CN109536396A - 重组酵母菌株 - Google Patents

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K·卢艾布林-加斯
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Abstract

本发明涉及经遗传工程化的酵母菌株和用于产生重组蛋白质(例如，胶原蛋白)的方法。本发明的重组蛋白质用于生产含有重组或工程化的胶原蛋白的生物制造的皮革或具有皮革样特性的材料。对酵母菌株进行工程化以产生抗坏血酸和/或增加的α‑酮戊二酸的产生。

Description

重组酵母菌株
相关申请的交叉引用
本申请涉及标题为Biofabricated Material Containing Collagen Fibrils的美国专利申请第15/433,566号、标题为Method for Making a Biofabricated MaterialContaining Collagen Fibrils的第15/433,650号、标题为Recombinant Yeast Strains的第62/526,912号和标题为Yeast Strains and Method for Controlling Hydroxylationof Recombinant Collagen的第62/539,213号，并且要求2017年9月22日提交的标题为Recombinant Yeast Strains的第62/562,109号的优先权。这些申请的全部内容通过引用并入。
发明领域
本发明在本文中提供了经遗传工程化的酵母菌株以及用于生产重组蛋白质和碳水化合物的方法。在一个实施方案中，本发明提供了经遗传工程化的酵母菌株和用于生产可用于生产生物制造的皮革材料的重组胶原的方法，包含生物制造的材料的制品，和/或含有重组或工程化的胶原的具有皮革样特性的材料。对酵母菌株进行工程化以通过使用α-酮戊二酸转运蛋白(kgtP)和/或使得抗坏血酸合成途径能够发挥功能的一种或多种多肽改善羟基化反应来产生增加量的羟基化蛋白质(例如，胶原蛋白)和碳水化合物，所述多肽是诸如GDP-L-Gal磷酸化酶、磷酸肌醇磷酸酶、GDP-甘露糖-3，5-差向异构酶和/或L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶、醛内酯酶(aldonolactonase)、葡糖醛酸内酯还原酶、D-葡糖醛酸还原酶、尿内酯酶(uronolactonase)、D-葡糖醛酸激酶、葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-D-葡萄糖脱氢酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase)和/或己糖激酶。
相关技术描述
皮革被用于各种应用中，包括家具装饰材料、服装、鞋子、箱包、手袋及配件以及汽车应用。估计的皮革全球贸易价值大约为每年1000亿美元(Future Trends in the WorldLeather Products Industry and Trade，United Nations Industrial DevelopmentOrganization，Vienna，2010)并且对皮革产品的需求在持续和不断地增加。传统的皮革生产对动物皮和化学品来说是浪费的。为了跟上对皮革产品持续和不断增长的需求，对动物生皮的需求不断增加，给我们日益紧张的食品来源带来了额外的压力，而化学废弃物继续导致我们正在恶化的环境条件。因此，考虑到生产皮革的经济、环境和社会成本，需要满足这种需求的新方法。为了跟上技术和审美趋势，皮革产品的生产者和使用者寻求掺入天然组分的表现出优越强度、均匀性、可加工性以及时尚和吸引人的美学性质的新材料。
鉴于人口增长和全球环境，将需要具有皮革般美学和改进的功能性的替代材料。皮革是动物生皮，并几乎完全由胶原组成。需要可被掺入到生物制造的材料中的新的胶原来源。
使用重组表达的胶原生产生物制造的材料面临许多挑战，包括需要以各种商业应用所需要的形式和数量高效产生胶原的方法。对于某些应用，需要更柔软和更具渗透性的胶原组分；在其他情况下，需要更坚硬、更具抗性和耐用的胶原组分。
本发明人试图通过用kgtP基因(其提供α酮戊二酸转运蛋白)和/或一种或多种能够使抗坏血酸合成途径起作用(以使得重组酵母细胞产生抗坏血酸)使重组酵母进行遗传工程化来解决这些挑战。
发明概要
本发明的一个方面涉及含有α-酮戊二酸转运蛋白的经修饰的酵母细胞。修饰包括将kgtP基因转化到酵母中，使得所述酵母能够产生α酮戊二酸转运蛋白。可以进一步修饰酵母细胞以表达和/或过表达使羟脯氨酸和/或赖氨酸残基羟基化(以产生羟脯氨酸、3-羟基脯氨酸(Hyp)和羟基赖氨酸(Hyl)以及羟赖氨酰基残基的糖基化)的蛋白。在本发明的一个实施方案中，本发明提供了用于增加酵母中蛋白质诸如羟基化蛋白质(例如，胶原蛋白)或碳水化合物的产生的方法。该方法包括将kgtP基因、蛋白质或碳水化合物的DNA和用于启动子、终止子和标记的DNA插入(例如，转化或基因组整合)到酵母中以使酵母能够产生α酮戊二酸转运蛋白和所述蛋白质或碳水化合物。该方法还包括插入表达羟化脯氨酸和/或赖氨酸残基的一种或多种蛋白质的基因。
本发明的另一方面涉及产生抗坏血酸的经修饰的酵母细胞。修饰包括插入使抗坏血酸合成途径起作用的基因。在一个实施方案中，本发明提供了用于产生生产抗坏血酸的经修饰酵的母细胞的方法。该方法包括插入完成功能性抗坏血酸合成途径所必需的基因。在该方法中，设想仅需要将一种或多种编码抗坏血酸合成途径的一部分的蛋白质的基因插入到供给酵母细胞的抗坏血酸途径前体下游。在另一个实施方案中，本发明提供了在酵母细胞中产生细胞内抗坏血酸的方法，其包括在培养基中培养经修饰的酵母细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了具有恒定量的细胞内抗坏血酸的经修饰的酵母细胞。
本发明的另一方面涉及含有α-酮戊二酸转运蛋白并产生抗坏血酸的经修饰的酵母细胞。可以进一步修饰酵母细胞以表达和/或过表达使羟脯氨酸和/或赖氨酸残基羟基化(以产生羟脯氨酸、3-羟基脯氨酸(Hyp)和羟基赖氨酸(Hyl)以及羟赖氨酰基残基的糖基化)的蛋白。该方法包括将完成功能性抗坏血酸合成途径和α-酮戊二酸转运蛋白所必需的基因插入酵母中。该方法还可包括插入表达羟化脯氨酸和/或赖氨酸残基的蛋白质的基因。在另一个实施方案中，本发明提供了在酵母细胞中产生细胞内抗坏血酸的方法，其包括在培养基中培养经修饰的酵母细胞。在本发明的一个实施方案中，本发明提供了增加酵母中蛋白质诸如羟基化胶原蛋白或碳水化合物的产生的方法，所述酵母含有α-酮戊二酸转运蛋白并产生抗坏血酸。
发明详述
如本文所述和举例说明的，酵母细胞(例如，巴斯德毕赤酵母)可用于表达具有不同羟基化程度的重组III型牛胶原蛋白。重组胶原蛋白的羟基化通过共表达牛P4HA和牛P4HB来完成，所述牛P4HA和牛P4HB分别编码牛脯氨酰基-4-羟化酶的α和β亚基。然而，本发明不限于III型胶原蛋白的产物和表达，并且可用其它蛋白质或碳水化合物、编码其它种类胶原蛋白的亚单元的多核苷酸以及用羟基化脯氨酸残基、赖氨酸残基或脯氨酸和赖氨酸残基的酶来实施。。III型原胶原蛋白是同源三聚体。然而，在一些实施方案中，胶原蛋白将形成由不同多肽链组成的异源三聚体，诸如I型胶原蛋白，其最初由两个pro-α1(I)链和一个pro-α2(I)链组成。
胶原。胶原是皮革的主要成分。皮肤或动物生皮含有大量的胶原(纤维状蛋白)。胶原为具有至少28个不同胶原类型的家族的通称；动物皮肤通常为I型胶原，虽然在形成皮革中可以使用其他类型的胶原，包括III型胶原。术语“胶原”包括具有三股螺旋结构的未加工的(例如，原胶原)以及翻译后修饰和蛋白水解的胶原。
胶原的特征在于氨基酸的重复三联体-(Gly-X-Y)n-，并且胶原中大约三分之一的氨基酸残基为甘氨酸。X通常为脯氨酸并且Y通常为羟基脯氨酸，虽然可以存在高达至400个可能的Gly-X-Y三联体。不同动物可以产生不同的胶原氨基酸组成，这可引起所得皮革的不同性质和差异。
胶原的结构可以由不同长度的三个缠结肽链组成。胶原三重螺旋(或单体)可以由约1,050个氨基酸长的α-链产生，以使得三重螺旋体采取约近似300nm长的棒状形式，其中直径近似为1.5nm。
取决于动物生皮的类型，纤维可具有一系列直径。除了I型胶原以外，皮肤(生皮)也可包括其它类型的胶原，包括III型胶原(网硬蛋白)、IV型胶原和VII型胶原。各种类型的胶原存在于整个哺乳动物身体中。例如，除了为皮肤和动物生皮的主要组分之外，I型胶原还存在于软骨、肌腱、血管结扎、器官、肌肉以及骨骼的有机部分中。已做出成功的努力将胶原从除了动物皮肤或生皮以外的各种哺乳动物身体区域中分离。数十年前，研究者发现在中性pH下，酸溶解的胶原自组装成在天然组织中观察到的相同横条纹图案组成的原纤维；Schmitt F.O.J.Cell.Comp Physiol.1942；20：11)。这导致在组织工程和各种生物医疗应用中使用胶原。在最近几年里，已使用重组技术从细菌和酵母中收获胶原。
通过物理和化学相互作用(包括静电相互作用诸如盐桥、氢键、范德华相互作用、偶极-偶极力、极化力、疏水相互作用和通常由酶促反应催化的共价键合)的组合形成和稳定胶原。已经在脊椎动物中鉴定了各种不同的胶原类型，包括牛、绵羊、猪、鸡和人胶原。
通常，胶原类型由罗马数字编号，并且存在于每种胶原类型中的链由阿拉伯数字标识。各种不同类型的天然存在的胶原的结构和生物功能的详述可在本领域中获得；参见，例如，Ayad等(1998)The Extracellular Matrix Facts Book，Academic Press，SanDiego，CA；Burgeson，R E.和Nimmi(1992)″Collagen types：Molecular Structure andTissue Distribution″in Clin.Orthop.282：250-272；Kielty，C.M.等(1993)″TheCollagen Family：Structure，Assembly And Organization In The ExtracellularMatrix，″Connective Tissue And Its Heritable Disorders，Molecular Genetics，AndMedical Aspects，Royce，P.M.和B.Steinmann编辑，Wiley-Liss，NY，第103-147页；以及Prockop，D.J-和K.I.Kivirikko(1995)″Collagens：Molecular Biology，Diseases，andPotentials for Therapy，″Annu.Rev.Biochem.，64：403-434.)
I型胶原为骨骼和皮肤的主要纤维状胶原，其占生物体总胶原的大约80％-90％。I型胶原为存在于多细胞生物体的细胞外基质中的主要结构大分子并且占总蛋白质质量的大约20％。I型胶原为包含两个α1(I)链和一个α2(I)链的异源三聚体分子，所述α1(I)链和α2(I)链分别由COL1A1基因和COL1A2基因编码。在体内，I型胶原纤维、纤维和纤维束的组装在发育过程中发生，并为组织提供机械支撑，同时允许细胞运动和营养物运输。其它胶原类型不如I型胶原丰富，并且表现出不同的分布模式。例如，II型胶原为软骨和玻璃体中的主要胶原，而III型胶原以高水平存在于血管中并且以较小的程度存在于皮肤中。
II型胶原为包含三个相同a1(II)链的同源三聚体胶原，所述a1(II)链由COL2A1基因编码。纯化的II型胶原可通过本领域中已知的方法，例如通过描述于Miller和Rhodes(1982)Methods In Enzymology 82：33-64中的程序由组织制备。
III型胶原为存在于皮肤和血管组织中的主要纤维状胶原。III型胶原为包含三个相同α1(III)链的同源三聚体胶原，所述α1(III)链由COL3A1基因编码。可以优化COL3A1基因以在宿主细胞例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(SEQ ID NO：10)中表达。用于从组织纯化III型胶原的方法可见于例如Byers等(1974)Biochemistry 13：5243-5248以及Miller和Rhodes，同上中。
IV型胶原以片状而不是原纤维的形式存在于基底膜中。最常见地，IV型胶原含有两个α1(IV)链和一个α2(IV)链。包含IV型胶原的特定链为组织特异性的。IV型胶原可例如使用描述于Furuto和Miller(1987)Methods in Enzymology，144：41-61，Academic Press中的程序来纯化。
V型胶原为主要存在于骨骼、肌腱、角膜、皮肤以及血管中的纤维状胶原。V型胶原以同源三聚体和异源三聚体形式存在。V型胶原的一种形式为两个α1(V)链和一个α2(V)链的异源三聚体。V型胶原的另一种形式为α1(V)链、α2(V)链和α3(V)链的异源三聚体。V型胶原的又一种形式为α1(V)的同源三聚体。用于从天然来源中分离V型胶原的方法可以见于例如Elstow和Weiss(1983)Collagen Rel.Res.3：181-193，以及Abedin等(1982)Biosci.Rep.2：493-502中。
VI型胶原具有一个小的三螺旋区和两个大的非胶原其余部分。VI型胶原为包含α1(VI)链、α2(VI)链和α3(VI)链的异源三聚体。VI型胶原存在于许多结缔组织中。如何从天然来源中纯化VI型胶原的描述可以见于例如Wu等(1987)Biochem.J.248：373-381，以及Kielty等(1991)J.Cell Sci.99：797-807。
VII型胶原为存在于特定上皮组织中的纤维状胶原。VII型胶原为三个α1(VII)链的同源三聚体分子。如何从组织中纯化VII型胶原的描述可以见于例如Lunstrum等(1986)J.Biol.Chem.261：9042-9048，以及Bentz等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3168-3172。VIII型胶原可以存在于角膜中的后弹力膜中。VIII型胶原为包含两个α1(VIII)链和一个α2(VIII)链的异源三聚体，虽然已报道了其它链组成。用于从自然界中纯化VIII型胶原的方法可以见于例如Benya和Padilla(1986)J.Biol.Chem.261：4160-4169，以及Kapoor等(1986)Biochemistry 25：3930-3937。
IX型胶原为存在于软骨和玻璃体中的原纤维相关的胶原。IX型胶原为包含α1(IX)链、α2(IX)链和α3(IX)链的异源三聚体分子。IX型胶原被分类为FACIT(具有中断三股螺旋的原纤维相关胶原)胶原，其具有被非三股螺旋结构域分隔的数个三股螺旋结构域。用于纯化IX型胶原的程序可以见于例如Duance等(1984)Biochem.J.221：885-889；Ayad等(1989)Biochem.J.262：753-761；以及Grant等(1988)The Control of Tissue Damage，Glauert，A.M.编辑，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，第3-28页。
X型胶原为α1(X)链的同源三聚体化合物。已从例如存在于生长板中的肥大软骨中分离X型胶原；参见，例如，Apte等(1992)Eur J Biochem 206(1)：217-24。
XI型胶原可以存在于与II型胶原和IX胶原相关的软骨组织中，并且存在于身体中的其它位置中。XI型胶原为包含α1(XI)链、α2(XI)链和α3(XI)链的异源三聚体分子。用于纯化XI型胶原的方法可见于Grant等，同上中。
XII型胶原为主要与I型胶原相伴存在的FACIT胶原。XII型胶原为包含三个α1(XII)链的同源三聚体分子。用于纯化XII型胶原及其变体的方法可以见于例如Dublet等(1989)J.Biol.Chem.264：13150-13156；Lunstrum等(1992)J.Biol.Chem.267：20087-20092；以及Watt等(1992)J.Biol.Chem.267：20093-20099。XIII型为例如存在于皮肤、肠、骨骼、软骨以及横纹肌中的非纤维状胶原。XIII型胶原的详述可见于例如Juvonen等(1992)J.Biol.Chem.267：24700-24707。
XIV型为特征为包含α1(XIV)链的同源三聚体分子的FACIT胶原。用于分离XIV型胶原的方法可见于例如Aubert-Foucher等(1992)J.Biol.Chem.267：15759-15764和Watt等，/同上。
XV型胶原在结构上与XVIII型胶原同源。关于天然XV型胶原的结构和分离的信息可以见于例如Myers等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10144-10148；Huebner等(1992)Genomics 14：220-224；Kivirikko等(1994)J.Biol.Chem.269：4773-4779；以及Muragaki，J.(1994)Biol.Chem.264：4042-4046。
XVI型胶原为例如存在于皮肤、肺成纤维细胞以及角质形成细胞中的原纤维相关胶原。关于XVI型胶原的结构和编码XVI型胶原的基因的信息可以见于例如Pan等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6565-6569；以及Yamaguchi等(1992)J.Biocheml 12：856-863。
XVII型胶原为也称为大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)抗原的半桥粒跨膜胶原。关于XVII型胶原的结构和编码XVII型胶原的基因的信息可以见于例如Li等(1993)J.Biol.Chem.268(12)：8825-88 34；以及McGrath等(1995)Nat.Genet.11(1)：83-86。
XVIII型胶原在结构上类似于XV型胶原并且可以从肝脏中分离。关于XVIII型胶原的结构和从天然来源中分离XVIII型胶原的描述可以见于例如Rehn和Pihlajaniemi(1994)Proc.Natl.Acad.Sci USA 91：4234-4238；Oh等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci USA 91：4229-4233；Rehn等(1994)J.Biol.Chem.269：13924-13935；以及Oh等(1994)Genomics 19：494-499。
XIX型胶原被认为是FACIT胶原家族的另一个成员，并且已存在于从横纹肌肉瘤细胞中分离的mRNA中。XIX型胶原的结构和分离的描述可以见于例如Inoguchi等(1995)J.Biochem.117：137-146；Yoshioka等(1992)Genomics 13：884-886；以及Myers等，J.Biol.Chem.289：18549-18557(1994)。
XX型胶原为新发现的FACIT胶原家族的成员，并且已在小鸡角膜中鉴定出。(参见，例如，Gordon等(1999)FASEB Journal 13：A1119；和Gordon等(1998)，IOVS 39：S1128.)
术语“胶原”是指已知胶原类型(包括上述I型至XX型胶原)中的任一种，以及指任何其它胶原，无论是天然的、合成的、半合成的还是重组的。其包括本文描述的所有胶原、经修饰的胶原和胶原样蛋白质。术语还涵盖包含基序(Gly-X-Y)n的原胶原和胶原样蛋白质或胶原蛋白，其中n为整数。其涵盖胶原和胶原样蛋白质的分子、胶原分子的三聚体、胶原的原纤维以及胶原原纤维的纤维。其还是指可被原纤化的化学、酶促或重组修饰的胶原或胶原样分子以及能够组装成纳米纤维的胶原、胶原样分子和胶原分子的片段。重组胶原分子(无论是天然的还工程化的)通常包含本文所述的重复的-(Gly-X-Y)n-序列。
胶原组合物中的胶原可同质地含有单一类型的胶原分子，诸如100％I型牛胶原或100％III型牛胶原，或可含有不同种类的胶原分子或胶原样分子的混合物，诸如牛I型和III型分子的混合物。此类混合物可包含＞0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或＜100％的单独的胶原或胶原样蛋白质组分。此范围包括所有中间值。例如，胶原组合物可含有30％I型胶原和70％III型胶原，或可含有33.3％的I型胶原、33.3％的II型胶原以及33.3％的III型胶原，其中胶原的百分比基于组合物中的胶原总质量或基于胶原分子的分子百分比。
“胶原原纤维”为由原胶原(胶原分子的三股螺旋)组成的纳米纤维。原胶原还包括表现出三股螺旋结构的原胶原样结构。本发明的胶原原纤维可具有1nm和1μm范围内的直径。例如，本发明的胶原原纤维可具有1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1,000nm(1μm)范围内的平均或单独的原纤维直径。此范围包括所有中间值和子范围。在本发明的一些实施方案中，胶原原纤维将形成网络。胶原纤维可缔合成呈现带状图案的原纤维，并且这些原纤维可缔合成更大的原纤维聚集体。在一些实施方案中，胶原或胶原样原纤维将具有类似于牛皮革或其它常规皮革的上粒面或表面层中的那些的直径和取向。在其它实施方案中，胶原原纤维可具有包括上粒面和常规皮革的真皮层的那些的直径。
“胶原纤维”由胶原原纤维组成，所述胶原原纤维紧密堆积并在纤维方向上表现出高度对准。其直径可以从大于1μm变化至大于10μm变化，例如＞1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μm或更大。本发明的胶原原纤维网络的一些实施方案不含有大量直径大于5μm的胶原纤维。皮革的粒面的组成可以与其更内部部分诸如包含较粗纤维束的真皮不同。
“原纤化”是指产生胶原原纤维的过程。其可通过提高pH或通过调节胶原溶液或悬浮液的盐浓度来进行。在形成原纤化的胶原中，胶原可被孵育以形成原纤维持续任何适当的时间长度，包括1分钟至24小时和所有中间值。
本文描述的原纤化的胶原可通常以任何适当的形状和/或厚度形成，包括扁平片、弯曲形状/片、圆柱体、线状物以及复合形状。这些片和其它形式可具有几乎任何线性的尺寸，包括大于10、20、30、40、50、60、70、80、90mm；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、200、500、1,000、1,500、2,000cm或更大的厚度、宽度或高度。
原纤化胶原可能缺乏任何或任何实质量的高级结构。在优选实施方案中，胶原原纤维是未成束的并且不形成在动物皮肤中发现的大胶原纤维，并为生物制造的皮革提供强而均匀的非各向异性结构。
在其它实施方案中，一些胶原原纤维可成束或排列成高级结构。生物制造的皮革中的胶原原纤维可表现出0、＞0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、＜1.0或1.0范围内的取向指数(orientation index)，其中取向指数为0描述了缺乏与其它原纤维对准的胶原蛋白原纤维，并且取向指数为1.0描述了完全对准的胶原蛋白原纤维。此范围包括所有中间值和子范围。本领域技术人员熟悉取向指数，所述取向指数还通过引用以下参考文献并入：Sizeland等，J.Agric.Food Chem.61：887-892(2013)或Basil-Jones等，J.Agric.Food Chem.59：9972-9979(2011)。
生物制造的皮革可被原纤化和加工以含有胶原原纤维，所述胶原原纤维类似或模拟通过特定动物物种或品种或通过在特定条件下喂养的动物产生的胶原原纤维的性质。
或者，原纤化和加工条件可以被选择来提供不同于存在于自然界中的那些的胶原原纤维，诸如通过与天然皮革中的原纤维相比减少或增加原纤维直径、对准程度或交联程度。
胶原的交联网络(有时称为水凝胶)可随着胶原被原纤化而形成，或其可在原纤化之后形成网络；在一些变体中，原纤化胶原的方法还形成凝胶样网络。一旦形成，原纤化的胶原网络可通过掺入具有双官能、三官能或多官能的反应性基团的分子来进一步稳定，所述反应性基团包括铬、胺、羧酸、硫酸盐、亚硫酸盐、磺酸盐、醛、酰肼、巯基、二氮丙啶、芳基-、叠氮化物、丙烯酸酯、环氧化物或苯酚。
原纤化的胶原网络还可与其它试剂(例如能够聚合的聚合物或其它合适的纤维)聚合，这可用于进一步稳定基质并提供所需的端部结构。基于丙烯酰胺、丙烯酸以及其盐的水凝胶可使用反相悬浮聚合来制备。本文描述的水凝胶可由极性单体制备。所用的水凝胶可为天然聚合物水凝胶、合成聚合物水凝胶或两者的组合。所用的水凝胶可使用接枝聚合、交联聚合、由水溶性聚合物形成的网络、辐射交联等来获得。可将少量交联剂添加至水凝胶组合物中以增强聚合。
在整个生物制造的皮革的厚度中，平均或单独的胶原原纤维长度可在100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000(1μm)；5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000μm(1mm)范围内。这些范围包括所有中间值和子范围。
原纤维可在其长度的50、100、200、300、400、500μm或更大长度上与其它原纤维对准，或可表现出几乎没有或没有对准。在其它实施方案中，一些胶原原纤维可成束或排列成高级结构。
生物制造的皮革中的胶原原纤维可表现出0、＞0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、＜1.0或1.0范围内的取向指数(orientation index)，其中取向指数为0描述了缺乏与其它原纤维对准的胶原蛋白原纤维，并且取向指数为1.0描述了完全对准的胶原蛋白原纤维。此范围包括所有中间值和子范围。本领域技术人员熟悉取向指数，所述取向指数还通过引用以下参考文献并入：Sizeland等，J.Agric.Food Chem.61：887-892(2013)或Basil-Jones等，J.Agric.Food Chem.59：9972-9979(2011)。
生物制造的皮革的胶原原纤维密度可在约1至1,000mg/cc，优选5至500mg/cc的范围内，包括所有中间值，诸如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900以及1,000mg/cc。
生物制造的皮革中的胶原原纤维可表现出单峰、双峰、三峰或多峰分布，例如生物制造的皮革可由两种不同的原纤维制剂组成，所述原纤维制剂各自具有围绕两种不同模式中的一种排列的不同原纤维直径范围。此类混合物可被选择来对生物制造的皮革赋予累和、协同或平衡的物理性质，所述物理性质由具有不同直径的原纤维赋予。
基于皮革产品的重量，天然皮革产品可含有150-300mg/cc胶原。基于生物制造的皮革的重量，生物制造的皮革可含有与常规皮革相似含量的胶原或胶原原纤维，诸如胶原浓度为100、150、200、250、300或350mg/cc。
原纤化的胶原(有时称为水凝胶)可具有基于其最终用途而选择的厚度。原纤化的胶原的较厚或更浓的制剂通常产生较厚的生物制造的皮革。生物制造的皮革的最终厚度可仅为通过交联、脱水和润滑引起的收缩前的原纤维制剂的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
“交联”是指胶原分子之间内的化学键的形成(或重新形成)。交联反应使胶原结构稳定并且在一些情况下在胶原分子之间形成网络。可以使用本领域已知的任何合适的交联剂，包括但不限于矿物盐诸如基于铬的那些、甲醛、六亚甲基二异氰酸酯、戊二醛、聚环氧化合物、γ辐射以及针对核黄素的紫外线辐射。交联可以通过任何已知的方法来进行；参见，例如，Bailey等，Radiat.Res.22：606-621(1964)；Housley等，Biochem.Biophys.Res.Commun.67：824-830(1975)；Siegel，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.71：4826-4830(1974)；Mechanic等，Biochem.Biophys.Res.Commun.45：644-653(1971)；Mechanic等，Biochem.Biophys.Res.Commun.41：1597-1604(1970)；以及Shoshan等，Biochim.Biophys.Acta 154：261-263(1968)，所述参考文献的每一篇通过引用并入。
交联剂包括异氰酸酯、碳二亚胺、聚(醛)、聚(氮吖啶)、矿物盐、聚(环氧化物)、酶、硫杂丙环、酚醛树脂、酚醛清漆、可溶酚醛树脂以及具有与氨基酸侧链反应的化学性质的其它化合物，所述氨基酸侧链是诸如赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、羟基脯氨酸或羟基赖氨酸。
胶原或胶原样蛋白质可被化学修饰以促进胶原原纤维之间的化学和/或物理交联。化学交联可为可能的，因为胶原分子上的反应性基团诸如赖氨酸、谷氨酸和羟基基团从胶原的棒状样原纤维结构中伸出。涉及这些基团的交联避免胶原分子在应力下彼此滑过去，并且因而增加胶原纤维的机械强度。化学交联反应的实例包括但不限于与赖氨酸的ε-氨基基团反应、或与胶原分子的羧基基团反应。诸如转谷氨酰胺酶这样的酶还可用于在谷氨酸与赖氨酸之间生成交联，以便形成稳定的γ-谷酰基-赖氨酸交联。诱导相邻胶原分子的官能团之间的交联为本领域已知的。交联为可在此实施以调节从原纤化的胶原水凝胶衍生的材料中获得的物理性质的另一个步骤。
原纤化或经原纤化的胶原仍可被交联或润滑。可在网络形成前、在网络形成或网络凝胶形成过程中用含有铬或至少一个醛基团的化合物或植物单宁处理胶原原纤维。交联进一步使原纤化的胶原皮革稳定。例如，用丙烯酸聚合物预处理接着用植物单宁诸如柔金合欢(Acacia Mollissima)处理的胶原原纤维可以表现出增加的水热稳定性。在其它实施方案中，甘油醛可被用作交联剂以增加原纤化的胶原的热稳定性、蛋白质水解抗性以及机械特征，诸如杨氏模量和拉伸应力。
含有胶原原纤维网络的生物制造的材料可含有0、＞0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或更多的交联剂，包括用于常规皮革的鞣剂。交联剂可被共价键合至胶原原纤维或生物制造的材料的其它组分或与它们非共价缔合。优选地，生物制造的皮革将含有不大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的交联剂。
“润滑”描述了将润滑剂施加至皮革或施加至包含胶原的生物制造的产品的方法，所述润滑剂是诸如脂肪或其它疏水性化合物或在脱水过程中调节或控制原纤维-原纤维粘合的任何材料。皮革美感的期望特征为材料的刚性或手感。为了实现这种性质，通过使用润滑剂将原纤维和/或纤维之间的水介导的氢键键合限制于皮革中。润滑剂的实例包括脂肪、生物油、矿物质油或合成油、鳕鱼油、磺化油、聚合物、有机官能硅氧烷、以及用于对常规皮革加脂的其他疏水性化合物或试剂以及其混合物。虽然润滑是以类似于对天然皮革加脂的一些方式，但生物制造的产品由于其制造方法、更同质的组合物以及较不复杂的组成而可以被更均匀地用润滑剂处理。
其它润滑剂包括表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阳离子聚合表面活性剂、阴离子聚合表面活性剂、两性聚合物、脂肪酸、改性的脂肪酸、非离子型亲水聚合物、非离子型疏水聚合物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、丙烯酸、天然橡胶、合成橡胶、树脂、两性阴离子聚合物和共聚物、两性阳离子聚合物和共聚物及其混合物以及这些物质在水、醇、酮和其它溶剂中的乳液或悬浮液。
润滑剂可被添加至含有胶原原纤维的生物制造的材料中。可以以有利于原纤维移动或赋予皮革样性质诸如柔性、脆性减小、耐用性或防水性的任何量掺入润滑剂。润滑剂含量可在按生物制造的皮革的重量计约0.1％、0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％和60％的范围内。
可以添加其它添加剂以改变生物制造的皮革或材料的性质。合适的添加剂包括但不限于染料、色素、芳香剂、树脂和微粒。可加入树脂以改变材料的拉伸性，强度和柔软性。合适的树脂包括但不限于弹性体、丙烯酸共聚物、聚氨酯等。合适的弹性体包括但不限于苯乙烯、异戊二烯、丁二烯共聚物诸如弹性体、丙烯酸树脂。树脂可以以约5％至200％，或约50％至150％(基于胶原的重量)使用，这些范围包括其间的所有值和子范围，诸如10、15、20、25、30、35、40、60、70、75、80、90、100、125、140等。
