 농도는 예를 들어, 약 10 mM 내지 5M, 예를 들어 50 mM 내지 2.5 M, 또는 100 mM 내지 1 M, 또는 250 mM 내지 500mM 범위일 수 있다.
콜라겐 네트워크는 또한 pH에 매우 민감할 수 있다. 피브릴화 단계 동안, pH는 직경 및 길이와 같은 피브릴 치수를 제어하도록 조정될 수 있다. 적합한 pH는 약 5.5 내지 10, 예를 들어 6 내지 9, 또는 7 내지 8 범위일 수 있다. 여과 이전 피브릴화 단계 이후, 용액의 pH는 pH가 약 3.5 내지 10, 예를 들어 3.5 내지 7, 또는 3.5 내지 5 범위가 되도록 조정될 수 있다. 콜라겐 피브릴의 전체적인 치수 및 조직은 결과로 생긴 피브릴화된 콜라겐 유도 물질의 인성, 신축성, 및 통기성에 영향을 미칠 것이다. 이는 상이한 인성, 가요성, 및 통기성이 필요할 수 있는 다양한 용도를 위하여 피브릴화된 콜라겐 유도 가죽을 제작하는데 유용할 수 있다.
탈수된 피브릴 네트워크의 조직을 조절하는 한 가지 방법은 건조하는 동안 피브릴이 떨어져서 간격을 둘 수 있도록 충전 물질(filling materials)을 포함하는 것이다. 충전제 물질은 나노입자, 마이크로입자, 미소구체, 마이크로섬유, 또는태닝 산업에서 널리 사용되는 다양한 폴리머를 포함할 수 있다. 이러한 충전 물질은 최종 탈수된 가죽 물질의 일부일 수 있거나, 또는 충전 물질이 희생(sacrificial)될 수 있는데, 즉 이들이 분해되거나 또는 용해되어서 더욱 다공성인 피브릴 네트워크를 위한 개방 공간을 남길 수 있다.
콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질은 콜라겐 피브릴들 사이에 화학적 및 물리적 가교결합을 촉진하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다. 콜라겐-유사 단백질은 미국 특허 출원 US 2012/0116053 A1에 개시되었으며, 이는 참조로 여기에 수록된다. 콜라겐 분자 상의 예컨대 라이신, 글루탐산, 및 하이드록실기와 같은 반응기가 콜라겐의 막대형 피브릴 구조로부터 돌출되기 때문에 화학적 가교결합이 가능할 수 있다. 상기 기들을 포함하는 가교결합은 콜라겐 분자가 스트레스 하에 서로 슬라이딩되는 것을 방지하여 콜라겐 섬유들의 기계적 강도를 증가시킨다. 화학적 가교결합 반응의 예로는 비제한적으로 라이신의 ε-아미노기와의 반응, 또는 콜라겐 분자의 카르복실기와의 반응을 포함한다.
트란스글루타미나제와 같은 효소가, 글루탐산과 라이신 사이의 가교결합을 생성하여 안정한 γ-글루타밀-라이신 가교결합을 형성하는데 또한 사용될 수 있다. 이웃하는 콜라겐 분자의 작용기들 사이의 가교결합을 유도하는 것은 해당 분야에 공지되어 있다. 가교결합은 피브릴화된 콜라겐 하이드로겔-유도된 물질로부터 수득된 물리적 특성을 조정하기 위해서 여기서 실시될 수 있는 또 다른 단계이다.
일단 형성되면, 피브릴화된 콜라겐 네트워크는 크롬, 아민, 카르복실산, 설페이트, 설파이트, 설포네이트, 알데히드, 하이드라지드, 설프하이드릴, 디아자린, 아릴-, 아지드, 아크릴레이트, 에폭사이드, 또는 페놀을 포함하는 디-, 트리- 또는 다관능성 반응기를 갖는 분자들을 도입시킴으로써 더욱 안정화될 수 있다.
피브릴화된 콜라겐 네트워크는 하이드로겔을 형성하거나 섬유성 품질을 갖는 또한 다른 제제(예컨대, 중합할 수 있는 폴리머 또는 다른 적당한 섬유)와 중합될 수 있고, 이는 매트릭스를 더욱 안정화시키고 원하는 최종 구조를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 아크릴아마이드, 아크릴산, 및 그 염에 기반한 하이드로겔이 역상 현탁 중합(inverse suspension polymerization)을 사용하여 생성될 수 있다. 여기에 개시된 하이드로겔은 극성 모노머로부터 생성될 수 있다. 사용된 하이드로겔은 천연 폴리머 하이드로겔, 합성 폴리머 하이드로겔, 또는 이들 둘의 조합일 수 있다. 사용된 하이드로겔은 그라프트 중합, 가교결합 중합, 수용성 폴리머로 형성된 네트워크, 방사선 가교결합 (radiation crosslinking) 등을 사용하여 수득될 수 있다. 소량의 가교결합제가 중합을 증강시키기 위해서 하이드로겔 조성물로 첨가될 수 있다.
콜라겐 용액의 점도는 20°C에서 1 cP 내지 1000 cP 범위일 수 있으며, 이들 사이의 모든 수치 및 범위 예컨대 10, 20, 30, 50, 75, 90, 100, 150, 225, 300, 400, 450, 500, 525, 575, 600, 650, 700, 800, 900 등을 포함한다. 용액은 표면에 부어지거나, 스프레이되거나, 페인트 칠해지거나, 또는 도포될 수 있다. 점도는 최종 물질이 어떻게 형성되는지에 따라 달라질 수 있다. 더 높은 점도가 요구되는 경우, 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 공지된 증점제 및 이와 유사한 것이 용액에 첨가 될 수 있다. 그 대신에, 용액 중의 콜라겐의 양이 점도를 변화시키도록 조정될 수 있다.
콜라겐 용액에서 가요성은 상기 콜라겐 용액의 침전을 통해 완전히 만들어진 새로운 물질의 생성, 예를 들어, 생제작된 가죽 레이스 물질 또는 3-차원 물질의 생성을 가능하게 한다. 어떤 의미에서, 콜라겐 용액은 예를 들어, 생제작된 가죽 또는 바이오레더를 형성하기 위한 액체 가죽으로 작용할 수 있다. 액체 가죽은 부어지거나, 피펫팅되거나, 노즐을 통하여 스프레이되거나, 또는 로봇에 의해 도포되거나 또는 상기 액체 가죽에 이차 물질을 담글 수 있다. 텍스쳐링된 표면은 물질의 형성 공정에서 천공된 물질을 이용함으로써 달성될 수 있다. 액체 가죽은 또한 마스킹, 스텐실링 및 몰딩 기술을 사용할 수 있다. 생제작된 가죽 용액의 도포는 또한 그것이 도포되는 물질의 특성을 변형시키는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 생제작된 가죽 용액은 최종 물질을 더욱 강하게, 더욱 유연하게, 더욱 단단하게, 더욱 신축성있게, 더욱 탄력있게 또는 더욱 부드럽게 만들 수 있다.
언급한 바와 같이, 위에서 설명한 방법으로 유도된 생제작된 가죽 물질은 동물 가죽에서 생성된 가죽과 비슷한 전체적인 구조적 및 물리적 특성을 가질 수 있다. 일반적으로, 본원의 효모 세포에 의해 생성된 콜라겐에 부가하여, 동물 가죽 또는 피부가 피브릴화된 콜라겐의 생성에 사용된 콜라겐의 공급원일 수 있음에도, 여기에 개시된 생제작된 가죽 물질은 동물 가죽 또는 피부의 시트 또는 조작 이외의 공급원으로부터 유도될 수 있다. 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질의 공급원은 모든 동물(예를 들어, 포유 동물, 어류), 또는 특히 세포/조직 배양된 공급원(특히 미생물 포함)으로부터 분리될 수 있다.
생제작된 가죽 물질은 거기에 함유된 피브릴 네트워크를 안정화시키는 제제를 포함하거나 피브릴화를 촉진시키는 제제를 함유할 수 있다. 이전 섹션에서 언급했듯이, 가교결합제(추가 안정성 제공용), 핵화제(피브릴화 촉진용), 및 추가 중합제(안정성 추가용)가 피브릴화 이전에 (또는 이후에) 콜라겐 용액에 첨가되어 원하는 특성(예 : 강도, 굽힘, 신축성 등)을 가진 피브릴화된 콜라겐 물질을 획득할 수 있다.
언급된 바와 같이, 탈수 또는 건조 후에, 상기 논의된 방법으로부터 유도된 조작된 생제작된 가죽 물질은 20중량% 또는 그 미만, 또는 17.5 중량% 또는 그 미만, 또는 15중량% 또는 그 미만, 또는 12.5중량% 또는 그 미만, 또는 10중량% 또는 그 미만의 수분 함량을 가진다. 조작된 생제작된 가죽 물질의 수분 함량은 상이한 목적 및 원하는 특성을 위한 가죽 물질의 획득하기 위하여 최종 단계에서 미세-조정될 수 있다.
언급된 바와 같이, 모든 이러한 생제작된 가죽은 태닐 될 수 있다(예컨대, 식물성 (탄닌), 크롬, 명반, 지르코늄, 티타늄, 철염, 또는 이들의 조합, 또는 임의 또 다른 적절한 태닝제를 포함하는 태닝제를 사용). 따라서, 여기서 개시된 산출된 생제작된 가죽 물질 모두에서, 상기 산출된 물질은 잔류 태닝제(예컨대 탄닌, 크롬, 등)의 퍼센트(예컨대, 0.01% 내지 10%, 또는 0.025% 내지 8%, 또는 0.05% 내지 6%, 또는 0.1% 내지 5%, 또는 0.25% 내지 4%, 또는 0.5% 내지 3%, 또는 0.75% 내지 2.5%, 또는 1% 내지 2%)를 포함할 수 있다. 따라서, 산출된 생제작된 가죽 물질 중의 콜라겐 피브릴은 태닝되도록, 예컨대 변색에 저항하기 위해 가교결합되도록 변형된다.
생제작된 가죽 물질은 표면 질감을 제공하기 위해 처리될 수 있다. 적절한 처리는 비제한적으로 물질 아래에 천공된 플레이트를 사용한 엠보싱(embossing), 디보싱(debossing), 및 진공 성형을 포함한다. 해당 업계에 공지된 바와 같이, 엠보싱 및 디보싱이 수행되는 압력 및 온도는 원하는 질감 및 디자인에 따라 달라질 수 있다. 가죽 산업에서 공지된 표면 코팅 및 마감재(finishes )가 생제작된 가죽 물질에 도포될 수 있도 있다.
전술한 바와 같이, 여기에 개시된 생제작된 가죽을 제조하기 위한 임의의 변형에서, 물질은 콜라겐이 피브릴화될 때 및/또는 별도로 피브릴화가 발생한 이후, 탈수 이전에, 태닝(가교결합)될 수 있다. 예를 들어, 태닝은 알데히드(예컨대, Relugan GTW) 및/또는 임의 또 다른 태닝제를 사용한 가교결합을 포함할 수도 있다. 따라서 일반적으로 태닝제는 알데히드 가교결합제, 크롬, 아민, 카르복실산, 설페이트, 설파이트, 설포네이트, 알데히드, 하이드라자이드, 설프하이드릴, 디아지린과 같은 임의 콜라겐 피브릴 가교결합제를 포함한다.
생제작된 가죽 물질을 포함하는 물질을 생성하는 몇몇 방법은 물질을 제공하는 단계, 상기 물질을 전처리하여 이를 콜라겐과의 결합에 적합하게 만드는 단계, 콜라겐 용액을 상기 물질에 도포하는 단계 및 건조하는 단계를 포함한다. 건조는 진공, 열풍 건조, 주변 공기 건조, 가열 압축 및 압력 건조를 통해 물을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 전처리가 요구되는 경우, 상기 전처리는 상기 물질에 공극 또는 구멍을 컷팅하고, 화학적으로 특정 섬유를 제거하고 화학 물질 또는 콜라겐 용액으로 상기 물질을 처리하는 것이다. 또 다른 방법은 상기 물질의 전처리를 요구하지 않는다. 전처리가 요구되지 않는 경우, 상기 물질은 부분적으로 수용성이거나 콜라겐을 보유하지만 물이 통과하는 것을 허용하지 않는다. 적합한 메쉬 크기는 제곱 인치 당 300 스레드(thread) 내지 제곱 피트 당 1 스레드 범위이다. 여기에 사용된 바와 같이, 직물에 결합되거나 결합한다는 용어는 생제작된 가죽이 손으로 잡아 당길 때 직물로부터 쉽게 벗겨지지 않도록 부착된다는 것을 의미한다. 결합의 효능을 시험하기 위한 적합한 방법은 인스트론(Instron)® 물질 시험 기계와 같은 도구에서 수행되는 박리 강도 시험이다. 상기 기계의 죄는부분(Jaw)이 생제작된 가죽 물질에 부착되며, 이것이 결합된 물질과 상기 죄는부분을 상기 물질이 찢어지거나 분리될 때까지 당겨서 분리시킨다. 찢는 힘은 N/mm 단위로 보고된다. 적합한 박리 강도는 약 0.5 N/mm N/cm2 내지 100 N/mm 범위이며, 0.75 N/mm 내지 75 N/mm, 또는 1 N/mm 내지 50 N/mm, 1.5 N/mm 내지 25 N/mm를 포함하며, 인용된 상한 및 하한에 의해 정의되는 모든 범위 및 하위-범위를 포함한다.
단백질(예컨대, 콜라겐) 중의 프롤린 및 라이신 잔기의 하이드록실화 . 콜라겐을 비롯하여, 프롤린과 라이신을 함유하는 단백질의 폴리펩티드의 주요 번역-후 변형은 4-하이드록시프롤린, 3-하이드록시프롤린(Hyp) 및 하이드록시라이신(Hyl)을 산출하기 위한 프롤린 및 라이신 잔기의 하이드록실화 및 하이드록시라이실 잔기의 글리코실화이다. 이러한 변형은 3개의 하이드록실라제--프롤릴 4-하이드록실라제, 프롤릴 3-하이드록실라제, 및 라이실 하이드록실라제-- 및 2개의 글리코실 트란스퍼라제에 의해 촉진된다. 생체 내에서 이러한 반응은 폴리펩티드가 삼중-나선 콜라겐 구조를 형성할 때까지 일어나며, 이는 추가 변형을 억제한다.
프롤릴 -4- 하이드록실라제. 상기 효소는 (2S,4R)-4-하이드록시프롤린(Hyp)으로의 프롤린 잔기의 하이드록실화를 촉진한다. Gorres, et al., Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 45 (2): (2010) 이는 참조로 수록된다. 이하의 실시예는 P4HA(SEQ ID NO: 8 (피키아(Pichia)에 최적화됨) 또는 SEQ ID NO: 15 (고유(native))) 및 P4HB (SEQ ID NO: 9 (피키아(Pichia)에 최적화됨) 또는 SEQ ID NO: 16 (고유))에 의해 인코딩되는 테트라머(tetrameric) 소(bovine)의 프롤릴-4-하이드록실라제(2 알파 및 2 베타 사슬)를 사용하며, 그렇지만, 아형(isoform), 오르토로그(ortholog), 변이체, 단편 및 비-소(non-bovine) 공급원으로부터의 프롤릴-4-하이드록실라제(예컨대, 인간 프롤릴-4-하이드록실라제)가 또한 이들이 효모 숙주 세포에서 하이드록실라제 활성을 보유하는 한 사용될 수 있다. P4HA1의 또 다른 예가 http://www.omim.org/entry/176710 (세포유전학적 위치: 10q22.1; 게놈 좌표 (GRCh38): 10:73,007,216-73,096,973 (NCBI로부터))에 의해 더욱 개시되며 P4HB1의 또 다른 예가 http://www.omim.org/entry/176790 (세포유전학적 위치: 17q25.3; 게놈 좌표 (GRCh38): 17:81,843,157-81,860,667 (NCBI로부터))에 의해 더욱 개시되며 이들 둘 모두는 참조로 수록된다.
본 출원의 문맥에서 "변이체(variant)"는 BLOSUM45, BLOSUM62 또는 BLOSUM80과 같은 유사도 매트릭스를 사용하여, P4HA 및 P4HB 아미노산 서열과 같은, 참조 아미노산에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 또는 99% 서열 일치도, 또는 유사도를 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BLOSUM45는 밀접 관련 서열(closely related sequences)에 대하여 사용될 수 있으며, BLOSUM62는 중간범위 서열(midrange sequences)에 대하여, 그리고 BLOSUM80은 원거리 관련 서열(more distantly related sequences)에 대하여 사용될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한 유사도 점수는 BLOSUM62의 사용을 기준으로 할 것이다. BLASTP가 사용될 때, 퍼센트 유사도는 BLASTP 양성 점수를 기반으로 하며 퍼센트 서열 일치도는 BLASTP 일치도 점수를 기반으로 한다. BLASTP "일치도(Identities)"는 동일한 높은 점수의 서열 쌍 중의 총 잔기의 수와 비율을 나타내고; BLASTP "양성(Positives)"은 정렬 점수가 양수이고 서로 비슷한 잔기의 수와 비율을 나타낸다. 여기에 개시된 아미노산 서열에 대한 이러한 일치도 또는 유사도 또는 임의의 중간 정도의 일치도 또는 유사도를 갖는 아미노산 서열이 본 출원에 의해 고려되고 포함된다. 10의 예상 임계값(Expect Threshold), 3의 워드 크기(Word Size), 매트릭스로서 BLOSUM 62, 및 11(현존(Existence)) 및 1(확장(Extension))의 갭 페널티(Gap Penalty) 그리고 조건부 구성 점수 매트릭스 보정을 사용하는 대표적인 BLASTP 설정. BLASTP에 대한 또 다른 기본 설정은 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome (2017.8.14. 최종 접속)에서 입수 가능한 문헌에 의해 개시되며 이는 참조로서 수록된다. 본 발명 내에서, "변이체"는 프롤릴-4-하이드록실라제 활성을 보유한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 효모 세포는 프롤릴-4-하이드록실라제를 과잉생성하도록 조작된다. 비-제한적인 예는 발현 벡터에 프롤릴-4-하이드록실라제 활성을 표현하는 프롤릴-4-하이드록실라제, 이의 아형(isoform), 이의 오르토로그, 이의 변이체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 프롤릴-4-하이드록실라제 활성을 표현하는 프롤릴-4-하이드록실라제, 이의 아형(isoform), 이의 오르토로그, 이의 변이체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 적합한 효모 세포, 발현 벡터, 및 프로모터가 이하에서 개시된다.
프롤릴 3- 하이드록실라제. 이러한 효소는 프롤린 잔기의 하이드록실화를 촉진한다. 3-하이드록실라제 1 전구체[보스 타우루스 ( Bos taurus)]가 NCBI 참조 서열: NP_001096761.1 (SEQ ID NO: 4)에 의해 또는 NM_001103291.1 (SEQ ID NO: 5)에 의해 개시된다. 추가 설명을 위해서 Vranka, et al., J. Biol. Chem. 279: 23615-23621 (2004) 또는 http://_www.omim.org/entry/610339 (2017.7.14. 최종 접속)를 참조하고 이는 참조로 수록된다. 이러한 효소는 그 고유 형태(native form)로 사용될 수 있다. 그러나, 비-소(non-bovine)의 공급원으로부터의 아형, 오르토로그, 변이체, 단편 및 프롤릴-3-하이드록실라제가 또한 효모 숙주 세포에서 하이드록실라제 활성을 보유하는 한 사용될 수 있다.