“脱水”或“除水”描述了从含有胶原原纤维和水的混合物诸如含有原纤化的胶原的水溶液、悬浮液、凝胶或水凝胶中去除水的过程。可通过过滤、蒸发、冷冻-干燥、溶剂交换、真空-干燥、对流-干燥、加热、辐射或微波，或通过用于去除水的其它已知方法来去除水。另外，已知胶原的化学交联来通过消耗亲水性氨基酸残基诸如赖氨酸、精氨酸和羟基赖氨酸等来从胶原去除结合水。本发明人已发现丙酮可快速地使胶原原纤维脱水，并且还可去除结合至水合胶原分子的水。脱水之后的生物制造的材料或皮革的含水量优选地为不大于按重量计60％，例如按生物制造皮革的重量计不大于5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、50％或60％。此范围包括所有中间值。通过在65％相对湿度下，在25℃和1个大气压下平衡来测量含水量。
“粒面纹理(Grain texture)”描述了皮革样纹理，其在美学上或纹理上类似于全粒面皮革、头层皮(top grain leather)、磨面皮(其中已经施加人造粒面(artificialgrain))的纹理或更粗糙的剥离-粒面皮革(split grain leather)的纹理。有利地，可以调整本发明的生物制造的材料以提供类似于皮革表面粒面的细粒面。
本发明中的制品可包括鞋袜、服装、手套、家具或车辆内饰以及其它皮革制品和产品。其包括但不限于服装，诸如大衣、外套、夹克、衬衫、长裤、衬裤、短裤、游泳衣、内衣、制服、徽章或字母、戏装、领结、短裙、连衣裙、女衬衫、绑腿、手套、连指手套、鞋子、鞋组件(诸如鞋底、鞋腰(quarter)、鞋舌、鞋领口、沿条以及后跟鞋帮)、时装鞋、运动鞋、跑鞋、休闲鞋、运动、跑步或休闲鞋组件(诸如鞋头、套头、大底、中底、鞋帮、鞋带、鞋眼、鞋领、衬里、阿基里斯切迹、鞋后跟以及后跟鞋帮)、时尚或女性鞋和其鞋组件(诸如鞋帮、大底、鞋头翘度、套头、装饰品、鞋面、衬里、鞋垫、内底、厚底、鞋帮以及鞋后跟)或高跟鞋、靴子、凉鞋、纽扣、凉鞋、帽子、口罩、头饰、束发带、后缚帽以及腰带；珠宝诸如手镯、表带和项链；手套、伞、拐杖、钱包、移动电话或可穿戴计算机覆盖物、钱包、背包、手提箱、手袋、表册、文件夹、盒子和其它个人物品；运动、体育运动、狩猎或娱乐设备诸如马具、缰绳、绳索、马嚼子、皮带、连指手套、网球拍、高尔夫球棒、马球、曲棍球或曲棍球用具、国际象棋盘和游戏板、健身实心球、玩具球(kick ball)、棒球和其它种类的球以及玩具；图书装订、书籍封面、相框或艺术品；家具和家居、办公室或其它室内或室外家具，包括椅子、沙发、门、座椅、垫脚软凳、房间分隔板、杯垫、鼠标垫、桌面记事簿或其它垫、桌子、床、地板、墙壁或天花板覆盖物、地板材料；汽车、船、飞机和其它车载产品，包括座椅、头枕、车内装饰、镶板、方向盘、操纵杆或控制覆盖物以及其它包装或覆盖物。
胶原原纤维的生物制造的网络或生物制造的皮革的物理性质可通过选择胶原类型、原纤化的胶原的浓度的量、原纤化、交联、脱水和润滑的程度来选择或调整。
许多有利的性质与胶原原纤维的网络结构相关，其可以为所得的生物制造的材料或皮革提供强的、柔韧和基本均匀的性质。根据本发明的生物制造的皮革的优选物理性质包括范围为1Mpa、2Mpa、3Mpa、4Mpa、5Mpa、6Mpa、7Mpa、8Mpa、9Mpa、10Mpa、11Mpa、12Mpa、13Mpa、14Mpa、15Mpa或更多MPa的拉伸强度，由1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或更大的断裂伸长范围确定的柔韧性，4mm、5mm、6mm、7mm、8mm或更大的由ISO 17235确定的柔软度，厚度范围为0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2.0mm或更多，以及胶原密度(胶原纤维密度)为10mg/cc、20mg/cc、30mg/cc、40mg/cc、50mg/cc、60mg/cc、70mg/cc、80mg/cc、90mg/cc、100mg/cc、200mg/cc、300mg/cc、400mg/cc、500mg/cc、600mg/cc、700mg/cc、800mg/cc、900mg/cc、1,000mg/cc或更大，优选100-500mg/cc。以上范围包括所有子范围和中间值。
厚度。根据其最终应用，生物制造的材料或皮革可具有任何厚度。其厚度优选为约0.05mm至20mm以及该范围内的任何中间值，诸如0.05mm、0.1mm、0.2mm、0.5mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm或更多。可通过调节胶原含量来控制生物制造的皮革的厚度。
弹性模量。弹性模量(也称为杨氏模量)是测量物体或物质在对其施加力时对弹性变形(即，非永久性地)的抵抗力的数字。物体的弹性模量定义为弹性变形区域中其应力-应变曲线的斜率。较硬的材料将具有较高的弹性模量。弹性模量可以使用物性分析仪(texture analyzer)来测量。
生物制造的皮革可具有至少100kPa的弹性模量。其可在100kPa至1,000MPa范围内以及此范围中的任何中间值，诸如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1,000MPa。生物制造的皮革可以能够从其松弛状态长度拉长至300％，例如＞0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％或300％的其松弛状态长度。
拉伸强度(也称为极限拉伸强度)是材料或结构承受趋于伸长的载荷的能力，与抗压强度相反，所述抗压强度承受趋于减小尺寸的载荷。拉伸强度抵抗张力或被拉开，而抗压强度抵抗压缩或被推到一起。
可使用Instron机器测试生物制造的材料的样品的拉伸强度。将夹具附接至样品的端部并且在相反方向上牵拉样品直到破坏。当样品具有至少1Mpa的拉伸强度时，证明强度良好。生物制造的皮革可具有至少1kPa的拉伸强度。其可在1kPa至100MPa范围内以及此范围中的任何中间值，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、200、300、400、500kPA；0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100MPa。
撕裂力量(也称为抗撕裂性)是材料能够承受撕裂作用的程度的量度。然而更具体地说，材料(通常是橡胶)在张力下抵抗任何切口的生长的程度，通常以kN/m为单位测量。抗撕裂性可通过ASTM D 412方法(用于测量拉伸强度、模量和伸长率的相同方法)来测量。ASTM D 624可用于测量对撕裂形成(撕裂开始)的抗性和对撕裂扩大(撕裂蔓延)的抗性。无论测量这两者中的哪一个，样品被夹持在两个夹持器之间并且施加均匀的牵拉力直到前面提到的变形发生。然后通过用所施加的力除以材料的厚度来计算抗撕裂性。生物制造的皮革可表现出大于常规上粒面或具有相同厚度的包含相同类型胶原(例如，牛I型或III型胶原)、使用相同交联剂或润滑剂加工的其它皮革至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、100％、150％或200％的抗撕裂性。生物制造的材料可具有约1至500N范围内的撕裂强度，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500以及此范围内的任何中间撕裂强度。
柔软性。ISO 17235：2015阐述了用于确定皮革柔软度的非破坏性方法。其可应用于所有非刚性皮革，例如鞋帮皮革、装饰用皮革、皮革商品皮革以及服装皮革。生物制造的皮革可具有2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、10mm、11mm、12mm或更大的如通过ISO 17235所确定的柔软度。
粒面。皮革的上粒面表面由于其柔软质地和光滑表面通常被认为是最期望的。上粒面为胶原原纤维的高度多孔网络。粒面的强度和抗撕裂性通常限制单独上粒面的实际应用并且常规皮革产品通常背面具有更粗糙粒面的真皮。可以产生具有牢固而均匀的物理性质或增加厚度的如本文所公开的生物制造的材料可用于提供上粒面样产品，而不要求真皮衬背。
其它他组分的含量。在一些实施方案中，胶原不含有其它皮革组分诸如弹性蛋白或非结构性动物蛋白质。然而，在一些实施方案中，生物制造的皮革中的肌动蛋白、角蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白、白蛋白、球蛋白、粘蛋白、类粘蛋白、非胶原结构性蛋白质和/或非胶原非结构性蛋白质的含量可在按生物制造的皮革的重量计0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％至10％范围内。在其它实施方案中，肌动蛋白、角蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白、白蛋白、球蛋白、粘蛋白、类粘蛋白、非胶原结构性蛋白质和/或非胶原非结构性蛋白质的含量可以在按生物制造的皮革的重量计＞0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或更大范围内的量掺入生物制造的皮革。此类组分可在原纤化、交联、脱水或润滑的过程中或之后引入。
胶原的含量。与常规皮革相比，根据本发明的生物制造的材料或皮革含有增加的胶原含量。在本发明中，生物制造的材料或皮革中的胶原含量范围为15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％或更多至95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或更小，包括由所述下限和上限限定的所有范围和子范围。
“皮革染料”是指可用于对皮革或生物制造的皮革进行染色的染料。这些包括酸性染料、直接染料、色淀颜料、硫化染料、碱性染料以及反应性染料。还可将染料和色素掺入生物制造的皮革的前体中，诸如在生物制造的皮革的生产过程中掺入包含胶原原纤维的悬浮液或网络凝胶中。
“填料”。在一些实施方案中，生物制造的皮革可包含除了皮革的组分以外的填料，诸如微球。控制脱水原纤维网络的组织化的一种方法为包含在脱水过程中保持原纤维分隔开的填充材料。这些填充材料包括纳米颗粒、微粒或各种聚合物诸如常见用于鞣制工业中的合成鞣剂。这些填充材料可为最终脱水皮革材料的一部分，或填充材料可为牺牲的，即它们被降解掉或溶解掉从而为更多孔性的原纤维网络留下开放空间。这些填料的形状和尺寸还可用于控制脱水原纤维网络的取向。
在一些实施方案中，填料可包含聚合物微球、珠粒、纤维、线或有机盐。还可将其它材料嵌入或以另外的方式掺入生物制造的皮革中或掺入根据本发明的胶原原纤维网络中。这些包括但不限于一种纤维，包括织造和非织造纤维以及棉花、羊毛、羊绒、安哥拉山羊毛、亚麻、竹子、韧皮、大麻、大豆、海藻、纤维、从乳或乳蛋白中产生的纤维、蚕丝、蜘蛛丝、其它肽或多肽(包括重组产生的肽或多肽)、壳聚糖、菌丝体、纤维素(包括细菌纤维素)、木材(包括木材纤维)、人造丝、莱赛尔(lyocell)、粘胶、抗菌纱线(A.M.Y.)、Sorbtek、尼龙、聚酯、弹性体诸如氨纶或弹性纤维和其它聚酯-聚氨酯共聚物、芳纶、碳，包括碳纤维和富勒烯、玻璃，包括玻璃纤维和无纺布、硅和含硅化合物、矿物，包括矿物颗粒和矿物纤维，以及金属或金属合金，包括包含铁、钢、铅、金、银、铂、铜、锌和钛的那些，它们可以是颗粒、纤维、金属丝或适合掺入生物制造的皮革的其它形式。此类填料可包括导电材料、磁性材料、荧光材料、生物发光材料、磷光材料或其它光致发光材料或其组合。还可将这些组分的混合物或共混物嵌入或掺入生物制造的皮革中，例如以便改变本文所公开的化学和物理性质。
各种胶原形式存在于整个动物界中。本文所用的胶原可从动物来源(包括脊椎动物和无脊椎动物)或从合成来源中获得。胶原还可源自现有的动物加工的副产物。从动物来源获得的胶原可使用本领域已知的标准实验室技术来分离，例如Silva等，Marine OriginCollagens and its Potential Applications，Mar.Drugs，2014年12月，12(12)；5881-5901)。
本文描述的胶原还可通过细胞培养技术(包括从生物反应器中生长的细胞)来获得。
胶原还可通过重组DNA技术来获得。可以将编码非人胶原的构建体引入酵母中以产生非人胶原。例如，胶原还可用酵母诸如多形汉逊酵母、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母等作为宿主来产生。胶原和胶原样蛋白质的重组表达已由以下文献报导：Bell，EP 1232182B1，Bovine collagen and method for producing recombinant gelatin；Olsen等，美国专利第6,428,978号，Methods for the production of gelatin and full-length triplehelical collagen in recombinant cells；VanHeerde等，美国专利第8,188,230号，Method for recombinant microorganism expression and isolation of collagen-like polypeptides，所述专利的公开内容在此通过引用并入。然而，重组胶原尚未用于生产皮革。
可用于本发明的材料包括但不限于生物制造的皮革材料、天然或合成的织造织物、非织造织物、针织织物、网眼织物和间隔织物。
保留胶原原纤维的任何材料都可用于本发明。通常，有用的织物具有范围为从每平方英寸300根线至每平方英尺1根线或直径大于或等于约11μm的孔径的网。水刺材料也可以是有用的。在一些实施方案中，水溶性织物是有用的。当使用时，暴露于胶原溶液的织物部分溶解，在织物中形成空隙或孔，并且胶原填充所述空隙或孔。水溶性织物通常由聚乙烯醇纤维形成，并涂有树脂，诸如聚乙烯醇、聚环氧乙烷、羟烷基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸酯和淀粉。或者，空隙或孔可覆盖以辅助材料，诸如天然或合成机织织物、非织造织物、针织织物、网眼织物和间隔织物。
或者，生物制造的皮革材料可用于堵塞切成织物的空隙或孔。空隙或孔的尺寸可以根据要赋予的设计而变化。空隙或孔的形状可根据设计而变化。空隙或孔的合适尺寸可在约0.1英寸至约5米的范围内。合适的形状包括但不限于圆形、正方形、矩形、三角形、椭圆形、卵形和品牌徽标形。
一些材料有助于预处理以改善生物制造的皮革材料的粘合。预处理可包括胶原包被、树脂包被、织物的吞噬(devore ofthe fabric)(也称为烧尽法(burn-out method))、化学品或其组合。例如，对由纤维素纤维制成的材料进行化学预处理可包括高碘酸盐(一种氧化剂)溶液处理。合适的纤维素织物选自由以下组成的组：粘胶、乙酸酯、莱赛尔、竹子及其组合。氧化剂打开纤维素中的糖环并使胶原与开环结合。溶液中氧化剂的浓度取决于所需的氧化程度。通常，氧化剂浓度越高或反应时间越长，达到的氧化程度越高。在本发明的一个实施方案中，可将氧化反应进行所需的时间以达到所需的氧化水平。取决于所用氧化剂的类型，可在各种温度下进行氧化反应。本发明人优先在室温(20℃至25℃，优选23℃)或环境温度下在15分钟至24小时的时间范围内使用受控氧化。然而，还可设想还可使用范围为17.5℃至30℃的温度。关于时间，可以设想受控氧化可能为5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时至36小时、30小时、24小时、20小时、18小时、15小时，包括本文允许的所有范围和子范围。高碘酸钠的量的范围为按供织物的重量提供25％至100％。如本文中所用，提供意指基于纤维素的重量％的添加剂的量。在由Greg Hermanson撰写的Bioconjugate Techniques(其在此通过引用并入)中教导了其它化学预处理。
如本文所述的生物制造的皮革(例如，生物皮革)溶液除了本文所论述的本发明酵母菌株产生的重组胶原以外，还可以包括任何合适的非人胶原来源，以及与所述重组胶原组合的所述非人胶原来源。
作为本文描述的形成胶原材料的初始步骤，可将起始胶原材料置于溶液中并且原纤化。胶原浓度范围可以为约0.5g/L至10g/L，例如0.75g/L至8g/L、或1g/L至7g/L、或2g/L至6g/L、或2.5g/L至5g/L、或3g/L至4g/L。胶原原纤化可通过将盐引入胶原溶液中来诱导。将盐或盐的组合诸如磷酸钠、磷酸钾、氯化钾和氯化钠添加至胶原溶液可改变胶原溶液的离子强度。胶原原纤化可由于增加的静电相互作用，通过更大的氢键键合、范德华相互作用以及共价键合而发生。合适的盐浓度范围可以为例如约10mM至5M，例如50mM至2.5M，或100mM至1M，或250mM至500mM。
胶原网络还可对pH高度敏感。在原纤化步骤过程中，可调节pH以便控制原纤维尺寸诸如直径和长度。合适的pH范围可以为约5.5至10，例如6至9，或7至8。在过滤之前的原纤化步骤之后，将溶液的pH调节至约3.5至10，例如3.5至7，或3.5至5的pH范围。胶原原纤维的总体尺寸和组织将影响所得的原纤化的胶原来源的材料的坚韧性、拉伸能力和透气性。这可用于制造用于各种用途的原纤化的胶原来源的皮革，所述用途可需要不同的坚韧性、柔韧性和透气性。
控制脱水原纤维网络的组织化的一种方法为包含在干燥过程中保持原纤维分隔开的填充材料。这些填充材料可包括纳米颗粒、微粒、微球、微纤维或制革工业中常用的各种聚合物。这些填充材料可为最终脱水皮革材料的一部分，或填充材料可为牺牲的，即它们被降解掉或溶解掉从而为更多孔性的原纤维网络留下开放空间。
胶原或胶原样蛋白质可被化学修饰以促进胶原原纤维之间的化学和物理交联。在美国专利申请US 2012/0116053 A1中教导了胶原样蛋白质，该专利申请在此通过引用并入。化学交联可为可能的，因为胶原分子上的反应性基团诸如赖氨酸、谷氨酸和羟基基团从胶原的棒状样原纤维结构中伸出。涉及这些基团的交联避免胶原分子在应力下彼此滑过去，并且因而增加胶原纤维的机械强度。化学交联反应的实例包括但不限于与胶原分子的赖氨酸的ε-氨基基团反应、或与胶原分子的羧基基团反应。
诸如转谷氨酰胺酶这样的酶还可用于在谷氨酸与赖氨酸之间生成交联，以便形成稳定的γ-谷酰基-赖氨酸交联。诱导相邻胶原分子的官能团之间的交联为本领域已知的。交联为可在此实施以调节从原纤化的胶原水凝胶衍生的材料中获得的物理性质的另一个步骤。
一旦形成，原纤化的胶原网络可通过掺入具有双官能、三官能或多官能的反应性基团的分子来进一步稳定，所述反应性基团包括铬、胺、羧酸、硫酸盐、亚硫酸盐、磺酸盐、醛、酰肼、巯基、二氮丙啶、芳基-、叠氮化物、丙烯酸酯、环氧化物或苯酚。
原纤化的胶原网络还可与形成水凝胶或具有纤维性质的其它试剂(例如能够聚合的聚合物或其它合适纤维)聚合，这可用于进一步稳定基质并且提供期望的端部结构。基于丙烯酰胺、丙烯酸以及其盐的水凝胶可使用反相悬浮聚合来制备。本文描述的水凝胶可由极性单体制备。所用的水凝胶可为天然聚合物水凝胶、合成聚合物水凝胶或两者的组合。所用的水凝胶可使用接枝聚合、交联聚合、由水溶性聚合物形成的网络、辐射交联等来获得。可将少量交联剂添加至水凝胶组合物中以增强聚合。
胶原溶液的粘度范围在20℃时可以为1cP至1000cP，包括其间的所有值和范围，诸如10、20、30、50、75、90、100、150、225、300、400、450、500、525、575、600、650、700、800、900等。可将溶液倾倒、喷涂、涂漆或涂在表面上。粘度可以根据最终材料的形成方式而变化。当需要更高的粘度时，可向溶液中加入已知的增稠剂诸如羧甲基纤维素等。或者，可以调节溶液中胶原的量以改变粘度。
胶原溶液的柔韧性使得能够生产完全通过所述胶原溶液的沉积制成的新材料，例如生物制造的皮革蕾丝材质或三维材料的产生。在某种意义上，胶原溶液可以起到液体皮革的作用，以形成例如生物制造的皮革或生物皮革。可将液体皮革倾倒、移液、通过喷嘴喷涂，或者机械地施加或将二级材料浸入液体皮革中。通过在材料的形成过程中使用多孔材料可以实现织构化表面。液体皮革还使得能够使用掩模、模板印刷和模塑技术。生物制造的皮革溶液的应用还使得能够改变其所应用的材料的性质。例如，生物制造的皮革溶液可使最终材料更坚固、更柔顺、更坚硬、更柔韧、更有弹性或更柔软。
如上所述，衍生自上述方法的生物制造的皮革材料可具有与由动物生皮生产的皮革相似的总体结构和物理特性。通常，除了由本发明的酵母细胞产生的胶原以外，本文所述的生物制造的皮革材料还可源自除成张或成片的动物生皮或皮肤外的来源，尽管动物生皮或皮肤可以是用于制备原纤化胶原的胶原来源。胶原或胶原样蛋白质的来源可以从任何动物(例如哺乳动物、鱼)，或更特别地细胞/组织培养的来源(包括特别地微生物)中分离。
生物制造的皮革材料可包括稳定其中包含的原纤维网络的试剂，或者可包含促进原纤化的试剂。如前面部分所述，可在原纤化之前(或之后)将交联剂(以提供进一步的稳定性)、成核剂(以促进原纤化)和另外的聚合剂(用于增加的稳定性)添加到胶原溶液中以获得具有所需特征(例如强度、弯曲、伸展等)的原纤化胶原材料。
如上所述，在脱水或干燥之后，源自上述方法的工程化的生物制造的皮革材料具有20重量％或更低，或17.5重量％或更低，或15重量％或更低，或12.5重量％或更低或10重量％或更低的含水量。工程化的生物制造的皮革材料的含水量可以在精加工步骤中微调，以获得用于不同目的和所需特征的皮革材料。
如上所述，可被鞣制(例如，使用鞣剂，包括植物(单宁)、铬、明矾、锆、钛、铁盐或其组合，或任何其它合适的鞣剂)这些生物制造的皮革中的任一种。因此，在本文所述的任何所得生物制造的皮革材料中，所得材料可包括百分比(例如，在0.01％至10％，或0.025％至8％，或0.05％至6％，或在0.1％至5％，或0.25％至4％，或0.5％至3％，或0.75％至2.5％，或1％至2％)的残留鞣剂(例如单宁、铬等)。因此，修饰所得生物制造的皮革材料中的胶原原纤维以被鞣制，例如交联以抵抗降解。
可处理生物制造的皮革材料以提供表面纹理。合适的处理包括但不限于压花、压凹和真空成型，其中孔板在材料下方。如本领域所知，进行压花和压凹的压力和温度可根据所需的纹理和设计而变化。皮革工业中已知的表面包被和涂饰可以应用于生物制造的皮革材料。
如上所述，在制备本文所述的生物制造的皮革的任何变型中，可在对胶原进行原纤化的同时和/或分开地在原纤化已发生后，进行脱水之前鞣制(交联)材料。例如，鞣制可包括使用醛(例如，Relugan GTW)和/或任何其它鞣剂进行交联。因此，通常鞣剂包括任何胶原原纤维交联剂，诸如醛交联剂、铬、胺、羧酸、硫酸盐、亚硫酸盐、磺酸盐、醛、酰肼、巯基、二氮丙啶等，
制造包括生物制造的皮革材料在内的材料的一些方法包括提供材料、预处理材料以使其适于与胶原键合，将胶原溶液施加到材料上并干燥。干燥可包括通过真空、加热空气干燥、环境空气干燥，加热压制和加压干燥除去水。在需要预处理的情况下，预处理是将空隙或孔切割到材料中，化学除去某些纤维并用化学或胶原溶液处理材料。其它方法不需要对材料进行预处理。在不需要预处理的情况下，材料是部分水溶性的或保留胶原但允许水通过。合适的网眼尺寸范围为每平方英寸300个根线至每平方英尺1根线。如本文中所用，术语粘结或粘合至织物上意指附着以使得生物制造的皮革在用手拉动时不容易从织物上剥离。用于测试粘合功效的合适方法是在诸如材料测试仪的仪器上进行的剥离强度测试。将机器的钳夹连接到生物制造的皮革材料和其所粘合的材料上，并且将钳夹拉开直到材料撕裂或分离。撕裂力以N/mm报告。合适的剥离强度范围为约0.5N/mm N/cm2至100N/mm，包括0.75N/mm至75N/mm，或1N/mm至50N/mm，1.5N/mm至25N/mm，包括由所述上限和下限界定的所有范围和子范围。
蛋白质(例如，胶原蛋白)中的脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化。含有脯氨酸和赖氨酸的蛋白质(包括胶原蛋白)的多肽的主要翻译后修饰是脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化，以产生4-羟基脯氨酸、3-羟基脯氨酸(Hyp)和羟基赖氨酸(Hyl)，以及羟基赖氨酰基残基的糖基化。这些修饰由三种羟化酶--脯氨酰4-羟化酶、脯氨酰3-羟化酶和赖氨酰羟化酶--和两种糖基转移酶催化。在体内这些反应进行直至多肽形成三股螺旋胶原结构，这抑制了进一步的修饰。
脯氨酰-4-羟化酶。该酶催化脯氨酸残基羟基化为(2S，4R)-4-羟基脯氨酸(Hyp)。Gorres等，Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 45(2)：(2010)，其通过引用并入。以下实施例使用由P4HA(SEQ ID NO：8(针对毕赤酵母属优化的)或SEQ IDNO：15(天然的))和P4HB(SEQ ID NO：9(针对毕赤酵母属优化的)或SEQ ID NO：16(天然的))编码的四聚体牛脯氨酰-4-羟化酶(2α和2β链)，然而，也可使用同种型、直向同源物、变体、片段和来自非牛来源的脯氨酰-4-羟化酶(例如，人脯氨酰-4-羟化酶)，只要它们在酵母宿主细胞中保留羟化酶活性就可。P4HA1的另一个实例进一步由http：//www.omim.org/entry/176710(Cytogenetic location：10q22.1；Genomic coordinates(GRCh38)：10：73，007，216-73，096，973(来自NCBI))描述，P4HB1的另一个实例进一步由http：//www.omim.org/entry/176790(Cytogenetic location：17q25.3；Genomic coordinates(GRCh38)：17：81，843，157-81，860，667(来自NCBI))描述，所述两篇文献均通过引用并入。
在本申请的说明书中，通过使用相似性矩阵诸如BLOSUM45、BLOSUM62或BLOSUM80(其中BLOSUM45可用于密切相关的序列，BLOSUM62用于相关性适中(midrange sequences)的序列，BLOSUM80用于相关性更远的序列)，“变体”包括与参考氨基酸诸如P4HA和P4HB氨基酸片列具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。除非另外指出，否则相似性得分将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，百分比相似性基于BLASTP正得分并且百分比序列同一性基于BLASTP同一性得分。BLASTP“同一性”显示相同的高得分序列对中的总残基的数量和分数；并且BLASTP“正(Positives)”显示比对得分具有正数值并且彼此相似的残基的数量和得分。本公开想到并且涵盖了与本文公开的氨基酸序列具有这些同一性或相似性程度或任何中间同一性或相似性程度的氨基酸序列。代表性BLASTP设置使用为10的期望阈值、为3的字长、BLOSUM 62作为矩阵以及为11(存在)和1(扩展)的空位罚分以及条件组合得分矩阵调节。BLASTP的其它默认设置由可在https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome(最后访问于2017年8月14日)获得的本公开描述并通过引用并入。在本发明内，“变体”保留了脯氨酰-4-羟化酶活性。
在本发明的一个实施方案中，对酵母细胞进行工程化以过量产生脯氨酰-4-羟化酶。非限制性实例是将编码脯氨酰-4-羟化酶、其同种型、其直向同源物、其变体或其表达脯氨酰-4-羟化酶活性的片段的的多核苷酸整合至表达载体中。在本发明的一个实施方案中，含有编码脯氨酰-4-羟化酶、其同种型、其直向同源物、其变体或其表达脯氨酰-4-羟化酶活性的片段的多核苷酸的表达载体处于诱导型启动子的控制之下。合适的酵母细胞、表达载体和启动子是如下所述的。
脯氨酰3-羟化酶。该酶催化脯氨酸残基的羟基化。3-羟化酶1前体[酵牛(Bostaurus)由NCBI参考序列：NP_001096761.1(SEQ ID NO：4)或由NM_001103291.1(SEQID NO：5)描述。关于进一步描述，参见Vranka等，J.Biol.Chem.279：23615-23621(2004)或http：//_www.omim.org/entry/610339(最后访问于2017年7月14日)，其通过引用并入。该酶可以以其天然形式使用。然而，也可以使用同种型、直向同源物、变体、片段和来自非牛来源的脯氨酰-3-羟化酶，只要它们在酵母宿主细胞中保留羟化酶活性即可。
在本申请的说明书中，通过使用相似性矩阵诸如BLOSUM45、BLOSUM62或BLOSUM80(其中BLOSUM45可用于密切相关的序列，BLOSUM62用于相关性适中的序列，BLOSUM80用于相关性更远的序列)，“变体”包括与参考氨基酸诸如脯氨酰-3-羟化酶氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。除非另外指出，否则相似性得分将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，百分比相似性基于BLASTP正得分并且百分比序列同一性基于BLASTP同一性得分。BLASTP“同一性”显示相同的高得分序列对中的总残基的数量和分数；并且BLASTP“正”显示比对得分具有正数值并且彼此相似的残基的数量和得分。本公开想到并且涵盖了与本文公开的氨基酸序列具有这些同一性或相似性程度或任何中间同一性或相似性程度的氨基酸序列。代表性BLASTP设置使用为10的期望阈值、为3的字长、BLOSUM 62作为矩阵并且为11(存在)和1(扩展)的空位罚分以及条件组合得分矩阵调节。BLASTP的其它默认设置由可在https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome(最后访问于2017年8月14日)获得的本公开描述并通过引用并入。在本发明内，“变体”保留了脯氨酰-4-羟化酶活性。
在本发明的一个实施方案中，对酵母细胞进行工程化以过量产生脯氨酰-3-羟化酶。非限制性实例是将编码脯氨酰-3-羟化酶、其同种型、其直向同源物、其变体或其表达脯氨酰-3-羟化酶活性的片段的的多核苷酸整合至表达载体中。在本发明的一个实施方案中，含有编码脯氨酰-3-羟化酶、其同种型、其直向同源物、其变体或其表达脯氨酰-3-羟化酶活性的片段的多核苷酸的表达载体处于诱导型启动子的控制之下。合适的酵母细胞、表达载体和启动子是如下所述的。
赖氨酰羟化酶。赖氨酰羟化酶(EC 1.14.11.4)通过X-lys-gly序列中赖氨酸残基的羟基化来催化羟基赖氨酸的形成。该酶是由具有约85kD分子量的亚基组成的同型二聚体。尽管这两种胶原羟化酶之间的动力学特性具有显著的相似性，但在赖氨酰羟化酶的一级结构与脯氨酰-4-羟化酶的两种亚基(176710，176790)之间未发现显著的同源性。在例如胶原中的赖氨酰羟化酶反应中形成的羟基赖氨酸残基具有两个重要功能：第一，它们的羟基用作碳水化合物单元(单糖半乳糖或二糖葡糖基半乳糖)的附接位点；第二，它们稳定分子间胶原交联。
示例性赖氨酰羟化酶是PLOD1原胶原-赖氨酸、2-氧戊二酸5-双加氧酶1[黄牛(牛)]由基因ID：281409(SEQ ID NO：6)(更新于2017年5月25日)描述，并通过引用并入https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/281409(最后访问于2017年7月14日)。另一个实例由SEQ ID NO：7描述，其描述了黄牛赖氨酰氧化酶(LOX)。又一个实例描述于SEQ ID NO：14中，其为黄牛双功能精氨酸脱甲基酶和赖氨酰羟化酶JMJD6。赖氨酰羟化酶可以其天然形式使用。然而，也可以使用同种型、直向同源物、变体、片段和来自非牛来源的赖氨酰羟化酶，只要它们在酵母宿主细胞中保留羟化酶活性即可。
在本申请的说明书中，通过使用相似性矩阵诸如BLOSUM45、BLOSUM62或BLOSUM80(其中BLOSUM45可用于密切相关的序列，BLOSUM62用于相关性适中的序列，BLOSUM80用于相关性更远的序列)，“变体”包括与参考氨基酸诸如赖氨酰羟化酶氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。除非另外指出，否则相似性得分将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，百分比相似性基于BLASTP正得分并且百分比序列同一性基于BLASTP同一性得分。BLASTP“同一性”显示相同的高得分序列对中的总残基的数量和分数；并且BLASTP“正”显示比对得分具有正数值并且彼此相似的残基的数量和得分。本公开想到并且涵盖了与本文公开的氨基酸序列具有这些同一性或相似性程度或任何中间同一性或相似性程度的氨基酸序列。代表性BLASTP设置使用为10的期望阈值、为3的字长、BLOSUM 62作为矩阵并且为11(存在)和1(扩展)的空位罚分以及条件组合得分矩阵调节。BLASTP的其它默认设置由可在https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome(最后访问于2017年8月14日)获得的本公开描述并通过引用并入。在本发明内，“变体”保留了脯氨酰-4-羟化酶活性。
在本发明的一个实施方案中，对酵母细胞进行工程化以过量产生赖氨酰羟化酶。非限制性实例是将编码赖氨酰羟化酶、其同种型、其直向同源物、其变体或其表达赖氨酰羟化酶活性的片段的多核苷酸整合至表达载体中。在本发明的一个实施方案中，含有编码赖氨酰羟化酶、，其同种型、其直向同源物、其变体或其表达赖氨酰羟化酶活性的片段的多核苷酸的表达载体处于诱导型启动子的控制之下。合适的酵母细胞、表达载体和启动子是如下所述的。
α-酮戊二酸转运蛋白。kgtP基因存在于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)中并且编码α酮戊二酸转运蛋白，其负责跨越边界膜的α酮戊二酸摄取和阳离子的伴随输入(Membrane Topology Model of Escherichia coli oL-Ketoglutarate Permease byPhoA Fusion Analysis，WONGI SEOLt AND AARON J.SHATKIN，JOURNAL OF BACTERIOLOGY，1993年1月，第565-567页)。该基因已转化至蓝细菌(cyanobacteria)中(Uptake of 2-Oxoglutarate in Synechococcus Strains Transformed with the Escherichia colikgtP Gene，MARI A FE LIX VA ZQUEZ-BERMU DEZ，ANTONIA HERRERO，AND ENRIQUEFLORES，JOURNAL OF BACTERIOLOGY，2000年1月，第211-215页)。
本发明人已发现将kgtP基因转化至酵母中提供了更健康的生物体。此外，如果酵母产生蛋白质诸如胶原蛋白或碳水化合物，则转化的酵母通过在内质网中产生更多可用的α-酮戊二酸而具有增加的蛋白质或碳水化合物产生和改善的胶原蛋白羟基化，其中产生蛋白质或碳水化合物并进行羟基化。
示例性kgtP基因示于SEQ ID NO：2中，而示例性α-酮戊二酸转运蛋白示于SEQ IDNO：1中。该酶可以以其天然形式使用。然而，还可使用同种型、直向同源物、变体、片段和来自非-大肠埃希氏菌来源的α酮戊二酸转运蛋白，只要它们在酵母宿主细胞中保留α-酮戊二酸转运蛋白活性即可。另外，可优化kgtP基因以在酵母中表达。例如，用于在毕赤酵母属中表达的优化的α-酮戊二酸转运蛋白基因(kgtP)的实例示于SEQ ID NO：3中。
在本申请的说明书中，通过使用相似性矩阵诸如BLOSUM45、BLOSUM62或BLOSUM80(其中BLOSUM45可用于密切相关的序列，BLOSUM62用于相关性适中的序列，BLOSUM80用于相关性更远的序列)，“变体”包括与参考氨基酸诸如α酮戊二酸转运蛋白氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。除非另外指出，否则相似性得分将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，百分比相似性基于BLASTP正得分并且百分比序列同一性基于BLASTP同一性得分。BLASTP“同一性”显示相同的高得分序列对中的总残基的数量和分数；并且BLASTP“正”显示比对得分具有正数值并且彼此相似的残基的数量和得分。本公开想到并且涵盖了与本文公开的氨基酸序列具有这些同一性或相似性程度或任何中间同一性或相似性程度的氨基酸序列。代表性BLASTP设置使用为10的期望阈值、为3的字长、BLOSUM 62作为矩阵并且为11(存在)和1(扩展)的空位罚分以及条件组合得分矩阵调节。BLASTP的其它默认设置由可在https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome(最后访问于2017年8月14日)获得的本公开描述并通过引用并入。在本发明内，“变体”保留了脯氨酰-4-羟化酶活性。
在本发明的一个实施方案中，对酵母细胞进行工程化以过量产生α-酮戊二酸转运蛋白。非限制性实例是将编码α酮戊二酸转运蛋白、其同种型、其直向同源物、其变体或其表达α酮戊二酸转运蛋白活性的片段的多核苷酸整合至表达载体中。在本发明的一个实施方案中，含有编码α酮戊二酸转运蛋白的多核苷酸、其同种型、其直向系同源物、其变体或其表达α酮戊二酸转运蛋白活性的片段的表达载体处于诱导型启动子的控制之下。合适的酵母细胞、表达载体和启动子是如下所述的。
编码一种或多种使抗坏血酸合成途径起作用的多肽的多核苷酸
酵母、植物和动物中的L-抗坏血酸、抗坏血酸生物合成途径描述于例如Smirnoff(2001)Vitamins&Hormones 61-241-266和Vitamin C.Functions and biochemistry inanimals and plants Asard等(编辑).Garland Science/BIOS Scientific Publishers，2004。单独或组合的各种基因可用于使抗坏血酸合能够在酵母中合成。这些包括，例如，对于植物途径，可将编码将GDP-L-半乳糖转化为L-半乳糖-1-P的GDP-L-Gal磷酸化酶、将L-半乳糖-1-P转化为L-半乳糖的肌醇-磷酸磷酸化酶、将GDP-D-甘露糖转化为GDP-L-半乳糖的GDP-甘露糖-3，5-差向异构酶的基因或多核苷酸转化至酵母中。毕赤酵母属已具有完成该途径所必需的另外基因。这些基因提供以下酶：己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶和甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶。
对于动物途径，可以添加以下基因：将L-古洛糖酸-1，4-内酯转化为L-抗坏血酸的L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶、将L-古洛糖酸转化为L-古洛糖酸-1，4-内酯的醛糖糖酸内酯酶、将D-葡糖醛酸转化为D-葡糖醛酸内酯的葡糖醛酸内酯还原酶、将D-葡糖醛酸转化为L-古洛糖酸的D-葡糖醛酸还原酶、将D-葡糖醛酸转化为D-葡糖醛酸内酯的尿内酯酶、将D-葡糖醛酸-1-P转化为D-葡糖醛酸的D-葡糖醛酸激酶、将UDP-葡糖醛酸转化为D-葡糖醛酸-1-P的葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰基转移酶、将UDP-D-葡萄糖转化为UDP-葡糖醛酸的UDP-D-葡萄糖脱氢酶、将D-葡萄糖-1-P转化为UDP-D-葡萄糖的UTP-葡萄糖-1磷酸尿苷酰基转移酶、将D-Glc-6-P转化为D-葡萄糖-1-P的磷酸葡萄糖变位酶和/或将D-葡萄糖转化为D-Glc-6-P的己糖激酶。
没有必要转化所有酶的所有基因以使酵母能够产生抗坏血酸。实际上，在本发明中，设想仅需要将一种或多种编码抗坏血酸合成途径的一部分的蛋白质的基因插入到供给酵母细胞的抗坏血酸途径前体下游。例如，可将使将L-半乳糖-1-P转化为L-半乳糖的酶磷酸肌醇磷酸酶的基因插入酵母，然后将L-半乳糖-1-P喂入酵母，这允许酵母生产L-抗坏血酸。
GDP-L-Gal磷酸化酶可从拟南芥提供并且包括SEQ ID NO：21的全部或部分核苷酸序列。
GDP-L-Gal磷酸化酶的代表性氨基酸序列是如SEQ ID NO：22所示的。
肌醇-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.25)是一类已知的酶，是作用于L-半乳糖1-磷酸(L-Gal 1-P)、D-肌醇3-磷酸(D-Ins 3-P)和D-肌醇1-磷酸(D-Ins 1-P)的磷酸酶。还可使用β-甘油磷酸酯(甘油2-P)以及在较低程度上使用D-半乳糖1-磷酸(D-Gal 1-P)、α-D-葡萄糖1-磷酸(a-D-Glc 1-P)、D-甘露醇1-磷酸和腺苷2′-一磷酸作为底物。对于D-果糖1-磷酸(D-Fru 1-P)、果糖1，6-二磷酸(Fru 1，6-bisP)、D-葡萄糖-6-磷酸(D-Glc 6-P)、D-α-甘油磷酸(甘油3-P)、D-山梨糖醇6-磷酸和D-肌醇2-磷酸无活性。六-元环基底中的C1磷酸位置对于催化是重要的。来自拟南芥的在71、91、93、94和221处的氨基酸位置有助于金属结合，氨基酸位置71和213有助于底物结合。代表性核苷酸序列示于SEQ ID NO：23中。
肌醇-磷酸磷酸酶的一种同种型示gfSEQ ID NO：24中。
GDP甘露糖-3，5-差向异构酶(EC 5.1.3.18)是一类已知的酶并且催化在维生素C(L-抗坏血酸)的生物合成中的关键步骤之前的GDP-D-甘露糖的可逆差向异构化，导致高能糖基-焦磷酰键联的水解。能够催化2种不同的差向异构化反应，并且可从GDP-甘露糖中释放GDP-L-半乳糖和GDP-L-古洛糖。在拟南芥中，区域143-145、216-21和/或241-243参与底物结合，其中一个或多个位置145、174、178、217和/或306参与酶活性，位置58、78、174和/或178中的一个或多个参与NAD结合，位置103、203、225、306和/或356中的一个或多个参与底物结合。
本文使用的多核苷酸可以编码SEQ ID NO：25的全部或部分氨基酸序列。
L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(EC 1.1.3.8)是一类已知的酶并且参与抗坏血酸的生物合成。在拟南芥中，位置156参与活性，优选仅含有氨基酸102至610或其片段，其中氨基酸123-258参与FAD结合。
本文使用的多核苷酸可以编码至少一种同种型的全部或部分氨基酸序列，例如SEQ ID NO：26的全部或部分氨基酸序列。
来自上述序列在494-512处的第二种同种型，其中序列改变自KSPISPAFSTSEDDIFSWV(SEQ ID NO：27)和WYNHVPPDSRPSPEKGHHR(SEQ ID NO：28)并且缺失513-610。
葡糖醛酸内酯还原酶(EC1.1.1.20)是一类已知的酶，催化L-古洛糖酸-1，4-内酯+NADP(+)＜＝＞D-葡糖醛酸-3，6-内酯+NADPH的反应，并且在本领域中例如从如下根据可公开访问的UniProt数据库概述的许多生物获知：
醛内酯酶在本领域中是已知的，并且在一些情况下也称为葡糖酸酸内酯酶(EC3.1.1.17)，并且从如下根据可公开访问的UniProt数据库概述的许多生物获知：
尿内酯酶是一类已知的酶(EC 3.1.1.19)并催化D-葡糖醛酸-6，2-内酯+H(2)O＜＝＞D-葡糖醛酸的反应，也被称为葡糖醛酸内酯酶或D-葡糖醛酸-6，2-内酯内酯水解酶，许多与该酶活性相关的酶是已知的，参见EC 3.1.1.19。
D-葡糖醛酸激酶(EC 2.7，1，43)是一类已知的酶，例如来自拟南芥，参与UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)的生物合成，其中氨基酸126-136参与结合。本文使用的多核苷酸可以编码SEQ ID NO：29的全部或部分氨基酸序列。
葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰基转移酶是一类已知的酶(EC 2.7.7.44)，其催化UTP+1-磷酸-α-D-葡糖醛酸至二磷酸+UDP-葡糖醛酸的化学反应，并且是本领域已知的，例如来自如下根据可公开访问的UniProt数据库概述的许多生物体：
UDP-D-葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.22)是一类已知的酶，其hat催化该化学反应UDP-葡萄糖+2NAD++H2O UDP-葡糖醛酸+2NADH+2H+(EC 1.1.1.22)并且可以包含SEQ ID NO：30的全部或部分。
来自UniProt公开可用的数据库的其它序列为：
UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(EC 2.7.7.9)是一类已知的酶，也称为葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(或UDP-葡萄糖焦磷酸化酶)，是一种参与碳水化合物代谢的酶。其从葡萄糖-1-磷酸和UTP合成UDP-葡萄糖。在本领域中有数百种来自与该类相关的各种物种的已知序列。
葡糖磷酸变位酶(EC5.4.2.2)是一类已知的酶并且是一种将α-D-葡萄糖单体上的磷酸基团以正向方向从1’转移到6′位置或以反向方向从6’转移到1′位置的酶。在本领域中有数百种来自与该类相关的各种物种的已知序列。
己糖激酶(EC 2.7.1.1)是一类已知的酶，其磷酸化酶己糖(六-碳)糖)，形成己糖磷酸。在本领域中有数百种来自与该类相关的各种物种的已知序列。
重组蛋白(例如，胶原蛋白)中脯氨酸残基的羟基化程度的测定。根据本发明产生的重组蛋白(例如，胶原蛋白)中脯氨酸残基的羟基化程度可以通过已知方法测定，所述方法包括如由Chan等，BMC Biotechnology12：51(2012)(其通过引用并入)描述的液相色谱-质谱法。
重组蛋白(例如，胶原蛋白)中赖氨酸残基的羟基化程度的测定。赖氨酸羟基化和胶原的交联由以下文献描述：Yamauchi等，Methods in Molecular Biology，第446卷，第95-108.页；Humana Press(2008)，其通过引用并入。根据本发明产生的重组蛋白(例如胶原)中赖氨酸残基的羟基化程度可通过已知方法测定，所述方法包括由Hausmann，Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Protein Structure 133(3)：591-593(1967)(其通过引用并入)描述的方法。
羟基化程度。根据本发明产生的蛋白质(例如，胶原蛋白)中脯氨酸或赖氨酸残基的羟基化程度优选为至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％。同样在本发明的范围内，脯氨酸加赖氨酸残基的羟基化程度为至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％。
胶原的解链点。胶原蛋白中的脯氨酸、赖氨酸或脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化程度可以通过与具有已知含量的羟基化氨基酸残基的对照胶原相比的水合胶原(诸如水凝胶)的解链温度来估计。胶原蛋白的解链温度范围可为25-40℃，其中更加高度羟基化的胶原通常具有更高的解链温度。该范围包括所有中间子范围和值，包括由选自25℃、26℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃和40℃的温度限定在下端与上端的范围内的子范围。
密码子修饰。在本发明的范围内，设想引入酵母宿主细胞的基因序列是从其天然序列修饰的。该过程包括改变编码目标蛋白质的多核苷酸序列(例如，胶原蛋白，诸如天然存在的胶原DNA序列)，以改变酵母诸如巴斯德毕赤酵母表达的重组蛋白(例如，胶原蛋白)的量，以改变重组酵母分泌的重组蛋白(例如，胶原蛋白)的量，以改变重组酵母中重组蛋白(如胶，原蛋白)的表达速度，或改变重组蛋白(例如，胶原蛋白)中的赖氨酸或脯氨酸残基的羟基化程度。密码子修饰也可以出于类似的目的应用于其它蛋白质诸如羟化酶或将羟化酶靶向特定的细胞内或细胞外区室，例如将脯氨酸羟化酶靶向与重组蛋白(例如，胶原蛋白)分子相同的区室，诸如内质网。可以基于对RNA二级结构的影响、对转录和基因表达的影响、对翻译延伸的速度的影响和/或对蛋白质折叠的影响来进行密码子选择。
可对编码胶原蛋白或羟化酶的密码子进行修饰以减少或增加编码重组胶原或羟化酶的mRNA中的二级结构，或者可对所述密码子进行修饰来用基于酵母中所有蛋白质编码序列(例如，密码子采样)平均最常被酵母使用的密码子、基于酵母中所有蛋白质编码序列(例如，密码子采样)最少被被酵母使用的密码子，或出现在被酵母宿主细胞大量表达的蛋白质中或出现在酵母宿主细胞分泌的蛋白质中的冗余密码子(例如，基于高密码子适应指数的密码子选择，使得该基因“看起来像”高度表达的基因或编码来自表达宿主的可分泌蛋白的基因)替换冗余密码子。
密码子修饰可应用于蛋白质编码序列的全部或部分，例如，应用于编码序列的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十个10％中的至少一个或其组合。其还可以选择性地应用于编码特定氨基酸的密码子或编码一些但非所有由冗余密码子编码的氨基酸的密码子。例如，只有亮氨酸和苯丙氨酸的密码子才可如上所述进行密码子修饰。由一个以上的密码子编码的氨基酸由本领域公知的的密码子表描述。
密码子修饰包括所谓的密码子优化方法，其由https：//www.atum.bio/services/genegps(最后访问时间为2017年7月13日)，由https：//www.idtdna.com/CodonOpt或Villalobos，Alan等BMC Bioinformatics 7(2006)：285.PMC.Web.2017年8月17日(通过引用并入本文)描述。
密码子修饰还包括选择密码子以允许形成mRNA二级结构或最小化或消除二级结构。这方面的一个实例是进行密码子选择，以消除、减少或减弱核糖体结合位点或起始密码子处或附近的二级结构强二级结构。
在本发明的一个实施方案中，优化α酮戊二酸转运蛋白基因序列被优化以用于酵母，特别是毕赤酵母属。优化的α-酮戊二酸转运蛋白基因(kgtP)的实例如SEQ ID NO：3所示。
胶原蛋白片段。重组胶原蛋白分子可包含能够形成原胶原(三聚体胶原)的天然胶原蛋白分子的氨基酸序列的片段或具有与天然胶原蛋白氨基酸序列(或与其原纤维形成区域或与主要包含[Gly-X-Y]n)的区段)具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的氨基酸序列的经修饰的胶原蛋白分子或截短的胶原蛋白分子的氨基酸序列的片段，诸如分别由以下登录号描述的Col1A1、Col1A2和Col3A1的氨基酸序列的那些片段：登录号NP_001029211.1(SEQ ID NO：11)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/77404252，最后访问时间为2017年8月23日)、NP_776945.1(SEQ ID NO：12)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/27806257最后访问时间为2017年8月23日)和NP_001070299.1(SEQ I NO：13)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/116003881最后访问2017年2月9日)，其通过引用并入。
编码胶原蛋白或羟化酶的基因可以被截短或以其它方式修饰以添加或去除序列。可以进行这样的修饰以定制多核苷酸或载体的大小，以将表达的蛋白质靶向内质网或其它细胞或细胞外区室，或控制编码蛋白质的长度。例如，本发明人发现仅含有前序列(Presequence)的构建体通常比含有整个前-原序列(Pre-pro sequence)的构建体表现更好。将前序列(Pre sequence)与P4HB融合以将P4HB定位在胶原蛋白也定位在其中的ER中。
胶原蛋白和羟化酶的经修饰的编码序列。可修饰胶原蛋白或羟化酶或其它蛋白质的多核苷酸编码序列以编码蛋白质，所述蛋白质与已知氨基酸具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或100％同一性或相似性，并且保留未修饰分子的基本性质，例如，形成原胶原的能力或羟基化胶原中的脯氨酸或赖氨酸残基的能力。可以去除或添加胶原分子中的糖基化位点。可进行修饰以促进酵母宿主细胞产生胶原蛋白或分泌其，或改变其结构、功能或美学性质。还可如本文所述对经修饰的胶原蛋白或羟化酶编码序列进行密码子修饰。
BLASTN可用于鉴定与参考多核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％或＜100％序列同一性的多核苷酸序列，所述参考序列是诸如编码本文所述的胶原蛋白、一种或多种羟化酶或本文公开的信号肽、前导序列或分泌肽或任何其它蛋白质的多核苷酸。经修饰以发现高度相似的序列的代表性BLASTN设置使用为10的期望阈值和为28的字长、为0的查询范围内的最大匹配、为1/-2的匹配/错配得分以及线性空位罚分。可过滤或遮掩低复杂度区域。标准核苷酸BLAST的默认设置在本领域中是公知的。
通过使用相似性矩阵诸如BLOSUM45、BLOSUM62或BLOSUM80(其中BLOSUM45可用于密切相关的序列，BLOSUM62用于相关性适中的序列，BLOSUM80用于相关性更远的序列)，BLASTP可用于鉴定与参考氨基酸诸如胶原蛋白氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％或＜100％序列同一性或相似性的氨基酸序列。除非另外指出，否则相似性得分将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，百分比相似性基于BLASTP正得分并且百分比序列同一性基于BLASTP同一性得分。BLASTP“同一性”显示相同的高得分序列对中的总残基的数量和分数；并且BLASTP“正”显示比对得分具有正数值并且彼此相似的残基的数量和得分。本公开想到并且涵盖了与本文公开的氨基酸序列具有这些同一性或相似性程度或任何中间同一性或相似性程度的氨基酸序列。代表性BLASTP设置使用为10的期望阈值、为3的字长、BLOSUM 62作为矩阵并且为11(存在)和1(扩展)的空位罚分以及条件组合得分矩阵调节。BLASTP的其它默认设置在本领域中是公知的。
如应用于本文公开的多肽的术语“变体”、“经修饰的序列”或“类似物”是指包含与生物活性分子的氨基酸序列具有至少70％，80％，90％，95％或99％同一性或相似性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，衍生物包含与天然或预先工程化的序列的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。衍生物可包含针对天然或预先工程化的分子的氨基酸序列的添加、缺失、取代或其组合。例如，与天然胶原蛋白序列相比，衍生物可以掺入或删除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个脯氨酸或赖氨酸残基。可以进行这样的选择以改变重组原胶原或原纤化胶原的松散性或紧密性。
衍生物可包括具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11-15个、16-20个、21-25个或26-30个氨基酸残基的添加、取代或缺失的突变型多肽。添加或取代还包括使用非天然存在的氨基酸或经修饰的氨基酸。衍生物还可包括对多肽的化学修饰，诸如半胱氨酸残基之间的交联，或羟基化或糖基化残基。
酵母菌株。本发明利用酵母产生胶原蛋白或其它蛋白质或碳水化合物。具体地，本发明利用经修饰的酵母产生具有增加的羟基化程度的胶原蛋白或其它碳水化合物。通过插入kgtP基因、表达羟化酶的基因或完成功能性抗坏血酸合成途径所必需的一个或多个基因中的一个或多个基因表达，对酵母可进行工程化以产生或过量产生α酮戊二酸和/或抗坏血酸。
合适的酵母包括但不限于毕赤酵母属、念珠菌属(Candida)、Komatagaella、汉逊酵母属(Hansenula)、隐球菌属(Cryptococcus)，酿酒酵母属(Saccharomyces)的那些酵母及其组合。可对酵母进行修饰或杂交。杂交酵母是同一种的不同菌株、同一属的不同种或不同属的菌株的混合育种。可根据本发明使用的酵母菌株的实例包括巴斯德毕赤酵母、膜醭毕赤酵母(Pichia membranifaciens)、沙漠毕赤酵母(Pichia deserticola)、Pichiacephalocereana、Pichia eremophila、Pichia myanmarensis、异常毕赤酵母菌(Pichiaanomala)、中濑毕赤酵母(Pichia nakasei)、暹罗毕赤酵母菌(Pichia siamensis)、黑迪氏毕赤酵母((Pichia heedii)、巴氏毕赤酵母(Pichia barkeri)、挪威毕赤酵母(Pichianorvegensis)、嗜热甲醇毕赤酵母(Pichia thermomethanolica)、树干毕赤酵母(Pichiastipites)、亚膜毕赤酵母(Pichia subpelliculosa)、短小毕赤酵母(Pichia exigua)、西方毕赤酵母(Pichia occidentalis)、卡特多菲毕赤酵母(Pichia cactophila)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)等。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是用于重组表达生物治疗性蛋白质诸如人干扰素γ的酵母物种，参见Razaghi等，Biologicals 45：52-60(2017)。其已被用于表达III型胶原和脯氨酰-4-羟化酶，参见Vuorela等，EMBO J.16：6702-6712(1997)。也已将胶原蛋白和脯氨酰-4-羟化酶在大肠埃希氏菌表达以产生胶原材料，参见Pinkas等，ACSChem.Biol.6(4)：320-324(2011)。
在一个实施方案中，本发明涉及已被工程化来表达密码子优化的胶原蛋白、羟化酶、α-酮戊二酸转运蛋白和/或完成功能性抗坏血酸合成途径所必需的一种或多种基因的巴斯德毕赤酵母菌株。有用巴斯德毕赤酵母宿主菌株包括但不限于野生型(菌株PPS-9010)；aox1Δ(MutS)(菌株PPS-9011)，其为PPS-9010的缓慢甲醇利用衍生物；和pep4Δ、prb1Δ(菌株PPS-9016)，其具有蛋白酶缺陷。这些菌株可公开获得，并且可以从ATUM的https：//www._atum.bio/products/cell-strains。
用于酵母的多肽分泌序列获得。在一些实施方案中，将由酵母宿主细胞编码的多肽与促进其从酵母分泌的多肽序列融合。例如，载体可以编码嵌合基因，其包含与编码分泌肽的序列融合的胶原的编码序列。可用于此目的的分泌序列包括酵母属α交配因子前原序列、酵母属α交配因子前序列、PHO1分泌信号、来自黑曲霉(Aspergillus niger)的α-淀粉酶信号序列、来自泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的葡糖淀粉酶信号序列、来自智人的血清白蛋白信号序列、来自Kluyveromcyes maxianus的菊糖酶信号序列、来自酿酒酵母的转化酶信号序列、来自酿酒酵母的杀伤蛋白信号序列或来自原鸡(Gallus gallus)的溶菌酶信号序列。也可使用本领域已知的其它分泌序列。
酵母启动子和终止子。在一些实施方案中，可将以下酵母启动子中的一种或多种整合入载体中，以促进编码目标蛋白质(例如，胶原蛋白)、一种或多种羟化酶、α酮戊二酸转运蛋白和/或完成功能性抗坏血酸合成途径所必需的一种或多种基因的mRNA转录。启动子是本领域已知的并且包括pAOX1、pDas1、pDas2、pPMP20、pCAT、pDF、pGAP、pFDH1、pFLD1、pTAL1、pFBA2、pAOX2、pRKI1、pRPE2、pPEX5、pDAK1、pFGH1、pADH2、pTPI1、pFBP1、pTAL1、pPFK1、pGPM1和pGCW14。
在一些实施方案中，将酵母终止子序列整合入载体中以终止编码目标蛋白质(例如，胶原蛋白)、一种或多种羟化酶、α酮戊二酸转运蛋白和/或完成功能性抗坏血酸合成途径所必需的一种或多种基因的mRNA转录。终止子包括但不限于AOX1 TT、Das1 TT、Das2 TT、AOD TT、PMP TT、Cat1 TT、TPI TT、FDH1 TT、TEF1 TT、FLD1 TT、GCW14 TT、FBA2 TT、ADH2TT、FBP1 TT和GAP TT。
除胃蛋白酶外的肽酶。胃蛋白酶可用于通过去除N-末端和C-末端序列将胶原蛋白加工成原胶。其它蛋白酶，包括但不限于胶原酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶，也可用于此目的。如本文中所用，‘稳定的胶原蛋白”是指在暴露于特定浓度的胃蛋白酶或另一种蛋白酶后至少20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的初始胶原蛋白浓度仍然存在。优选地，与在相同条件下处理相同时间量的不稳定胶原相比，在用胃蛋白酶或另一种蛋白酶处理后，至少75％的稳定胶原将得到保留。在翻译后修饰之前，胶原蛋白是非羟基化的，并且在高胃蛋白酶浓度(例如，胃蛋白酶∶蛋白质比率为1∶200或更多)存在的情况下降解。
一旦翻译后修饰，就可使胶原蛋白与胃蛋白酶或另一种蛋白酶接触以切割胶原蛋白的N-末端和C-末端前肽，从而实现胶原原纤化。与非羟基化胶原相比，羟基化胶原具有更好的热稳定性，并且对高浓度胃蛋白酶消化(例如在1∶25至1∶1的胃蛋白酶∶总蛋白质比例下)具有抗性。因此，为了避免重组胶原的过早蛋白水解，提供羟基化胶原是有用的。
替代表达系统。除了巴斯德毕赤酵母以外，胶原蛋白和其它蛋白质还可在其它种类的酵母细胞中表达，例如，可在另一种酵母甲基营养型酵母(methylotrophic yeast)或其它生物体中表达。可将酿酒酵母与许多表达载体中的任一种一起使用。常见使用的表达载体为含有用于在酵母中增殖的2P复制起始点和用于高效转录外来基因的大肠埃希氏菌的Col E1起始点的穿梭载体。基于2P质粒的此类载体的通常实例为pWYG4，所述载体具有2PORI-STB元件、GAL1-10启动子以及2P D基因终止子。在该载体中，Ncol克隆位点用于插入待表达多肽的基因并提供ATG起始密码子。另一种表达载体为pWYG7L，所述表达载体具有完整的2aORI、STB、REP1和REP2以及GAL1-10启动子，并且使用FLP终止子。在该载体中，编码多核苷酸被插入到多接头中，其中其5’末端处于BamHI或Ncol位点。含有插入的多核苷酸的载体在去除细胞壁以产生原生质球之后被转化到酿酒酵母中，所述原生质球在用钙和聚乙二醇处理时或通过用锂离子处理完整细胞来吸收DNA。
或者，可以通过电穿孔来引入DNA。可以例如使用宿主酵母细胞来选择转化体，所述宿主酵母细胞为亮氨酸、色氨酸、尿嘧啶或组氨酸营养缺陷型的，同时具有可选择的标记基因诸如LEU2、TRP1、URA3、HIS3或LEU2-D。
在甲基营养型酵母诸如巴斯德毕赤酵母中存在许多甲醇响应基因，每种甲醇响应基因的表达受控于甲醇响应调控区(也称为启动子)。任何此类甲醇响应启动子都适合用于实践本发明。特定调控区的实例包括AOX1启动子、AOX2启动子、二羟基丙酮合酶(DAS)、P40启动子和来自巴斯德毕赤酵母的过氧化氢酶基因的启动子等。
还提到了甲基营养型酵母多形汉逊酵母。在甲醇上生长导致诱导甲醇代谢的重要酶诸如MOX(甲醇氧化酶)、DAS(二羟丙酮合酶)以及FMHD(甲酸脱氢酶)。这些酶可以构成高达总细胞蛋白质的30％-40％。编码MOX、DAS和FMDH产生的基因受控于通过在甲醇上生长诱导并且通过在葡萄糖上生长抑制的强启动子。任何或所有三种这些启动子可用于在多形汉逊酵母中获得高水平的异源基因表达。因此，一方面，在诱导型多形汉逊酵母启动子的控制下，将编码动物胶原蛋白的多核苷酸或其片段或变体克隆到表达载体中。如果期望分泌产物，那么将编码用于在酵母中分泌的信号序列的多核苷酸与所述多核苷酸同框融合。在另一个实施方案中，表达载体优选含有可用于弥补营养缺陷宿主的缺陷的营养缺陷标记基因，诸如URA3或LEU2。
然后表达载体被用于使用本领域技术人员已知的技术转化多形汉逊酵母宿主细胞。多形汉逊酵母转化的有用特征为将高达100个表达载体拷贝自发整合到基因组中。在大多数情况下，整合的多核苷酸形成表现出头对尾排列的多聚体。整合的外来多核苷酸在数种重组菌株中甚至在非选择性的条件下显示出有丝分裂稳定。高拷贝整合的这种现象进一步有助于系统的高生产率潜力。
将外来DNA插入酵母基因组中或以附加型方式维持以产生胶原蛋白。通过载体将胶原蛋白的DNA序列引入酵母中。外源DNA是任何非酵母宿主DNA，包括例如但不限于哺乳动物、秀丽隐杆线虫和细菌。用于在酵母中产生胶原的合适的哺乳动物DNA包括但不限于牛、猪、袋鼠、短吻鳄、鳄鱼、大象、长颈鹿、斑马\美洲驼、羊驼、羊、恐龙及其组合。
还可将使得能够产生抗坏血酸的DNA插入单个或多个载体上。对于植物途径，通过载体将基因GDP-L-Gal磷酸化酶、肌醇-磷酸化磷酸酶、GDP-甘露糖-3，5-差向异构酶的DNA插入酵母细胞中。已知毕赤酵母属含有通过载体转化到酵母细胞中的从葡萄糖产生抗坏血酸的途径中的其余基因。
可将抗坏血酸途径的DNA单独插入或将其与蛋白质的DNA组合插入。抗坏血酸途径使得能够产生适合产生大多数蛋白质的健康酵母菌株。
还可使得能够产生α-酮戊二酸转运蛋白的DNA插入单一载体中。通过载体将酵母优化的kgtP基因转化到酵母细胞中。
可将α酮戊二酸转运蛋白的DNA单独插入或将其与蛋白质或碳水化合物的DNA组合插入。α-酮戊二酸转运蛋白使得够健康、快速生长的酵母菌株能够合于产生大多数蛋白质和碳水化合物。转运蛋白还使得能够增加羟基化胶原蛋白的产生。