본 출원의 문맥에서 "변이체(variant)"는 BLOSUM45, BLOSUM62 또는 BLOSUM80과 같은 유사도 매트릭스를 사용하여, 프롤릴-3-하이드록실라제 아미노산 서열과 같은, 참조 아미노산에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 또는 99% 서열 일치도, 또는 유사도를 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BLOSUM45는 밀접 관련 서열(closely related sequences)에 대하여 사용될 수 있으며, BLOSUM62는 중간범위 서열(midrange sequences)에 대하여, 그리고 BLOSUM80은 원거리 관련 서열(more distantly related sequences)에 대하여 사용될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한 유사도 점수는 BLOSUM62의 사용을 기준으로 할 것이다. BLASTP가 사용될 때, 퍼센트 유사도는 BLASTP 양성 점수를 기반으로 하며 퍼센트 서열 일치도는 BLASTP 일치도 점수를 기반으로 한다. BLASTP "일치도(Identities)"는 동일한 높은 점수의 서열 쌍 중의 총 잔기의 수와 비율을 나타내고; BLASTP "양성(Positives)"은 정렬 점수가 양수이고 서로 비슷한 잔기의 수와 비율을 나타낸다. 여기에 개시된 아미노산 서열에 대한 이러한 일치도 또는 유사도 또는 임의의 중간 정도의 일치도 또는 유사도를 갖는 아미노산 서열이 본 출원에 의해 고려되고 포함된다. 10의 예상 임계값(Expect Threshold), 3의 워드 크기(Word Size), 매트릭스로서 BLOSUM 62, 및 11(현존(Existence)) 및 1(확장(Extension))의 갭 페널티(Gap Penalty) 그리고 조건부 구성 점수 매트릭스 보정을 사용하는 대표적인 BLASTP 설정. BLASTP에 대한 또 다른 기본 설정은 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome (2017.8.14. 최종 접속)에서 입수 가능한 문헌에 의해 개시되며 이는 참조로서 수록된다. 본 발명 내에서, "변이체"는 프롤릴-4-하이드록실라제 활성을 보유한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 효모 세포는 프롤릴-3-하이드록실라제를 과잉생성하도록 조작된다. 비-제한적인 예는 발현 벡터에 프롤릴-3-하이드록실라제 활성을 표현하는 프롤릴-3-하이드록실라제, 이의 아형(isoform), 이의 오르토로그, 이의 변이체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 프롤릴-3-하이드록실라제 활성을 표현하는 프롤릴-3-하이드록실라제, 이의 아형(isoform), 이의 오르토로그, 이의 변이체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 적합한 효모 세포, 발현 벡터, 및 프로모터가 이하에서 개시된다.
라이실 하이드록실라제. 라이실 하이드록실라제(EC 1.14.11.4)는 X-lys-gly 서열에서 라이신 잔기의 하이드록실화에 의한 하이드록시라이신의 형성을 촉진한다. 효소는 약 85kD의 분자 질량을 갖는 서브유닛으로 구성된 호모다이머이다. 라이실 하이드록실라제의 일차 구조와 프롤릴-4-하이드록실라제의 2개 유형의 서브유닛(176710, 176790) 사이에는, 이들 2개의 콜라겐 하이드록실라제 사이에서 운동 특성의 뚜렷한 유사성에도 불구하고, 현저한 상동관계가 발견되지 않았다. 예를 들어, 콜라겐 중의 라이실 하이드록실라제 반응에서 형성된 하이드록시라이신 잔기는 2가지 중요한 기능을 갖는데: 첫째는, 이들의 하이드록시기가 탄수화물 유닛, 즉 모노사카라이드 갈락토오스 또는 디사카라이드 글루코실갈락토오스에 대한 부착 부위로서 작용하고; 둘째, 이들은 분자간 콜라겐 가교결합을 안정화시킨다.
예시적인 라이실 하이드록실라제는 PLOD1 프로콜라겐-라이신이며, 2-옥소글루타레이트 5-디옥시게나제 1 [ 보스 타우루스 ( Bos taurus) (소(cattle))]이 유전자 ID: 281409 (SEQ ID NO: 6)에 의해 개시되며, 2017-05-25 업데이트되었고 이는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/281409 (2017.07.14. 최종 접속됨)에 참조하여 수록된다. 또 다른 예가 SEQ ID NO: 7에 의해 개시되고 이는 보스 타우루스 ( Bos taurus) 라이실 옥시다제 (LOX)를 개시한다. 또 다른 예가 SEQ ID NO: 14에 개시되며, 이는 보스 타우루스 ( Bos taurus) 이작용성 아르기닌 디메틸라제 및 라이실-하이드록실라제 JMJD6이다. 라이실 하이드록실라제 효소는 그 고유 형태로 사용될 수 있다. 그러나, 비-소(non-bovine)의 공급원으로부터의 아형, 오르토로그, 변이체, 단편 및 라이실 하이드록실라제가 또한 효모 숙주 세포에서 하이드록실라제 활성을 보유하는 한 사용될 수 있다.
본 출원의 문맥에서 "변이체(variant)"는 BLOSUM45, BLOSUM62 또는 BLOSUM80과 같은 유사도 매트릭스를 사용하여, 라이실 하이드록실라제 아미노산 서열과 같은, 참조 아미노산에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 또는 99% 서열 일치도, 또는 유사도를 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BLOSUM45는 밀접 관련 서열(closely related sequences)에 대하여 사용될 수 있으며, BLOSUM62는 중간범위 서열(midrange sequences)에 대하여, 그리고 BLOSUM80은 원거리 관련 서열(more distantly related sequences)에 대하여 사용될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한 유사도 점수는 BLOSUM62의 사용을 기준으로 할 것이다. BLASTP가 사용될 때, 퍼센트 유사도는 BLASTP 양성 점수를 기반으로 하며 퍼센트 서열 일치도는 BLASTP 일치도 점수를 기반으로 한다. BLASTP "일치도(Identities)"는 동일한 높은 점수의 서열 쌍 중의 총 잔기의 수와 비율을 나타내고; BLASTP "양성(Positives)"은 정렬 점수가 양수이고 서로 비슷한 잔기의 수와 비율을 나타낸다. 여기에 개시된 아미노산 서열에 대한 이러한 일치도 또는 유사도 또는 임의의 중간 정도의 일치도 또는 유사도를 갖는 아미노산 서열이 본 출원에 의해 고려되고 포함된다. 10의 예상 임계값(Expect Threshold), 3의 워드 크기(Word Size), 매트릭스로서 BLOSUM 62, 및 11(현존(Existence)) 및 1(확장(Extension))의 갭 페널티(Gap Penalty) 그리고 조건부 구성 점수 매트릭스 보정을 사용하는 대표적인 BLASTP 설정. BLASTP에 대한 또 다른 기본 설정은 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome (2017.8.14. 최종 접속)에서 입수 가능한 문헌에 의해 개시되며 이는 참조로서 수록된다. 본 발명 내에서, "변이체"는 프롤릴-4-하이드록실라제 활성을 보유한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 효모 세포는 라이실 하이드록실라제를 과잉생성하도록 조작된다. 비-제한적인 예는 발현 벡터에 라이실 하이드록실라제 활성을 표현하는 라이실 하이드록실라제, 이의 아형(isoform), 이의 오르토로그, 이의 변이체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 라이실 하이드록실라제 활성을 표현하는 라이실 하이드록실라제, 이의 아형(isoform), 이의 오르토로그, 이의 변이체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 적합한 효모 세포, 발현 벡터, 및 프로모터가 이하에서 개시된다.
α 케토글루타레이트 수송체. kgtP 유전자는 대장균( Escherichia coli )에 존재하며 경계 막(boundary membrane)을 가로지르는 α 케토글루타레이트의 섭취 및 수반되는 양이온 도입을 담당하는 α 케토글루타레이트 수송체를 인코딩한다(Membrane Topology Model of Escherichia coli oL-Ketoglutarate Permease by PhoA Fusion Analysis, WONGI SEOLt AND AARON J. SHATKIN, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Jan. 1993, p. 565-567). 유전자는 시아노박테리아로 형질전환되었다(Uptake of 2-Oxoglutarate in Synechococcus Strains Transformed with the Escherichia coli kgtP Gene,
Figure pat00001
ANTONIA HERRERO, AND ENRIQUE FLORES, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Jan. 2000, p. 211-215).
본 발명자들은 kgtP 유전자를 효모로 형질전환시키는 것이 더욱 건강한 생물체를 제공한다는 것을 발견했다. 또한, 효모가 콜라겐 또는 탄수화물과 같은 단백질을 생성하는 경우, 형질전환된 효모는, 단백질 또는 탄수화물이 생성되고 하이드록실화가 일어나는 소포체(endoplasmic reticulum)에서 이용가능한 더 많은 α 케토글루타레이트를 생성함으로써 단백질 또는 탄수화물 생성을 증가시키고 콜라겐의 하이드록실화를 향상시켰다.
예시적인 kgtP 유전자는 SEQ ID NO: 2에 제시되며, 한편 예시적인 α 케토글루타레이트 수송체는 SEQ ID NO: 1에 제시된다. 이러한 효소는 그 고유 형태로 사용될 수 있다. 그러나, 비-대장균(non-E.coli) 공급원으로부터의 아형, 오르토로그, 변이체, 단편 및 α 케토글루타레이트 수송체가 또한 효모 숙주 세포에서 α 케토글루타레이트 수송체 활성을 보유하는 한 사용될 수 있다. 또한, kgtP 유전자는 효모에서의 발현을 위하여 최적화될 수 있다. 예를 들어, 피키아(Pichia)에서의 발현을 위하여 최적화된 α 케토글루타레이트 수송체 유전자(kgtP)의 예가 SEQ ID NO: 3에 제시된다.
본 출원의 문맥에서 "변이체(variant)"는 BLOSUM45, BLOSUM62 또는 BLOSUM80과 같은 유사도 매트릭스를 사용하여, α 케토글루타레이트 수송체 아미노산 서열과 같은, 참조 아미노산에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 또는 99% 서열 일치도, 또는 유사도를 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BLOSUM45는 밀접 관련 서열(closely related sequences)에 대하여 사용될 수 있으며, BLOSUM62는 중간범위 서열(midrange sequences)에 대하여, 그리고 BLOSUM80은 원거리 관련 서열(more distantly related sequences)에 대하여 사용될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한 유사도 점수는 BLOSUM62의 사용을 기준으로 할 것이다. BLASTP가 사용될 때, 퍼센트 유사도는 BLASTP 양성 점수를 기반으로 하며 퍼센트 서열 일치도는 BLASTP 일치도 점수를 기반으로 한다. BLASTP "일치도(Identities)"는 동일한 높은 점수의 서열 쌍 중의 총 잔기의 수와 비율을 나타내고; BLASTP "양성(Positives)"은 정렬 점수가 양수이고 서로 비슷한 잔기의 수와 비율을 나타낸다. 여기에 개시된 아미노산 서열에 대한 이러한 일치도 또는 유사도 또는 임의의 중간 정도의 일치도 또는 유사도를 갖는 아미노산 서열이 본 출원에 의해 고려되고 포함된다. 10의 예상 임계값(Expect Threshold), 3의 워드 크기(Word Size), 매트릭스로서 BLOSUM 62, 및 11(현존(Existence)) 및 1(확장(Extension))의 갭 페널티(Gap Penalty) 그리고 조건부 구성 점수 매트릭스 보정을 사용하는 대표적인 BLASTP 설정. BLASTP에 대한 또 다른 기본 설정은 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome (2017.8.14. 최종 접속)에서 입수 가능한 문헌에 의해 개시되며 이는 참조로서 수록된다. 본 발명 내에서, "변이체"는 프롤릴-4-하이드록실라제 활성을 보유한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 효모 세포는 α 케토글루타레이트 수송체를 과잉생성하도록 조작된다. 비-제한적인 예는 발현 벡터에 α 케토글루타레이트 수송체 활성을 표현하는 α 케토글루타레이트 수송체, 이의 아형(isoform), 이의 오르토로그, 이의 변이체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, α 케토글루타레이트 수송체 활성을 표현하는 α 케토글루타레이트 수송체, 이의 아형(isoform), 이의 오르토로그, 이의 변이체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 적합한 효모 세포, 발현 벡터, 및 프로모터가 이하에서 개시된다.
아스코르베이트 합성 경로가 작동되도록 하는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (들)
효모, 식물 및 동물에서의 L-아스코르빈산, 아스코르베이트 생합성 경로가 예컨대, Smirnoff (2001) Vitamins & Hormones 61-241-266 및 Vitamin C. Functions and biochemistry in animals and plants Asard et al (ed.). Garland Science/BIOS Scientific Publishers, 2004에 개시된다. 다양한 유전자가 개별적으로 또는 조합하여 효모에서의 아스코르베이트 합성을 가능하게 하기 위해 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 식물 경로를 위하여 포함하며, GDP-L-갈락토오스를 L-갈락토오스-1-P로 전환시키는 GDP-L-Gal 포스포릴라제, L-갈락토오스-1-P를 L-갈락토오스로 전환시키는 이노시톨-포스페이트 포스파타제, GDP-D-만노스를 GDP-L-갈락토오스로 전환시키는 GDP-만노스-3,5-에피머라제를 인코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드가 효모로 형질전환될 수 있다. 피키아(Pichia)는 이미 경로를 완결하기 위해 필요한 또 다른 유전자를 갖는다. 이러한 유전자는 다음 효소들을 제공한다: 헥소키나제, 글루코오스-6-포스페이트-아이소머라제, 만노스-6-포스페이트-아이소머라제, 포스포만노뮤타제 및 만노스-1-포스페이트-구아닐일트란스퍼라제.
동물 경로를 위하여, 다음 유전자가 첨가될 수 있다: L-굴로노-1,4-락톤을 L-아스코르베이트로 전환시키는 L-굴로노-1,4-락톤옥시다제, L-굴론산을 L-굴로노-1,4-락톤으로 전환시키는 알도노락토나제, D-글루쿠론산을 D-글루쿠로노 락톤으로 전환시키는 글루쿠로노 락톤리덕타제, D-글루쿠론산을 L-굴론산으로 전환시키는 D-글루쿠로네이트 리덕타제, D-글루쿠론산을 D-글루쿠로노 락톤으로 전환시키는 우로노락토나제, D-글루쿠론산-1-P를 D-글루쿠론산으로 전환시키는 D-글루쿠로노 키나제, UDP-글루쿠론산을 D-글루쿠론산-1-P로 전환시키는 글루쿠로네이트-1-포스페이트 우리딜일트란스퍼라제, UDP-D-글루코오스를 UDP-글루쿠론산으로 전환시키는 UDP-D-글루코오스 데하이드로제나제, D-글루코오스-1-P를 UDP-D-글루코오스로 전환시키는 UTP- 글루코오스-1-포스페이트 우리딜일트란스퍼라제, D-Glc-6-P를 D-글루코오스-1-P로 전환시키는 포스포글루코뮤타제, 및/또는 D-글루코오스를 D-Glc-6-P로 전환시키는 헥소키나제.
효모가 아스코르베이트를 생성하도록 모든 효소에 대한 모든 유전자를 형질전환시키는 것이 필수적인 것은 아니다. 실제로, 본 발명에서, 효모 세포에 공급된 아스코르베이트 경로 전구체의 하류에서 아스코르베이트 합성 경로의 일부분을 위한 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 삽입하는 것만이 필요하다는 것을 알 수 있다. 예를 들어, L-갈락토오스-1-P를 L-갈락토오스로 전환시키는 효소 이노시톨-포스페이트 포스파타제를 위한 유전자를 효모 내에 삽입시키고 그 후 L-갈락토오스-1-P를 효모에 공급할 수 있으며, 이는 효모가 L-아스코르베이트를 생성하도록 한다.
GDP-L-Gal 포스포릴라제는 애기 장대(Arabidopsis thaliana)로부터 제공될 수 있으며 SEQ ID NO: 21의 염기 서열 전부 또는 일부분을 포함할 수 있다.
GDP-L-Gal 포스포릴라제의 대표적인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 22에 제시된 바와 같다.
이노시톨-포스페이트 포스파타제(EC　3.1.3.25)는 공지된 효소 종류이며 L-갈락토오스 1-포스페이트(L-Gal 1-P), D-미오이노시톨 3-포스페이트(D-Ins 3-P) 및 D-미오이노시톨 1-포스페이트(D-Ins 1-P)에 작용하는 포스파타제이다. 베타-글리세로포스페이트 (글리세롤 2-P) 및, 보다 적게는, D-갈락토오스 1-포스페이트 (D-Gal 1-P), 알파-D-글루코오스 1-포스페이트 (a-D-Glc 1-P), D-만니톨 1-포스페이트 및 아데노신 2'-모노포스페이트를 기질로서 사용할 수 있다. D-프룩토오스 1-포스페이트 (D-Fru 1-P), 프룩토오스 1,6-비스포스페이트 (Fru 1,6-bisP), D-글루코오스 6-포스페이트 (D-Glc 6-P), D-알파-글리세로포스페이트 (글리세롤 3-P), D-소르비톨 6-포스페이트 및 D-미오이노시톨 2-포스페이트에 대하여 활성이 없다. 6-원자 고리 기질에서의 C1 포스페이트 위치는 촉매작용을 위하여 중요하다. 71, 91, 93, 94, 및 221에서의 애기 장대 (Arabidopsis thaliana )로부터의 아미노산 위치는 금속 결합에 기여하며 아미노산 위치 71 및 213은 기질 결합에 기여한다. 대표적인 염기 서열은 SEQ ID NO: 23에 제시된다.
이노시톨-포스페이트 포스파타제의 한 가지 아형이 SEQ ID NO: 24에 제시된다.
GDP-만노스-3,5-에피머라제 (EC　5.1.3.18)는 공지된 효소 종류이며 비타민 C(L-아스코르베이트)의 생합성에서 수행되는 단계에 선행하는 GDP-D-만노스의 가역적 에피머화를 촉진하여, 매우 활성인 글리코실-피로포스포릴 결합의 가수분해를 야기한다. 2개의 개별적인 에피머화 반응을 촉진할 수 있으며 GDP-L-갈락토오스와 GDP-L-굴로오스 둘 모두를 GDP-만노스로부터 분리시킬 수 있다. 애기 장대(Arabidopsis thaliana)에서, 영역 143-145, 216-21 및/또는 241-243이 효소 활성에 포함된 하나 또는 그 이상의 위치 145, 174, 178, 217 및/또는 306 및 NAD 결합에 포함된 하나 또는 그 이상의 위치 58, 78, 174, 및/또는 178, 기질 결합에 포함된 하나 또는 그 이상의 위치 103, 203, 225, 306 및/또는 356이 있는 기질 결합에 포함된다.
여기에 사용되는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열의 전부 또는 일부분을 인코딩할 수 있다.
L-굴로노-1,4-락톤옥시다제(EC　1.1.3.8)는 공지된 효소 종류이며 아스코르빈산의 생합성에 포함된다. 애기 장대(Arabidopsis thaliana)에서, 위치 156은 활성에 포함되며 바람직하게는 FAD 결합에 포함된 아미노산 123-258이 있는 아미노산 102 내지 610 또는 이의 단편만을 함유한다.
여기에 사용된 폴리뉴클레오타이드는 적어도 1종의 아형, 예를 들어 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열의 전부 또는 일부분을 인코딩할 수 있다.
서열이 KSPISPAFSTSEDDIFSWV　(SEQ ID NO: 27) 및 WYNHVPPDSRPSPEKGHHR (SEQ ID NO: 28)로부터 변형된 494-512 에서의 상기 서열로부터의 두 번째 아형은 513-610 이 결핍된다.