可将DNA插入载体中。用于在酵母中表达蛋白质的载体是已知的，参见，Ausubel等，同上，第2卷，第13章；Grant等(1987)Expression and Secretion Vectors for Yeast，in Methods in Enzymology，编辑.Wu&Grossman，Acad.Press，N.Y.153：516-544；Glover(1986)DNA Cloning，第II卷，IRL Press，Wash.，D.C.，第3章；Bitter(1987)HeterologousGene Expression in Yeast，in Methods in Enzymology，编辑Berger&Kimmel，Acad.Press，N.Y.152：673-684；和The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces，编辑Strathem等，Cold Spring Harbor Press，第I和II卷(1982)，其公开内容在此通过引用并入。其它合适的载体包括但不限于pHTX1-BiDi-P4HA-Pre-P4HBhygro、pHTX1-BiDi-P4HA-PHO1-P4HB hygro、pGCW14-pGAP1-BiDi-P4HA-Prepro-P4HBG418、pGCW14-pGAP1-BiDi-P4HA-PHO1-P4HB Hygro、pDF-Col3A1修饰的博莱霉素、pCAT-Col3A1修饰的博莱霉素、pDF-Col3A1修饰的博莱霉素(具有AOX1着陆垫)、pHTX1-BiDi-P4HA-Pre-Pro-P4HB hygro。载体通常包括至少一个用于DNA线性化的限制性位点。
选定的启动子可增加重组蛋白的产生，并且可包含在包含编码目标蛋白(例如胶原蛋白)或羟化酶的序列的载体中。适用于本发明的启动子包括但不限于AOX1甲醇诱导型启动子、pDF去阻遏启动子、pCAT去阻遏启动子、Das1-Das2甲醇诱导型双向启动子、pHTX1组成型双向启动子、pGCW14-pGAP1组成型双向启动子及其组合。合适的甲醇诱导型启动子包括但不限于AOX2、Das 1、Das 2、pDF、pCAT、pPMP20、pFDH1、pFLD1、pTAL2、pFBA2、pPEX5、pDAK1、pFGH1、pRKI1、pREP2及其组合。
根据前述内容，还设想可以将载体工程化为一体化载体，其包含选自以下的至少一种基因的每种基因，包括其中的任何组合或亚组合或全部：胶原蛋白、一种或多种羟化酶、α-酮戊二酸转运蛋白和/或完成功能性抗坏血酸合成途径所必需的一种或多种基因。
在根据本发明的载体(包括一体化载体)中，可以将终止子置于整合到酵母中的载体中使用的每个开放阅读框架的末端。将终止子的DNA序列插入载体中。对于复制载体，需要复制起努点来启动复制。将复制起始点的DNA序列插入载体中。可将包含与酵母基因组同源性的一个或多个DNA序列整合到载体中以促进重组和整合到酵母基因组中以一旦转化到酵母细胞中后就稳定载体。
根据本发明的载体通常还包括至少一种选择标记，其用于选择已成功转化的酵母细胞。标记有时与抗生素抗性相关，标记也可与在某些氨基酸存在或不存在的情况下生长的能力相关(营养缺陷型标记)。合适的营养缺陷型标记包括但不限于ADE、HIS、URA、LEU、LYS、TRP及其组合。为了提供含有重组载体的酵母细胞的选择，将至少一种选择标记的DNA序列整合入载体中。
在本发明的一些实施方案中，重组酵母表达的蛋白质(包括胶原蛋白或胶原样蛋白质)中的氨基酸残基(诸如赖氨酸和脯氨酸)可缺乏羟基化或可具有比相应的天然或未经修饰的蛋白质(例如，胶原蛋白或胶原样蛋白质)更低或更高程度的羟基化。在其它实施方案中，重组酵母表达的蛋白质(包括胶原蛋白或胶原样蛋白质)中的氨基酸残基可缺乏糖基化，或可具有比相应的天然或未经修饰的蛋白质(例如胶原蛋白或胶原样蛋白质)更低或更高程度的糖基化。
例如，羟基化胶原蛋白具有比羟基化不足的胶原蛋白(＜32℃)高的解链温度(＞37℃)，并且还比羟基化不足的胶原蛋白更好地原纤化，并形成出于材料目的的更强结构。胶原制剂的解链温度可用于估计其羟基化程度，并且可在例如25至40℃的范围内，以及所有中间值诸如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40℃，以及被约束在由选自上述值的温度界定的下端与上端之间的子范围可用于选择一组要使用的胶原蛋白。
在羟基化胶原蛋白下，可能仅形成不适合耐用物品诸如鞋或袋的果冻状材料，但其可被配制成更柔软或更具吸收性的产品。通过提高羟基化程度，有以改善胶原蛋白的热稳定性，并且还可以提高由其产生的生物制造的材料的强度。这些生物制造的材料可以更适合需要更高耐久性的物品，包括鞋子、袋子、座椅等。作为调节羟基化程度的手段，可以设想可以增加相应酶的拷贝数或表达数，还可以设想的是改变细胞培养的温度、pH和碳源。
上述工程化的酵母细胞可用作宿主来产生胶原蛋白或其它蛋白质或碳水化合物。为此，将细胞置于发酵室内的培养基中，并在受控的pH条件下供给溶解氧和碳源，持续12小时至1周的时间。合适的培养基包括但不限于缓冲的甘油复合培养基(BMGY)、缓冲的甲醇复合培养基(BMMY)和酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YPD)。由于在酵母细胞中产生蛋白质并使用胶原蛋白作为实例，因此为了分离胶原蛋白，必须使用酵母的分泌菌株或裂解酵母细胞以释放胶原蛋白。然后可通过常规技术诸如离心、沉淀、过滤、色谱等纯化胶原蛋白。
实施例
以下非限制性实施例对本发明进行了说明。本发明的范围不限于这些实施例中描述的细节。
实施例1
修饰酵母以启动抗坏血酸的功能性植物合成途径。巴斯德毕赤酵母菌株BG10(野生型)获自ATUM(先前为DNA 2.0)。将含有GDP-L-Gal磷酸化酶(SEQ ID NO：19)、磷酸肌醇磷酸酶(SEQ ID NO：20)和GDP-甘露糖-3，5-差向异构酶(SEQ ID NO：18)的DNA序列的载体插入野生型巴斯德毕赤酵母中以产生经修饰的菌株。用Pme I消化DNA并将其转化到PP1(野生型巴斯德毕赤酵母菌株)中。这适合作为宿主菌株。
实施例2
如下所述修饰来自实施例1的宿主菌株：
对编码天然III型牛胶原蛋白的DNA进行测序，并通过聚合酶链式反应“PCR”方案扩增该序列以产生线性DNA序列。
对编码P4HA/B酶的DNA进行测序(SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9)，并通过聚合酶链反应“PCR”方案扩增该序列以产生线性DNA序列。
使用毕赤酵母属电穿孔方案(Bio-Rad Gene Pulser XcellTM Total System#1652660)将DNA转化到来自实施例1的菌株中。用P4HA/B共表达质粒转化酵母细胞，并在Hygro板(200ug/ml)上选择转化体。
将来自实施例1的所得菌株的单个菌落接种在100ml YPD培养基中，并在30℃下以215rpm振荡生长过夜。第二天当培养物达到OD600～3.5(～3-5X 107个细胞/OD600)时，用新鲜的YPD将其稀释至OD 600～1.7，并在30℃下以215rpm再振荡生长1小时。
将细胞以3,500g离心5分钟；用水洗涤一次，并重悬于10ml 10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM LiAc、10mM DTT(新鲜加入)和0.6M山梨糖醇中。
对于每次转化，将8X 108个细胞等分到8ml 10mM Tris-HCl(pH 7.5)、100mMLiAc、10mM DTT、0.6M山梨糖醇中，并使其在室温下孵育30分钟。
将细胞以5000g离心5分钟，并用冰冷的1.5ml 1M山梨糖醇洗涤3次，然后重悬于80ul冰冷的1M山梨糖醇中。
向细胞中加入不同量(约5ug)的线性化DNA，并通过吹打混合。
将细胞和DNA混合物(80-100ul)加入到0.2cm电穿孔杯中并使用毕赤酵母属-方案)进行脉冲(1500v，25uF，200Q)。
将细胞立即转移到YPD与1M山梨糖醇(1∶1)的1ml混合物中，并在30℃下孵育＞2小时。
将这些细胞以不同密度铺板并在30℃下孵育2天。
将两天后出现在平板上的单个菌落接种到24深孔板中的2mLBMGY培养基中，并在30℃下以900rpm振荡生长至少48小时。按照以下步骤，使用细胞裂解、SDS-page和胃蛋白酶测定法测试所得细胞的胶原蛋白。
使用Qiagen Tissue Lyser以30Hz的速度连续14分钟在1x裂解缓冲液中裂解酵母细胞。裂解缓冲液由2.5ml 1M HEPES(终浓度50mM)、438.3mg NaCl(终浓度150mM)、5ml甘油(终浓度10％)、0.5ml Triton X-100(终浓度1％)和42ml Millipure水制成。
将裂解的细胞在4℃下于台式离心机上以2,500rpm离心15分钟。保留上清液并弃去沉淀。
在2-巯基乙醇存在的情况下对上清液、分子量标记、阴性对照和阳性对照进行SDS-PAGE。电泳后，移除凝胶并用考马斯蓝染色，然后在水中脱色。
使用以下程序进行胃蛋白酶测定：
在胃蛋白酶处理之前，进行BCA测定以按照Thermo Scientific方案获得每个样品的总蛋白质。将总蛋白质针对所有样品中的最低浓度进行归一化。(注意：如果最低总蛋白质浓度小于0.5mg/mL，则不要使用该浓度进行归一化)。
将100uL裂解物放入微量离心管中。生成包含以下物质的主混合物：37％HC 1(每100μL含0.6μL酸)和胃蛋白酶(原液为在去离子水中1mg/mL，并且胃蛋白酶的最终添加应为1∶25的胃蛋白酶：总蛋白质比率(重量∶重量)。加入胃蛋白酶后，用移液管混合3次，并使样品在室温下孵育1小时，以进行胃蛋白酶反应。一小时后，向每个样品中添加1∶1体积的含有β-巯基乙醇的LDS上样缓冲液，并使其在70℃下孵育7分钟。(在该情况下，应添加100uL的LDS)。然后以14,000rpm旋转1分钟以除去浊度。
将来自样品顶部的18uL添加到3-8％TAE缓冲液上，并在150V下跑凝胶1小时10分钟。
实施例3
产生抗坏血酸的酵母
将来自实施例1的细胞接种到含葡萄糖的培养基中并在30℃下振荡生长。在不同时间点(例如24、48、72等小时)收集样品，并通过使用市售试剂盒分析细胞内和细胞外的抗坏血酸。抗坏血酸的量随时间推移是恒定的。
实施例4
产生抗坏血酸和羟基化胶原的酵母
将来自实施例2的细胞接种到含葡萄糖的培养基中并在30℃下振荡生长。在不同时间点(例如24、48、72等小时)收集样品，并通过使用市售试剂盒分析细胞内和细胞外的抗坏血酸。还通过已知方法分析胶原蛋白表达水平和羟基化。
实施例5
修饰酵母以包含α酮戊二酸转运蛋白。巴斯德毕赤酵母菌株(野生型)获自ATUM(以前为DNA 2.0)。
将含有kgtP(SEQ ID NO：3)的DNA序列的载体插入野生型巴斯德毕赤酵母以产生经修饰的菌株。用Bam HI消化DNA并将其转化到PP1(野生型巴斯德毕赤酵母菌株)中。这适合作为宿主菌株。
用HA标签标记kgtP基因。使用抗HA抗体通过免疫印迹检测重组基因。印迹上显示的条带具有针对kgtP基因的预期分子量。
实施例6
修饰酵母以表达α酮戊二酸转运蛋白并产生羟基化胶原。
如下所述修饰来自实施例5的宿主菌株：
对编码天然III型牛胶原的DNA进行测序(SEQ ID NO：10)，并通过聚合酶链式反应“PCR”方案扩增该序列以产生线性DNA序列。
对编码P4HA/B酶的DNA进行测序(SEQ ID NO：8和9(经优化的毕赤酵母属)或SEQID NO：15和16(天然的))，并通过聚合酶链式反应“PCR”方案扩增序列以产生线性DNA序列。
将含有胶原序列的线性DNA插入毕赤酵母属基因组中，并将含有P4HA/B序列的线性DNA插入毕赤酵母属基因组中。
使用毕赤酵母属电穿孔方案(Bio-Rad Gene Pulser XcellTM Total System#1652660)将DNA转化到来自实施例5的菌株中。用P4HA/B共表达质粒转化酵母细胞，并在Hygro板(200μg/ml)上选择转化体。
将来自实施例1的所得菌株的单个菌落接种在100ml YPD培养基中，并在30℃下以215rpm振荡生长过夜。第二天当培养物达到OD600～3.5(～3-5X 107个细胞/OD600)时，用新鲜的YPD将其稀释至OD 600～1.7，并在30℃下以215rpm再振荡生长1小时。
以3,500g离心细胞5分钟；用水洗涤一次，并重悬于10ml 10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM LiAc、10mM DTT(新鲜添加的)、0.6M山梨糖醇中
对于每次转化，将8X108个细胞等分到8ml 10mM Tris-HCl(pH 7.5)、100mM LiAc、10mM DTT、0.6M山梨糖醇中，并在室温下孵育30分钟。
将细胞以5000g下离心5分钟，并用冰冷的1.5ml 1M山梨糖醇洗涤3次并重悬于80μl冰冷的1M山梨糖醇中。
向细胞中加入不同量(约5μg)的线性化DNA，并通过吹打混合。
将细胞和DNA混合物(80-100μl)加入到0.2cm杯中并使用毕赤酵母属-方案(1500v，25uF，200Ω)进行脉冲。
将细胞立即转移到YPD与1M山梨糖醇(1∶1)的1ml混合物中，并在30℃下孵育＞2小时。
以不同密度将细胞铺板。
将单个菌落接种到24深孔板中的2mL BMGY培养基中，并在30℃下以900rpm振荡生长至少48小时。按照以下程序，使用细胞裂解、SDS-page和胃蛋白酶测定法测试所得细胞的胶原蛋白。
使用Qiagen TissueLyser以30Hz的速度连续14分钟在1x裂解缓冲液中裂解酵母细胞。裂解缓冲液由2.5ml 1M HEPES(终浓度50mM)、438.3mg NaCl(终浓度150mM)、5ml甘油(终浓度10％)、0.5ml Triton X-100(终浓度1％)和42ml Millipure水制成。
将裂解的细胞在4℃下于台式离心机上以2,500rpm离心15分钟。保留上清液并弃去沉淀。
在2-巯基乙醇存在的情况下对上清液、分子量标记、阴性对照和阳性对照进行SDS-PAGE。电泳后，移除凝胶并用考马斯蓝染色，然后在水中脱色。
使用以下程序进行胃蛋白酶测定：
在胃蛋白酶处理之前，进行BCA测定以按照Thermo Scientific方案获得每个样品的总蛋白质。将总蛋白质针对所有样品中的最低浓度进行归一化。(注意：如果最低总蛋白质浓度小于0.5mg/mL，则不要使用该浓度进行归一化)。
将100μL裂解物置于微量离心管中。生成含有以下物质的主混合物：37％HC 1(每100μL含0.6μL酸)和胃蛋白酶(原液为在去离子水中1mg/mL，并且胃蛋白酶的最终添加应为1∶25的胃蛋白酶∶总蛋白质比例(重量∶重量)。加入胃蛋白酶后，用移液管混合3次，并使样品在室温下孵育1小时，以进行胃蛋白酶反应。一小时后，将1∶1体积的含有β-巯基乙醇的LDS上样缓冲液添加到每个样品中，并使其在70℃下孵育7分钟。(在这种情况下应添加100μL的LDS)。然后以14,000rpm旋转1分钟以除去浊度。
将来自样品顶部的18μL添加到3-8％TAE上，并在150V下跑凝胶1小时10分钟。进行氨基酸分析以确定羟基化的百分比。kgtP的表达使得α酮戊二酸能够转运到内质网中，这导致胶原蛋白和羟基化胶原蛋白水平升高。
实施例7
用实施例5的方法修饰来自实施例1的具有抗坏血酸途径的酵母，以将转运蛋白转化到酵母中，提供具有抗坏血酸途径和kgtP转运蛋白的毕赤酵母属。
实施例8
用实施例2的程序修饰来自实施例7的具有抗坏血酸途径和kgtP转运蛋白的酵母，以提供具有抗坏血酸途径、kgtP转运蛋白和羟基化胶原蛋白的毕赤酵母属。
实施例9
L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(购自Eurofins Genomics)的基因经密码子优化以在毕赤酵母属中表达(SEQ ID NO 17)。将该基因克隆到组成型启动子pDF下，并且所使用的抗生素标记是博莱霉素。使用与实施例2中相同的电穿孔方法将质粒转化到毕赤酵母属细胞中，并将其涂铺在具有50μg/ml的博莱霉素的YPD板上。将板在30℃下孵育2天或直至转化体开始出现在平板上。
从平板挑取六个转化体并将其在30℃下在24孔板中的2mlBMGY培养基中持续振荡生长18小时。18小时后，向生长培养物中加入不同浓度的底物(L-古洛糖酸-1，4-内酯)(0g/L、0.1g/L和1g/L的终浓度)。野生型毕赤酵母属细胞用作实验的对照，并且还将底物加入对照培养物中。加入底物20小时后收获培养物。将光密度进行归一化并通过机械剪切在水中裂解细胞。两种方法用于定量细胞裂解物中的抗坏血酸浓度。在第一方法中，使用abcam试剂盒(Cat#ab65356)，其中测量反应混合物的荧光强度。第二方法称为Sullivan和Clarke方法，其中将不同细胞裂解物样品的吸光度记录为抗坏血酸产生的量度。具有L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶基因的转化体的细胞裂解物显示出比对照(野生型毕赤酵母属和在底物不存在的情况下生长的转化体)更高的荧光强度和更高的吸光度。初步数据表明，当向细胞中加入1g/L底物时产生抗坏血酸，并且在稍后的时间点(加入底物后36小时)产生～10nmol抗坏血酸。
序列表
SEQ ID NO：1
kgtP基因-来自大肠埃希氏菌的AKG转运蛋白
蛋白质序列
SEQ ID NO：2
kgtP基因-来自大肠埃希氏菌的AKG转运蛋白
DNA序列-天然的(未优化的)
SEQ ID NO：3
kgtP基因-来自大肠埃希氏菌的AKG转运蛋白
DNA序列-经优化用于毕赤酵母属的密码子
SEQ ID NO：4
脯氨酰3-羟化酶1前体[黄牛]
NCBI参考序列：NP_001096761.1
SEQ ID NO：5
黄牛脯氨酰3-羟化酶1(P3H1)，mRNA
NCBI参考序列：NM_001103291.1
SEQ ID NO：6
原胶原-赖氨酸，2-氧戊二酸5-双加氧酶1前体[黄牛]
NCBI参考序列：NP_776573.1
SEQ ID NO：7
赖氨酰氧化酶[黄牛]
GenBank：AAL13313.1
SEQ ID NO：8
牛P4HA
经优化的cDNA
SEQ ID NO：9
牛P4HB(PDI)序列，具有α前原信号序列
经优化的cDNA
SEQ ID NO：10
Col3A1
cDNA序列-经优化的
SEQ ID NO：11
胶原蛋白α-1(I)链前体[黄牛]
NCBI参考序列：NP_001029211.1
SEQ ID NO：12
胶原蛋白α-2(I)链前体[黄牛]
NCBI参考序列：NP_776945.1
SEQ ID NO：13
胶原蛋白α-1(III)链前体[黄牛]
NCBI参考序列：NP_001070299.1
SEQ ID NO：14
双功能精氨酸脱甲基酶和赖氨酰-羟化酶JMJD6[黄牛]
NCBI参考序列：NP_001029492.2
SEQ ID NO：15
牛P4HA
cDNA，天然的
SEQ ID NO：16
牛P4HB(PDI)序列，
天然的，具有自己的信号肽
SEQ ID NO：17
L-古洛糖酸，1，4-内酯氧化酶序列
SEQ ID NO：18
GDP-甘露糖-3，5-差向异构酶，经优化用于毕赤酵母属的密码子
SEQ ID NO：19
GDP-L-半乳糖磷酸化酶
SEQ ID NO：20
磷酸肌醇磷酸酶
SEQ ID NO：21
来自拟南芥的GDP-L-Gal磷酸化酶：
SEQ ID NO：22
来自拟南芥的GDP-L-Gal磷酸化酶：
SEQ ID NO：23
磷酸肌醇磷酸酶
SEQ ID NO：24
磷酸肌醇磷酸酶
SEQ ID NO：25：
GDP-甘露糖-3，5-差向异构酶
SEQ ID NO：26
L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶
SEQ ID NO：27
KSPISPAFSTSEDDIFSWV
SEQ ID NO：28
WYNHVPPDSRPSPEKGHHR
SEQ ID NO：29
D-葡糖醛酸激酶
SEQ ID NO：30
UDP-D-葡萄糖脱氢酶
序列表
<110> Modern Meadow. Inc.
<120> 重组酵母菌株
<130> 515858US
<150> US 62/562,109
<151> 2017-09-22
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 432
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽: kgtP基因, 来自大肠埃希氏菌的AKG转运蛋白
<400> 1
Met Ala Glu Ser Thr Val Thr Ala Asp Ser Lys Leu Thr Ser Ser Asp
1 5 10 15
Thr Arg Arg Arg Ile Trp Ala Ile Val Gly Ala Ser Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Val Glu Trp Phe Asp Phe Tyr Val Tyr Ser Phe Cys Ser Leu Tyr Phe
35 40 45
Ala His Ile Phe Phe Pro Ser Gly Asn Thr Thr Thr Gln Leu Leu Gln
50 55 60
Thr Ala Gly Val Phe Ala Ala Gly Phe Leu Met Arg Pro Ile Gly Gly
65 70 75 80
Trp Leu Phe Gly Arg Ile Ala Asp Lys His Gly Arg Lys Lys Ser Met
85 90 95
Leu Leu Ser Val Cys Met Met Cys Phe Gly Ser Leu Val Ile Ala Cys
100 105 110
Leu Pro Gly Tyr Glu Thr Ile Gly Thr Trp Ala Pro Ala Leu Leu Leu
115 120 125
Leu Ala Arg Leu Phe Gln Gly Leu Ser Val Gly Gly Glu Tyr Gly Thr
130 135 140
Ser Ala Thr Tyr Met Ser Glu Val Ala Val Glu Gly Arg Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Ala Ser Phe Gln Tyr Val Thr Leu Ile Gly Gly Gln Leu Leu Ala
165 170 175
Leu Leu Val Val Val Val Leu Gln His Thr Met Glu Asp Ala Ala Leu
180 185 190
Arg Glu Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Ala Leu Gly Ala Val Leu Ala
195 200 205
Val Val Ala Leu Trp Leu Arg Arg Gln Leu Asp Glu Thr Ser Gln Gln
210 215 220
Glu Thr Arg Ala Leu Lys Glu Ala Gly Ser Leu Lys Gly Leu Trp Arg
225 230 235 240
Asn Arg Arg Ala Phe Ile Met Val Leu Gly Phe Thr Ala Ala Gly Ser
245 250 255
Leu Cys Phe Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Met Gln Lys Tyr Leu Val Asn
260 265 270
Thr Ala Gly Met His Ala Asn Val Ala Ser Gly Ile Met Thr Ala Ala
275 280 285
Leu Phe Val Phe Met Leu Ile Gln Pro Leu Ile Gly Ala Leu Ser Asp
290 295 300
Lys Ile Gly Arg Arg Thr Ser Met Leu Cys Phe Gly Ser Leu Ala Ala
305 310 315 320
Ile Phe Thr Val Pro Ile Leu Ser Ala Leu Gln Asn Val Ser Ser Pro
325 330 335
Tyr Ala Ala Phe Gly Leu Val Met Cys Ala Leu Leu Ile Val Ser Phe
340 345 350
Tyr Thr Ser Ile Ser Gly Ile Leu Lys Ala Glu Met Phe Pro Ala Gln
355 360 365
Val Arg Ala Leu Gly Val Gly Leu Ser Tyr Ala Val Ala Asn Ala Ile
370 375 380
Phe Gly Gly Ser Ala Glu Tyr Val Ala Leu Ser Leu Lys Ser Ile Gly
385 390 395 400
Met Glu Thr Ala Phe Phe Trp Tyr Val Thr Leu Met Ala Val Val Ala
405 410 415
Phe Leu Val Ser Leu Met Leu His Arg Lys Gly Lys Gly Met Arg Leu
420 425 430
<210> 2
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: kgtP基因, 来自大肠埃希氏菌的AKG转运蛋白, 天然的（未优化的）
<400> 2
atggctgaaa gtactgtaac ggcagacagc aaactgacaa gtagtgatac tcgtcgccgc 60
atttgggcga ttgtgggggc ctcttcaggt aatctggtcg agtggttcga tttctatgtc 120
tactcgttct gttcactcta ctttgcccac atcttcttcc cttccgggaa cacgacgact 180
caactactac aaacagcagg tgtttttgct gcgggattcc tgatgcgccc aataggcggt 240
tggctatttg gccgcatagc cgataaacat ggtcgcaaaa aatcgatgct gttatcggtg 300
tgtatgatgt gtttcggatc gctggttatc gcctgcctcc caggttatga aactataggt 360
acgtgggctc cggcattatt gcttctcgct cgtttatttc agggattatc tgttggcgga 420
gaatatggca ccagcgccac ctatatgagt gaagttgccg ttgaagggcg caaaggtttt 480
tacgcatcat ttcagtatgt gacgttgatc ggcggacaac tgctagccct actggttgtc 540
gtggttttac aacacaccat ggaagacgct gcactcagag agtggggatg gcgtattcct 600
ttcgcgttag gagctgtgtt agctgttgtg gcgttgtggt tacgtcgtca gttagatgaa 660
acttcgcaac aagaaacgcg cgctttaaaa gaagctggat ctctgaaagg attatggcgc 720
aatcgccgtg cattcatcat ggttctcggt tttaccgctg cgggctccct ttgtttctat 780
accttcacta cttatatgca gaagtatctg gtaaatactg cgggaatgca tgccaacgtg 840
gcgagtggca ttatgactgc cgcattgttt gtattcatgc ttattcaacc actcattggc 900
gcgctgtcgg ataagattgg tcgccgtacc tcaatgttat gtttcggttc gctggcagcc 960
atttttaccg ttcctattct ctcagcattg caaaacgttt cctcgcctta tgccgctttt 1020
ggtctggtga tgtgtgccct gctgatagtg agtttttata catcaatcag tggaatactg 1080
aaggctgaga tgttcccggc acaggttcgc gcattaggcg ttggtctgtc atatgcggtc 1140
gctaatgcta tatttggtgg ttcggcggag tacgtagcgt tgtcgctgaa atcaatagga 1200
atggaaacag ccttcttctg gtatgtgacc ttgatggccg tggtggcgtt tctggtttct 1260
ttgatgctac atcgcaaagg gaaggggatg cgtctttag 1299
<210> 3
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: kgtP基因, 来自大肠埃希氏菌的AKG转运蛋白, 经优化用于毕赤酵母属的密码子
<400> 3
atggcagaat caactgtgac ggcagacagt aagctgacct catcagatac tagaaggaga 60
atctgggcaa tagttggagc ctcttccgga aatcttgtag agtggtttga cttttatgtt 120
tattcattct gcagtctgta ttttgcacat attttctttc catctggcaa caccaccaca 180
caactgttac agaccgccgg cgtgttcgct gccggatttc ttatgaggcc cattggtgga 240
tggttgtttg gtagaatagc tgacaagcat ggtcgtaaga agtctatgtt gttgtctgtc 300
tgtatgatgt gcttcggatc actggtaatt gcatgtcttc caggttacga gaccattgga 360
acatgggctc ccgctttgct tctacttgcc aggctatttc agggtttatc agtcggtggc 420
gaatacggca cttctgcaac gtacatgtct gaggtagcag tcgagggtag aaaaggattc 480
tacgcctcct ttcaatacgt tacactgata ggaggtcaac ttcttgcctt gctagtggtc 540
gttgtcctac aacacacgat ggaggacgct gctctgaggg aatggggatg gcgtataccc 600
ttcgctttag gtgccgtcct ggccgttgtc gcattgtggt tgaggaggca gctagatgaa 660
acttcccagc aagagacaag agcattgaaa gaggccggtt cacttaaagg tctgtggcgt 720
aaccgtcgtg cctttattat ggtgcttggc ttcacggctg ctggctccct ttgcttctat 780
actttcacca cttatatgca gaaatatttg gtgaatactg caggtatgca cgctaacgtc 840
gcttccggaa ttatgacggc tgcattgttt gtctttatgc taattcaacc attgataggc 900
gctctatctg ataagatagg ccgtaggact tcaatgctat gtttcggctc cttggctgca 960
atttttaccg tgcctattct atctgcccta caaaatgtgt cttctccata cgctgctttt 1020
ggtctggtaa tgtgcgcttt actaattgtg tctttttaca cgtcaatttc cggaatacta 1080
aaagccgaga tgttccccgc ccaggtacgt gccttaggtg ttggcctttc ttacgcagtc 1140
gcaaacgcta ttttcggtgg aagtgccgag tatgtagctt tgtctcttaa aagtatcgga 1200
atggagacgg cctttttctg gtatgtaact ttgatggccg tcgttgcatt cctagtttcc 1260
cttatgttac acaggaaagg caaaggtatg aggttataa 1299
<210> 4
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽: 脯氨酰3-羟化酶1前体（黄牛）, NCBI参考序列 NP_001096761.1
<400> 4
Met Ala Ala Arg Ala Leu Arg Leu Leu Thr Ile Leu Leu Ala Val Ala
1 5 10 15
Ala Thr Ala Ser Gln Ala Glu Ala Glu Ser Glu Ala Gly Trp Asp Leu
20 25 30
Thr Ala Pro Asp Leu Leu Phe Ala Glu Gly Thr Ala Ala Tyr Ala Arg
35 40 45
Gly Asp Trp Ala Gly Val Val Leu Ser Met Glu Arg Ala Leu Arg Ser
50 55 60
Arg Ala Ala Leu Arg Ala Leu Arg Leu Arg Cys Arg Thr Arg Cys Ala
65 70 75 80
Ala Asp Leu Pro Trp Glu Val Asp Pro Asp Ser Pro Pro Ser Leu Ala
85 90 95
Gln Ala Ser Gly Ala Ser Ala Leu His Asp Leu Arg Phe Phe Gly Gly
100 105 110
Leu Leu Arg Arg Ala Ala Cys Leu Arg Arg Cys Leu Gly Pro Ser Thr
115 120 125
Ala His Ser Leu Ser Glu Glu Leu Glu Leu Glu Phe Arg Lys Arg Ser
130 135 140
Pro Tyr Asn Tyr Leu Gln Val Ala Tyr Phe Lys Ile Asn Lys Leu Glu
145 150 155 160
Lys Ala Val Ala Ala Ala His Thr Phe Phe Val Gly Asn Pro Glu His
165 170 175
Met Glu Met Arg Gln Asn Leu Asp Tyr Tyr Gln Thr Met Ser Gly Val
180 185 190
Lys Glu Ala Asp Phe Lys Asp Leu Glu Ala Lys Pro His Met His Glu
195 200 205
Phe Arg Leu Gly Val Arg Leu Tyr Ser Glu Glu Gln Pro Gln Glu Ala
210 215 220
Val Pro His Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Tyr Phe Val Ala Ala Glu
225 230 235 240
Glu Cys Arg Ala Leu Cys Glu Gly Pro Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Asn
245 250 255
Tyr Leu Glu Tyr Asn Ala Asp Leu Phe Gln Ala Ile Thr Asp His Tyr
260 265 270
Ile Gln Val Leu Ser Cys Lys Gln Asn Cys Val Thr Glu Leu Ala Ser
275 280 285
His Pro Ser Arg Glu Lys Pro Phe Glu Asp Phe Leu Pro Ser His Tyr
290 295 300
Asn Tyr Leu Gln Phe Ala Tyr Tyr Asn Ile Gly Asn Tyr Thr Gln Ala
305 310 315 320
Ile Glu Cys Ala Lys Thr Tyr Leu Leu Phe Phe Pro Asn Asp Glu Val
325 330 335
Met Ser Gln Asn Leu Ala Tyr Tyr Thr Ala Met Leu Gly Glu Glu Gln
340 345 350
Ala Arg Ser Ile Gly Pro Arg Glu Ser Ala Gln Glu Tyr Arg Gln Arg
355 360 365
Ser Leu Leu Glu Lys Glu Leu Leu Phe Phe Ala Tyr Asp Val Phe Gly
370 375 380
Ile Pro Phe Val Asp Pro Asp Ser Trp Thr Pro Val Glu Val Ile Pro
385 390 395 400
Lys Arg Leu Gln Glu Lys Gln Lys Ser Glu Arg Glu Thr Ala Ala Arg
405 410 415
Ile Ser Gln Glu Ile Gly Asn Leu Met Lys Glu Ile Glu Thr Leu Val
420 425 430
Glu Glu Lys Thr Lys Glu Ser Leu Asp Val Ser Arg Leu Thr Arg Glu
435 440 445
Gly Gly Pro Leu Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Leu Thr Met Asn Ser Lys
450 455 460
Val Leu Asn Gly Ser Gln Arg Val Val Met Asp Gly Val Ile Ser Asp
465 470 475 480
Glu Glu Cys Gln Glu Leu Gln Arg Leu Thr Asn Ala Ala Ala Thr Ser
485 490 495
Gly Asp Gly Tyr Arg Gly Gln Thr Ser Pro His Thr Pro Ser Glu Lys
500 505 510
Phe Tyr Gly Val Thr Val Phe Lys Ala Leu Lys Leu Gly Gln Glu Gly
515 520 525
Lys Val Pro Leu Gln Ser Ala His Leu Tyr Tyr Asn Val Thr Glu Lys
530 535 540
Val Arg Arg Val Met Glu Ser Tyr Phe Arg Leu Asp Thr Pro Leu Tyr
545 550 555 560
Phe Ser Tyr Ser His Leu Val Cys Arg Thr Ala Ile Glu Glu Ala Gln
565 570 575
Ala Glu Arg Lys Asp Gly Ser His Pro Val His Val Asp Asn Cys Ile
580 585 590
Leu Asn Ala Glu Ala Leu Val Cys Ile Lys Glu Pro Pro Ala Tyr Thr
595 600 605
Phe Arg Asp Phe Ser Ala Ile Leu Tyr Leu Asn Glu Asp Phe Asp Gly
610 615 620
Gly Asn Phe Tyr Phe Thr Glu Leu Asp Ala Lys Thr Val Thr Ala Glu
625 630 635 640
Val Gln Pro Gln Cys Gly Arg Ala Val Gly Phe Ser Ser Gly Thr Glu
645 650 655
Asn Pro His Gly Val Lys Ala Val Thr Arg Gly Gln Arg Cys Ala Ile
660 665 670
Ala Leu Trp Phe Thr Leu Asp Ala Arg His Ser Glu Arg Glu Arg Val
675 680 685
Gln Ala Asp Asp Leu Val Lys Met Leu Phe Ser Pro Glu Glu Met Asp
690 695 700
Leu Pro His Glu Gln Pro Gln Glu Ala Gln Glu Gly Thr Pro Glu Pro
705 710 715 720
Leu Gln Glu Pro Val Ser Ser Ser Glu Ser Gly His Lys Asp Glu Leu
725 730 735
<210> 5
<211> 2580
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: 黄牛脯氨酰3-羟化酶1 (P3H1), NCBI参考序列 NM_001103291.1
<400> 5
caagggtccc gttaggtctg agcggccatg gcggcacgcg ctttaaggct gctgaccata 60
ttgctggccg tcgccgccac tgcctcccag gctgaggccg agtccgaggc gggatgggac 120
ctgacggcgc ctgatctgct gttcgcggag gggacggcgg cctatgctcg cggggactgg 180
gccggtgtgg ttctgagcat ggagcgggcg ctccgctcgc gggccgccct gcgcgccctc 240
cgtctgcgct gccgcactcg gtgtgccgcc gacctcccat gggaagtgga cccagactcg 300
cccccaagct tggcgcaggc ttcaggtgcc tccgccctgc acgacctgcg gttcttcgga 360
ggcttgctgc gccgcgccgc ttgcctgcgc cgctgcctcg ggccgtcgac cgcccactcg 420
ctcagcgagg agctggagtt ggagttccgc aagcggagcc cctacaacta cctgcaggtc 480
gcctacttca agataaacaa gttggagaaa gctgtagcag cagcccatac cttcttcgtg 540
ggcaaccctg agcacatgga gatgcgacag aacctggact attaccagac catgtctggg 600
gtgaaggagg ctgacttcaa ggatcttgag gccaaacccc atatgcacga atttcggctg 660
ggagtgcgcc tctactccga ggagcagccg caggaagccg tgccccacct ggaggcggcg 720
ctgcgggagt acttcgtggc ggccgaggag tgccgcgcgc tctgcgaagg gccctatgac 780
tacgacggct acaactacct ggagtacaat gccgacctct tccaggccat cacagatcat 840
tacatccagg tcctcagctg taagcagaac tgtgtcacgg agcttgcttc ccacccaagt 900
cgagagaagc cctttgaaga cttcctgcca tctcattata attatctgca gtttgcctac 960
tataacattg ggaattacac acaggccatt gaatgtgcca agacctatct cctcttcttt 1020
cccaatgatg aggtgatgag ccagaatctg gcctactata cagccatgct tggagaagag 1080
caagccagat ccattggccc ccgtgagagt gcccaggagt accgccagcg gagcctgctg 1140
gagaaggaac tgcttttctt cgcctatgac gtttttggaa ttccctttgt tgatccggat 1200
tcatggactc cagtggaggt gattcctaag agactgcaag agaaacagaa gtcagaacgg 1260
gaaacagctg cccgcatctc ccaggaaatc gggaacctta tgaaggagat cgagaccctc 1320
gtggaggaga agaccaagga gtcactggac gtgagcaggc tgacccggga aggtggcccc 1380
ctgctgtatg atggcatcag actcaccatg aactccaaag tcctgaatgg ttcccagcgg 1440
gtggtgatgg atggcgtcat ctctgacgag gagtgccagg agctgcagag actgaccaat 1500
gcagcagcaa cttcaggaga tggctaccgg ggtcagacct ccccacacac ccccagcgag 1560
aagttctacg gtgtcaccgt cttcaaggcc ctcaagctgg ggcaggaagg gaaggttcct 1620
ctgcagagcg cccacctgta ctacaacgtg acggagaagg tgcgccgcgt catggagtcg 1680
tacttccgcc tggatacccc gctctacttc tcctactccc acctggtgtg ccgcaccgcc 1740
atcgaagagg cacaggctga gaggaaggac ggtagccacc ccgtccacgt ggacaactgc 1800
atcctgaatg ccgaggccct cgtgtgcatc aaggagcccc ctgcctacac tttccgggac 1860
ttcagcgcca ttctttatct gaacgaagac ttcgatggag gaaactttta tttcactgaa 1920
ctagatgcca agaccgtgac ggcagaggtg cagccccagt gcggaagggc tgtgggattc 1980
tcttccggca cggaaaaccc gcatggagta aaggccgtca ccagagggca gcgctgtgcc 2040
attgccctct ggttcacttt ggatgctcga cacagcgaga gggagcgagt gcaggcggac 2100
gacctggtaa agatgctctt tagcccagaa gagatggacc tcccccacga gcagccccaa 2160
gaagcccagg aggggacccc cgagccccta caggagcccg tctccagcag tgagtcaggg 2220
cacaaggatg agctctgaca actcccgtgg atggtgatca gacccacacg agggactctg 2280
tcctgcagcc tggactggcc agccccgggc gaggagcagt gggaacccag gcctgccgcc 2340
cagctgaggg ggctctgctc acggccgtcc gcatggtgct gctgctcttg gagtggacat 2400
ggcgagatgg ccctctcccc tctgggcctg actgagggct caggacgcag gcccagagcc 2460
actctggggg cccacacagg cagccacgtg acagcaatac agtatttaag tgcctgtgta 2520
gacaaccaaa gaataaatga ttcgtggttt tttttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580
<210> 6
<211> 726
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽: 原胶原-赖氨酸 2-氧戊二酸5-双加氧酶1前体, 黄牛, NCBI参考序列 NP_776573.1
<400> 6
Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Pro Leu Gly Trp Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Glu Thr Lys Gly Asp Ala Lys Pro Glu Asp Asn Leu Leu Val Leu Thr
20 25 30
Val Ala Thr Lys Glu Thr Glu Gly Phe Arg Arg Phe Lys Arg Ser Ala
35 40 45
Gln Phe Phe Asn Tyr Lys Ile Gln Ala Leu Gly Leu Gly Glu Asp Trp
50 55 60
Pro Gly Glu Ala Met Leu Ala Gly Gly Gly Leu Lys Val Arg Leu Leu
65 70 75 80
Lys Lys Ala Leu Glu Lys His Ala Asp Lys Glu Asn Leu Val Ile Leu
85 90 95
Phe Thr Asp Ser Tyr Asp Val Val Phe Ala Ser Gly Pro Arg Glu Leu
100 105 110
Leu Lys Lys Phe Arg Gln Ala Arg Ser Gln Val Val Phe Ser Ala Glu
115 120 125
Glu Leu Ile Tyr Pro Asp Arg Arg Leu Glu Ala Asn Tyr Pro Val Val
130 135 140
Ser Asp Gly Lys Arg Phe Leu Gly Ser Gly Gly Phe Ile Gly Tyr Ala
145 150 155 160
Pro Asn Leu Ile Lys Leu Val Ala Glu Trp Glu Gly Gln Asp Ser Asp
165 170 175
Ser Asp Gln Leu Phe Tyr Thr Lys Ile Phe Leu Asp Pro Glu Lys Arg
180 185 190
Glu Gln Ile Asn Ile Thr Leu Asp His Arg Cys Arg Ile Phe Gln Asn
195 200 205
Phe His Gly Ala Leu Asp Glu Val Val Leu Lys Phe Glu Met Gly Gln
210 215 220
Val Arg Ala Arg Asn Leu Ala Tyr Asp Thr Leu Pro Val Leu Ile His
225 230 235 240
Gly Asn Gly Pro Thr Lys Leu Gln Leu Asn Tyr Leu Gly Asn Tyr Ile
245 250 255
Pro Arg Phe Trp Thr Phe Glu Thr Gly Cys Ala Val Cys Asp Glu Gly
260 265 270
Leu Arg Ser Leu Lys Gly Ile Gly Asp Glu Ala Leu Pro Ala Val Leu
275 280 285
Val Gly Val Phe Ile Glu Gln Pro Thr Pro Phe Leu Ser Leu Phe Phe
290 295 300
Gln Arg Leu Leu Leu Leu His Tyr Pro Gln Lys Arg Phe Arg Leu Phe
305 310 315 320
Ile His Asn His Glu Gln His His Lys Ala Gln Val Glu Gln Phe Leu
325 330 335
Ala Glu His Gly Asp Glu Tyr Gln Ser Val Lys Leu Val Gly Pro Glu
340 345 350
Val Arg Val Ala Asn Ala Asp Ala Arg Asn Met Gly Ala Asp Leu Cys
355 360 365
Arg Gln Asp Arg Gly Cys Thr Tyr Tyr Phe Ser Val Asp Ala Asp Val
370 375 380
Ala Leu Thr Glu Pro Lys Thr Leu Arg Leu Leu Ile Glu Gln Asn Lys
385 390 395 400
Asn Val Ile Thr Pro Leu Met Thr Arg His Gly Arg Leu Trp Ser Asn
405 410 415
Phe Trp Gly Ala Leu Ser Ala Asp Gly Tyr Tyr Ala Arg Ser Glu Asp
420 425 430
Tyr Val Asp Ile Val Gln Gly Arg Arg Val Gly Val Trp Asn Val Pro
435 440 445
Tyr Ile Ser Asn Ile Tyr Leu Ile Lys Gly Ser Ala Leu Arg Ala Glu
450 455 460
Leu Gln Glu Thr Asp Leu Phe His His Ser Lys Leu Asp Pro Asp Met
465 470 475 480
Ala Phe Cys Ala Asn Ile Arg Gln Gln Asp Val Phe Met Phe Leu Thr
485 490 495
Asn Arg His Ser Phe Gly His Leu Leu Ser Leu Asp Ser Tyr Gln Thr
500 505 510
Thr His Leu His Asn Asp Leu Trp Glu Val Phe Ser Asn Pro Glu Asp
515 520 525
Trp Lys Glu Lys Tyr Ile His Glu Asn Tyr Thr Lys Ala Leu Ala Gly
530 535 540
Lys Met Val Glu Met Pro Cys Pro Asp Val Tyr Trp Phe Pro Ile Phe
545 550 555 560
Thr Glu Thr Ala Cys Asp Glu Leu Val Glu Glu Met Glu His Tyr Gly
565 570 575
Gln Trp Ser Leu Gly Asp Asn Lys Asp Asn Arg Ile Gln Gly Gly Tyr
580 585 590
Glu Asn Val Pro Thr Ile Asp Ile His Met Asn Gln Ile Asn Tyr Glu
595 600 605
Arg Glu Trp His Lys Phe Leu Val Glu Tyr Ile Ala Pro Met Thr Glu
610 615 620
Lys Leu Tyr Pro Gly Tyr Tyr Thr Arg Ala Gln Phe Asp Leu Ala Phe
625 630 635 640
Val Val Arg Tyr Lys Pro Asp Glu Gln Pro Ser Leu Val Pro His His
645 650 655
Asp Ala Ser Thr Phe Thr Ile Asn Ile Gly Leu Asn Arg Val Gly Val
660 665 670
Asp Tyr Glu Gly Gly Gly Cys Arg Phe Leu Arg Tyr Asn Cys Ser Ile
675 680 685
Arg Ala Pro Arg Lys Gly Trp Thr Leu Met His Pro Gly Arg Leu Thr
690 695 700
His Tyr His Glu Gly Val Pro Thr Thr Lys Gly Thr Arg Tyr Ile Ala
705 710 715 720
Val Ser Phe Val Asp Pro
725
<210> 7
<211> 418
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽: 赖氨酰氧化酶, 黄牛, GenBank AAL13313.1
<220>
<221> misc_feature
<222> (253)..(253)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 7
Met Arg Phe Ala Trp Thr Ala Leu Leu Gly Ser Leu Gln Leu Cys Ala
1 5 10 15
Leu Val Arg Cys Ala Pro Pro Ala Ala Ser His Arg Gln Pro Pro Arg
20 25 30
Glu Gln Ala Ala Ala Pro Gly Ala Trp Arg Gln Lys Ile Gln Trp Glu
35 40 45
Asn Asn Gly Gln Val Phe Ser Leu Leu Ser Leu Gly Ser Gln Tyr Gln
50 55 60
Pro Gln Arg Arg Arg Asp Pro Gly Ala Thr Ala Pro Gly Ala Ala Asn
65 70 75 80
Ala Thr Ala Pro Gln Met Arg Thr Pro Ile Leu Leu Leu Arg Asn Asn
85 90 95
Arg Thr Ala Ala Ala Arg Val Arg Thr Ala Gly Pro Ser Ala Ala Ala
100 105 110
Ala Gly Arg Pro Arg Pro Ala Ala Arg His Trp Phe Gln Ala Gly Tyr
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Ala His Asp Ala Gly Thr Ser Arg Ala Asp Asn Gln
130 135 140
Thr Ala Pro Gly Glu Val Pro Thr Leu Ser Asn Leu Arg Pro Pro Asn
145 150 155 160
Arg Val Glu Val Asp Gly Met Val Gly Asp Asp Pro Tyr Asn Pro Tyr
165 170 175
Lys Tyr Thr Asp Asp Asn Pro Tyr Tyr Asn Tyr Tyr Asp Thr Tyr Glu
180 185 190
Arg Pro Arg Pro Gly Ser Arg Tyr Arg Pro Gly Tyr Gly Thr Gly Tyr
195 200 205
Phe Gln Tyr Gly Leu Pro Asp Leu Val Pro Asp Pro Tyr Tyr Ile Gln
210 215 220
Ala Ser Thr Tyr Val Gln Lys Met Ala Met Tyr Asn Leu Arg Cys Ala
225 230 235 240
Ala Glu Glu Asn Cys Leu Ala Ser Ser Ala Tyr Arg Xaa Asp Val Arg
245 250 255
Asp Tyr Asp His Arg Val Leu Leu Arg Phe Pro Gln Arg Val Lys Asn
260 265 270
Gln Gly Thr Ser Asp Phe Leu Pro Ser Arg Pro Arg Tyr Ser Trp Glu
275 280 285
Trp His Ser Cys His Gln His Tyr His Ser Met Asp Glu Phe Ser His
290 295 300
Tyr Asp Leu Leu Asp Ala Ser Thr Gln Arg Arg Val Ala Glu Gly His
305 310 315 320
Lys Ala Ser Phe Cys Leu Glu Asp Thr Ser Cys Asp Tyr Gly Tyr His
325 330 335
Arg Arg Phe Ala Cys Thr Ala His Thr Gln Gly Leu Ser Pro Gly Cys
340 345 350
Tyr Asp Thr Tyr Asn Ala Asp Ile Asp Cys Gln Trp Ile Asp Ile Thr
355 360 365
Asp Val Lys Pro Gly Asn Tyr Ile Leu Lys Val Ser Val Asn Pro Ser
370 375 380
Tyr Leu Val Pro Glu Ser Asp Tyr Ser Asn Asn Val Val Arg Cys Glu
385 390 395 400
Ile Arg Tyr Thr Gly His His Ala Tyr Ala Ser Gly Cys Thr Ile Ser
405 410 415
Pro Tyr
<210> 8
<211> 1612
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: 牛P4HA cDNA, 经优化的
<400> 8
atgatttggt atatcctagt cgttggtatt ttgttgccac agtcactggc tcacccaggc 60
ttcttcactt ctataggaca gatgactgat ttgattcaca cagaaaaaga cctagttaca 120
agccttaaag actatatcaa agctgaagag gataagttgg agcaaatcaa aaagtgggca 180
gagaaactcg atagattgac tagtactgca acaaaagatc ctgagggttt tgtgggtcac 240
ccagtgaatg ctttcaagct gatgaagaga cttaatacag agtggtcaga attggaaaac 300
ttggtactta aagatatgag tgatggattc atttctaact taacaattca aagacaatac 360
tttccaaacg atgaggacca agtaggagca gcaaaagctt tgttgcgatt gcaggacaca 420
tacaatttgg acaccgacac gatatcgaag ggtgatttac ctggtgtgaa gcataagtcc 480
ttcctcactg tggaagattg ttttgaattg ggaaaagtcg catatacaga agccgactac 540
tatcacacag aattatggat ggagcaagct ctgcgtcagt tggacgaagg tgaagtttct 600
accgttgata aggtttcagt tttggattac ttatcatacg ctgtttacca gcaaggtgat 660
ctggacaaag ctctactttt aactaaaaag ttgttggagc tggacccgga gcatcaaaga 720
gctaacggta atctgaaata ctttgaatac atcatggcta aggaaaagga cgcaaataag 780
tcctcgtccg atgaccaatc cgatcaaaag accactctga aaaaaaaagg tgcagctgtt 840
gactacctcc cagagagaca aaagtatgaa atgctgtgta gaggagaggg tatcaagatg 900
actccaagga gacagaaaaa gctgttctgt agatatcatg atgggaaccg taacccaaaa 960
ttcattcttg ctccagcgaa acaggaagat gaatgggaca agcctagaat cattcgtttt 1020
catgacatca tctccgatgc agaaatagag gttgtgaaag acttggccaa accaagattg 1080
agtagggcta ccgtccatga ccctgagact ggaaaattga ctaccgcaca atatcgtgtc 1140
tctaaatcag catggttgtc cggttacgag aatcccgtgg tcagccgtat caatatgcgt 1200
attcaagatt tgactggtct tgacgtaagc actgctgagg aactacaagt tgccaactat 1260