글루쿠로노 락톤리덕타제(EC　1.1.1.20)는 공지된 효소 종류이며 L-굴로노-1,4-락톤　+　NADP(+)　<=>　D-글루쿠로노-3,6-락톤　+　NADPH의 반응을 촉진하며, 예컨대 공개적으로 접속 가능한 유니프로트(UniProt) 데이터베이스로부터 아래에 제시된 바와 같은 많은 생물체로부터 해당 분야에 공지되어 있다:
Figure pat00002
알도노락토나제는 해당 분야에 공지되어 있으며 일부 경우에 글루코노락토나제(EC　3.1.1.17)로 또한 불리며 공개적으로 접속 가능한 유니프로트(UniProt) 데이터베이스로부터 아래에 제시된 바와 같은 많은 생물체로부터 알려져 있다:
Figure pat00003
Figure pat00004
D-글루쿠로네이트 리덕타제(EC　1.1.1.19)는 공지된 효소 종류이며 예컨대 공개적으로 접속 가능한 유니프로트(UniProt) 데이터베이스로부터 아래에 제시된 바와 같은 많은 생물체로부터 알려져 있다:
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
우로노락토나제는 공지된 효소 종류이며(EC 3.1.1.19) D-글루쿠로노-6,2-락톤　+　H(2)O　<=>　D-글루쿠로네이트의 반응을 촉진하며 또한 글루쿠로노락토나제 또는 D-글루쿠로노-6,2-락톤 락토노하이드롤라제로 알려져 있으며 이러한 효소 활성과 관련된 많은 효소가 알려져 있으며, EC 3.1.1.19를 참조하라.
D-글루쿠로노키나제(EC 2.7,1,43)는 공지된 효소 종류이며 예를 들어 애기 장대(Arabidopsis thaliana)로부터 유래하며 UDP-글루크론산(UDP-GlcA)과 결합에 포함된 아미노산 126-136과의 생합성에 포함된다. 여기에 사용되는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열의 전부 또는 일부분을 인코딩할 수 있다.
글루쿠로네이트-1-포스페이트 우리딜일트란스퍼라제는 공지된 효소 종류이며(EC　2.7.7.44) UTP + 1-포스포-알파-D-글루쿠로네이트에서 디포스페이트 + UDP-글루쿠로네이트로의 화학 반응을 촉진하며 해당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어 공개적으로 접속 가능한 유니프로트(UniProt) 데이터베이스로부터 아래에 제시된 바와 같이 많은 생물체로부터 유래한다:
Figure pat00009
Figure pat00010
Figure pat00011
UDP-D-글루코오스 데하이드로제나제(EC 1.1.1.22)는 공지된 효소 종류이며 화학 반응 UDP-글루코오스 + 2 NAD+　+ H2O　UDP-글루쿠로네이트 + 2 NADH + 2 H+ (E.C. 1.1.1.22)를 촉진하고 SEQ ID NO: 30의 전부 또는 일부분을 포함할 수 있다.
유니프로트(UniProt) 공개적으로 접속 가능한 데이터베이스로부터의 또 다른 서열은 다음과 같다:
Figure pat00012
UTP- 글루코오스-1-포스페이트 우리딜일트란스퍼라제(EC 2.7.7.9)는 공지된 효소 종류이며 또한 글루코오스-1-포스페이트 우리딜일트란스퍼라제　(또는 UDP-글루코오스 피로포스포릴라제)로 알려져 있으며 탄수화물 대사에 포함된 효소이다. 이는 글루코오스-1-포스페이트 및　UTP로부터 UDP-글루코오스를 합성한다. 해당 분야에는 이러한 종류와 관련된 다양한 종으로부터 공지된 수천 가지의 서열이 존재한다.
포스포글루코뮤타제(EC　5.4.2.2)는 공지된 효소 종류이며 α-D-글루코오스 모노머의 포스페이트 그룹을 전방향으로 1'에서 6' 위치로 또는 역방향으로 6'에서 1' 위치로 전달하는 효소이다. 해당 분야에는 이러한 종류와 관련된 다양한 종으로부터 공지된 수천 가지의 서열이 존재한다.
헥소키나제(EC 2.7.1.1)는 공지된 효소 종류이며 헥소오스 포스페이트를 형성하는 헥소오스(6-탄당)를 인산화(phosphorylate)시킨다. 해당 분야에는 이러한 종류와 관련된 다양한 종으로부터 공지된 수천 가지의 서열이 존재한다.
재조합 단백질(예컨대, 콜라겐)에서의 프롤린 잔기의 수산화도 분석. 본 발명에 따라 생성된 재조합 단백질(예컨대, 콜라겐)에서의 프롤린 잔기의 수산화도는 참조로 수록되는 Chan, et al., BMC Biotechnology 12:51 (2012)에 개시된 바와 같이 액체 크로마토 그래피 질량 분석법(liquid chromatography-mass spectrometry)을 비롯하여 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다.
재조합 단백질(예컨대, 콜라겐)에서의 라이신 잔기의 하이드록실화 정도 분석. 콜라겐의 가교결합 및 라이신 하이드록실화는 참조로 수록되는 Yamauchi, et al., Methods in Molecular Biology, vol. 446, pages 95-108.; Humana Press (2008)에 의해 개시된다. 본 발명에 따라 생성된 재조합 단백질(예컨대, 콜라겐)에서의 라이신 잔기의 수산화도는 참조로 수록되는 Hausmann, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure 133(3): 591-593 (1967)에 의해 개시된 방법에 의한 것을 비롯하여, 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다.
수산화도. 본 발명에 따라 생성된 단백질(예컨대, 콜라겐)에서의 프롤린 또는 라이신 잔기의 수산화도 바람직하게는 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 100%이다. 또한 본 발명의 범위 내에서 프롤린 + 라이신 잔기의 수산화도는 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 100%이다.
콜라겐 녹는점. 콜라겐에서의 프롤린, 라이신 또는 프롤린과 라이신 잔기의 수산화도는 공지된 함량의 수산화된 아미노산 잔기를 갖는 대조군 콜라겐과 비교하여, 예컨대 하이드로겔과 같은 수화된 콜라겐의 용융 온도에 의해 평가될 수 있다. 콜라겐 용융 온도는 25-40℃의 범위일 수 있으며 더욱 고도로 수산화된 콜라겐은 일반적으로 더 높은 용융 온도를 갖는다. 이러한 범위는 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40°C로부터 선택된 온도에 의해 하한 및 상한이 제한되는 하위범위를 포함하는 수치 및 중간 하위범위를 포함한다.
코돈- 변형. 본 발명의 범위 내에서 효모 숙주 세포 내로 도입된 유전자 서열은 그 고유 서열(native sequence)로부터 변형된다는 것이 예상된다. 이러한 과정은, 예컨대 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모에 의해 발현되는 재조합 단백질(예컨대, 콜라겐)의 양을 조절하기 위해, 재조합 효모에 의해 분비되는 재조합 단백질(예컨대, 콜라겐)의 양을 조절하기 위해, 재조합 효모에서의 재조합 단백질(예컨대, 콜라겐)의 발현 속도를 조절하기 위해, 또는 재조합 단백질(예컨대, 콜라겐)에서의 라이신 또는 프롤린 잔기의 수산화도를 조절하기 위해, 해당 단백질(예컨대 자연에서 발견되는 콜라겐 DNA 서열과 같은 콜라겐)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 변경을 포함한다. 코돈 변형은 또한 유사한 목적을 위하여 하이드록실라제와 같은 또 다른 단백질에 또는 특정한 세포내 또는 세포외 구획에 대한 표적 하이드록실라제에, 예를 들어 소포체(endoplasmic reticulum)와 같은, 동일한 구획에 대한 표적 프롤린 하이드록실라제에, 재조합 단백질(예컨대, 콜라겐) 분자로서, 적용될 수 있다. 코돈 선택은 RNA 이차 구조에 대한 효과, 전사 및 유전자 발현에 대한 효과, 번역 신장(translation elongation)의 속도에 대한 효과, 및/또는 단백질 접힘에 대한 효과에 기반하여 이루어진다.
콜라겐 또는 하이드록실라제를 인코딩하는 코돈은 재조합 콜라겐 또는 하이드록실라제를 인코딩하는 mRNA 중의 이차 구조를 감소시키거나 증가시키기 위해 변형될 수 있거나, 또는 과잉 코돈을, 평균적으로 효모에서의 모든 단백질-코딩 서열에 기초하여(예컨대, 코돈 샘플링) 효모 숙주 세포에 의해 최고 빈도수로 사용되는 코돈, 효모에서의 모든 단백질-코딩 서열에 기초하여(예컨대, 코돈 샘플링) 효모 숙주 세포에 의해 최저 빈도수로 사용되는 코돈, 또는 효모 숙주 세포에 의해 과잉-발현되는 단백질에서 나타나거나 또는 효모 숙주 세포에 의해 분비되는 단백질에서 나타나는 과잉 코돈으로 대체하기 위해 변형될 수 있다(예컨대, 유전자를 고도로 발현된 유전자 또는 발현 숙주로부터 분비가능한 단백질을 인코딩하는 유전자처럼 보이게 하는 높은 코돈 적응 지수(High Codon Adaptation Index)를 기반으로 하는 코돈 선택).
코돈-변형은 단백질-코딩 서열의 전부 또는 일부에 적용될 수 있는데, 예를 들어, 코딩-서열의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9 또는 제 10의 10% 또는 그 조합 중 적어도 하나에 적용될 수 있다. 이는 또한 특정 아미노산을 인코딩하는 코돈 또는 과잉 코돈에 의해 인코딩된 전부가 아닌 일부 아미노산을 인코딩하는 코돈에 선택적으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 류신 및 페닐알라닌에 대한 코돈만이 전술한 바와 같이 코돈-변형 될 수 있다. 하나 초과의 코돈에 의해 인코딩되는 아미노산이 코돈 테이블에 의해 개시되며, 이는 해당 분야에서 공지되어 있다.
코돈-변형은 https://www.atum.bio/services/genegps (2017.7.13. 최종 접속), https://www.idtdna.com/CodonOpt 또는 Villalobos, Alan et al. BMC Bioinformatics 7 (2006): 285. PMC. Web. 17 Aug. 2017에 의해 개시되는 소위 코돈-최적화 방법을 포함하며, 이들은 참조로 여기에 수록된다.
코돈-변형은 또한 mRNA 이차 구조의 형성을 허용하기 위하거나 또는 이차 구조를 최소화하거나 제거하기 위한 코돈의 선택을 포함한다. 이러한 것의 예는 리보솜-결합 부위 또는 개시 코돈에서 또는 그 주위에서 이차 구조 강한 이차 구조를 제거, 감소 또는 약화시키기 위해 코돈 선택을 하는 것이다.
본 발명의 한 구체예에서 α 케토글루타레이트 수송체 유전자 서열은 효모, 즉 특정 피키아(Pichia)에서의 사용을 위해 최적화된다. 최적화된 α 케토글루타레이트 수송체 유전자(kgtP)의 예는 SEQ ID NO: 3에 제시된다.
콜라겐 단편. 재조합 콜라겐 분자는 각각 참조로 수록되는 예컨대 가입 번호 NP_001029211.1 (SEQ ID NO: 11) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/77404252, 2017.8.23. 최종 접속), NP_776945.1 (SEQ ID NO: 12) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/27806257 2017.8.23. 최종 접속) 및 NP_001070299.1 (SEQ I NO: 13) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/116003881 2017.2.9. 최종 접속)에 의해 개시된, Col1A1, Col1A2, 및 Col3A1의 아미노산 서열의 그것들과 같이, 트로포콜라겐(트리머 콜라겐)을 형성할 수 있는 고유 콜라겐 분자 또는 고유 콜라겐 아미노산 서열에 대하여(또는 이의 영역을 형성하는 피브릴에 대하여 또는 실질적으로 [Gly-X-Y]n을 포함하는 세그먼트에 대하여) 적어도 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 일치하거나 유사한 아미노산 서열을 갖는 절단된 콜라겐 분자 또는 변형된 콜라겐 분자의 아미노산 서열의 단편을 포함할 수 있다.
콜라겐 또는 하이드록실라제를 인코딩하는 유전자는 서열을 추가하거나 제거하기 위해 절단되거나 또는 또 다른 방식으로 변형될 수 있다. 이러한 변형은 발현된 단백질을 소포체(endoplasmic reticulum) 또는 또 다른 세포 또는 세포외 구획에 표적화하기 위하거나, 또는 인코딩된 단백질의 길이를 조절하기 위해, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 크기를 맞춤화하기 위해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 단지 프리(Pre) 서열만을 함유하는 구조체가 종종 전체 프리-프로(Pre-pro) 서열을 함유하는 것들보다 더욱 잘 작동함을 발견하였다. 프리 서열(Pre sequence)은 P4HB에 융합되어 ER에서 P4HB를 국소화시켰으며 여기서는 또한 콜라겐이 국소화된다.
콜라겐 및 하이드록실라제를 위한 변형된 코딩 서열. 콜라겐 또는 하이드록실라제, 또는 또 다른 단백질을 위한 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열은, 공지된 아미노산 서열에 대하여 적어도 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 100% 일치하거나 유사하고 그리고 변형되지 않은 분자의 본질적인 특성, 예를 들어, 콜라겐에서 프롤린 또는 라이신 잔기를 수산화시키는 능력 또는 트로포콜라겐을 형성하는 능력을 보유하는 단백질을 인코딩하도록 변형될 수 있다. 콜라겐 분자에서의 글리코실화 부위는 제거되거나 추가될 수 있다. 변형은 효모 숙주 세포에 의한 콜라겐 수득률 또는 그 분비를 촉진하기 위해 또는 그 구조적, 기능적, 또는 미적 특성을 변화시키기 위해 이루어질 수 있다. 변형된 콜라겐 또는 하이드록실라제 코딩 서열이 또한 여기에 개시된 바와 같이 코돈-변형될 수 있다.
BLASTN은 예컨대 콜라겐, 여기에 개시된 하나 또는 그 이상의 하이드록실라제, 또는 신호, 리더, 또는 분비 펩티드 또는 여기에 개시된 임의 또 다른 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 같은 참조 폴리뉴클레오타이드에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% 또는 <100% 서열 일치도를 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 매우 유사한 서열을 찾기 위해 변형된 대표적인 BLASTN 설정은 10의 예상 임계값(Expect Threshold) 및 28의 워드크기(Wordsize), 0의 검색어 범위에서 최대 일치, 1/-2의 일치/불일치 점수, 및 선형 간격 비용(linear gap cost)을 사용한다. 낮은 복잡도 영역은 필터링되거나 마스크될 수 있다. 표준 뉴클레오타이드(Standard Nucleotide) BLAST의 기본 설정은 해당 분야에 공지되어 있다.
BLASTP는 BLOSUM45, BLOSUM62 또는 BLOSUM80과 같은 유사도 매트릭스를 사용하여, 콜라겐 아미노산 서열과 같은, 참조 아미노산에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% 또는 <100% 서열 일치도, 또는 유사도를 갖는 아미노산 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 BLOSUM45는 밀접 관련 서열(closely related sequences)에 대하여 사용될 수 있으며, BLOSUM62는 중간범위 서열(midrange sequences)에 대하여, 그리고 BLOSUM80은 원거리 관련 서열(more distantly related sequences)에 대하여 사용될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한 유사도 점수는 BLOSUM62의 사용을 기준으로 할 것이다. BLASTP가 사용될 때, 퍼센트 유사도는 BLASTP 양성 점수를 기반으로 하며 퍼센트 서열 일치도는 BLASTP 일치도 점수를 기반으로 한다. BLASTP "일치도(Identities)"는 동일한 높은 점수의 서열 쌍 중의 총 잔기의 수와 비율을 나타내고; BLASTP "양성(Positives)"은 정렬 점수가 양수이고 서로 비슷한 잔기의 수와 비율을 나타낸다. 여기에 개시된 아미노산 서열에 대한 이러한 일치도 또는 유사도 또는 임의의 중간 정도의 일치도 또는 유사도를 갖는 아미노산 서열이 본 출원에 의해 고려되고 포함된다. 10의 예상 임계값(Expect Threshold), 3의 워드 크기(Word Size), 매트릭스로서 BLOSUM 62, 및 11(현존(Existence)) 및 1(확장(Extension))의 갭 페널티(Gap Penalty) 그리고 조건부 구성 점수 매트릭스 보정을 사용하는 대표적인 BLASTP 설정. BLASTP에 대한 또 다른 기본 설정은 해당 분야에 공지되어 있다.
여기에 개시된 폴리펩티드에 적용되는 용어 "변이체", "변형된 서열" 또는 "유사체"는 생물학적 활성 분자의 아미노산 서열에 대하여 적어도 70, 80, 90, 95, 또는 99% 일치하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 구체예에서, 유도체는 고유 서열 또는 사전 조작된 서열의 아미노산 서열에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 유도체는 고유 분자 또는 사전 조작된 분자의 아미노산 서열에 대한 추가, 제거, 치환, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유도체는 고유 콜라겐 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 프롤린 또는 라이신 잔기를 도입하거나 제거할 수 있다. 이러한 선택은 재조합 트로포콜라겐 또는 피브릴화된 콜라겐의 느슨함(looseness) 또는 견고함(tightness)을 변경하기 위해 이루어질 수 있다.
유도체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-15, 16- 20, 21-25, 또는 26-30의 아미노산 잔기의 추가, 치환, 또는 제거를 갖는 변종 폴리펩티드를 포함할 수도 있다. 추가 또는 치환은 또한 비-자연적으로 발생하는 아미노산 또는 변형된 아미노산의 사용을 포함한다. 유도체는 또한 폴리펩티드에 대한 화학적 변형, 예컨대 시스테인 잔기들, 또는 수산화된 또는 글리코실화된 잔기들 사이의 가교결합을 포함할 수 있다.
효모 균주(Yeast strains). 본 발명은 콜라겐 또는 또 다른 단백질 또는 탄수화물을 생성하는 효모를 사용한다. 특히, 본 발명은 증가된 수산화도를 갖는 콜라겐 또는 또 다른 탄수화물을 생성하기 위하여 변형된 효모를 사용한다. 효모는 kgtP 유전자를 발현하는 유전자, 하이드록실라제를 발현하는 유전자, 또는 기능성 아스코르베이트 합성 경로를 완결하는데 필수적인 유전자 중 하나 이상을 삽입함으로써 α 케토글루타레이트 및/또는 아스코르빈산을 생성하거나 과생성하도록 조작될 수 있다.
적절한 효모는 비제한적으로 유전자 피키아 ( Pichia ), 칸디다( Candida ), 코마타가젤라 (Komatagaella), 한세눌라 ( Hansenula ), 크립토코커스 ( Cryptococcus ), 사카로마이세스 ( Saccharomyces ) 및 이들의 조합의 효모를 포함한다. 효모는 변형되거나 잡종으로 될 수 있다. 잡종 효모는 동일 종의 다른 균주, 동일 속의 다른 종 또는 다른 속의 균주의 혼합된 번식이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 효모 균주의 예는 Pichia pastoris , Pichia membranifaciens , Pichia deserticola , Pichia cephalocereana , Pichia eremophila , Pichia myanmarensis , Pichia anomala , Pichia nakasei , Pichia siamensis , Pichia heedii, Pichia barkeri , Pichia norvegensis , Pichia thermomethanolica , Pichia stipites , Pichia subpelliculosa, Pichia exigua , Pichia occidentalis , Pichia cactophila , Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces pombe , 등을 포함한다.
피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 인간 인터페론 감마와 같은 생물치료학적 단백질을 재조합적으로 발현하는데 사용된 효모 종이며, Razaghi, et al., Biologicals 45: 52- 60 (2017)을 참조하라. 이는 유형 III 콜라겐 및 프롤릴-4-하이드록실라제를 발현하기 위해 사용되었으며, Vuorela, et al., EMBO J. 16:6702-6712 (1997)를 참조하라. 콜라겐 및 프롤릴-4-하이드록실라제가 또한 콜라겐성 물질을 생성하기 위해 대장균( Escherichia coli )에서 발현되었으며, Pinkas, et al., ACS Chem. Biol. 6(4):320-324 (2011)를 참조하라.