ggtgtgggcg gtcagtatga accccacttt gatttcgcca gaaaggacga gcctgatgct 1320
tttaaggagc taggtactgg aaatagaatc gcaacgtggt tgttctatat gtccgatgtg 1380
cttgctggag gagccacagt tttccctgag gtaggtgctt ctgtttggcc taaaaagggc 1440
acggccgtat tttggtacaa tctgtttgca tctggagaag gtgattacag cactagacat 1500
gctgcttgtc ccgtcttagt cggtaataag tgggtttcca ataagtggct gcatgagaga 1560
ggtcaagagt ttaggaggcc atgcacattg tcagaattag aatgataatt tt 1612
<210> 9
<211> 1747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: 牛P4HB (PDI)序列, 具有α前原信号序列, 经优化的cDNA
<400> 9
atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60
cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120
tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa ctccactaac 180
aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga agagggtgtc 240
tctctcgaga aaagagaggc cgaagctgca cccgatgagg aagatcatgt tttagtattg 300
cataaaggaa atttcgatga agctttggcc gctcacaaat atctgctcgt cgagttttac 360
gctccctggt gcggtcattg taaggccctt gcaccagagt acgccaaggc agctggtaag 420
ttaaaggccg aaggttcaga gatcagatta gcaaaagttg atgctacaga agagtccgat 480
cttgctcaac aatacggggt tcgaggatac ccaacaatta agtttttcaa aaatggtgat 540
actgcttccc caaaggaata tactgctggt agagaggcag acgacatagt caactggctc 600
aaaaagagaa cgggcccagc tgcgtctaca ttaagcgacg gagcagcagc cgaagctctt 660
gtggaatcta gtgaagttgc tgtaatcggt ttctttaagg acatggaatc tgattcagct 720
aaacagttcc ttttagcagc tgaagcaatc gatgacatcc ctttcggaat cacctcaaat 780
agtgacgtgt tcagcaagta ccaacttgac aaagatggag tggtcttgtt caaaaagttt 840
gacgaaggca gaaacaattt cgagggtgag gttacaaagg agaaactgct tgatttcatt 900
aaacataacc aactaccctt agttatcgaa ttcactgaac aaactgctcc taagattttc 960
ggtggagaaa tcaaaacaca tatcttgttg tttttgccaa agtccgtatc ggattatgaa 1020
ggtaaactct ccaatttcaa aaaggccgct gagagcttta agggcaagat tttgttcatc 1080
tttattgact cagaccacac agacaatcag aggattttgg agtttttcgg tttgaaaaag 1140
gaggaatgtc cagcagtccg tttgatcacc ttggaggagg agatgaccaa atacaaacca 1200
gagtcggatg agttgactgc cgagaagata acagaatttt gtcacagatt tctggaaggt 1260
aagatcaagc ctcatcttat gtctcaagag ttgcctgatg actgggataa gcaaccagtt 1320
aaagtattgg tgggtaaaaa ctttgaggaa gtggccttcg acgagaaaaa aaatgtcttt 1380
gttgaattct atgctccgtg gtgtggtcac tgtaagcagc tggcaccaat ttgggataaa 1440
ctgggtgaaa cttacaaaga tcacgaaaac attgttattg caaagatgga cagtactgct 1500
aacgaagtgg aggctgtgaa agttcactcc ttccctacgc tgaagttctt tcctgcatct 1560
gctgacagaa ctgttatcga ctataatgga gagaggacat tggatggttt taaaaagttt 1620
cttgaatccg gaggtcaaga cggagctggt gacgacgatg atttggaaga tctggaggag 1680
gctgaggaac ctgatcttga ggaggatgac gaccagaagg cagtcaaaga tgaactgtga 1740
taagggg 1747
<210> 10
<211> 4404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: Col3A1 cDNA, 经优化的
<400> 10
atgatgtctt ttgtccaaaa gggtacttgg ttactttttg ctctgttgca cccaactgtt 60
attctcgcac aacaggaagc agtagatggt ggttgctcac atttaggtca atcttacgca 120
gatagagatg tatggaaacc tgaaccatgt caaatttgcg tgtgtgactc aggttcagtg 180
ctctgcgacg atatcatatg tgacgaccag gaattggact gtccaaaccc agagatacca 240
ttcggtgaat gttgtgctgt ttgtccacag ccaccaactg ctcctacaag acctccaaac 300
ggtcaaggtc cacaaggtcc taaaggtgat ccgggtccac ctggtattcc tggtagaaat 360
ggtgaccctg gacctcccgg ttccccaggt agcccaggat cacctgggcc tcctggaata 420
tgtgaatcct gcccaactgg tggtcagaac tatagcccac aatacgaggc ctacgacgtc 480
aaatctggtg ttgctggagg aggtattgca ggctaccctg gtcccgcagg gcccccaggt 540
ccgccgggtc cgcccggaac atcaggtcat cccggagccc ctggtgcacc aggttatcag 600
ggaccgcccg gagagcctgg acaagctggt cccgctggac cccctggtcc accaggtgct 660
attggaccaa gtggtcctgc cggaaaagac ggtgaatccg gtagacctgg tagacccggc 720
gaaaggggtt tcccaggtcc tcccggaatg aagggtccag ccggtatgcc cggttttcct 780
gggatgaagg gtcacagagg atttgatggt agaaacggag agaaaggcga aaccggtgct 840
cccggactga agggtgaaaa cggtgtccct ggtgagaacg gcgctcctgg acctatgggt 900
ccacgtggtg ctccaggaga aagaggcaga ccaggattgc ctggtgcagc tggtgctaga 960
ggtaacgatg gtgcccgtgg ttccgatgga caacccgggc cacccggccc tccaggtacc 1020
gctggatttc ctggaagccc tggtgctaag ggggaggttg gtccggctgg tagtcccgga 1080
agtagcggtg ccccaggtca aagaggcgaa ccaggccctc agggtcacgc aggagcacct 1140
ggaccgcctg gtcctcctgg ttcgaatggt tcgcctggag gaaaaggtga aatggggccc 1200
gcaggaatcc ccggtgcgcc tggtcttatt ggtgccaggg gtcctccagg cccgccaggt 1260
acaaatggtg tacccggaca gcgaggagca gctggtgaac ctggtaaaaa cggtgccaaa 1320
ggagatccag gtcctcgtgg agagcgtggt gaagctggct ctcccggtat cgccggtcca 1380
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ggtgaaaaag ggccccctgg tgatagggga ggacccggtc cagcaggccc tcgtggagtt 1560
gctggtgagc ctggacgtga cggtttacca ggagggccag gtttgagggg tattcccggg 1620
tcccctggcg gtcctggatc ggatggaaaa ccagggccac caggttcgca gggtgaaaca 1680
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<223> 合成的肽: 胶原蛋白α-1(I)链前体（黄牛）, NCBI参考序列 NP_001029211.1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽: 胶原蛋白α-2(I)链前体（黄牛）, NCBI参考序列: NP_776945.1
<400> 12
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<211> 1466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽: 胶原蛋白α-1(III) 链前体（黄牛）, NCBI参考序列: NP_001070299.1
<400> 13
Met Met Ser Phe Val Gln Lys Gly Thr Trp Leu Leu Phe Ala Leu Leu
1 5 10 15
His Pro Thr Val Ile Leu Ala Gln Gln Glu Ala Val Asp Gly Gly Cys
20 25 30
Ser His Leu Gly Gln Ser Tyr Ala Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu
35 40 45
Pro Cys Gln Ile Cys Val Cys Asp Ser Gly Ser Val Leu Cys Asp Asp
50 55 60
Ile Ile Cys Asp Asp Gln Glu Leu Asp Cys Pro Asn Pro Glu Ile Pro
65 70 75 80
Phe Gly Glu Cys Cys Ala Val Cys Pro Gln Pro Pro Thr Ala Pro Thr
85 90 95
Arg Pro Pro Asn Gly Gln Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly
100 105 110
Pro Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asn Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Ser
115 120 125
Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Ile Cys Glu Ser Cys
130 135 140
Pro Thr Gly Gly Gln Asn Tyr Ser Pro Gln Tyr Glu Ala Tyr Asp Val
145 150 155 160
Lys Ser Gly Val Ala Gly Gly Gly Ile Ala Gly Tyr Pro Gly Pro Ala
165 170 175
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr Ser Gly His Pro Gly
180 185 190
Ala Pro Gly Ala Pro Gly Tyr Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Gln
195 200 205
Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Ile Gly Pro Ser
210 215 220
Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Arg Pro Gly
225 230 235 240
Glu Arg Gly Phe Pro Gly Pro Pro Gly Met Lys Gly Pro Ala Gly Met
245 250 255
Pro Gly Phe Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Asp Gly Arg Asn
260 265 270
Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly Ala Pro Gly Leu Lys Gly Glu Asn Gly
275 280 285
Val Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Ala
290 295 300
Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Leu Pro Gly Ala Ala Gly Ala Arg
305 310 315 320
Gly Asn Asp Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly
325 330 335
Pro Pro Gly Thr Ala Gly Phe Pro Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Glu
340 345 350
Val Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg
355 360 365
Gly Glu Pro Gly Pro Gln Gly His Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly
370 375 380
Pro Pro Gly Ser Asn Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Glu Met Gly Pro
385 390 395 400
Ala Gly Ile Pro Gly Ala Pro Gly Leu Ile Gly Ala Arg Gly Pro Pro
405 410 415
Gly Pro Pro Gly Thr Asn Gly Val Pro Gly Gln Arg Gly Ala Ala Gly
420 425 430
Glu Pro Gly Lys Asn Gly Ala Lys Gly Asp Pro Gly Pro Arg Gly Glu
435 440 445
Arg Gly Glu Ala Gly Ser Pro Gly Ile Ala Gly Pro Lys Gly Glu Asp
450 455 460
Gly Lys Asp Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly
465 470 475 480
Ala Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Ala
485 490 495
Asn Gly Leu Pro Gly Glu Lys Gly Pro Pro Gly Asp Arg Gly Gly Pro
500 505 510
Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Val Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly
515 520 525
Leu Pro Gly Gly Pro Gly Leu Arg Gly Ile Pro Gly Ser Pro Gly Gly
530 535 540
Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gln Gly Glu Thr
545 550 555 560
Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Pro Arg Gly Gln Pro Gly
565 570 575
Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Asn Asp Gly Ala Pro Gly Lys
580 585 590
Asn Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ala
595 600 605
Gly Lys Asn Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly
610 615 620
Pro Ser Gly Asp Lys Gly Asp Thr Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu
625 630 635 640
Gln Gly Leu Pro Gly Thr Ser Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Lys Pro
645 650 655
Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Ile Pro Gly
660 665 670
Gly Lys Gly Asp Ser Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Ala
675 680 685
Gly Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Gly Ala Gly Pro Pro Gly Pro Glu
690 695 700
Gly Gly Lys Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly
705 710 715 720
Thr Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly
725 730 735
Pro Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Ser Ser Gly Val Asp
740 745 750
Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Pro Arg Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly
755 760 765
Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Ala
770 775 780
Pro Gly Val Pro Gly Ile Ala Gly Pro Arg Gly Gly Pro Gly Glu Arg
785 790 795 800
Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly
805 810 815
Gln Asn Gly Glu Pro Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu
820 825 830
Lys Gly Glu Gly Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Gly Ser
835 840 845
Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu Arg Gly
850 855 860
Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ala Ala Gly Phe Pro Gly Gly Arg Gly Pro
865 870 875 880
Pro Gly Pro Pro Gly Ser Asn Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ser
885 890 895
Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Asn Gly
900 905 910
Ala Pro Gly Ser Pro Gly Ile Ser Gly Pro Lys Gly Asp Ser Gly Pro
915 920 925
Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ala Pro
930 935 940
Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Leu Thr Gly Ala Arg Gly Leu Ala Gly
945 950 955 960
Pro Pro Gly Met Pro Gly Ala Arg Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Ile
965 970 975
Lys Gly Glu Asn Gly Lys Pro Gly Pro Ser Gly Gln Asn Gly Glu Arg
980 985 990
Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly Thr Ala Gly
995 1000 1005
Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp Gly Leu Pro Gly
1010 1015 1020
Arg Asp Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Asn Gly
1025 1030 1035
Ser Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly
1040 1045 1050
Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly
1055 1060 1065
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly
1070 1075 1080
Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly
1085 1090 1095
Glu Arg Gly Ala Met Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Pro Gly
1100 1105 1110
Asn Pro Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly His Gln Gly
1115 1120 1125
Ala Val Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Val Gly
1130 1135 1140
Pro Ser Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Ala Ser Gly His Pro Gly
1145 1150 1155
Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asn Arg Gly Glu Arg Gly
1160 1165 1170
Ser Glu Gly Ser Pro Gly His Pro Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly
1175 1180 1185
Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Cys Cys Gly Ala Gly Gly Val Ala
1190 1195 1200
Ala Ile Ala Gly Val Gly Ala Glu Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro
1205 1210 1215
Tyr Tyr Gly Asp Glu Pro Ile Asp Phe Lys Ile Asn Thr Asp Glu
1220 1225 1230
Ile Met Thr Ser Leu Lys Ser Val Asn Gly Gln Ile Glu Ser Leu
1235 1240 1245
Ile Ser Pro Asp Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Asn Cys Arg
1250 1255 1260
Asp Leu Lys Phe Cys His Pro Glu Leu Gln Ser Gly Glu Tyr Trp
1265 1270 1275
Val Asp Pro Asn Gln Gly Cys Lys Leu Asp Ala Ile Lys Val Tyr
1280 1285 1290
Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys Ile Ser Ala Ser Pro Leu
1295 1300 1305
Thr Ile Pro Gln Lys Asn Trp Trp Thr Asp Ser Gly Ala Glu Lys
1310 1315 1320
Lys His Val Trp Phe Gly Glu Ser Met Glu Gly Gly Phe Gln Phe
1325 1330 1335
Ser Tyr Gly Asn Pro Glu Leu Pro Glu Asp Val Leu Asp Val Gln
1340 1345 1350
Leu Ala Phe Leu Arg Leu Leu Ser Ser Arg Ala Ser Gln Asn Ile
1355 1360 1365
Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp His Ala Ser
1370 1375 1380
Gly Asn Val Lys Lys Ala Leu Lys Leu Met Gly Ser Asn Glu Gly
1385 1390 1395
Glu Phe Lys Ala Glu Gly Asn Ser Lys Phe Thr Tyr Thr Val Leu
1400 1405 1410
Glu Asp Gly Cys Thr Lys His Thr Gly Glu Trp Gly Lys Thr Val
1415 1420 1425
Phe Gln Tyr Gln Thr Arg Lys Ala Val Arg Leu Pro Ile Val Asp
1430 1435 1440
Ile Ala Pro Tyr Asp Ile Gly Gly Pro Asp Gln Glu Phe Gly Ala
1445 1450 1455
Asp Ile Gly Pro Val Cys Phe Leu
1460 1465
<210> 14
<211> 403
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽: 双功能精氨酸脱甲基酶和赖氨酰-羟化酶JMJD6（黄牛）, NCBI参考序列: NP_001029492.2
<400> 14
Met Asn His Lys Ser Lys Lys Arg Ile Arg Glu Ala Lys Arg Ser Ala
1 5 10 15
Arg Pro Glu Leu Lys Asp Ser Leu Asp Trp Thr Arg His Asn Tyr Phe
20 25 30
Glu Ser Phe Pro Leu Asn Pro Ala Ala Val Ala Asp Asn Val Glu Arg
35 40 45
Ala Asp Ala Leu Gln Leu Ser Val Glu Glu Phe Val Glu Arg Tyr Glu
50 55 60
Arg Pro Tyr Lys Pro Val Val Leu Leu Asn Ala Gln Glu Gly Trp Ser
65 70 75 80
Ala Gln Glu Lys Trp Thr Leu Glu Arg Leu Lys Arg Lys Tyr Arg Asn
85 90 95
Gln Lys Phe Lys Cys Gly Glu Asp Asn Asp Gly Tyr Ser Val Lys Met
100 105 110
Lys Met Lys Tyr Tyr Ile Glu Tyr Met Glu Ser Thr Arg Asp Asp Ser
115 120 125
Pro Leu Tyr Ile Phe Asp Ser Ser Tyr Gly Glu His Pro Lys Arg Arg
130 135 140
Lys Leu Leu Glu Asp Tyr Lys Val Pro Lys Phe Phe Thr Asp Asp Leu
145 150 155 160
Phe Gln Tyr Ala Gly Glu Lys Arg Arg Pro Pro Tyr Arg Trp Phe Val
165 170 175
Met Gly Pro Pro Arg Ser Gly Thr Gly Ile His Ile Asp Pro Leu Gly
180 185 190
Thr Ser Ala Trp Asn Ala Leu Val Gln Gly His Lys Arg Trp Cys Leu
195 200 205
Phe Pro Thr Ser Thr Pro Arg Glu Leu Ile Lys Val Thr Arg Glu Glu
210 215 220
Gly Gly Asn Gln Gln Asp Glu Ala Ile Thr Trp Phe Asn Ile Ile Tyr
225 230 235 240
Pro Arg Thr Gln Leu Pro Thr Trp Pro Pro Glu Phe Lys Pro Leu Glu
245 250 255
Ile Leu Gln Lys Pro Gly Glu Thr Val Phe Val Pro Gly Gly Trp Trp
260 265 270
His Val Val Leu Asn Leu Asp Thr Thr Ile Ala Ile Thr Gln Asn Phe
275 280 285