하나의 구체 예에서, 본 발명은 코돈-최적화된 콜라겐, 하이드록실라제(들), α 케토글루타레이트 수송체, 및/또는 기능성 아스코르베이트 합성 경로를 완결하는데 필수적인 유전자를 발현하기 위해 조작되어왔던 피키아 파스토리스 ( Pichia pastoris) 균주에 관한 것이다. 유용한 피키아 파스토리스 ( Pichia pastoris ) 숙주 균주는 비제한적으로 야생형(wild type) (균주 PPS-9010); PPS-9010의 느린 메탄올 이용 유도체인 aox1Δ (MutS)(균주 PPS-9011); 및 프로테아제 결핍된 pep4Δ, prb1Δ (균주 PPS-9016)를 포함한다. 이들 균주들은 공개적으로 입수가능하며 https://www._atum.bio/products/cell-strains에서 ATUM으로부터 획득할 수 있다.
효모에 대한 폴리펩티드 분비 서열. 일부 구체예에서, 효모 숙주 세포에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 효모로부터 그 분비를 촉진하는 폴리펩티드 서열에 융합된다. 예를 들어, 벡터는 분비 펩티드를 인코딩하는 서열에 융합된 콜라겐에 대한 코딩 서열을 포함하는 키메라 유전자(chimeric gene)를 인코딩할 수 있다. 이러한 목적을 위하여 사용될 수 있는 분비 서열은 Saccharomyces 알파 교배 인자 프리프로 서열, Saccharomyces 알파 교배 인자 프리 서열, PHO1 분비 신호, Aspergillus niger로부터의 α-아밀라제 신호 서열, Aspergillus awamori로부터의 글루코아밀라제 신호 서열, Homo sapiens로부터의 혈청 알부민 신호 서열, Kluyveromcyes maxianus로부터의 이눌리나제 신호 서열, Saccharomyces cerevisiae로부터의 인버타제 신호 서열, Saccharomyces cerevisiae로부터의 킬러 단백질 신호 서열 및 Gallus gallus로부터의 리소자임 신호 서열을 포함한다. 해당 분야에 공지된 또 다른 분비 서열이 또한 사용될 수 있다.
효모 프로모터 및 터미네이터. 일부 구체예에서 이하의 효모 프로모터 중 하나 이상이 해당 단백질(예컨대, 콜라겐), 하이드록실라제(들), α 케토글루타레이트 수송체, 및/또는 기능성 아스코르베이트 합성 경로를 완결하는데 필수적인 유전자(들)를 인코딩하는 mRNA의 전사를 촉진하기 위해 벡터 내에 혼입될 수 있다. 프로모터는 해당 분야에 공지되어 있으며 pAOX1, pDas1, pDas2, pPMP20, pCAT, pDF, pGAP, pFDH1, pFLD1, pTAL1, pFBA2, pAOX2, pRKI1, pRPE2, pPEX5, pDAK1, pFGH1, pADH2, pTPI1, pFBP1, pTAL1, pPFK1, pGPM1, 및 pGCW14를 포함한다.
일부 구체 예에서 효모 터미네이터 서열이 해당 단백질(예컨대, 콜라겐), 하이드록실라제(들), α 케토글루타레이트 수송체, 및/또는 기능성 아스코르베이트 합성 경로를 완결하는데 필수적인 유전자(들)를 인코딩하는 mRNA의 전사를 종결하기 위해 벡터 내에 혼입된다. 터미네이터는 비제한적으로 AOX1 TT, Das1 TT, Das2 TT, AOD TT, PMP TT, Cat1 TT, TPI TT, FDH1 TT, TEF1 TT, FLD1 TT, GCW14 TT, FBA2 TT, ADH2 TT, FBP1 TT, 및 GAP TT를 포함한다.
펩신 이외의 펩티다제 . 펩신은 N-말단 및 C-말단 서열을 제거함으로써 콜라겐을 트로폴라겐으로 처리하는데 사용될 수 있다. 비제한적으로 콜라게나제, 트립신, 키모트립신, 파파인, 피케인, 및 브로멜라인을 포함하는 또 다른 프로테아제가 이러한 목적을 위하여 또한 사용될 수 있다. 여기에 사용된 바와 같이, "안정한 콜라겐"은 펩신 또는 또 다른 프로테아제의 특정 농도에 노출된 이후에도 초기 콜라겐 농도의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%가 여전히 존재함을 의미한다. 바람직하게는, 적어도 75%의 안정한 콜라겐이 동일한 조건에서 동일한 시간 동안 처리된 불안정한 콜라겐과 비교하여, 펩신 또는 또 다른 프로테아제로 처리된 이후에 잔류할 것이다. 번역-후 변형 이전에, 콜라겐은 높은 펩신 농도(예컨대, 펩신:단백질 비율이 1:200 또는 그 이상)의 존재 하에서 수산화되지 않으며 분해된다.
일단 번역-후 변형되면 콜라겐은 펩신 또는 또 다른 프로테아제와 접촉하여 콜라겐의 N-말단 및 C-말단 프로펩티드를 절단함으로써, 콜라겐 피브릴화를 가능하게 한다. 수산화된 콜라겐은 비-수산화된 콜라겐과 비교하여 더 나은 열안정성을 가지며 예를 들어 펩신:전체 단백질 비율이 1:25 내지 1:1에서, 고농축 펩신 소화에 내성이 있다. 따라서, 재조합 콜라겐의 조기 단백질분해(proteolysis)를 피하기 위하여, 수산화된 콜라겐을 제공하는 것이 유용하다.
대체 발현 시스템. 콜라겐 및 또 다른 단백질이 피키아 파스토리스 ( Pichia pastoris ) 이외의 또 다른 종류의 효모 세포에서 발현될 수 있으며, 예를 들어, 또 다른 효모, 메틸로트로픽 효모 또는 또 다른 생물체에서 발현될 수 있다. 사카로마이세스 세레비시애 ( Saccharomyces cerevisiae )는 임의의 많은 수의 발현 벡터와 함께 사용될 수 있다. 통상적으로 사용되는 발현 벡터는, 외래 유전자의 효율적인 전사를 위하여, 효모에서의 증식을 위한 2P 복제 시작점(origin of replication) 및 대장균(E. coli )에 대한 Col E1 시작점(origin)을 함유하는 셔틀 벡터이다. 2P 플라스미드에 기초한 이러한 벡터의 전형적인 예는 pWYG4이며, 이는 2P ORI-STB 요소(elements), GAL1-10 프로모터, 및 2P D 유전자 터미네이터를 갖는다. 이러한 벡터에서, Ncol 클로닝 부위(cloning site)가 사용되어 발현될 폴리펩티드에 대한 유전자를 삽입하고 ATG 개시 코돈을 제공한다. 또 다른 발현 벡터는 pWYG7L이며, 이는 손상되지 않은 2αORI, STB, REP1 및 REP2, 그리고 GAL1-10 프로모터를 가지며, FLP 터미네이터를 사용한다. 이러한 벡터에서, 인코딩 폴리뉴클레오타이드가 BamHI 또는 NcoI 부위에서 이의 5' 말단을 갖는 폴리링커에 삽입된다. 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터는 칼슘 및 폴리에틸렌 글리콜로 처리시 DNA를 흡수하는 스페로플라스트를 생성하기 위해 세포 벽을 제거한 후 또는 손상되지 않은 세포를 리튬 이온으로 처리하여 에스 . 세레비시애 (S. cerevisiae) 로 형절전환된다.
그 대신에, DNA는 전기천공법(electroporation)에 의해 도입될 수 있다. 형질전환체는 예를 들어, 류신, 트립토판, 우라실, 또는 히스티딘에 대해 영양요구성을 갖는 숙주 효모 세포를 LEU2, TRP1, URA3, HIS3, 또는 LEU2-D와 같은 선택가능한 마커 유전자와 함께 사용함으로써 선택될 수 있다.
피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 메틸로트로픽 효모에는 다수의 메탄올 반응성 유전자가 존재하며, 각각의 발현은 프로모터라고도 불리는 메탄올 반응 조절 영역에 의해 조절된다. 임의의 이러한 메탄올 반응성 프로모터는 본 발명의 실시에 사용하기에 적합하다. 특정 조절 영역의 예는 AOX1 프로모터, AOX2 프로모터, 디하이드록시아세톤 신타제 (DAS), P40 프로모터, 및 피. 파스토리스(P. pastoris)로부터 유래한 카탈라제 유전자를 위한 프로모터, 등을 포함한다.
메틸로트로픽 효모 한세눌라 폴리모르파 ( Hansenula polymorpha )가 또한 언급된다. 메탄올에서의 성장은 MOX (메탄올 옥시다제), DAS (디하이드록시아세톤 신타제), 및 FMHD (포메이트 디하이드로게나제)와 같은, 메탄올 메타볼리즘의 핵심 효소를 유도한다. 이러한 효소들은 전체 세포 단백질의 최대 30-40%를 구성할 수 있다. MOX, DAS, 및 FMDH 생성을 인코딩하는 유전자는 메탄올에서의 성장에 의해 유도된 강한 프로모터에 의해 조절되고 글루코오스에서의 성장에 의해 억압된다. 이들 프로모터 중 어느 하나 또는 셋 모두는 H. 폴리모르파(H. polymorpha)에서 이종 유전자의 고-수준 발현을 획득하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 한 양상에서, 동물성 콜라겐 또는 이의 단편 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 유도성 H. 폴리모르파 프로모터의 제어하에 발현 벡터 내로 클로닝된다. 생성물의 분비가 요구되는 경우, 효모에서의 분비를 위한 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오티드와 프레임 내에서 융합된다. 또 따른 구체예에서, 발현 벡터는 바람직하게는 영양요구성 숙주의 결핍을 보완하기 위해 사용될 수 있는 예컨대 URA3 또는 LEU2와 같은 영양요구성 마커 유전자를 함유한다.
발현 벡터는 그 후 통상의 기술자에게 공지된 기술을 사용하여 H. 폴리모르파 숙주 세포를 형질 전환시키는데 사용된다. H. 폴리모르파 형질전환의 유용한 특징은 발현 벡터의 최대 100 카피를 게놈에 자발적으로 통합시키는 것이다. 대부분의 경우, 통합된 폴리뉴클레오타이드는 헤드-투-테일(head-to-tail) 배열을 나타내는 멀티머(multimer)를 형성한다. 통합된 외래 폴리뉴클레오타이드는, 심지어 비-선택적 조건 하에서, 여러 재조합 균주에서 유사분열적으로 안정한 것으로 나타났다. 이러한 높은 카피 통합 현상은 시스템의 높은 생성성 잠재력을 더욱 부각시킨다.
외래 DNA는 효모 게놈에 삽입되거나 또는 콜라겐을 생성하기 위해 염색체 외에서(episomally) 유지된다. 콜라겐에 대한 DNA 서열은 벡터를 통해 효모 내로 도입된다. 외래 DNA는 임의 비-효모 숙주 DNA이며 비제한적으로 예를 들어 포유 동물, 카에노르하브디티스 엘레간스 ( Caenorhabditis elegans ) 및 박테리아를 포함한다. 효모에서의 콜라겐 생성을 위한 적절한 포유동물 DNA는 비제한적으로 소(bovine), 돼지(porcine), 캥거루(kangaroo), 엘리케이터(alligator), 그로커다일(crocodile), 코기리(elephant), 기린(giraffe), 얼룩말(zebra), 라마(llama), 알파카(alpaca), 어린양(lamb), 공룡(dinosaur) 및 이들의 조합을 포함한다.
아스코르베이트의 생성을 가능하게 하는 DNA는 또한 단일 또는 다중 벡터 상에 삽입될 수 있다. 식물 경로의 경우 유전자 GDP-L-Gal 포스포릴라제, 이노시톨-포스페이트 포스파타제, GDP-만노스-3,5-에피머라제를 위한 DNA가 벡터를 통해 효모 세포 내로 삽입된다. 피키아는 벡터를 통해 효모 세포 내로 형질전환된 글루코오스로부터 아스코르베이트를 생성하기 위한 경로에 남아 있는 유전자를 함유하는 것으로 이미 알려져 있다.
아스코르브 경로를 위한 DNA는 그 자체로 삽입되거나 단백질을 위한 DNA와 결합될 수 있다. 아스코르브 경로는 대부분의 단백질 생성에 적합한 건강한 효모 균주의 생성을 가능하게 한다.
α 케토글루타레이트 수송체의 생성을 가능하게 하는 DNA는 또한 단일 벡터 상에 삽입될 수 있다. 효모 최적화된 kgtP 유전자는 벡터를 통해 효모 세포 내로 형질전환된다.
α 케토글루타레이트 수송체를 위한 DNA는 그 자체로 삽입되거나 단백질 또는 탄수화물을 위한 DNA와 결합될 수 있다. α 케토글루타레이트 수송체는 대부분의 단백질과 탄수화물을 생성하기에 적합한 건강하고 빠르게 자라는 효모 균주를 가능하게 한다. 수송체는 또한 수산화된 콜라겐의 생성을 증가시킨다.
DNA가 벡터 내로 삽입될 수 있다. 효모에서 단백질을 발현시키는데 유용한 벡터는 공지되어 있으며, Ausubel et al., supra, Vol. 2, Chapter 13; Grant et al. (1987) Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Ed. Wu & Grossman, Acad. Press, N.Y. 153:516-544; Glover (1986) DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; Bitter (1987) Heterologous Gene Expression in Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y. 152:673-684; 및 The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II (1982)를 참조하며, 이들 문헌은 참조로 여기에 수록된다. 또 다른 적절한 벡터는, 비제한적으로, pHTX1- BiDi-P4HA-Pre-P4HB 하이그로(hygro), pHTX1- BiDi-P4HA-PHO1-P4HB 하이그로(hygro), pGCW14-pGAP1- BiDi-P4HA-프리프로(Prepro)-P4HB G418, pGCW14-pGAP1- BiDi-P4HA-PHO1-P4HB 하이그로(hygro), pDF- Col3A1 변형된 제오신(Zeocin), pCAT-Col3A1 변형된 제오신(Zeocin), AOX1 랜딩 패드(landing pad)가 있는 pDF-Col3A1 변형된 제오신(Zeocin), pHTX1- BiDi-P4HA-Pre-Pro-P4HB 하이그로(hygro)를 포함한다. 벡터는 전형적으로 DNA의 선형화를 위한 적어도 하나의 제한 부위(restriction site)를 포함하였다.
선택 프로모터는 재조합 단백질의 생성을 향상시킬 수 있으며 해당 단백질(예컨대, 콜라겐) 또는 하이드록실라제를 인코딩하는 서열을 포함하는 벡터에 포함될 수 있다. 본 발명에서의 사용에 적합한 프로모터는, 비제한적으로, AOX1 메탄올 유도 프로모터, pDF 탈-억제 프로모터, pCAT 탈-억제 프로모터, Das1-Das2 메탄올 유도 양방향 프로모터, pHTX1 구성형 양방향 프로모터, pGCW14-pGAP1 구성형 양방향 프로모터 및 이들의 조합을 포함한다. 적절한 메탄올 유도 프로모터는, 비제한적으로, AOX2, Das 1, Das 2, pDF, pCAT, pPMP20, pFDH1, pFLD1, pTAL2, pFBA2, pPEX5, pDAK1, pFGH1, pRKI1, pREP2 및 이들의 조합을 포함한다.
전술한 바에 따르면, 동일 또는 그 전체의 모든 조합 또는 하위-조합을 포함하여, 콜라겐, 하이드록실라제(들), α 케토글루타레이트 수송체, 및/또는 기능성 아스코르베이트 합성 경로를 완결하는데 필수적인 유전자 중에서 적어도 하나로부터 선택되는 유전자 각각을 함유하는 올-인-원(all-in-one) 벡터로 조작될 수 있음이 또한 예상된다.
올-인-원(all-in-one) 벡터를 포함하여, 본 발명에 따르는 벡터에는, 터미네이터는 효모 내로 혼입된 벡터에서 이용되는 각각의 개방 판독 프레임의 말단에 위치될 수 있다. 터미네이터에 대한 DNA 서열이 벡터 내로 삽입된다. 벡터를 복제하려면, 복제를 시작하기 위해 복제 시작점이 필요하다. 복제 시작점에 대한 DNA 서열이 벡터 내로 삽입된다. 효모 게놈에 대한 상동성을 포함하는 하나 이상의 DNA 서열은 효모 게놈으로의 재조합 및 혼입을 용이하게 하거나 또는 한 번 효모 세포로 형질전환된 벡터를 안정화시키기 위해 벡터에 혼입될 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 일반적으로 성공적으로 형질전환된 효모 세포를 선택하는데 사용되는 하나 이상의 선택성 마커를 또한 포함할 것이다. 마커는 때때로 항생제 내성과 관련이 있으며 마커는 특정 아미노산 유무에 관계없이 성장할 수 있는 능력과 관련이 있을 수 있다(영양요구성 마커). 적절한 영양요구성 마커는, 비제한적으로 ADE, HIS, URA, LEU, LYS, TRP 및 이들의 조합을 포함한다. 재조합 벡터를 함유하는 효모 세포의 선택을 제공하기 위하여, 선택 마커를 위한 적어도 하나의 DNA 서열이 벡터 내에 혼입된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질을 포함하여, 재조합 효모-발현된 단백질에서, 라이신 및 프롤린과 같은 아미노산 잔기는 하이드록실화가 없거나 또는 대응하는 천연 또는 변형되지 않은 단백질, 예컨대, 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질보다 더 적은 또는 더 큰 수산화도를 가질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질을 포함하여, 재조합 효모-발현된 단백질에서 아미노산 잔기는 글리코실화가 없거나 또는 대응하는 천연 또는 변형되지 않은 단백질, 예컨대, 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질보다 더 적은 또는 더 큰 글리코실화 정도를 가질 수 있다.
수산화된 콜라겐은, 예를 들어, 적게(under) 수산화된 콜라겐(<32℃)보다 더 큰 용융 온도(>37℃)를 가지며 또한 적게(under) 수산화된 콜라겐보다 더 잘 피브릴화하며 물질 목적을 위한 더 강한 구조를 형성한다. 콜라겐 제제의 용융 온도는 그의 수산화도를 평가하는데 사용될 수도 있으며, 예를 들어, 25 내지 40℃ 범위일 수 있으며, 뿐만 아니라 모든 중간 값 예건대 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40℃, 뿐만 아니라 전술한 수치로부터 선택되는 온도에 의해 하한 및 상한이 한정되는 하위범위가 사용을 위한 콜라겐의 개체군을 선택하기 위하여 사용될 수 있다.
적게(Under) 수산화된 콜라겐은 신발이나 가방과 같은 튼튼한 제품에는 적합하지 않지만 부드럽고 흡수성 있는 제품으로 만들어질 수 있는 젤로-유사(jello-like) 물질만을 형성할 수 있다. 수산화도를 높임으로써, 콜라겐의 열안정성을 향상시킬 수 있으며, 콜라겐으로부터 생성되는 생제작된 물질의 강도를 향상시킬 수 있다. 이러한 생제작된 물질은 신발, 가방, 시트 등을 포함하여 더 큰 내구성을 요구하는 품목에 더 적합할 수 있다. 수산화도를 조절하는 수단으로서, 각각의 효소의 카피 또는 발현의 수가 증가될 수 있음이 고려될 수 있으며, 또한 세포 배양물의 온도, pH 및 탄소 공급원을 개조하는 것을 고려할 수 있다.