Ala Ser Ser Thr Asn Phe Pro Val Val Trp His Lys Thr Val Arg Gly
290 295 300
Arg Pro Lys Leu Ser Arg Lys Trp Tyr Arg Ile Leu Lys Gln Glu His
305 310 315 320
Pro Glu Leu Ala Val Leu Ala Asp Ser Val Asp Leu Gln Glu Ser Thr
325 330 335
Gly Ile Ala Ser Asp Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
340 345 350
Ser Ser Ser Asp Ser Asp Ser Glu Cys Glu Ser Gly Ser Glu Gly Glu
355 360 365
Gly Thr Met His Arg Arg Lys Lys Arg Arg Thr Cys Gly Met Val Gly
370 375 380
Asn Gly Asp Thr Thr Ser Gln Asp Asp Cys Val Ser Lys Glu Arg Ser
385 390 395 400
Ser Ser Arg
<210> 15
<211> 1605
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: 牛P4HA cDNA, 天然的
<400> 15
atgatctggt atattttagt tgtagggatt ctacttcccc agtctttggc ccatccaggc 60
ttttttactt ctattggtca gatgactgat ttgattcata ctgaaaaaga tctggtgact 120
tccctgaaag actatataaa ggcagaagag gacaaattag aacaaataaa aaaatgggca 180
gagaaattag atcgattaac cagcacagcg acaaaagatc cagaaggatt tgttggacac 240
cctgtaaatg cattcaaatt aatgaaacgt ctgaacactg agtggagtga gttggagaat 300
ctggtcctta aggatatgtc agatggtttt atctctaacc taaccattca gagacagtac 360
ttccctaatg atgaagatca ggttggggca gccaaagctc tgttgcgtct acaggacacc 420
tacaatttgg atacagatac catctcaaag ggtgatcttc caggagtaaa acacaaatct 480
tttctaacag ttgaggactg ttttgagttg ggcaaagtgg cctacacaga agcagattat 540
taccatacag agctgtggat ggaacaagca ctgaggcagc tggatgaagg cgaggtttct 600
accgttgata aagtctctgt tctggattat ttgagctatg cagtatacca gcagggagac 660
ctggataagg cgcttttgct cacaaagaag cttcttgaac tagatcctga acatcagaga 720
gctaacggta acttaaaata ctttgagtat ataatggcta aagaaaaaga tgccaataag 780
tcttcttcag atgaccaatc tgatcagaaa accacactga agaagaaagg tgctgctgtg 840
gattacctgc cagagagaca gaagtacgaa atgctgtgcc gtggggaggg tatcaaaatg 900
actcctcgga gacagaaaaa actcttctgt cgctaccatg atggaaaccg gaatcctaaa 960
tttatcctgg ctccagccaa acaggaggat gagtgggaca agcctcgtat tatccgcttc 1020
catgatatta tttctgatgc agaaattgaa gtcgttaaag atctagcaaa accaaggctg 1080
aggcgagcca ccatttcaaa cccaataaca ggagacttgg agacggtaca ttacagaatt 1140
agcaaaagtg cctggctgtc tggctatgaa aaccctgtgg tgtcacgaat taatatgaga 1200
atccaagatc tgacaggact agatgtctcc acagcagagg aattacaggt agcaaattat 1260
ggagttggag gacagtatga accccatttt gattttgcac ggaaagatga gccagatgct 1320
ttcaaagagc tggggacagg aaatagaatt gctacatggc tgttttatat gagtgatgtg 1380
ttagcaggag gagccactgt ttttcctgaa gtaggagcta gtgtttggcc caaaaaggga 1440
actgctgttt tctggtataa tctgtttgcc agtggagaag gagattatag tacacggcat 1500
gcagcctgtc cagtgctggt tggaaacaaa tgggtatcca ataaatggct ccatgaacgt 1560
ggacaggaat ttcgaagacc atgcaccttg tcagaattgg aatga 1605
<210> 16
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: 牛P4HB (PDI)序列, 天然的，具有自己的信号肽
<400> 16
atgctgcgcc gcgctctgct ctgcctggcc ctgaccgcgc tattccgcgc gggtgccggc 60
gcccccgacg aggaggacca cgtcctggtg ctccataagg gcaacttcga cgaggcgctg 120
gcggcccaca agtacctgct ggtggagttc tacgccccat ggtgcggcca ctgcaaggct 180
ctggccccgg agtatgccaa agcagctggg aagctgaagg cagaaggttc tgagatcaga 240
ctggccaagg tggatgccac tgaagagtct gacctggccc agcagtatgg tgtccgaggc 300
taccccacca tcaagttctt caagaatgga gacacagctt cccccaaaga gtacacagct 360
ggccgagaag cggatgatat cgtgaactgg ctgaagaagc gcacgggccc cgctgccagc 420
acgctgtccg acggggctgc tgcagaggcc ttggtggagt ccagtgaggt ggccgtcatt 480
ggcttcttca aggacatgga gtcggactcc gcaaagcagt tcttgttggc agcagaggcc 540
attgatgaca tccccttcgg gatcacatct aacagcgatg tgttctccaa ataccagctg 600
gacaaggatg gggttgtcct ctttaagaag tttgacgaag gccggaacaa ctttgagggg 660
gaggtcacca aagaaaagct tctggacttc atcaagcaca accagttgcc cctggtcatt 720
gagttcaccg agcagacagc cccgaagatc ttcggagggg aaatcaagac tcacatcctg 780
ctgttcctgc cgaaaagcgt gtctgactat gagggcaagc tgagcaactt caaaaaagcg 840
gctgagagct tcaagggcaa gatcctgttt atcttcatcg acagcgacca cactgacaac 900
cagcgcatcc tggaattctt cggcctaaag aaagaggagt gcccggccgt gcgcctcatc 960
acgctggagg aggagatgac caaatataag ccagagtcag atgagctgac ggcagagaag 1020
atcaccgagt tctgccaccg cttcctggag ggcaagatta agccccacct gatgagccag 1080
gagctgcctg acgactggga caagcagcct gtcaaagtgc tggttgggaa gaactttgaa 1140
gaggttgctt ttgatgagaa aaagaacgtc tttgtagagt tctatgcccc gtggtgcggt 1200
cactgcaagc agctggcccc catctgggat aagctgggag agacgtacaa ggaccacgag 1260
aacatagtca tcgccaagat ggactccacg gccaacgagg tggaggcggt gaaagtgcac 1320
agcttcccca cgctcaagtt cttccccgcc agcgccgaca ggacggtcat cgactacaat 1380
ggggagcgga cactggatgg ttttaagaag ttcctggaga gtggtggcca ggatggggcc 1440
ggagatgatg acgatctaga agatcttgaa gaagcagaag agcctgatct ggaggaagat 1500
gatgatcaaa aagctgtgaa agatgaactg taa 1533
<210> 17
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: L-古洛糖酸, 1,4-内酯氧化酶
<400> 17
atggtgcacg gctacaaggg cgtccagttt caaaactggg ctaagacgta tggatgttcc 60
ccagaggttt attaccagcc tacgtcagtc gaagaggtga gagaagtact ggcattggca 120
agggaacaaa agaaaaaagt gaaggtcgtg ggtggcggac atagtccatc cgacattgca 180
tgcactgacg gatttatgat ccatatggga aagatgaata gagtcttgca agtagataaa 240
gaaaaaaagc agattaccgt tgaagctggt atcctgctgg ctgatctgca tccccagctg 300
gatgaacatg gtcttgctat gtctaatcta ggcgccgtat ccgacgttac agttgctggt 360
gtgattggta gtggcaccca caacacggga ataaaacacg gaatactagc cacccaagta 420
gttgctctta ccttaatgac ggccgatggt gaagtcctgg agtgtagtga gtctagaaac 480
gccgacgtct ttcaagctgc ccgtgtgcat cttggttgct tgggcatcat cctaacagtc 540
acccttcaat gcgtccctca gtttcatcta caagaaactt ccttcccaag taccttaaag 600
gaggtcctag ataatttgga ttcacacctg aagagatcag agtatttcag gttcctgtgg 660
tttccacata cagagaacgt ttccatcatc tatcaagacc atacaaataa agcaccctcc 720
agtgcttcta actggttttg ggattatgca atcggttttt atctacttga atttttactg 780
tggacttcta cctacctacc ttgtttggtg ggttggataa accgtttctt tttttggatg 840
cttttcaatt gcaagaaaga gagttccaac ctatcccaca agatcttcac ttatgaatgc 900
cgttttaagc aacacgtgca agattgggca atcccaagag aaaagaccaa ggaggctctt 960
ttggagctaa aagcaatgct tgaggcacac cccaaggtag tggcccacta ccctgtagag 1020
gtcaggttca ccaggggcga tgatatattg ctgtcacctt gcttccagcg tgattcctgc 1080
tacatgaaca tcattatgta caggccctac ggcaaagacg tgccaagact agattactgg 1140
cttgcttacg agacgattat gaagaaattt ggaggtagac cccattgggc caaggctcac 1200
aactgtactc agaaggattt cgaggaaatg tatccaacct tccataaatt ttgcgacata 1260
agggaaaaac ttgaccctac aggcatgttc ctaaattctt accttgaaaa ggtcttttat 1320
taa 1323
<210> 18
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: GDP-甘露糖-3,5-差向异构酶，经优化用于毕赤酵母属的密码子
<400> 18
atgggcacca ccaatggtac agattatggc gcatatactt acaaggaatt ggaaagagag 60
cagtactggc cctctgagaa tctgaagatt tccataactg gtgcaggcgg atttatagca 120
tcccatattg caaggagatt aaaacacgag ggacactatg taatagcatc tgactggaaa 180
aagaacgagc acatgactga ggacatgttt tgcgacgaat ttcatcttgt tgacttaagg 240
gtcatggaaa attgccttaa agttactgag ggcgtagacc acgtctttaa ccttgccgcc 300
gacatgggcg gtatgggatt catccagtcc aatcattccg tgatcatgta caacaatacg 360
atgatcagtt tcaacatgat tgaagctgct agaatcaatg gaatcaagag attcttttac 420
gcatcttcag catgtatcta tccagaattt aagcaacttg aaaccactaa tgttagtctt 480
aaggaatccg acgcttggcc cgcagaacct caagatgcat atggtttgga gaaactggca 540
accgaagagc tatgcaaaca ttacaacaag gactttggta tcgagtgcag gattggcaga 600
ttccacaaca tatacggccc tttcggaact tggaaaggtg gcagagaaaa ggcccctgct 660
gctttctgta ggaaagcaca aacctccaca gataggtttg agatgtgggg cgatggccta 720
cagacaaggt cttttacttt cattgacgaa tgtgtcgaag gagttttgcg tttaactaag 780
agtgatttta gggagcctgt caatatagga tccgatgaga tggtgtccat gaacgagatg 840
gcagagatgg ttttatcttt tgaggagaaa aagctgccca tccatcatat tcccggtccc 900
gagggtgtca gaggcagaaa tagtgataat aacctaatca aggaaaaact tggttgggca 960
ccaaatatga gattgaaaga aggccttaga attacttact tctggataaa agaacaaatt 1020
gaaaaggaaa aggccaaggg tagtgatgtt agtctatacg gatcatctaa ggtcgttgga 1080
acgcaggccc cagtccaact gggaagtctt agagcagctg atggaaaaga ataa 1134
<210> 19
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: GDP-L-半乳糖磷酸化酶
<400> 19
atgctgaaga tcaagagggt ccctactgtg gtgtcaaact accaaaaaga tgacggcgcc 60
gaagatcctg tcggatgtgg tagaaactgt cttggcgcat gttgcctgaa tggagcccgt 120
ctacctttat atgcctgtaa aaatttggta aaatcaggag aaaaattagt cattagtcac 180
gaggctatcg agccacccgt agcttttctt gagtcattgg ttctgggcga gtgggaggat 240
aggtttcaga gaggactgtt ccgttacgac gtcacggcat gcgagacaaa agtgataccc 300
ggaaaatatg gattcgttgc ccaactgaac gaaggcagac atctaaagaa gcgtccaacc 360
gaatttaggg tggataaagt attacaatct tttgatggct ctaaatttaa ttttactaaa 420
gttggacagg aagaactgct gtttcagttt gaagccggtg aagacgcaca ggtacagttt 480
tttccatgca tgccaataga tccagaaaat tcaccctctg tggtcgcaat aaatgtttcc 540
ccaatagaat atggacacgt tttacttatt cctagggtgt tggactgcct gccacaaagg 600
atcgaccaca agagtctttt gctggctgta catatggcag ctgaagctgc aaatccctac 660
ttccgtcttg gatacaattc tttgggtgcc tttgccacga tcaatcattt gcattttcaa 720
gcctactacc tggcaatgcc attcccatta gagaaagctc ctactaaaaa gattacgacc 780
accgtttcag gagtgaaaat atccgaactg ttaagttatc ccgtaagatc cctgctgttt 840
gaaggaggta gttccatgca agaattaagt gatacagtca gtgactgttg cgtgtgtcta 900
caaaataaca acataccatt taacatacta atctccgact gtggcaggca aatattttta 960
atgcctcaat gttatgccga aaaacaggcc ttaggagagg tgtcccctga agtgctagaa 1020
actcaggtga acccagccgt ttgggagatt tccggtcaca tggtccttaa aagaaaagaa 1080
gactacgaag gtgcctctga ggacaacgct tggcgtctac tagctgaggc tagtctaagt 1140
gaagaaagat tcaaggaagt tactgctcta gcattcgagg ccatcggctg ttccaatcaa 1200
gaggaagacc ttgaaggcac tatagtccac caacaaaaca gttctggaaa cgtgaaccaa 1260
aaatcaaaca gaacacacgg cggaccaatc accaatggta cggctgcaga gtgtttagtt 1320
ttacaataa 1329
<210> 20
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: 磷酸肌醇磷酸酶
<400> 20
atggccgaca atgattctct tgaccagttt ctggccgccg ccatcgacgc cgcaaaaaag 60
gcaggacaga ttattcgtaa gggattttat gaaaccaagc acgtcgagca taaaggtcag 120
gtcgatctag tgactgaaac ggataagggc tgtgaagaac tggtgttcaa tcatttaaaa 180
cagctattcc ccaatcataa gttcattggc gaagagacaa ctgctgcatt tggtgtaacg 240
gagctaactg atgagccaac ctggatcgta gatcccttag atggcaccac taatttcgta 300
catggttttc cttttgtgtg cgtatcaata ggtttaacca tcggtaaagt acctgtcgta 360
ggcgtcgttt acaatcccat tatggaagag ctttttacag gcgtccaagg aaaaggcgct 420
ttcttaaacg gaaaaaggat taaagtttct gcccagtcag agctattgac tgctctactt 480
gtcaccgagg caggtacaaa acgtgataaa gctactctgg atgatacaac caatcgtata 540
aactccctat tgactaaagt aaggagtctt cgtatgtcag gtagttgtgc cttagatttg 600
tgtggcgtag cctgcggaag ggtcgacatc ttctacgagt tgggtttcgg aggaccctgg 660
gacattgccg ccggaatagt gatcgtcaag gaagctggag gactaatctt cgatcctagt 720
ggtaaggatc tggacataac gtcacaaagg atcgcagcca gtaacgcatc cttaaaagag 780
ctatttgcag aagctctgag attgactgga gcctaa 816
<210> 21
<211> 2746
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: 来自拟南芥的GDP-L-Gal磷酸化酶
<400> 21
ctggttcact catctcctat ctatttaaag cccattcgat atcctaaaac actgtatcat 60
caaaaaacac ctcaaagaat tattcattca ggcatcttct caaatttttg tttgtgaaaa 120
aaacccacat caaaagatct ctcatttatt cgtttcgttt ctgctgtttt gagtgtcggg 180
ttcgttttag ctgtaatctt tttttccggc gttcgatttg aaaaaatccg gggaacaggt 240
gatcggaatc acggctatac acgggatatc acggggtgtt agctcacatg tccatattgt 300
ccgacagaag ggttgtttaa tcgaaactaa tcctttgccg cacggaggac gtggagctct 360
gccgtctgaa ggcggcagcc cttccgatct cctctttctc gccggtggcg gttccagctt 420
taacttcttt tcctttaggt tttaggagtt agggtttgtt agtgtttttt ccttcttctt 480
tttttggtgc tcttgaatcg cttttttctt gggggaagtt ttttcttttg ctcttcgaaa 540
tttgtctttt ttgagaatgt tgaaaatcaa aagagttccg accgttgttt cgaactacca 600
gaaggacgat ggagcggagg atcccgtcgg ctgtggacgg aattgcctcg gcgcttgttg 660
ccttaacggt acgttttgga aacctgaatc gtctttttta atcatgttta aattttatca 720
cttttttttt attcacctta tgatgtgttt gttcaggggc taggcttcca ttgtatgcat 780
gtaagaatct ggtaaaatcc ggagagaagc ttgtaatcag tcatgaggct atagagcctc 840
ctgtagcttt tctcgagtcc cttgttctcg gagaggtaaa tcatagacca ctgattttga 900
tattctgata atggtttctg tagcttggaa gagtctaatc agtattctta tgtttagtgg 960
gaggataggt tccaaagagg actttttcgc tatgatgtca ctgcctgcga aaccaaagta 1020
attgtctttc ttaccttgtt tgacaatcta gttatgttgg gttgtttgtt gctgaggaat 1080
ccgagatatg ttttacattg ttcttaagat tgtttctctt gatgttatag gttatcccgg 1140
ggaagtatgg tttcgttgct cagcttaacg agggtcgtca cttgaagaag aggccaactg 1200
agttccgtgt agataaggtg ttgcagtctt ttgatggcag caaattcaac ttcactaaag 1260
ttggccaaga agagttgctc ttccagtttg aagctggtga agatgcccaa gttcagttct 1320
tcccttgcat gcctattgac cctgagaatt ctcccagtgt tgttgccatc aatgtaaaga 1380
ctcttgtgca gagagcttgg ttttttcttt cttcctttta ttggtttcgc tagcaaaaga 1440
ttaattcttt attgttgttt ttaacaggtt agtccgatag agtatggcca tgtgctgctg 1500
attcctcgtg ttcttgactg cttgcctcaa aggatcgatc acaaaagcct tttgcttgca 1560
gttcacatgg ctgctgaggc tgctaatcca tacttcagac tcggttacaa cagcttgggt 1620
gcttttgcca ctatcaatca tctccacttt caggtatatc caaaagtgat ccaagcataa 1680
ccttttcacc cttgctcatc taagatgttt gttctgattg ttttggtggt gattgttttt 1740
ggaaacaggc ttattacttg gccatgcctt tcccactgga gaaagctcct accaagaaga 1800
taactaccac tgttagtggt gtcaaaatct cagagcttct aagttaccct gtgagaagtc 1860
ttctctttga aggtggaagc tctatgcaag aactatctga tactgtttca gactgctgtg 1920
tttgccttca aaacaacaac attcctttca acattctcat ctctgattgt ggaaggcaga 1980
tcttcttaat gccacaggta tataactaca ccgttggatg aatacatgtt ttgaattact 2040
taatcaaaag tgaataacag tttgaatgta aaaattgcag tgttacgcag agaaacaggc 2100
tctaggtgaa gtgagcccgg aggtattgga aacacaagtg aacccagccg tgtgggagat 2160
aagtggtcac atggtactga agaggaaaga ggattacgaa ggtgcttcag aggataacgc 2220
gtggaggctc cttgcggaag cttctctgtc ggaggaaagg tttaaggagg ttactgctct 2280
cgcctttgaa gccataggtt gtagtaacca agaggaggat cttgaaggaa ccatagttca 2340
tcagcaaaac tctagtggca atgttaacca gaaaagcaac agaacccatg gaggtccgat 2400
cacaaatggg acggccgccg agtgccttgt ccttcagtga acaatatggt gacttggtgg 2460
tttgtatgta taattaaaag cctaaataag caaactctct ttgtagttgc atttgaagct 2520
tcttggttta tgtatgatgg ttgtgggcat tttgtgccta gacttctggt tctttgtttt 2580
ttgttatgag ttggtgttta tgaattatat atgttcttca ctaatatgat tattatttgt 2640
atagatttga ttattcaaag gatatgtctt aagaaggggt tcaggttcag ccaactaatt 2700
acttgtaacc aagtctttct accatcaaca accatgttaa gattca 2746
<210> 22
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽: 来自拟南芥的GDP-L-Gal磷酸化酶
<400> 22
Met Leu Lys Ile Lys Arg Val Pro Thr Val Val Ser Asn Tyr Gln Lys
1 5 10 15
Asp Asp Gly Ala Glu Asp Pro Val Gly Cys Gly Arg Asn Cys Leu Gly
20 25 30
Ala Cys Cys Leu Asn Gly Ala Arg Leu Pro Leu Tyr Ala Cys Lys Asn
35 40 45
Leu Val Lys Ser Gly Glu Lys Leu Val Ile Ser His Glu Ala Ile Glu
50 55 60
Pro Pro Val Ala Phe Leu Glu Ser Leu Val Leu Gly Glu Trp Glu Asp
65 70 75 80
Arg Phe Gln Arg Gly Leu Phe Arg Tyr Asp Val Thr Ala Cys Glu Thr
85 90 95
Lys Val Ile Pro Gly Lys Tyr Gly Phe Val Ala Gln Leu Asn Glu Gly
100 105 110
Arg His Leu Lys Lys Arg Pro Thr Glu Phe Arg Val Asp Lys Val Leu
115 120 125
Gln Ser Phe Asp Gly Ser Lys Phe Asn Phe Thr Lys Val Gly Gln Glu
130 135 140
Glu Leu Leu Phe Gln Phe Glu Ala Gly Glu Asp Ala Gln Val Gln Phe
145 150 155 160
Phe Pro Cys Met Pro Ile Asp Pro Glu Asn Ser Pro Ser Val Val Ala
165 170 175
Ile Asn Val Ser Pro Ile Glu Tyr Gly His Val Leu Leu Ile Pro Arg
180 185 190
Val Leu Asp Cys Leu Pro Gln Arg Ile Asp His Lys Ser Leu Leu Leu
195 200 205
Ala Val His Met Ala Ala Glu Ala Ala Asn Pro Tyr Phe Arg Leu Gly
210 215 220
Tyr Asn Ser Leu Gly Ala Phe Ala Thr Ile Asn His Leu His Phe Gln
225 230 235 240
Ala Tyr Tyr Leu Ala Met Pro Phe Pro Leu Glu Lys Ala Pro Thr Lys
245 250 255
Lys Ile Thr Thr Thr Val Ser Gly Val Lys Ile Ser Glu Leu Leu Ser
260 265 270
Tyr Pro Val Arg Ser Leu Leu Phe Glu Gly Gly Ser Ser Met Gln Glu
275 280 285
Leu Ser Asp Thr Val Ser Asp Cys Cys Val Cys Leu Gln Asn Asn Asn
290 295 300
Ile Pro Phe Asn Ile Leu Ile Ser Asp Cys Gly Arg Gln Ile Phe Leu
305 310 315 320
Met Pro Gln Cys Tyr Ala Glu Lys Gln Ala Leu Gly Glu Val Ser Pro
325 330 335
Glu Val Leu Glu Thr Gln Val Asn Pro Ala Val Trp Glu Ile Ser Gly
340 345 350
His Met Val Leu Lys Arg Lys Glu Asp Tyr Glu Gly Ala Ser Glu Asp
355 360 365
Asn Ala Trp Arg Leu Leu Ala Glu Ala Ser Leu Ser Glu Glu Arg Phe
370 375 380
Lys Glu Val Thr Ala Leu Ala Phe Glu Ala Ile Gly Cys Ser Asn Gln
385 390 395 400
Glu Glu Asp Leu Glu Gly Thr Ile Val His Gln Gln Asn Ser Ser Gly
405 410 415
Asn Val Asn Gln Lys Ser Asn Arg Thr His Gly Gly Pro Ile Thr Asn
420 425 430
Gly Thr Ala Ala Glu Cys Leu Val Leu Gln
435 440
<210> 23
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核苷酸: 磷酸肌醇磷酸酶
<400> 23
gcctaaccac aaaaaccgta acttttggtt ttctctgaaa cacatcccaa agtaaagaaa 60
gcatcactct tttcgtcttc tctcgaaaat ggcggacaat gattctctag atcagttttt 120
ggctgccgcc attgatgccg ctaaaaaagc tggacagatc attcgtaaag ggttttacga 180
gactaaacat gttgaacaca aaggccaggt ggatttggtg acagagactg ataaaggatg 240
tgaagaactt gtgtttaatc atctcaagca gctctttccc aatcacaagt tcataggaga 300
agaaactaca gctgcatttg gtgtgacaga actaactgac gaaccaactt ggattgttga 360
tcctcttgat ggaacaacca atttcgttca cgggttccct ttcgtgtgtg tttccattgg 420
acttacgatt ggaaaagtcc ctgttgttgg agttgtttat aatcctatta tggaagagct 480
attcaccggt gtccaaggga aaggagcatt cttgaatgga aagcgaatca aagtgtcagc 540
tcaaagcgaa cttttaaccg ctttgctcgt gacagaggcg ggtactaaac gagataaagc 600
tacattagac gatacaacca acagaatcaa cagtttgcta accaaggtca ggtcccttag 660
gatgagtggt tcgtgtgcac tggacctctg tggcgttgcg tgtggaaggg ttgatatctt 720
ctacgagctc ggtttcggtg gtccatggga cattgcagca ggaattgtta tcgtgaaaga 780
agctggtgga ctcatctttg atccatccgg taaagatttg gacataacat cgcagaggat 840
cgcggcttca aacgcttctc tcaaggagtt attcgctgag gcgttgcggc ttacaggggc 900
atgaagtcat ctgttattat tttacaatat ggtctcaacc ttatatgatc aaactcaatt 960
caaaaactta acattattga atatttcttt tcggtagaaa 1000
<210> 24
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽: 磷酸肌醇磷酸酶
<400> 24
Met Ala Asp Asn Asp Ser Leu Asp Gln Phe Leu Ala Ala Ala Ile Asp
1 5 10 15
Ala Ala Lys Lys Ala Gly Gln Ile Ile Arg Lys Gly Phe Tyr Glu Thr
20 25 30
Lys His Val Glu His Lys Gly Gln Val Asp Leu Val Thr Glu Thr Asp
35 40 45
Lys Gly Cys Glu Glu Leu Val Phe Asn His Leu Lys Gln Leu Phe Pro
50 55 60
Asn His Lys Phe Ile Gly Glu Glu Thr Thr Ala Ala Phe Gly Val Thr
65 70 75 80
Glu Leu Thr Asp Glu Pro Thr Trp Ile Val Asp Pro Leu Asp Gly Thr
85 90 95
Thr Asn Phe Val His Gly Phe Pro Phe Val Cys Val Ser Ile Gly Leu
100 105 110
Thr Ile Gly Lys Val Pro Val Val Gly Val Val Tyr Asn Pro Ile Met
115 120 125
Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Gln Gly Lys Gly Ala Phe Leu Asn Gly
130 135 140
Lys Arg Ile Lys Val Ser Ala Gln Ser Glu Leu Leu Thr Ala Leu Leu
145 150 155 160
Val Thr Glu Ala Gly Thr Lys Arg Asp Lys Ala Thr Leu Asp Asp Thr
165 170 175
Thr Asn Arg Ile Asn Ser Leu Leu Thr Lys Val Arg Ser Leu Arg Met
180 185 190
Ser Gly Ser Cys Ala Leu Asp Leu Cys Gly Val Ala Cys Gly Arg Val
195 200 205
Asp Ile Phe Tyr Glu Leu Gly Phe Gly Gly Pro Trp Asp Ile Ala Ala
210 215 220
Gly Ile Val Ile Val Lys Glu Ala Gly Gly Leu Ile Phe Asp Pro Ser
225 230 235 240
Gly Lys Asp Leu Asp Ile Thr Ser Gln Arg Ile Ala Ala Ser Asn Ala
245 250 255
Ser Leu Lys Glu Leu Phe Ala Glu Ala Leu Arg Leu Thr Gly Ala
260 265 270
<210> 25
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽: GDP-甘露糖-3,5-差向异构酶
<400> 25
Met Gly Thr Thr Asn Gly Thr Asp Tyr Gly Ala Tyr Thr Tyr Lys Glu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Glu Gln Tyr Trp Pro Ser Glu Asn Leu Lys Ile Ser Ile
20 25 30
Thr Gly Ala Gly Gly Phe Ile Ala Ser His Ile Ala Arg Arg Leu Lys
35 40 45
His Glu Gly His Tyr Val Ile Ala Ser Asp Trp Lys Lys Asn Glu His
50 55 60
Met Thr Glu Asp Met Phe Cys Asp Glu Phe His Leu Val Asp Leu Arg
65 70 75 80
Val Met Glu Asn Cys Leu Lys Val Thr Glu Gly Val Asp His Val Phe
85 90 95
Asn Leu Ala Ala Asp Met Gly Gly Met Gly Phe Ile Gln Ser Asn His
100 105 110
Ser Val Ile Met Tyr Asn Asn Thr Met Ile Ser Phe Asn Met Ile Glu
115 120 125
Ala Ala Arg Ile Asn Gly Ile Lys Arg Phe Phe Tyr Ala Ser Ser Ala
130 135 140
Cys Ile Tyr Pro Glu Phe Lys Gln Leu Glu Thr Thr Asn Val Ser Leu
145 150 155 160
Lys Glu Ser Asp Ala Trp Pro Ala Glu Pro Gln Asp Ala Tyr Gly Leu
165 170 175
Glu Lys Leu Ala Thr Glu Glu Leu Cys Lys His Tyr Asn Lys Asp Phe
180 185 190
Gly Ile Glu Cys Arg Ile Gly Arg Phe His Asn Ile Tyr Gly Pro Phe
195 200 205
Gly Thr Trp Lys Gly Gly Arg Glu Lys Ala Pro Ala Ala Phe Cys Arg
210 215 220
Lys Ala Gln Thr Ser Thr Asp Arg Phe Glu Met Trp Gly Asp Gly Leu
225 230 235 240
Gln Thr Arg Ser Phe Thr Phe Ile Asp Glu Cys Val Glu Gly Val Leu
245 250 255
Arg Leu Thr Lys Ser Asp Phe Arg Glu Pro Val Asn Ile Gly Ser Asp
260 265 270
Glu Met Val Ser Met Asn Glu Met Ala Glu Met Val Leu Ser Phe Glu
275 280 285
Glu Lys Lys Leu Pro Ile His His Ile Pro Gly Pro Glu Gly Val Arg
290 295 300
Gly Arg Asn Ser Asp Asn Asn Leu Ile Lys Glu Lys Leu Gly Trp Ala
305 310 315 320
Pro Asn Met Arg Leu Lys Glu Gly Leu Arg Ile Thr Tyr Phe Trp Ile
325 330 335
Lys Glu Gln Ile Glu Lys Glu Lys Ala Lys Gly Ser Asp Val Ser Leu
340 345 350
Tyr Gly Ser Ser Lys Val Val Gly Thr Gln Ala Pro Val Gln Leu Gly
355 360 365
Ser Leu Arg Ala Ala Asp Gly Lys Glu
370 375
<210> 26
<211> 610
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽: L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶
<400> 26
Met Leu Arg Ser Leu Leu Leu Arg Arg Ser Val Gly His Ser Leu Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ile Arg Ser Ser Phe Ser Pro His
20 25 30
Arg Thr Leu Cys Thr Thr Gly Gln Thr Leu Thr Pro Pro Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Ala Ser Glu Ala Gln
50 55 60
Phe Arg Lys Tyr Ala Gly Tyr Ala Ala Leu Ala Ile Phe Ser Gly Val
65 70 75 80
Ala Thr Tyr Phe Ser Phe Pro Phe Pro Glu Asn Ala Lys His Lys Lys
85 90 95
Ala Gln Ile Phe Arg Tyr Ala Pro Leu Pro Glu Asp Leu His Thr Val
100 105 110
Ser Asn Trp Ser Gly Thr His Glu Val Gln Thr Arg Asn Phe Asn Gln
115 120 125
Pro Glu Asn Leu Ala Asp Leu Glu Ala Leu Val Lys Glu Ser His Glu
130 135 140
Lys Lys Leu Arg Ile Arg Pro Val Gly Ser Gly Leu Ser Pro Asn Gly
145 150 155 160
Ile Gly Leu Ser Arg Ser Gly Met Val Asn Leu Ala Leu Met Asp Lys
165 170 175
Val Leu Glu Val Asp Lys Glu Lys Lys Arg Val Thr Val Gln Ala Gly
180 185 190
Ile Arg Val Gln Gln Leu Val Asp Ala Ile Lys Asp Tyr Gly Leu Thr
195 200 205
Leu Gln Asn Phe Ala Ser Ile Arg Glu Gln Gln Ile Gly Gly Ile Ile
210 215 220
Gln Val Gly Ala His Gly Thr Gly Ala Arg Leu Pro Pro Ile Asp Glu
225 230 235 240
Gln Val Ile Ser Met Lys Leu Val Thr Pro Ala Lys Gly Thr Ile Glu
245 250 255
Leu Ser Arg Glu Lys Asp Pro Glu Leu Phe His Leu Ala Arg Cys Gly
260 265 270
Leu Gly Gly Leu Gly Val Val Ala Glu Val Thr Leu Gln Cys Val Ala
275 280 285
Arg His Glu Leu Val Glu His Thr Tyr Val Ser Asn Leu Gln Glu Ile
290 295 300
Lys Lys Asn His Lys Lys Leu Leu Ser Ala Asn Lys His Val Lys Tyr
305 310 315 320
Leu Tyr Ile Pro Tyr Thr Asp Thr Val Val Val Val Thr Cys Asn Pro
325 330 335
Val Ser Lys Trp Ser Gly Pro Pro Lys Asp Lys Pro Lys Tyr Thr Thr
340 345 350
Asp Glu Ala Val Gln His Val Arg Asp Leu Tyr Arg Glu Ser Ile Val
355 360 365
Lys Tyr Arg Val Gln Asp Ser Gly Lys Lys Ser Pro Asp Ser Ser Glu
370 375 380
Pro Asp Ile Gln Glu Leu Ser Phe Thr Glu Leu Arg Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Ala Leu Asp Pro Leu Asn Asp Val His Val Ala Lys Val Asn Gln Ala
405 410 415
Glu Ala Glu Phe Trp Lys Lys Ser Glu Gly Tyr Arg Val Gly Trp Ser
420 425 430
Asp Glu Ile Leu Gly Phe Asp Cys Gly Gly Gln Gln Trp Val Ser Glu
435 440 445
Ser Cys Phe Pro Ala Gly Thr Leu Ala Asn Pro Ser Met Lys Asp Leu
450 455 460
Glu Tyr Ile Glu Glu Leu Lys Lys Leu Ile Glu Lys Glu Ala Ile Pro
465 470 475 480
Ala Pro Ala Pro Ile Glu Gln Arg Trp Thr Ala Arg Ser Lys Ser Pro
485 490 495
Ile Ser Pro Ala Phe Ser Thr Ser Glu Asp Asp Ile Phe Ser Trp Val
500 505 510
Gly Ile Ile Met Tyr Leu Pro Thr Ala Asp Pro Arg Gln Arg Lys Asp
515 520 525
Ile Thr Asp Glu Phe Phe His Tyr Arg His Leu Thr Gln Lys Gln Leu
530 535 540
Trp Asp Gln Phe Ser Ala Tyr Glu His Trp Ala Lys Ile Glu Ile Pro
545 550 555 560
Lys Asp Lys Glu Glu Leu Glu Ala Leu Gln Ala Arg Ile Arg Lys Arg
565 570 575
Phe Pro Val Asp Ala Tyr Asn Lys Ala Arg Arg Glu Leu Asp Pro Asn
580 585 590
Arg Ile Leu Ser Asn Asn Met Val Glu Lys Leu Phe Pro Val Ser Thr
595 600 605
Thr Ala
610
<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 27
Lys Ser Pro Ile Ser Pro Ala Phe Ser Thr Ser Glu Asp Asp Ile Phe
1 5 10 15
Ser Trp Val
<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 28
Trp Tyr Asn His Val Pro Pro Asp Ser Arg Pro Ser Pro Glu Lys Gly
1 5 10 15
His His Arg
<210> 29
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽: D-葡糖醛酸激酶
<400> 29
Met Asp Pro Asn Ser Thr Val Ser Gly Asp Gly Gln Ala Thr Ala Ala
1 5 10 15
Ile Glu His Arg Ser Phe Ala Arg Ile Gly Phe Leu Gly Asn Pro Ser
20 25 30
Asp Val Tyr Phe Gly Arg Thr Ile Ser Leu Thr Ile Gly Asn Phe Trp
35 40 45
Ala Ser Val Lys Leu Glu Pro Ser Glu His Leu Val Ile Lys Pro His
50 55 60
Pro Phe His Asp Leu Val Gln Phe Thr Ser Leu Asp His Leu Leu Asn
65 70 75 80
Arg Leu Gln Asn Glu Gly Tyr Tyr Gly Gly Val Arg Leu Leu Met Ala
85 90 95
Ile Cys Lys Val Phe Arg Asn Tyr Cys Lys Glu Asn Asp Ile Gln Leu
100 105 110
His Gln Ala Asn Phe Ser Leu Ser Tyr Asp Thr Asn Ile Pro Arg Gln
115 120 125
Thr Gly Leu Ser Gly Ser Ser Ala Ile Val Ser Ala Ala Leu Asn Cys
130 135 140
Leu Leu Asp Phe Tyr Asn Val Arg His Leu Ile Lys Val Gln Val Arg
145 150 155 160
Pro Asn Ile Val Leu Ser Ala Glu Lys Glu Leu Gly Ile Val Ala Gly
165 170 175
Leu Gln Asp Arg Val Ala Gln Val Tyr Gly Gly Leu Val His Met Asp
180 185 190
Phe Ser Lys Glu His Met Asp Lys Leu Gly His Gly Ile Tyr Thr Pro
195 200 205
Met Asp Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu His Leu Ile Tyr Ala Glu Asn
210 215 220
Pro Ser Asp Ser Gly Lys Val His Ser Met Val Arg Gln Arg Trp Leu
225 230 235 240
Asp Gly Asp Glu Phe Ile Ile Ser Ser Met Lys Glu Val Gly Ser Leu
245 250 255
Ala Glu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Leu Asn Lys Asp His Ser Lys Leu
260 265 270
Val Glu Leu Met Asn Leu Asn Phe Asp Ile Arg Arg Arg Met Phe Gly
275 280 285
Asp Glu Cys Leu Gly Ala Met Asn Ile Glu Met Val Glu Val Ala Arg
290 295 300
Arg Val Gly Ala Ala Ser Lys Phe Thr Gly Ser Gly Gly Ala Val Val
305 310 315 320
Val Phe Cys Pro Glu Gly Pro Ser Gln Val Lys Leu Leu Glu Glu Glu
325 330 335
Cys Arg Lys Ala Gly Phe Thr Leu Gln Pro Val Lys Ile Ala Pro Ser
340 345 350
Cys Leu Asn Asp Ser Asp Ile Gln Thr Leu
355 360
<210> 30
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽: UDP-D-葡萄糖脱氢酶
<400> 30
Met Val Lys Ile Cys Cys Ile Gly Ala Gly Tyr Val Gly Gly Pro Thr
1 5 10 15
Met Ala Val Ile Ala Leu Lys Cys Pro Asp Ile Glu Val Ala Val Val
20 25 30
Asp Ile Ser Val Pro Arg Ile Asn Ala Trp Asn Ser Asp Gln Leu Pro
35 40 45
Ile Tyr Glu Pro Gly Leu Asp Asp Ile Val Lys Gln Cys Arg Gly Lys
50 55 60
Asn Leu Phe Phe Ser Thr Asp Val Glu Lys His Val Arg Glu Ala Asp
65 70 75 80
Ile Val Phe Val Ser Val Asn Thr Pro Thr Lys Thr Thr Gly Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Lys Ala Ala Asp Leu Thr Tyr Trp Glu Ser Ala Ala Arg Met
100 105 110
Ile Ala Asp Val Ser Val Ser Asp Lys Ile Val Val Glu Lys Ser Thr
115 120 125
Val Pro Val Lys Thr Ala Glu Ala Ile Glu Lys Ile Leu Met His Asn
130 135 140
Ser Lys Gly Ile Lys Phe Gln Ile Leu Ser Asn Pro Glu Phe Leu Ala
145 150 155 160
Glu Gly Thr Ala Ile Ala Asp Leu Phe Asn Pro Asp Arg Val Leu Ile
165 170 175
Gly Gly Arg Glu Thr Pro Glu Gly Phe Lys Ala Val Gln Thr Leu Lys
180 185 190
Glu Val Tyr Ala Asn Trp Val Pro Glu Gly Gln Ile Ile Thr Thr Asn
195 200 205
Leu Trp Ser Ala Glu Leu Ser Lys Leu Ala Ala Asn Ala Phe Leu Ala
210 215 220
Gln Arg Ile Ser Ser Val Asn Ala Met Ser Ala Leu Cys Glu Ser Thr
225 230 235 240
Gly Ala Asp Val Thr Gln Val Ser Tyr Ala Val Gly Thr Asp Ser Arg
245 250 255
Ile Gly Ser Lys Phe Leu Asn Ala Ser Val Gly Phe Gly Gly Ser Cys
260 265 270
Phe Gln Lys Asp Ile Leu Asn Leu Val Tyr Ile Cys Gln Cys Asn Gly
275 280 285
Leu Pro Glu Val Ala Glu Tyr Trp Lys Gln Val Ile Lys Ile Asn Asp
290 295 300
Tyr Gln Lys Asn Arg Phe Val Asn Arg Ile Val Ser Ser Met Phe Asn
305 310 315 320
Thr Val Ser Asn Lys Lys Val Ala Ile Leu Gly Phe Ala Phe Lys Lys
325 330 335
Asp Thr Gly Asp Thr Arg Glu Thr Pro Ala Ile Asp Val Cys Lys Gly
340 345 350
Leu Leu Gly Asp Lys Ala Gln Ile Ser Ile Tyr Asp Pro Gln Val Thr
355 360 365
Glu Glu Gln Ile Gln Arg Asp Leu Ser Met Lys Lys Phe Asp Trp Asp
370 375 380
His Pro Leu His Leu Gln Pro Met Ser Pro Thr Thr Val Lys Gln Val
385 390 395 400
Ser Val Thr Trp Asp Ala Tyr Glu Ala Thr Lys Asp Ala His Ala Val
405 410 415
Cys Val Leu Thr Glu Trp Asp Glu Phe Lys Ser Leu Asp Tyr Gln Lys
420 425 430
Ile Phe Asp Asn Met Gln Lys Pro Ala Phe Ile Phe Asp Gly Arg Asn
435 440 445
Ile Met Asn Val Asn Lys Leu Arg Glu Ile Gly Phe Ile Val Tyr Ser
450 455 460
Ile Gly Lys Pro Leu Asp Pro Trp Leu Lys Asp Met Pro Ala Phe Val
465 470 475 480

Claims (14)

1.一种重组酵母细胞，其包含编码α-酮戊二酸转运蛋白的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的重组酵母细胞，其中所述α-酮戊二酸转运蛋白具有与SEQ IDNO：1至少90％同一的序列。
3.根据权利要求1所述的重组酵母细胞，其中所述多核苷酸经优化用于在所述酵母细胞中表达。
4.根据权利要求1所述的重组酵母细胞，其中将所述多核苷酸重组到所述酵母细胞的基因组中，或者以附加体形式存在于重组载体中，所述重组载体包含使得能够在所述酵母细胞中产生编码序列mRNA的转录控制元件。
5.根据权利要求1所述的重组酵母细胞，其还包含至少一种编码胶原蛋白或其胶原蛋白片段的多核苷酸。
6.根据权利要求1所述的重组酵母细胞，其还包含至少一种编码脯氨酰4-羟化酶、脯氨酰3-羟化酶和赖氨酰羟化酶的多核苷酸。
7.根据权利要求1所述的重组酵母细胞，其中所述胶原蛋白或其胶原蛋白片段在至少一个羟基赖氨酰基残基处被糖基化。
8.根据权利要求1所述的重组酵母细胞，其还包含至少一种编码糖基羟化酶的多核苷酸。
9.根据权利要求1所述的重组酵母细胞，其中所述酵母细胞是巴斯德毕赤酵母。
10.一种用于产生如权利要求1所述的重组酵母细胞的方法，所述方法包括用编码α酮戊二酸转运蛋白的多核苷酸转化所述酵母细胞，所述多核苷酸可操作地连接至使得能够在所述酵母细胞中产生编码序列mRNA的一个或多个转录控制元件。
11.一种在酵母细胞中产生羟基化胶原蛋白的方法，所述方法包括在培养基中培养如权利要求1所述的重组酵母细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其还包括分离或纯化由培养中的所述重组酵母细胞产生的经修饰的重组胶原蛋白。
13.一种胶原蛋白，其通过如权利要求11所述的方法获得。
14.一种生物制造的皮革材料，其包含如权利要求13所述的胶原蛋白。
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