앞서 개시된 조작된 효모 세포는 콜라겐 또는 또 다른 단백질 또는 탄수화물을 생성하기 위해 숙주로서 사용될 수 있다. 그렇게 하기 위해서, 세포는 발효 챔버 내의 배지(media)에 놓여지고 12 시간 내지 1 주 범위의 시간 기간 동안 조절된 pH 조건 하에서, 용존 산소 및 탄소 공급원을 공급받는다. 적합한 배지는, 비제한적으로, 완충된 글리세롤 복합체 배지(BMGY), 완충된 메탄올 복합체 배지(BMMY), 및 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD)를 포함한다. 콜라겐을 분리하기 위해 단백질이 효모 세포에서 생성되고 예로서 콜라겐을 사용한다는 사실 때문에, 콜라겐을 방출하기 위해서는 효모의 분비 균주를 사용하거나 또는 효모 세포를 용해(lyse)시켜야 한다. 콜라겐은 이후 원심분리, 침전, 여과, 크로마토그래피 등과 같은 통상적인 기술을 통해 정제될 수 있다.
실시예
이하의 비-제한적인 실시예는 본 발명 예시이다. 본 발명의 범위는 이들 실시예에 기재된 세부사항에 한정되지 않는다.
실시예 1
아스코르베이트를 위한 기능성 식물 합성 경로를 가능하게 하는 효모의 변형.
피키아 파스토리스 ( Pichia pastoris ) 균주 BG10 (야생형)은 ATUM으로부터 획득하였다(이전 DNA 2.0). GDP-L-Gal 포스포릴라제(SEQ ID NO: 19), 이노시톨-포스페이트 포스파타제(SEQ ID NO: 20) 및 GDP-만노스-3,5-에피머라제(SEQ ID NO: 18)의 DNA 서열을 함유하는 벡터를 야생형 피키아 파스토리스 ( Pichia pastoris ) 내에 삽입시켜 변형된 균주를 생성하였다. DNA를 Pme I에 의해 소화시키고 PP1(야생형 피키아 파스토리스 ( Pichia pastoris ) 균주)으로 형질전환시켰다. 이는 숙주 균주로서 적합했다.
실시예 2
실시예 1로부터의 숙주 균주를 아래 개시된 바에 따라 변형시킨다:
고유 유형 III 소(bovine) 콜라겐을 인코딩하는 DNA를 시퀀싱하고, 서열을 폴리머라제 연쇄 반응 "PCR" 프로토콜에 의해 증폭시켜 선형 DNA 서열을 생성한다.
P4HA/B 효소를 인코딩하는 DNA를 시퀀싱하고(SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 9) 서열을 폴리머라제 연쇄 반응 "PCR" 프로토콜에 의해 증폭시켜 선형 DNA 서열을 생성한다.
DNA를 피키아 ( Pichia ) 전기천공법 프로토콜(Bio-Rad Gene Pulser XcellTM Total System #1652660)을 사용하여 실시예 1로부터의 균주로 형질전환시킨다. 효모 세포를 P4HA/B 동시-발현 플라스미드 및 하이그로(Hygro) 플레이트(200ug/ml) 상에서 선택된 형질전환체를 사용하여 형질전환시킨다.
실시예 1에서 생성된 균주의 단일 콜로니를 100 ml YPD 배지에 접종하고 215 rpm으로 흔들면서 밤새 30도에서 성장시킨다. 다음 날 배양물이 OD600 ~3.5 (~3-5 X 107 세포/OD600)에 도달하면 신선한 YPD로 OD600 ~ 1.7로 희석하고 215 rpm으로 흔들면서 30도에서 1 시간 더 성장시킨다.
세포를 3,500g에서 5 분 동안 스핀 다운(spin down)시키고; 물로 1회 세척하고 10 ml 10mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM LiAc, 10 mM DTT (신선하게 첨가됨), 및 0.6 M 소르비톨에 재현탁시킨다.
각각의 형질전환을 위해, 8 X 108 세포를 8 ml 10mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM LiAc, 10 mM DTT, 0.6 M 소르비톨에 분취(aliquot)하고 실온에서 30 분 동안 배양하였다.
세포를 5 분 동안 5000g에서 스핀 다운시키고 빙냉(ice cold)한 1.5 ml 1M 소르비톨로 3회 세척하고 80 ul의 빙냉(ice cold)한 1M 소르비톨에 재현탁시킨다.
다양한 양(약 5 ug)의 선형화된 DNA를 세포에 첨가하고 피펫팅(pipetting)으로 혼합한다.
세포와 DNA 혼합물(80-100ul)을 0.2 cm 전기천공법 큐벳에 넣고 피키아(Pichia) - 프로토콜 (1500 v, 25 uF, 200 Ω)을 사용하여 펄싱한다.
세포를 즉시 YPD와 1M 소르비톨(1 : 1)의 1ml 혼합물에 옮기고 30도에서 > 2 시간 동안 배양한다.
이들 세포를 상이한 밀도로 플레이팅하고 30 ℃에서 2 일 동안 배양한다.
2일 후에 플레이트 상에 나타난 단일 콜로니를 24 딥 웰 플레이트에서 2 mL BMGY 배지에 접종하고 섭씨 30도에서 적어도 48 시간 동안 900 rpm으로 흔들면서 성장시킨다. 산출된 세포를 콜라겐에 대해 아래의 절차에 따라 세포 용해, SDS-페이지 및 펩신 분석을 사용하여 테스트한다.
효모 세포를 퀴아젠 티슈 레이어(Qiagen Tissue Lyser)를 사용하여 30 Hz의 속도로 14 분 동안 연속적으로 1x 용해 완충액(lysis buffer)에서 용해시킨다. 용액 완충액을 2.5 ml 1 M HEPES (최종 농도 50 mM); 438.3 mg NaCl; 최종 농도 150 mM; 5 ml 글리세롤; 최종 농도 10%; 0.5 ml Triton X-100; 최종 농도 1%; 및 42 ml 밀리포어 물(Millipure water)로부터 제조한다.
용해된 세포를 탁상 원심분리기에서 2,500 rpm에서 4°C에서 15 분 동안 원심분리한다. 상청액을 남기고 펠렛을 버린다.
상청액, 분자량 마커, 음성 대조군 및 양성 대조군에서 2-메르캅토에탄올 존재하에 SDS-PAGE를 수행한다. 전기영동 후 겔을 제거하고 쿠마시 블루(Commassie Blue)로 염색하고 이후 물에서 탈염색한다.
다음 절차에 따라 펩신 분석을 실시한다:
펩신 처리 전에 BCA 분석을 수행하여 열 과학(Thermo Scientific) 프로토콜 당 각 시료의 총 단백질을 얻는다. 전체 단백질을 모든 시료에 대해 최저 농도로 표준화한다. (참조: 최저 전체 단백질 농도가 0.5mg/mL보다 적으면 그 농도를 표준화를 위해 사용하지 마시오).
100 uL의 용해물을 미세원심분리 관에 넣는다. 다음을 함유하는 마스터 믹스(master mix)를 만든다: 37% HCl (100 μL 당 0.6μL의 산) 및 펩신(배양액(stock)은 탈이온수 중의 1mg/mL이고, 펩신의 마지막 첨가는 1:25 비율 펩신:전체 단백질(중량:중량)이어야 한다). 펩신을 첨가한 후, 피펫으로 3X 혼합하고 펩신 반응이 일어나기 위해 실온에서 1 시간 동안 샘플을 배양한다.1 시간 후, 각 시료에 β-메르캅토에탄올을 함유한 1:1 부피의 LDS 로딩 완충액을 넣고 7 분 동안 70℃에서 배양한다. (이 상황에서는 100uL의 LDS가 추가되어야 한다). 그런 다음 탁도를 제거하기 위해 1 분 동안 14,000 rpm으로 회전시킨다.
샘플 상단으로부터 18uL를 취해서 3-8% TAE 완충액에 넣고 150V에서 1시간 10 분 동안 젤을 흐르게 한다.
실시예 3
아스코르베이트를 생성하는 효모
실시예 1로부터의 세포를 글루코오스 함유 배지에 접종하고 30 ℃에서 흔들면서 성장시킨다. 샘플을 상이한 시점(예를 들면 24, 48, 72, 기타 시간)에 수집하고 상업적으로 입수가능한 키트를 사용하여 세포내 및 세포외 모두에 대해 아스코르빈산을 분석한다. 아스코르빈산의 함량은 시간에 따라 일정하다.
실시예 4
아스코르베이트 및 수산화된 콜라겐을 생성하는 효모
실시예 2로부터의 세포를 글루코오스 함유 배지에 접종하고 30 ℃에서 흔들면서 성장시킨다. 샘플을 상이한 시점(예를 들면 24, 48, 72, 기타 시간)에 수집하고 상업적으로 입수가능한 키트를 사용하여 세포내 및 세포외 모두에 대해 아스코르빈산을 분석한다. 콜라겐 발현 수준 및 하이드록실화를 또한 공지된 방법에 의해 분석한다.
실시예 5
α 케토글루타레이트 수송체를 포함하기 위한 효모의 변형.피키아 파스토리스 ( Pichia pastoris ) 균주 (야생형)는 ATUM으로부터 획득하였다(이전 DNA 2.0).
kgtP의 DNA 서열을 함유하는 벡터(SEQ ID NO: 3)를 야생형 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 삽입하여 변형된 균주를 생성하였다. DNA를 Bam HI에 의해 소화시키고 PP1(야생형 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris ) 균주)으로 형질전환시켰다. 이는 숙주 균주로서 적합하다.
kgtP 유전자에 HA 태그를 태깅하였다. 재조합 유전자를 항 HA 항체를 사용하여 웨스턴 블롯(Western Blot)으로 검출하였다. 블롯에 표시된 밴드는 kgtP 유전자에 대한 예상 분자량을 가졌다.
실시예 6
α 케토글루타레이트 수송체를 발현하고 수산화된 콜라겐을 생성하기 위한 효모의 변형.
실시예 5로부터의 숙주 균주를 아래 개시된 바에 따라 변형시킨다:
고유 유형 III 소(bovine) 콜라겐을 인코딩하는 DNA를 시퀀싱하고(SEQ ID NO: 10), 서열을 폴리머라제 연쇄 반응 "PCR" 프로토콜에 의해 증폭시켜 선형 DNA 서열을 생성한다.
P4HA/B 효소를 인코딩하는 DNA를 시퀀싱하고(SEQ ID NO: 8 및 9 (피키아 최저화됨) 또는 SEQ ID NO: 15 및 16 (고유)) 서열을 폴리머라제 연쇄 반응 "PCR" 프로토콜에 의해 증폭시켜 선형 DNA 서열을 생성한다.
콜라겐 서열을 함유하는 선형 DNA를 피키아 게놈에 삽입하고 P4HA/B 서열을 함유하는 선형 DNA를 피키아 게놈에 삽입한다.
DNA를 피키아 ( Pichia ) 전기천공법 프로토콜(Bio-Rad Gene Pulser XcellTM Total System #1652660)을 사용하여 실시예 5로부터의 균주로 형질전환시킨다. 효모 세포를 P4HA/B 동시-발현 플라스미드 및 하이그로(Hygro) 플레이트(200 μg/ml) 상에서 선택된 형질전환체를 사용하여 형질전환시킨다.
실시예 1에서 생성된 균주의 단일 콜로니를 100 ml YPD 배지에 접종하고 215 rpm으로 흔들면서 밤새 30도에서 성장시킨다. 다음 날 배양물이 OD600 ~3.5 (~3-5 X 107 세포/OD600)에 도달하면 신선한 YPD로 OD600 ~ 1.7로 희석하고 215 rpm으로 흔들면서 30도에서 1 시간 더 성장시킨다.
세포를 3,500g에서 5 분 동안 스핀-다운(spin down)시키고; 물로 1회 세척하고 10 ml 10mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM LiAc, 10 mM DTT (신선하게 첨가), 0.6 M 소르비톨에 재현탁시킨다.
각각의 형질전환을 위해, 8 X 108 세포를 8 ml 10mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM LiAc, 10 mM DTT, 0.6 M 소르비톨에 분취(aliquot)하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
세포를 5 분 동안 5000g에서 스핀 다운시키고 빙냉(ice cold)한 1.5 ml 1M 소르비톨로 3회 세척하고 80 μl의 빙냉(ice cold)한 1M 소르비톨에 재현탁시킨다.
다양한 양(약 5 μg)의 선형화된 DNA를 세포에 첨가하고 피펫팅(pipetting)으로 혼합한다.
세포와 DNA 혼합물(80-100 μl)을 0.2 cm 큐벳에 넣고 피키아 ( Pichia ) - 프로토콜 (1500 v, 25 uF, 200 Ω)을 사용하여 펄싱한다.
세포를 즉시 YPD와 1M 소르비톨(1 : 1)의 1ml 혼합물에 옮기고 30도에서 > 2 시간 동안 배양한다.
세포를 상이한 밀도로 플레이팅한다.
단일 콜로니를 24 딥 웰 플레이트에서 2 mL BMGY 배지에 접종하고 섭씨 30도에서 적어도 48 시간 동안 900 rpm으로 흔들면서 성장시켰다. 산출된 세포를 콜라겐에 대해 아래의 절차에 따라 세포 용해, SDS-페이지 및 펩신 분석을 사용하여 테스트한다.
효모 세포를 퀴아젠 티슈 레이어(Qiagen Tissue Lyser)를 사용하여 30 Hz의 속도로 14 분 동안 연속적으로 1x 용해 완충액(lysis buffer)에서 용해시킨다. 용액 완충액을 2.5 ml 1 M HEPES (최종 농도 50 mM); 438.3 mg NaCl; 최종 농도 150 mM; 5 ml 글리세롤; 최종 농도 10%; 0.5 ml Triton X-100; 최종 농도 1%; 및 42 ml 밀리포어 물(Millipure water)로부터 제조하였다.
용해된 세포를 탁상 원심분리기에서 2,500 rpm에서 4℃에서 15 분 동안 원심분리한다. 상청액을 남기고 펠렛을 버린다.
상청액, 분자량 마커, 음성 대조군 및 양성 대조군에서 2-메르캅토에탄올 존재하에 SDS-PAGE를 수행한다. 전기영동 후 겔을 제거하고 쿠마시 블루(Commassie Blue)로 염색하고 이후 물에서 탈염색한다.
다음 절차에 따라 펩신 분석을 실시한다:
펩신 처리 전에 BCA 분석을 수행하여 열 과학(Thermo Scientific) 프로토콜 당 각 시료의 총 단백질을 얻는다. 전체 단백질을 모든 시료에 대해 최저 농도로 표준화한다. (참조: 최저 전체 단백질 농도가 0.5mg/mL보다 적으면 그 농도를 표준화를 위해 사용하지 마시오)
100 μL 의 용해물을 미세원심분리 관에 넣는다.다음을 함유하는 마스터 믹스(master mix)를 만든다: 37% HCl (100 μL 당 0.6μL의 산) 및 펩신(배양액(stock)은 탈이온수 중의 1mg/mL이고, 펩신의 마지막 첨가는 1:25 비율 펩신:전체 단백질(중량:중량)이어야 한다). 펩신을 첨가한 후, 피펫으로 3X 혼합하고 펩신 반응이 일어나기 위해 실온에서 1 시간 동안 샘플을 배양한다. 1 시간 후, 각 시료에 β-메르캅토에탄올을 함유한 1:1 부피의 LDS 로딩 완충액을 넣고 7 분 동안 70℃에서 배양한다. (이 상황에서는 100 μL의 LDS가 추가되어야 한다). 그런 다음 탁도를 제거하기 위해 1 분 동안 14,000 rpm으로 회전시킨다.
샘플 상단으로부터 18 μL를 취해서 3-8% TAE에 넣고 150V에서 1시간 10 분 동안 젤을 흐르게 한다. 아미노산 분석을 수행하여 하이드록실화의 백분율을 결정하였다. kgtP의 발현은 알파 케토글루타레이트의 소포체(endoplasmic reticulum) 내로의 수송을 가능하게 하여 콜라겐 및 수산화된 콜라겐 수준을 증가시킨다.
실시예 7
아스코르베이트 경로에 의해 실시예 1로부터 얻은 효모를 실시예 5의 절차에 따라 변형시켜 수송체를 효모로 형질전환시켜 아스코르베이트 경로 및 kgtP 수송체에 의해 피키아를 제공한다.
실시예 8
아스코르베이트 경로 및 kgtP에 대한 수송체에 의해 실시예 7로부터 얻은 효모를 실시예 2의 절차에 따라 변형시켜 아스코르베이트 경로, kgtP에 대한 수송체 및 수산화된 콜라겐에 의해 피키아를 제공한다.
실시예 9
L-굴로노-1,4-락톤옥시다제를 위한 유전자(유로핀스 게노믹스(Eurofins Genomics)로부터 구입함)는 피키아에서의 발현에 최적화된 코돈이었다(SEQ ID NO 17). 이 유전자를 구성형 프로모터 pDF 하에서 클로닝되었고 사용된 항생제 마커는 제오신(zeocin)이었다. 플라스미드를 실시예 2에서와 같은 전기천공 방법을 사용하여 피키아 세포 내로 형질전환시키고 50μg/ml의 제오신(zeocin)이 있는 YPD 플레이트에 플레이팅시켰다. 플레이트를 30 ℃에서 2일 동안 또는 형질전환체가 플레이트 상에서 나타나기 시작할 때까지 배양시켰다.
플레이트로부터 얻은 6개의 형질전환체를 뽑아내고 24웰 플레이트에서 2 ml의 BMGY 배지에서 18 시간 동안 30 ℃에서 일정하게 흔들면서 성장시켰다. 18 시간 후에, 다양한 농도의 기질(L-굴로노-1,4-락톤)을 성장 배양물에 첨가하였다(0, 0.1 및 1 g/L 최종 농도). 야생형 피키아(Pichia) 세포를 실험을 위한 대조군으로 사용하고 기질을 또한 대조군 배양물에 첨가하였다. 배양물을 기질 첨가 후 20 시간 후에 수확하였다. 광학 밀도를 표준화하고 세포를 기계적 전단에 의해 물에서 용해시켰다. 두 가지 방법을 사용하여 세포 용해물에서 아스코르빈산 농도를 정량화하였다. 첫 번째 방법에서는, 아비캠(abcam) 키트(Cat# ab65356)를 사용하였으며, 여기서 반응 혼합물의 형광 강도를 측정했다. 두 번째 방법은 설비안과 클라크 방법(Sullivan and Clarke method)으로 알려져 있으며, 여기서 상이한 세포 용해물 샘플에 대한 흡광도를 아스코르빈산 생성의 측정치로서 기록했다. L-굴로노-1,4-락톤옥시다제 유전자를 갖는 형질전환체의 세포 용해물은 대조군(기질 없이 성장한 야생형 피키아 및 형질전환체)보다 더 높은 형광 강도 및 더 높은 흡광도를 나타냈다. 예비 데이터는 1 g/L의 기질이 세포에 첨가되었을 때 아스코르빈산이 만들어졌고 ~10 nmol의 아스코르빈산은 후기 시점(기질 첨가 후 36시간)에서 생성되었음을 나타냈다.
<110> Modern Meadow. Inc. <120> Recombinant Yeast Strains <130> 515858US <150> US 62/562,109 <151> 2017-09-22 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: kgtP gene, AKG transporter from E. coli <400> 1 Met Ala Glu Ser Thr Val Thr Ala Asp Ser Lys Leu Thr Ser Ser Asp 1 5 10 15 Thr Arg Arg Arg Ile Trp Ala Ile Val Gly Ala Ser Ser Gly Asn Leu 20 25 30 Val Glu Trp Phe Asp Phe Tyr Val Tyr Ser Phe Cys Ser Leu Tyr Phe 35 40 45 Ala His Ile Phe Phe Pro Ser Gly Asn Thr Thr Thr Gln Leu Leu Gln 50 55 60 Thr Ala Gly Val Phe Ala Ala Gly Phe Leu Met Arg Pro Ile Gly Gly 65 70 75 80 Trp Leu Phe Gly Arg Ile Ala Asp Lys His Gly Arg Lys Lys Ser Met 85 90 95 Leu Leu Ser Val Cys Met Met Cys Phe Gly Ser Leu Val Ile Ala Cys 100 105 110 Leu Pro Gly Tyr Glu Thr Ile Gly Thr Trp Ala Pro Ala Leu Leu Leu 115 120 125 Leu Ala Arg Leu Phe Gln Gly Leu Ser Val Gly Gly Glu Tyr Gly Thr 130 135 140 Ser Ala Thr Tyr Met Ser Glu Val Ala Val Glu Gly Arg Lys Gly Phe 145 150 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gaagttgccg ttgaagggcg caaaggtttt 480 tacgcatcat ttcagtatgt gacgttgatc ggcggacaac tgctagccct actggttgtc 540 gtggttttac aacacaccat ggaagacgct gcactcagag agtggggatg gcgtattcct 600 ttcgcgttag gagctgtgtt agctgttgtg gcgttgtggt tacgtcgtca gttagatgaa 660 acttcgcaac aagaaacgcg cgctttaaaa gaagctggat ctctgaaagg attatggcgc 720 aatcgccgtg cattcatcat ggttctcggt tttaccgctg cgggctccct ttgtttctat 780 accttcacta cttatatgca gaagtatctg gtaaatactg cgggaatgca tgccaacgtg 840 gcgagtggca ttatgactgc cgcattgttt gtattcatgc ttattcaacc actcattggc 900 gcgctgtcgg ataagattgg tcgccgtacc tcaatgttat gtttcggttc gctggcagcc 960 atttttaccg ttcctattct ctcagcattg caaaacgttt cctcgcctta tgccgctttt 1020 ggtctggtga tgtgtgccct gctgatagtg agtttttata catcaatcag tggaatactg 1080 aaggctgaga tgttcccggc acaggttcgc gcattaggcg ttggtctgtc atatgcggtc 1140 gctaatgcta tatttggtgg ttcggcggag tacgtagcgt tgtcgctgaa atcaatagga 1200 atggaaacag ccttcttctg gtatgtgacc ttgatggccg tggtggcgtt tctggtttct 1260 ttgatgctac atcgcaaagg gaaggggatg cgtctttag 1299 <210> 3 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide: kgtP gene, AKG transporter from E. coli, codon optimized for Pichia <400> 3 atggcagaat caactgtgac ggcagacagt aagctgacct catcagatac tagaaggaga 60 atctgggcaa tagttggagc ctcttccgga aatcttgtag agtggtttga cttttatgtt 120 tattcattct gcagtctgta ttttgcacat attttctttc catctggcaa caccaccaca 180 caactgttac agaccgccgg cgtgttcgct gccggatttc ttatgaggcc cattggtgga 240 tggttgtttg gtagaatagc tgacaagcat ggtcgtaaga agtctatgtt gttgtctgtc 300 tgtatgatgt gcttcggatc actggtaatt gcatgtcttc caggttacga gaccattgga 360 acatgggctc ccgctttgct tctacttgcc aggctatttc agggtttatc agtcggtggc 420 gaatacggca cttctgcaac gtacatgtct gaggtagcag tcgagggtag aaaaggattc 480 tacgcctcct ttcaatacgt tacactgata ggaggtcaac ttcttgcctt gctagtggtc 540 gttgtcctac aacacacgat ggaggacgct gctctgaggg aatggggatg gcgtataccc 600 ttcgctttag gtgccgtcct ggccgttgtc gcattgtggt tgaggaggca gctagatgaa 660 acttcccagc aagagacaag agcattgaaa gaggccggtt cacttaaagg tctgtggcgt 720 aaccgtcgtg cctttattat ggtgcttggc ttcacggctg ctggctccct ttgcttctat 780 actttcacca cttatatgca gaaatatttg gtgaatactg caggtatgca cgctaacgtc 840 gcttccggaa ttatgacggc tgcattgttt gtctttatgc taattcaacc attgataggc 900 gctctatctg ataagatagg ccgtaggact tcaatgctat gtttcggctc cttggctgca 960 atttttaccg tgcctattct atctgcccta caaaatgtgt cttctccata cgctgctttt 1020 ggtctggtaa tgtgcgcttt actaattgtg tctttttaca cgtcaatttc cggaatacta 1080 aaagccgaga tgttccccgc ccaggtacgt gccttaggtg ttggcctttc ttacgcagtc 1140 gcaaacgcta ttttcggtgg aagtgccgag tatgtagctt tgtctcttaa aagtatcgga 1200 atggagacgg cctttttctg gtatgtaact ttgatggccg tcgttgcatt cctagtttcc 1260 cttatgttac acaggaaagg caaaggtatg aggttataa 1299 <210> 4 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: prolyl 3-hydroxylase 1 precursor (Bos taurus), NCBI reference sequence NP_001096761.1 <400> 4 Met Ala Ala Arg Ala Leu Arg Leu Leu Thr Ile Leu Leu Ala Val Ala 1 5 10 15 Ala Thr Ala Ser Gln Ala Glu Ala Glu Ser Glu Ala Gly Trp Asp Leu 20 25 30 Thr Ala Pro Asp Leu Leu Phe Ala Glu Gly Thr Ala Ala Tyr Ala Arg 35 40 45 Gly Asp Trp Ala Gly Val Val Leu Ser Met Glu Arg Ala Leu Arg Ser 50 55 60 Arg Ala Ala Leu Arg Ala Leu Arg Leu Arg Cys Arg Thr Arg Cys Ala 65 70 75 80 Ala Asp Leu Pro Trp Glu Val Asp Pro Asp Ser Pro Pro Ser Leu Ala 85 90 95 Gln Ala Ser Gly Ala Ser Ala Leu His Asp Leu Arg Phe Phe Gly Gly 100 105 110 Leu Leu Arg Arg Ala Ala Cys Leu Arg Arg Cys Leu Gly Pro Ser Thr 115 120 125 Ala His Ser Leu Ser Glu Glu Leu Glu Leu Glu Phe Arg Lys Arg Ser 130 135 140 Pro Tyr Asn Tyr Leu Gln Val Ala Tyr Phe Lys Ile Asn Lys Leu Glu 145 150 155 160 Lys Ala Val Ala Ala Ala His Thr Phe Phe Val Gly Asn Pro Glu His 165 170 175 Met Glu Met Arg Gln Asn Leu Asp Tyr Tyr Gln Thr Met Ser Gly Val 180 185 190 Lys Glu Ala Asp Phe Lys Asp Leu Glu Ala Lys Pro His Met His Glu 195 200 205 Phe Arg Leu Gly Val Arg Leu Tyr Ser Glu Glu Gln Pro Gln Glu Ala 210 215 220 Val Pro His Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Tyr Phe Val Ala Ala Glu 225 230 235 240 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ttgcctgcgc cgctgcctcg ggccgtcgac cgcccactcg 420 ctcagcgagg agctggagtt ggagttccgc aagcggagcc cctacaacta cctgcaggtc 480 gcctacttca agataaacaa gttggagaaa gctgtagcag cagcccatac cttcttcgtg 540 ggcaaccctg agcacatgga gatgcgacag aacctggact attaccagac catgtctggg 600 gtgaaggagg ctgacttcaa ggatcttgag gccaaacccc atatgcacga atttcggctg 660 ggagtgcgcc tctactccga ggagcagccg caggaagccg tgccccacct ggaggcggcg 720 ctgcgggagt acttcgtggc ggccgaggag tgccgcgcgc tctgcgaagg gccctatgac 780 tacgacggct acaactacct ggagtacaat gccgacctct tccaggccat cacagatcat 840 tacatccagg tcctcagctg taagcagaac tgtgtcacgg agcttgcttc ccacccaagt 900 cgagagaagc cctttgaaga cttcctgcca tctcattata attatctgca gtttgcctac 960 tataacattg ggaattacac acaggccatt gaatgtgcca agacctatct cctcttcttt 1020 cccaatgatg aggtgatgag ccagaatctg gcctactata cagccatgct tggagaagag 1080 caagccagat ccattggccc ccgtgagagt gcccaggagt accgccagcg gagcctgctg 1140 gagaaggaac tgcttttctt cgcctatgac gtttttggaa ttccctttgt tgatccggat 1200 tcatggactc cagtggaggt gattcctaag agactgcaag agaaacagaa gtcagaacgg 1260 gaaacagctg cccgcatctc ccaggaaatc gggaacctta tgaaggagat cgagaccctc 1320 gtggaggaga agaccaagga gtcactggac gtgagcaggc tgacccggga aggtggcccc 1380 ctgctgtatg atggcatcag actcaccatg aactccaaag tcctgaatgg ttcccagcgg 1440 gtggtgatgg atggcgtcat ctctgacgag gagtgccagg agctgcagag actgaccaat 1500 gcagcagcaa cttcaggaga tggctaccgg ggtcagacct ccccacacac ccccagcgag 1560 aagttctacg gtgtcaccgt cttcaaggcc ctcaagctgg ggcaggaagg gaaggttcct 1620 ctgcagagcg cccacctgta ctacaacgtg acggagaagg tgcgccgcgt catggagtcg 1680 tacttccgcc tggatacccc gctctacttc tcctactccc acctggtgtg ccgcaccgcc 1740 atcgaagagg cacaggctga gaggaaggac ggtagccacc ccgtccacgt ggacaactgc 1800 atcctgaatg ccgaggccct cgtgtgcatc aaggagcccc ctgcctacac tttccgggac 1860 ttcagcgcca ttctttatct gaacgaagac ttcgatggag gaaactttta tttcactgaa 1920 ctagatgcca agaccgtgac ggcagaggtg cagccccagt gcggaagggc tgtgggattc 1980 tcttccggca cggaaaaccc gcatggagta aaggccgtca ccagagggca gcgctgtgcc 2040 attgccctct ggttcacttt ggatgctcga cacagcgaga gggagcgagt gcaggcggac 2100 gacctggtaa agatgctctt tagcccagaa gagatggacc tcccccacga gcagccccaa 2160 gaagcccagg aggggacccc cgagccccta caggagcccg tctccagcag tgagtcaggg 2220 cacaaggatg agctctgaca actcccgtgg atggtgatca gacccacacg agggactctg 2280 tcctgcagcc tggactggcc agccccgggc gaggagcagt gggaacccag gcctgccgcc 2340 cagctgaggg ggctctgctc acggccgtcc gcatggtgct gctgctcttg gagtggacat 2400 ggcgagatgg ccctctcccc tctgggcctg actgagggct caggacgcag gcccagagcc 2460 actctggggg cccacacagg cagccacgtg acagcaatac agtatttaag tgcctgtgta 2520 gacaaccaaa gaataaatga ttcgtggttt tttttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 <210> 6 <211> 726 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: procollagen-lysine 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1 precursor, Bos taurus, NCBI reference sequence NP_776573.1 <400> 6 Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Pro Leu Gly Trp Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Glu Thr Lys Gly Asp Ala Lys Pro Glu Asp Asn Leu Leu Val Leu Thr 20 25 30 Val Ala Thr Lys Glu Thr Glu Gly Phe Arg Arg 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tgatggattc atttctaact taacaattca aagacaatac 360 tttccaaacg atgaggacca agtaggagca gcaaaagctt tgttgcgatt gcaggacaca 420 tacaatttgg acaccgacac gatatcgaag ggtgatttac ctggtgtgaa gcataagtcc 480 ttcctcactg tggaagattg ttttgaattg ggaaaagtcg catatacaga agccgactac 540 tatcacacag aattatggat ggagcaagct ctgcgtcagt tggacgaagg tgaagtttct 600 accgttgata aggtttcagt tttggattac ttatcatacg ctgtttacca gcaaggtgat 660 ctggacaaag ctctactttt aactaaaaag ttgttggagc tggacccgga gcatcaaaga 720 gctaacggta atctgaaata ctttgaatac atcatggcta aggaaaagga cgcaaataag 780 tcctcgtccg atgaccaatc cgatcaaaag accactctga aaaaaaaagg tgcagctgtt 840 gactacctcc cagagagaca aaagtatgaa atgctgtgta gaggagaggg tatcaagatg 900 actccaagga gacagaaaaa gctgttctgt agatatcatg atgggaaccg taacccaaaa 960 ttcattcttg ctccagcgaa acaggaagat gaatgggaca agcctagaat cattcgtttt 1020 catgacatca tctccgatgc agaaatagag gttgtgaaag acttggccaa accaagattg 1080 agtagggcta ccgtccatga ccctgagact ggaaaattga ctaccgcaca atatcgtgtc 1140 tctaaatcag catggttgtc cggttacgag aatcccgtgg tcagccgtat caatatgcgt 1200 attcaagatt tgactggtct tgacgtaagc actgctgagg aactacaagt tgccaactat 1260 ggtgtgggcg gtcagtatga accccacttt gatttcgcca gaaaggacga gcctgatgct 1320 tttaaggagc taggtactgg aaatagaatc gcaacgtggt tgttctatat gtccgatgtg 1380 cttgctggag gagccacagt tttccctgag gtaggtgctt ctgtttggcc taaaaagggc 1440 acggccgtat tttggtacaa tctgtttgca tctggagaag gtgattacag cactagacat 1500 gctgcttgtc ccgtcttagt cggtaataag tgggtttcca ataagtggct gcatgagaga 1560 ggtcaagagt ttaggaggcc atgcacattg tcagaattag aatgataatt tt 1612 <210> 9 <211> 1747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide: bovine P4HB (PDI) sequence, with Alpha pre-pro signal sequence, cDNA optimized <400> 9 atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60 cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120 tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa ctccactaac 180 aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga agagggtgtc 240 tctctcgaga aaagagaggc cgaagctgca cccgatgagg aagatcatgt tttagtattg 300 cataaaggaa atttcgatga agctttggcc gctcacaaat atctgctcgt cgagttttac 360 gctccctggt gcggtcattg taaggccctt gcaccagagt acgccaaggc agctggtaag 420 ttaaaggccg aaggttcaga gatcagatta gcaaaagttg atgctacaga agagtccgat 480 cttgctcaac aatacggggt tcgaggatac ccaacaatta agtttttcaa aaatggtgat 540 actgcttccc caaaggaata tactgctggt agagaggcag acgacatagt caactggctc 600 aaaaagagaa cgggcccagc tgcgtctaca ttaagcgacg gagcagcagc cgaagctctt 660 gtggaatcta gtgaagttgc tgtaatcggt ttctttaagg acatggaatc tgattcagct 720 aaacagttcc ttttagcagc tgaagcaatc gatgacatcc ctttcggaat cacctcaaat 780 agtgacgtgt tcagcaagta ccaacttgac aaagatggag tggtcttgtt caaaaagttt 840 gacgaaggca gaaacaattt cgagggtgag gttacaaagg agaaactgct tgatttcatt 900 aaacataacc aactaccctt agttatcgaa ttcactgaac aaactgctcc taagattttc 960 ggtggagaaa tcaaaacaca tatcttgttg tttttgccaa agtccgtatc ggattatgaa 1020 ggtaaactct ccaatttcaa aaaggccgct gagagcttta agggcaagat tttgttcatc 1080 tttattgact cagaccacac agacaatcag aggattttgg agtttttcgg tttgaaaaag 1140 gaggaatgtc cagcagtccg tttgatcacc ttggaggagg agatgaccaa atacaaacca 1200 gagtcggatg agttgactgc cgagaagata acagaatttt gtcacagatt tctggaaggt 1260 aagatcaagc ctcatcttat gtctcaagag ttgcctgatg actgggataa gcaaccagtt 1320 aaagtattgg tgggtaaaaa ctttgaggaa gtggccttcg acgagaaaaa aaatgtcttt 1380 gttgaattct atgctccgtg gtgtggtcac tgtaagcagc tggcaccaat ttgggataaa 1440 ctgggtgaaa cttacaaaga tcacgaaaac attgttattg caaagatgga cagtactgct 1500 aacgaagtgg aggctgtgaa agttcactcc ttccctacgc tgaagttctt tcctgcatct 1560 gctgacagaa ctgttatcga ctataatgga gagaggacat tggatggttt taaaaagttt 1620 cttgaatccg gaggtcaaga cggagctggt gacgacgatg atttggaaga tctggaggag 1680 gctgaggaac ctgatcttga ggaggatgac gaccagaagg cagtcaaaga tgaactgtga 1740 taagggg 1747 <210> 10 <211> 4404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide: Col3A1 cDNA optimized <400> 10 atgatgtctt ttgtccaaaa gggtacttgg ttactttttg ctctgttgca cccaactgtt 60 attctcgcac aacaggaagc agtagatggt ggttgctcac atttaggtca atcttacgca 120 gatagagatg tatggaaacc tgaaccatgt caaatttgcg tgtgtgactc aggttcagtg 180 ctctgcgacg atatcatatg tgacgaccag gaattggact gtccaaaccc agagatacca 240 ttcggtgaat gttgtgctgt ttgtccacag ccaccaactg ctcctacaag acctccaaac 300 ggtcaaggtc cacaaggtcc taaaggtgat ccgggtccac ctggtattcc tggtagaaat 360 ggtgaccctg gacctcccgg ttccccaggt agcccaggat cacctgggcc tcctggaata 420 tgtgaatcct gcccaactgg tggtcagaac tatagcccac aatacgaggc ctacgacgtc 480 aaatctggtg ttgctggagg aggtattgca ggctaccctg gtcccgcagg gcccccaggt 540 ccgccgggtc cgcccggaac atcaggtcat cccggagccc ctggtgcacc aggttatcag 600 ggaccgcccg gagagcctgg acaagctggt cccgctggac cccctggtcc accaggtgct 660 attggaccaa gtggtcctgc cggaaaagac ggtgaatccg gtagacctgg tagacccggc 720 gaaaggggtt tcccaggtcc tcccggaatg aagggtccag ccggtatgcc cggttttcct 780 gggatgaagg gtcacagagg atttgatggt agaaacggag agaaaggcga aaccggtgct 840 cccggactga agggtgaaaa cggtgtccct ggtgagaacg gcgctcctgg acctatgggt 900 ccacgtggtg ctccaggaga aagaggcaga ccaggattgc 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tcccaggtgg ccgtggacct 2640 cctggtcccc ctggatcgaa tggtaatcct ggtccgccag gtagttcggg tgctcctggg 2700 aaggacggtc cacctggccc cccaggtagt aacggtgcac ctggtagtcc aggtatatcc 2760 ggacctaaag gagattccgg tccaccaggc gaaagagggg ccccaggccc acagggtcca 2820 ccaggagccc ccggtcctct gggtattgct ggtcttactg gtgcacgtgg actggccggt 2880 ccacccggaa tgcctggagc aagaggttca cctggaccac aaggtattaa aggagagaac 2940 ggtaaacctg gaccttccgg tcaaaacgga gagcggggac ccccaggccc ccaaggtctg 3000 ccaggactag ctggtaccgc aggggaacca ggaagagatg gaaatccagg ttcagacgga 3060 ctacccggta gagatggtgc accgggggcc aagggcgaca ggggtgagaa tggatctcct 3120 ggtgcgccag gggcaccagg ccacccaggt cccccaggtc ctgtgggccc tgctggaaag 3180 tcaggtgaca ggggagagac aggcccggct ggtccatctg gcgcacccgg accagctggt 3240 tccagaggcc cacctggtcc gcaaggccct agaggtgaca agggagagac tggagaacga 3300 ggtgctatgg gtatcaaggg tcatagaggt tttccgggta atcccggcgc cccaggttct 3360 cctggtccag ctggccatca aggtgcagtc ggatcgcccg gcccagccgg tcccaggggc 3420 cctgttggtc catccggtcc tccaggaaag gatggtgctt 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gcaaagcagt tagattgcca 4320 atcgtcgata tcgcaccata cgacattgga ggaccagatc aagagttcgg agctgacatc 4380 ggtccggtgt gtttcctttg ataa 4404 <210> 11 <211> 1463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: collagen alpha-1(I) chain precursor (Bos taurus), NCBI reference sequence NP_001029211.1 <400> 11 Met Phe Ser Phe Val Asp Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Thr 1 5 10 15 Ala Leu Leu Thr His Gly Gln Glu Glu Gly Gln Glu Glu Gly Gln Glu 20 25 30 Glu Asp Ile Pro Pro Val Thr Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His 35 40 45 Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Val Pro Cys Gln Ile Cys Val Cys Asp 50 55 60 Asn Gly Asn Val Leu Cys Asp Asp Val Ile Cys Asp Glu Leu Lys Asp 65 70 75 80 Cys Pro Asn Ala Lys Val Pro Thr Asp Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro 85 90 95 Glu Gly Gln Glu Ser Pro Thr Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly 100 105 110 Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro 115 120 125 Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro 130 135 140 Gly Pro Pro Gly 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cagaaggatt tgttggacac 240 cctgtaaatg cattcaaatt aatgaaacgt ctgaacactg agtggagtga gttggagaat 300 ctggtcctta aggatatgtc agatggtttt atctctaacc taaccattca gagacagtac 360 ttccctaatg atgaagatca ggttggggca gccaaagctc tgttgcgtct acaggacacc 420 tacaatttgg atacagatac catctcaaag ggtgatcttc caggagtaaa acacaaatct 480 tttctaacag ttgaggactg ttttgagttg ggcaaagtgg cctacacaga agcagattat 540 taccatacag agctgtggat ggaacaagca ctgaggcagc tggatgaagg cgaggtttct 600 accgttgata aagtctctgt tctggattat ttgagctatg cagtatacca gcagggagac 660 ctggataagg cgcttttgct cacaaagaag cttcttgaac tagatcctga acatcagaga 720 gctaacggta acttaaaata ctttgagtat ataatggcta aagaaaaaga tgccaataag 780 tcttcttcag atgaccaatc tgatcagaaa accacactga agaagaaagg tgctgctgtg 840 gattacctgc cagagagaca gaagtacgaa atgctgtgcc gtggggaggg tatcaaaatg 900 actcctcgga gacagaaaaa actcttctgt cgctaccatg atggaaaccg gaatcctaaa 960 tttatcctgg ctccagccaa acaggaggat gagtgggaca agcctcgtat tatccgcttc 1020 catgatatta tttctgatgc agaaattgaa gtcgttaaag atctagcaaa accaaggctg 1080 aggcgagcca ccatttcaaa cccaataaca ggagacttgg agacggtaca ttacagaatt 1140 agcaaaagtg cctggctgtc tggctatgaa aaccctgtgg tgtcacgaat taatatgaga 1200 atccaagatc tgacaggact agatgtctcc acagcagagg aattacaggt agcaaattat 1260 ggagttggag gacagtatga accccatttt gattttgcac ggaaagatga gccagatgct 1320 ttcaaagagc tggggacagg aaatagaatt gctacatggc tgttttatat gagtgatgtg 1380 ttagcaggag gagccactgt ttttcctgaa gtaggagcta gtgtttggcc caaaaaggga 1440 actgctgttt tctggtataa tctgtttgcc agtggagaag gagattatag tacacggcat 1500 gcagcctgtc cagtgctggt tggaaacaaa tgggtatcca ataaatggct ccatgaacgt 1560 ggacaggaat ttcgaagacc atgcaccttg tcagaattgg aatga 1605 <210> 16 <211> 1533 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide: bovine P4HB (PDI) sequence, native with own signal peptide <400> 16 atgctgcgcc gcgctctgct ctgcctggcc ctgaccgcgc tattccgcgc gggtgccggc 60 gcccccgacg aggaggacca cgtcctggtg ctccataagg gcaacttcga cgaggcgctg 120 gcggcccaca agtacctgct ggtggagttc tacgccccat ggtgcggcca ctgcaaggct 180 ctggccccgg agtatgccaa agcagctggg aagctgaagg cagaaggttc tgagatcaga 240 ctggccaagg tggatgccac tgaagagtct gacctggccc agcagtatgg tgtccgaggc 300 taccccacca tcaagttctt caagaatgga gacacagctt cccccaaaga gtacacagct 360 ggccgagaag cggatgatat cgtgaactgg ctgaagaagc gcacgggccc cgctgccagc 420 acgctgtccg acggggctgc tgcagaggcc ttggtggagt ccagtgaggt ggccgtcatt 480 ggcttcttca aggacatgga gtcggactcc gcaaagcagt tcttgttggc agcagaggcc 540 attgatgaca tccccttcgg gatcacatct aacagcgatg tgttctccaa ataccagctg 600 gacaaggatg gggttgtcct ctttaagaag tttgacgaag gccggaacaa ctttgagggg 660 gaggtcacca aagaaaagct tctggacttc atcaagcaca accagttgcc cctggtcatt 720 gagttcaccg agcagacagc cccgaagatc ttcggagggg aaatcaagac tcacatcctg 780 ctgttcctgc cgaaaagcgt gtctgactat gagggcaagc tgagcaactt caaaaaagcg 840 gctgagagct tcaagggcaa gatcctgttt atcttcatcg acagcgacca cactgacaac 900 cagcgcatcc tggaattctt cggcctaaag aaagaggagt gcccggccgt gcgcctcatc 960 acgctggagg aggagatgac caaatataag ccagagtcag atgagctgac ggcagagaag 1020 atcaccgagt tctgccaccg cttcctggag ggcaagatta agccccacct gatgagccag 1080 gagctgcctg acgactggga caagcagcct gtcaaagtgc tggttgggaa gaactttgaa 1140 gaggttgctt ttgatgagaa aaagaacgtc tttgtagagt tctatgcccc gtggtgcggt 1200 cactgcaagc agctggcccc catctgggat aagctgggag agacgtacaa ggaccacgag 1260 aacatagtca tcgccaagat ggactccacg gccaacgagg tggaggcggt gaaagtgcac 1320 agcttcccca cgctcaagtt cttccccgcc agcgccgaca ggacggtcat cgactacaat 1380 ggggagcgga cactggatgg ttttaagaag ttcctggaga gtggtggcca ggatggggcc 1440 ggagatgatg acgatctaga agatcttgaa gaagcagaag agcctgatct ggaggaagat 1500 gatgatcaaa aagctgtgaa agatgaactg taa 1533 <210> 17 <211> 1323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide: L-gulono, 1,4-lactone oxidase <400> 17 atggtgcacg gctacaaggg cgtccagttt caaaactggg ctaagacgta tggatgttcc 60 ccagaggttt attaccagcc tacgtcagtc gaagaggtga gagaagtact ggcattggca 120 agggaacaaa agaaaaaagt gaaggtcgtg ggtggcggac atagtccatc cgacattgca 180 tgcactgacg gatttatgat ccatatggga aagatgaata gagtcttgca agtagataaa 240 gaaaaaaagc agattaccgt tgaagctggt atcctgctgg ctgatctgca tccccagctg 300 gatgaacatg gtcttgctat gtctaatcta ggcgccgtat ccgacgttac agttgctggt 360 gtgattggta gtggcaccca caacacggga ataaaacacg gaatactagc cacccaagta 420 gttgctctta ccttaatgac ggccgatggt gaagtcctgg agtgtagtga gtctagaaac 480 gccgacgtct ttcaagctgc ccgtgtgcat cttggttgct tgggcatcat cctaacagtc 540 acccttcaat gcgtccctca gtttcatcta caagaaactt ccttcccaag taccttaaag 600 gaggtcctag ataatttgga ttcacacctg aagagatcag agtatttcag gttcctgtgg 660 tttccacata cagagaacgt ttccatcatc tatcaagacc atacaaataa agcaccctcc 720 agtgcttcta actggttttg ggattatgca atcggttttt atctacttga atttttactg 780 tggacttcta cctacctacc ttgtttggtg ggttggataa accgtttctt tttttggatg 840 cttttcaatt gcaagaaaga gagttccaac ctatcccaca agatcttcac ttatgaatgc 900 cgttttaagc aacacgtgca agattgggca atcccaagag aaaagaccaa ggaggctctt 960 ttggagctaa aagcaatgct tgaggcacac cccaaggtag tggcccacta ccctgtagag 1020 gtcaggttca ccaggggcga tgatatattg ctgtcacctt gcttccagcg tgattcctgc 1080 tacatgaaca tcattatgta caggccctac ggcaaagacg tgccaagact agattactgg 1140 cttgcttacg agacgattat gaagaaattt ggaggtagac cccattgggc caaggctcac 1200 aactgtactc agaaggattt cgaggaaatg tatccaacct tccataaatt ttgcgacata 1260 agggaaaaac ttgaccctac aggcatgttc ctaaattctt accttgaaaa ggtcttttat 1320 taa 1323 <210> 18 <211> 1134 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide: GDP-Mannose-3,5-epimerase, codon optimized for Pichia <400> 18 atgggcacca ccaatggtac agattatggc gcatatactt acaaggaatt ggaaagagag 60 cagtactggc cctctgagaa tctgaagatt tccataactg gtgcaggcgg atttatagca 120 tcccatattg caaggagatt aaaacacgag ggacactatg taatagcatc tgactggaaa 180 aagaacgagc acatgactga ggacatgttt tgcgacgaat ttcatcttgt tgacttaagg 240 gtcatggaaa attgccttaa agttactgag ggcgtagacc acgtctttaa ccttgccgcc 300 gacatgggcg gtatgggatt catccagtcc aatcattccg tgatcatgta caacaatacg 360 atgatcagtt tcaacatgat tgaagctgct agaatcaatg gaatcaagag attcttttac 420 gcatcttcag catgtatcta tccagaattt aagcaacttg aaaccactaa tgttagtctt 480 aaggaatccg acgcttggcc cgcagaacct caagatgcat atggtttgga gaaactggca 540 accgaagagc tatgcaaaca ttacaacaag gactttggta tcgagtgcag gattggcaga 600 ttccacaaca tatacggccc tttcggaact tggaaaggtg gcagagaaaa ggcccctgct 660 gctttctgta ggaaagcaca aacctccaca gataggtttg agatgtgggg cgatggccta 720 cagacaaggt cttttacttt cattgacgaa tgtgtcgaag gagttttgcg tttaactaag 780 agtgatttta gggagcctgt caatatagga tccgatgaga tggtgtccat gaacgagatg 840 gcagagatgg ttttatcttt tgaggagaaa aagctgccca tccatcatat tcccggtccc 900 gagggtgtca gaggcagaaa tagtgataat aacctaatca aggaaaaact tggttgggca 960 ccaaatatga gattgaaaga aggccttaga attacttact tctggataaa agaacaaatt 1020 gaaaaggaaa aggccaaggg tagtgatgtt agtctatacg gatcatctaa ggtcgttgga 1080 acgcaggccc cagtccaact gggaagtctt agagcagctg atggaaaaga ataa 1134 <210> 19 <211> 1329 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide: GDP-L-galactose phosphorylase <400> 19 atgctgaaga tcaagagggt ccctactgtg gtgtcaaact accaaaaaga tgacggcgcc 60 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acataccatt taacatacta atctccgact gtggcaggca aatattttta 960 atgcctcaat gttatgccga aaaacaggcc ttaggagagg tgtcccctga agtgctagaa 1020 actcaggtga acccagccgt ttgggagatt tccggtcaca tggtccttaa aagaaaagaa 1080 gactacgaag gtgcctctga ggacaacgct tggcgtctac tagctgaggc tagtctaagt 1140 gaagaaagat tcaaggaagt tactgctcta gcattcgagg ccatcggctg ttccaatcaa 1200 gaggaagacc ttgaaggcac tatagtccac caacaaaaca gttctggaaa cgtgaaccaa 1260 aaatcaaaca gaacacacgg cggaccaatc accaatggta cggctgcaga gtgtttagtt 1320 ttacaataa 1329 <210> 20 <211> 816 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide: Inositol-phosphate phosphatase <400> 20 atggccgaca atgattctct tgaccagttt ctggccgccg ccatcgacgc cgcaaaaaag 60 gcaggacaga ttattcgtaa gggattttat gaaaccaagc acgtcgagca taaaggtcag 120 gtcgatctag tgactgaaac ggataagggc tgtgaagaac tggtgttcaa tcatttaaaa 180 cagctattcc ccaatcataa gttcattggc gaagagacaa ctgctgcatt tggtgtaacg 240 gagctaactg atgagccaac ctggatcgta gatcccttag atggcaccac taatttcgta 300 catggttttc cttttgtgtg cgtatcaata ggtttaacca tcggtaaagt acctgtcgta 360 ggcgtcgttt acaatcccat tatggaagag ctttttacag gcgtccaagg aaaaggcgct 420 ttcttaaacg gaaaaaggat taaagtttct gcccagtcag agctattgac tgctctactt 480 gtcaccgagg caggtacaaa acgtgataaa gctactctgg atgatacaac caatcgtata 540 aactccctat tgactaaagt aaggagtctt cgtatgtcag gtagttgtgc cttagatttg 600 tgtggcgtag cctgcggaag ggtcgacatc ttctacgagt tgggtttcgg aggaccctgg 660 gacattgccg ccggaatagt gatcgtcaag gaagctggag gactaatctt cgatcctagt 720 ggtaaggatc tggacataac gtcacaaagg atcgcagcca gtaacgcatc cttaaaagag 780 ctatttgcag aagctctgag attgactgga gcctaa 816 <210> 21 <211> 2746 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide: GDP-L-Gal phosphorylase from Arabidopsis thaliana <400> 21 ctggttcact catctcctat ctatttaaag cccattcgat atcctaaaac actgtatcat 60 caaaaaacac ctcaaagaat tattcattca ggcatcttct caaatttttg tttgtgaaaa 120 aaacccacat caaaagatct ctcatttatt cgtttcgttt ctgctgtttt gagtgtcggg 180 ttcgttttag ctgtaatctt tttttccggc gttcgatttg aaaaaatccg gggaacaggt 240 gatcggaatc acggctatac acgggatatc acggggtgtt agctcacatg tccatattgt 300 ccgacagaag ggttgtttaa tcgaaactaa tcctttgccg cacggaggac gtggagctct 360 gccgtctgaa ggcggcagcc cttccgatct cctctttctc gccggtggcg gttccagctt 420 taacttcttt tcctttaggt tttaggagtt agggtttgtt agtgtttttt ccttcttctt 480 tttttggtgc tcttgaatcg cttttttctt gggggaagtt ttttcttttg ctcttcgaaa 540 tttgtctttt ttgagaatgt tgaaaatcaa aagagttccg accgttgttt cgaactacca 600 gaaggacgat ggagcggagg atcccgtcgg ctgtggacgg aattgcctcg gcgcttgttg 660 ccttaacggt acgttttgga aacctgaatc gtctttttta atcatgttta aattttatca 720 cttttttttt attcacctta tgatgtgttt gttcaggggc taggcttcca ttgtatgcat 780 gtaagaatct ggtaaaatcc ggagagaagc ttgtaatcag tcatgaggct atagagcctc 840 ctgtagcttt tctcgagtcc cttgttctcg gagaggtaaa tcatagacca ctgattttga 900 tattctgata atggtttctg tagcttggaa gagtctaatc agtattctta tgtttagtgg 960 gaggataggt tccaaagagg actttttcgc tatgatgtca ctgcctgcga aaccaaagta 1020 attgtctttc ttaccttgtt tgacaatcta gttatgttgg gttgtttgtt gctgaggaat 1080 ccgagatatg ttttacattg ttcttaagat tgtttctctt gatgttatag gttatcccgg 1140 ggaagtatgg tttcgttgct cagcttaacg agggtcgtca cttgaagaag aggccaactg 1200 agttccgtgt agataaggtg ttgcagtctt ttgatggcag caaattcaac ttcactaaag 1260 ttggccaaga agagttgctc ttccagtttg aagctggtga agatgcccaa gttcagttct 1320 tcccttgcat gcctattgac cctgagaatt ctcccagtgt tgttgccatc aatgtaaaga 1380 ctcttgtgca gagagcttgg ttttttcttt cttcctttta ttggtttcgc tagcaaaaga 1440 ttaattcttt attgttgttt ttaacaggtt agtccgatag agtatggcca tgtgctgctg 1500 attcctcgtg ttcttgactg cttgcctcaa aggatcgatc acaaaagcct tttgcttgca 1560 gttcacatgg ctgctgaggc tgctaatcca tacttcagac tcggttacaa cagcttgggt 1620 gcttttgcca ctatcaatca tctccacttt caggtatatc caaaagtgat ccaagcataa 1680 ccttttcacc cttgctcatc taagatgttt gttctgattg ttttggtggt gattgttttt 1740 ggaaacaggc ttattacttg gccatgcctt tcccactgga gaaagctcct accaagaaga 1800 taactaccac tgttagtggt gtcaaaatct cagagcttct aagttaccct gtgagaagtc 1860 ttctctttga aggtggaagc tctatgcaag aactatctga tactgtttca gactgctgtg 1920 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Ser Asn Gln 385 390 395 400 Glu Glu Asp Leu Glu Gly Thr Ile Val His Gln Gln Asn Ser Ser Gly 405 410 415 Asn Val Asn Gln Lys Ser Asn Arg Thr His Gly Gly Pro Ile Thr Asn 420 425 430 Gly Thr Ala Ala Glu Cys Leu Val Leu Gln 435 440 <210> 23 <211> 1000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide: Inositol-phosphate phosphatase <400> 23 gcctaaccac aaaaaccgta acttttggtt ttctctgaaa cacatcccaa agtaaagaaa 60 gcatcactct tttcgtcttc tctcgaaaat ggcggacaat gattctctag atcagttttt 120 ggctgccgcc attgatgccg ctaaaaaagc tggacagatc attcgtaaag ggttttacga 180 gactaaacat gttgaacaca aaggccaggt ggatttggtg acagagactg ataaaggatg 240 tgaagaactt gtgtttaatc atctcaagca gctctttccc aatcacaagt tcataggaga 300 agaaactaca gctgcatttg gtgtgacaga actaactgac gaaccaactt ggattgttga 360 tcctcttgat ggaacaacca atttcgttca cgggttccct ttcgtgtgtg tttccattgg 420 acttacgatt ggaaaagtcc ctgttgttgg agttgtttat aatcctatta tggaagagct 480 attcaccggt gtccaaggga aaggagcatt cttgaatgga aagcgaatca aagtgtcagc 540 tcaaagcgaa cttttaaccg ctttgctcgt gacagaggcg ggtactaaac gagataaagc 600 tacattagac gatacaacca acagaatcaa cagtttgcta accaaggtca ggtcccttag 660 gatgagtggt tcgtgtgcac tggacctctg tggcgttgcg tgtggaaggg ttgatatctt 720 ctacgagctc ggtttcggtg gtccatggga cattgcagca ggaattgtta tcgtgaaaga 780 agctggtgga ctcatctttg atccatccgg taaagatttg gacataacat cgcagaggat 840 cgcggcttca aacgcttctc tcaaggagtt attcgctgag gcgttgcggc ttacaggggc 900 atgaagtcat ctgttattat tttacaatat ggtctcaacc ttatatgatc aaactcaatt 960 caaaaactta acattattga atatttcttt tcggtagaaa 1000 <210> 24 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: Inositol-phosphate phosphatase <400> 24 Met Ala Asp Asn Asp Ser Leu Asp Gln Phe Leu Ala Ala Ala Ile Asp 1 5 10 15 Ala Ala Lys Lys Ala Gly Gln Ile Ile Arg Lys Gly Phe Tyr Glu Thr 20 25 30 Lys His Val Glu His Lys Gly Gln Val Asp Leu Val Thr Glu Thr Asp 35 40 45 Lys Gly Cys Glu Glu Leu Val Phe Asn His Leu Lys Gln Leu Phe Pro 50 55 60 Asn His Lys Phe Ile Gly Glu Glu Thr Thr Ala Ala Phe Gly Val Thr 65 70 75 80 Glu Leu Thr Asp Glu Pro Thr Trp Ile Val Asp Pro Leu Asp Gly Thr 85 90 95 Thr Asn Phe Val His Gly Phe Pro Phe Val Cys Val Ser Ile Gly Leu 100 105 110 Thr Ile Gly Lys Val Pro Val Val Gly Val Val Tyr Asn Pro Ile Met 115 120 125 Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Gln Gly Lys Gly Ala Phe Leu Asn Gly 130 135 140 Lys Arg Ile Lys Val Ser Ala Gln Ser Glu Leu Leu Thr Ala Leu Leu 145 150 155 160 Val Thr Glu Ala Gly Thr Lys Arg Asp Lys Ala Thr Leu Asp Asp Thr 165 170 175 Thr Asn Arg Ile Asn Ser Leu Leu Thr Lys Val Arg Ser Leu Arg Met 180 185 190 Ser Gly Ser Cys Ala Leu Asp Leu Cys Gly Val Ala Cys Gly Arg Val 195 200 205 Asp Ile Phe Tyr Glu Leu Gly Phe Gly Gly Pro Trp Asp Ile Ala Ala 210 215 220 Gly Ile Val Ile Val Lys Glu Ala Gly Gly Leu Ile Phe Asp Pro Ser 225 230 235 240 Gly Lys Asp Leu Asp Ile Thr Ser Gln Arg Ile Ala Ala Ser Asn Ala 245 250 255 Ser Leu Lys Glu Leu Phe Ala Glu Ala Leu Arg Leu Thr Gly Ala 260 265 270 <210> 25 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: GDP-Mannose-3,5-epimerase <400> 25 Met Gly Thr Thr Asn Gly Thr Asp Tyr Gly Ala Tyr Thr Tyr Lys Glu 1 5 10 15 Leu Glu Arg Glu Gln Tyr Trp Pro Ser Glu Asn Leu Lys Ile Ser Ile 20 25 30 Thr Gly Ala Gly Gly Phe Ile Ala Ser His Ile Ala Arg Arg Leu Lys 35 40 45 His Glu Gly His Tyr Val Ile Ala Ser Asp Trp Lys Lys Asn Glu His 50 55 60 Met Thr Glu Asp Met Phe Cys Asp Glu Phe His Leu Val Asp Leu Arg 65 70 75 80 Val Met Glu Asn Cys Leu Lys Val Thr Glu Gly Val Asp His Val Phe 85 90 95 Asn Leu Ala Ala Asp Met Gly Gly Met Gly Phe Ile Gln Ser Asn His 100 105 110 Ser Val Ile Met Tyr Asn Asn Thr Met Ile Ser Phe Asn Met Ile Glu 115 120 125 Ala Ala Arg Ile Asn Gly Ile Lys Arg Phe Phe Tyr Ala Ser Ser Ala 130 135 140 Cys Ile Tyr Pro Glu Phe Lys Gln Leu Glu Thr Thr Asn Val Ser Leu 145 150 155 160 Lys Glu Ser Asp Ala Trp Pro Ala Glu Pro Gln Asp Ala Tyr Gly Leu 165 170 175 Glu Lys Leu Ala Thr Glu Glu Leu Cys Lys His Tyr Asn Lys Asp Phe 180 185 190 Gly Ile Glu Cys Arg Ile Gly Arg Phe His Asn Ile Tyr Gly Pro Phe 195 200 205 Gly Thr Trp Lys Gly Gly Arg Glu Lys Ala Pro Ala Ala Phe Cys Arg 210 215 220 Lys Ala Gln Thr Ser Thr Asp Arg Phe Glu Met Trp Gly Asp Gly Leu 225 230 235 240 Gln Thr Arg Ser Phe Thr Phe Ile Asp Glu Cys Val Glu Gly Val Leu 245 250 255 Arg Leu Thr Lys Ser Asp Phe Arg Glu Pro Val Asn Ile Gly Ser Asp 260 265 270 Glu Met Val Ser Met Asn Glu Met Ala Glu Met Val Leu Ser Phe Glu 275 280 285 Glu Lys Lys Leu Pro Ile His His Ile Pro Gly Pro Glu Gly Val Arg 290 295 300 Gly Arg Asn Ser Asp Asn Asn Leu Ile Lys Glu Lys Leu Gly Trp Ala 305 310 315 320 Pro Asn Met Arg Leu Lys Glu Gly Leu Arg Ile Thr Tyr Phe Trp Ile 325 330 335 Lys Glu Gln Ile Glu Lys Glu Lys Ala Lys Gly Ser Asp Val Ser Leu 340 345 350 Tyr Gly Ser Ser Lys Val Val Gly Thr Gln Ala Pro Val Gln Leu Gly 355 360 365 Ser Leu Arg Ala Ala Asp Gly Lys Glu 370 375 <210> 26 <211> 610 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: L-gulono-1,4-lactone oxidase <400> 26 Met Leu Arg Ser Leu Leu Leu Arg Arg Ser Val Gly His Ser Leu Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ile Arg Ser Ser Phe Ser Pro His 20 25 30 Arg Thr Leu Cys Thr Thr Gly Gln Thr Leu Thr Pro Pro Pro Pro Pro 35 40 45 Pro Pro Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Ala Ser Glu Ala Gln 50 55 60 Phe Arg Lys Tyr Ala Gly Tyr Ala Ala Leu Ala Ile Phe Ser Gly Val 65 70 75 80 Ala Thr Tyr Phe Ser Phe Pro Phe Pro Glu Asn Ala Lys His Lys Lys 85 90 95 Ala Gln Ile Phe Arg Tyr Ala Pro Leu Pro Glu Asp Leu His Thr Val 100 105 110 Ser Asn Trp Ser Gly Thr His Glu Val Gln Thr Arg Asn Phe Asn Gln 115 120 125 Pro Glu Asn Leu Ala Asp Leu Glu Ala Leu Val Lys Glu Ser His Glu 130 135 140 Lys Lys Leu Arg Ile Arg Pro Val Gly Ser Gly Leu Ser Pro Asn Gly 145 150 155 160 Ile Gly Leu Ser Arg Ser Gly Met Val Asn Leu Ala Leu Met Asp Lys 165 170 175 Val Leu Glu Val Asp Lys Glu Lys Lys Arg Val Thr Val Gln Ala Gly 180 185 190 Ile Arg Val Gln Gln Leu Val Asp Ala Ile Lys Asp Tyr Gly Leu Thr 195 200 205 Leu Gln Asn Phe Ala Ser Ile Arg Glu Gln Gln Ile Gly Gly Ile Ile 210 215 220 Gln Val Gly Ala His Gly Thr Gly Ala Arg Leu Pro Pro Ile Asp Glu 225 230 235 240 Gln Val Ile Ser Met Lys Leu Val Thr Pro Ala Lys Gly Thr Ile Glu 245 250 255 Leu Ser Arg Glu Lys Asp Pro Glu Leu Phe His Leu Ala Arg Cys Gly 260 265 270 Leu Gly Gly Leu Gly Val Val Ala Glu Val Thr Leu Gln Cys Val Ala 275 280 285 Arg His Glu Leu Val Glu His Thr Tyr Val Ser Asn Leu Gln Glu Ile 290 295 300 Lys Lys Asn His Lys Lys Leu Leu Ser Ala Asn Lys His Val Lys Tyr 305 310 315 320 Leu Tyr Ile Pro Tyr Thr Asp Thr Val Val Val Val Thr Cys Asn Pro 325 330 335 Val Ser Lys Trp Ser Gly Pro Pro Lys Asp Lys Pro Lys Tyr Thr Thr 340 345 350 Asp Glu Ala Val Gln His Val Arg Asp Leu Tyr Arg Glu Ser Ile Val 355 360 365 Lys Tyr Arg Val Gln Asp Ser Gly Lys Lys Ser Pro Asp Ser Ser Glu 370 375 380 Pro Asp Ile Gln Glu Leu Ser Phe Thr Glu Leu Arg Asp Lys Leu Leu 385 390 395 400 Ala Leu Asp Pro Leu Asn Asp Val His Val Ala Lys Val Asn Gln Ala 405 410 415 Glu Ala Glu Phe Trp Lys Lys Ser Glu Gly Tyr Arg Val Gly Trp Ser 420 425 430 Asp Glu Ile Leu Gly Phe Asp Cys Gly Gly Gln Gln Trp Val Ser Glu 435 440 445 Ser Cys Phe Pro Ala Gly Thr Leu Ala Asn Pro Ser Met Lys Asp Leu 450 455 460 Glu Tyr Ile Glu Glu Leu Lys Lys Leu Ile Glu Lys Glu Ala Ile Pro 465 470 475 480 Ala Pro Ala Pro Ile Glu Gln Arg Trp Thr Ala Arg Ser Lys Ser Pro 485 490 495 Ile Ser Pro Ala Phe Ser Thr Ser Glu Asp Asp Ile Phe Ser Trp Val 500 505 510 Gly Ile Ile Met Tyr Leu Pro Thr Ala Asp Pro Arg Gln Arg Lys Asp 515 520 525 Ile Thr Asp Glu Phe Phe His Tyr Arg His Leu Thr Gln Lys Gln Leu 530 535 540 Trp Asp Gln Phe Ser Ala Tyr Glu His Trp Ala Lys Ile Glu Ile Pro 545 550 555 560 Lys Asp Lys Glu Glu Leu Glu Ala Leu Gln Ala Arg Ile Arg Lys Arg 565 570 575 Phe Pro Val Asp Ala Tyr Asn Lys Ala Arg Arg Glu Leu Asp Pro Asn 580 585 590 Arg Ile Leu Ser Asn Asn Met Val Glu Lys Leu Phe Pro Val Ser Thr 595 600 605 Thr Ala 610 <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 27 Lys Ser Pro Ile Ser Pro Ala Phe Ser Thr Ser Glu Asp Asp Ile Phe 1 5 10 15 Ser Trp Val <210> 28 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 28 Trp Tyr Asn His Val Pro Pro Asp Ser Arg Pro Ser Pro Glu Lys Gly 1 5 10 15 His His Arg <210> 29 <211> 362 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: D-glucuronokinase <400> 29 Met Asp Pro Asn Ser Thr Val Ser Gly Asp Gly Gln Ala Thr Ala Ala 1 5 10 15 Ile Glu His Arg Ser Phe Ala Arg Ile Gly Phe Leu Gly Asn Pro Ser 20 25 30 Asp Val Tyr Phe Gly Arg Thr Ile Ser Leu Thr Ile Gly Asn Phe Trp 35 40 45 Ala Ser Val Lys Leu Glu Pro Ser Glu His Leu Val Ile Lys Pro His 50 55 60 Pro Phe His Asp Leu Val Gln Phe Thr Ser Leu Asp His Leu Leu Asn 65 70 75 80 Arg Leu Gln Asn Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Val Arg Leu Leu Met Ala 85 90 95 Ile Cys Lys Val Phe Arg Asn Tyr Cys Lys Glu Asn Asp Ile Gln Leu 100 105 110 His Gln Ala Asn Phe Ser Leu Ser Tyr Asp Thr Asn Ile Pro Arg Gln 115 120 125 Thr Gly Leu Ser Gly Ser Ser Ala Ile Val Ser Ala Ala Leu Asn Cys 130 135 140 Leu Leu Asp Phe Tyr Asn Val Arg His Leu Ile Lys Val Gln Val Arg 145 150 155 160 Pro Asn Ile Val Leu Ser Ala Glu Lys Glu Leu Gly Ile Val Ala Gly 165 170 175 Leu Gln Asp Arg Val Ala Gln Val Tyr Gly Gly Leu Val His Met Asp 180 185 190 Phe Ser Lys Glu His Met Asp Lys Leu Gly His Gly Ile Tyr Thr Pro 195 200 205 Met Asp Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu His Leu Ile Tyr Ala Glu Asn 210 215 220 Pro Ser Asp Ser Gly Lys Val His Ser Met Val Arg Gln Arg Trp Leu 225 230 235 240 Asp Gly Asp Glu Phe Ile Ile Ser Ser Met Lys Glu Val Gly Ser Leu 245 250 255 Ala Glu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Leu Asn Lys Asp His Ser Lys Leu 260 265 270 Val Glu Leu Met Asn Leu Asn Phe Asp Ile Arg Arg Arg Met Phe Gly 275 280 285 Asp Glu Cys Leu Gly Ala Met Asn Ile Glu Met Val Glu Val Ala Arg 290 295 300 Arg Val Gly Ala Ala Ser Lys Phe Thr Gly Ser Gly Gly Ala Val Val 305 310 315 320 Val Phe Cys Pro Glu Gly Pro Ser Gln Val Lys Leu Leu Glu Glu Glu 325 330 335 Cys Arg Lys Ala Gly Phe Thr Leu Gln Pro Val Lys Ile Ala Pro Ser 340 345 350 Cys Leu Asn Asp Ser Asp Ile Gln Thr Leu 355 360 <210> 30 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: UDP-D-glucose dehydrogenase <400> 30 Met Val Lys Ile Cys Cys Ile Gly Ala Gly Tyr Val Gly Gly Pro Thr 1 5 10 15 Met Ala Val Ile Ala Leu Lys Cys Pro Asp Ile Glu Val Ala Val Val 20 25 30 Asp Ile Ser Val Pro Arg Ile Asn Ala Trp Asn Ser Asp Gln Leu Pro 35 40 45 Ile Tyr Glu Pro Gly Leu Asp Asp Ile Val Lys Gln Cys Arg Gly Lys 50 55 60 Asn Leu Phe Phe Ser Thr Asp Val Glu Lys His Val Arg Glu Ala Asp 65 70 75 80 Ile Val Phe Val Ser Val Asn Thr Pro Thr Lys Thr Thr Gly Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Lys Ala Ala Asp Leu Thr Tyr Trp Glu Ser Ala Ala Arg Met 100 105 110 Ile Ala Asp Val Ser Val Ser Asp Lys Ile Val Val Glu Lys Ser Thr 115 120 125 Val Pro Val Lys Thr Ala Glu Ala Ile Glu Lys Ile Leu Met His Asn 130 135 140 Ser Lys Gly Ile Lys Phe Gln Ile Leu Ser Asn Pro Glu Phe Leu Ala 145 150 155 160 Glu Gly Thr Ala Ile Ala Asp Leu Phe Asn Pro Asp Arg Val Leu Ile 165 170 175 Gly Gly Arg Glu Thr Pro Glu Gly Phe Lys Ala Val Gln Thr Leu Lys 180 185 190 Glu Val Tyr Ala Asn Trp Val Pro Glu Gly Gln Ile Ile Thr Thr Asn 195 200 205 Leu Trp Ser Ala Glu Leu Ser Lys Leu Ala Ala Asn Ala Phe Leu Ala 210 215 220 Gln Arg Ile Ser Ser Val Asn Ala Met Ser Ala Leu Cys Glu Ser Thr 225 230 235 240 Gly Ala Asp Val Thr Gln Val Ser Tyr Ala Val Gly Thr Asp Ser Arg 245 250 255 Ile Gly Ser Lys Phe Leu Asn Ala Ser Val Gly Phe Gly Gly Ser Cys 260 265 270 Phe Gln Lys Asp Ile Leu Asn Leu Val Tyr Ile Cys Gln Cys Asn Gly 275 280 285 Leu Pro Glu Val Ala Glu Tyr Trp Lys Gln Val Ile Lys Ile Asn Asp 290 295 300 Tyr Gln Lys Asn Arg Phe Val Asn Arg Ile Val Ser Ser Met Phe Asn 305 310 315 320 Thr Val Ser Asn Lys Lys Val Ala Ile Leu Gly Phe Ala Phe Lys Lys 325 330 335 Asp Thr Gly Asp Thr Arg Glu Thr Pro Ala Ile Asp Val Cys Lys Gly 340 345 350 Leu Leu Gly Asp Lys Ala Gln Ile Ser Ile Tyr Asp Pro Gln Val Thr 355 360 365 Glu Glu Gln Ile Gln Arg Asp Leu Ser Met Lys Lys Phe Asp Trp Asp 370 375 380 His Pro Leu His Leu Gln Pro Met Ser Pro Thr Thr Val Lys Gln Val 385 390 395 400 Ser Val Thr Trp Asp Ala Tyr Glu Ala Thr Lys Asp Ala His Ala Val 405 410 415 Cys Val Leu Thr Glu Trp Asp Glu Phe Lys Ser Leu Asp Tyr Gln Lys 420 425 430 Ile Phe Asp Asn Met Gln Lys Pro Ala Phe Ile Phe Asp Gly Arg Asn 435 440 445 Ile Met Asn Val Asn Lys Leu Arg Glu Ile Gly Phe Ile Val Tyr Ser 450 455 460 Ile Gly Lys Pro Leu Asp Pro Trp Leu Lys Asp Met Pro Ala Phe Val 465 470 475 480

Claims (14)

  1. α 케토글루타레이트 수송체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 효모 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 α 케토글루타레이트 수송체는 SEQ ID NO: 1에 적어도 90% 일치하는 서열을 갖는, 재조합 효모 세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 효모 세포에서의 발현에 최적화된, 재조합 효모 세포.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 효모 세포의 게놈 내로 재조합되거나 또는 상기 효모 세포 내에서 코딩 서열 mRNA의 생성을 가능하게 하는 전사 제어 요소를 포함하는 재조합 벡터에서 염색체 외에서(episomally) 존재하는, 재조합 효모 세포.
  5. 청구항 1에 있어서, 콜라겐, 또는 이의 콜라겐 단편을 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 더욱 포함하는, 재조합 효모 세포.
  6. 청구항 1에 있어서, 프롤릴 4-하이드록실라제, 프롤릴 3-하이드록실라제, 및 라이실 하이드록실라제를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 더욱 포함하는, 재조합 효모 세포.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 콜라겐 또는 이의 콜라겐 단편은 적어도 하나의 하이드록시라이실 잔기에서 글리코실화되는, 재조합 효모 세포.
  8. 청구항 1에 있어서, 글리코실 하이드록실라제를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 더욱 포함하는, 재조합 효모 세포.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 효모 세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)인, 재조합 효모 세포.
  10. 청구항 1의 재조합 효모 세포의 생성 방법에서, 상기 방법은 효모 세포에서 코딩 서열 mRNA의 생성을 가능하게 하는 하나 이상의 전사 조절 요소에 기능적으로 결합된 α 케토글루타레이트 수송체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 상기 효소 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 효모 세포 내에서 수산화된 콜라겐을 생성하는 방법에서, 상기 방법은 청구항 1의 재조합 효모 세포를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 배양물에서 상기 재조합 효모 세포에 의해 생성된 변형 재조합 콜라겐을 분리 또는 정제하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
  13. 청구항 11의 방법에 의해 획득되는 콜라겐.
  14. 청구항 13의 콜라겐을 포함하는, 생제작된 가죽 물질.
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