CN103842517A - 胶原蛋白7及相关方法 - Google Patents
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Abstract
公开了制造胶原蛋白7或其功能性片段的方法，以及通过此种方法生产的胶原蛋白7和其功能性片段、编码胶原蛋白7和其功能性片段的核酸，以及包括此种核酸的载体和宿主细胞。
Description
本发明涉及胶原蛋白7、胶原蛋白7相关核酸和细胞及相关方法。
背景
胶原蛋白是加强和支持结缔组织，例如皮肤、腱、韧带和骨骼的蛋白质家族。胶原蛋白7作为锚原纤维的主要组分，其功能在于加强和稳定各种组织，包括皮肤（Ricard-Blum,Cold Spring Harb PerspectBiol3(1):a004978(2011)）。
胶原蛋白7合成为三条前-α1（Ⅶ）多肽链，该多肽链随后在内质网中经加工和折叠成三螺旋前胶原蛋白7蛋白质。前胶原蛋白7分泌到细胞外空间中，在那里它被进一步加工为成熟胶原蛋白7（Chung etal.Dermatol Clin28(1):93-105(2010)）。成熟胶原蛋白7经过多步骤的聚合过程以形成结构性锚原纤维(Fritsch et al.J Biol Chem284(44):30248-30256(2009))。在皮肤中，发现这些锚原纤维在表皮基底膜带内，其是位于皮肤最上层、表皮和真皮底层之间的两层膜。在这里锚原纤维连接表皮基底膜至乳突真皮层。这种连接协助将皮肤的表皮和真皮层连接在一起，为皮肤提供构造和稳定性(Villone et al.J BiolChem283(36):24506-24513(2008))。
发明概述
在一个方面，公开的特征在于制造胶原蛋白7或其功能性片段的方法。该方法包括：
提供细胞，例如哺乳动物细胞，例如，CHO或HEK细胞，经基因修饰以表达胶原蛋白7或其功能性片段，和可选地，一种或多种多肽，例如，在细胞中提高胶原蛋白7产量的一种或多种多肽（例如，脯氨酸肽酶和/或脯氨酰羟化酶）；以及
在足够用于生产胶原蛋白7或其功能性片段的条件下培养所述细胞，从而制造胶原蛋白7或其功能性片段。
在一个实施方案中，胶原蛋白7是人胶原蛋白7。在一个实施方案中，胶原蛋白7由高甘氨酸密码子优化的序列所编码，例如，本文所描述的高甘氨酸密码子优化的序列。在一个实施方案中，胶原蛋白7具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。在一个实施方案中，胶原蛋白7的氨基酸序列与SEQ ID NO2至少80、90、95或99％相同。在一个实施方案中，胶原蛋白7的氨基酸序列与SEQ ID NO2的不同不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸残基。
在一个实施方案中，所述细胞经基因修饰以表达脯氨酸肽酶或其功能性片段，并且例如，所述脯氨酸肽酶可以是哺乳动物，例如人脯氨酸肽酶，或者啮齿动物，如小鼠、大鼠或仓鼠脯氨酸肽酶。在一个实施方案中，脯氨酸肽酶是：人脯氨酸肽酶，例如具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的人脯氨酸肽酶；具有与SEQ ID NO4至少80、90、95或99%相同的氨基酸序列的脯氨酸肽酶；具有与SEQ ID NO4的不同不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的氨基酸序列的脯氨酸肽酶。
在一个实施方案中，所述细胞经基因修饰以表达脯氨酰羟化酶或其功能性片段，并且例如，所述脯氨酰羟化酶可以是哺乳动物，例如人脯氨酰羟化酶，或者啮齿动物，如小鼠、大鼠或仓鼠脯氨酰羟化酶。在一个实施方案中，脯氨酰羟化酶是：人脯氨酰羟化酶，例如具有SEQID NO X的氨基酸序列的人脯氨酰羟化酶；具有与SEQ ID NO X至少80、90、95或99%相同的氨基酸序列的脯氨酰羟化酶；具有与SEQ ID NO X的不同不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的氨基酸序列的脯氨酰羟化酶。
在一个实施方案中，所述细胞经基因修饰以表达糖基转移酶或其功能性片段，例如唾液酸转移酶或其功能片段。糖基转移酶可以是哺乳动物，例如人糖基转移酶，如唾液酸转移酶，或者啮齿动物，如小鼠、大鼠或仓鼠糖基转移酶。
在一个实施方案中，糖基转移酶是唾液酸转移酶，例如具有SEQID NO5的氨基酸序列的唾液酸转移酶;具有与SEQ ID NO：5至少80、90、95或99％相同的氨基酸序列的唾液酸转移酶；具有与SEQ ID NO5的不同不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的氨基酸序列的唾液酸转移酶。
在一个实施方案中，所述经基因修饰的细胞包括编码胶原蛋白7或其功能性片段的核酸，例如高甘氨酸密码子优化的核酸序列，例如SEQ ID NO1的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO1至少80、90、95或99％相同；所述核酸序列与SEQ ID NO1的不同不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基。在一个实施方案中，至少80、90、95、或99％的密码子具有SEQ ID NO1的密码子值。
在一个实施方案中，经基因修饰的细胞包括编码脯氨酸肽酶或其功能性片段的核酸。
在一个实施方案中，经基因修饰的细胞包括编码脯氨酰羟化酶或其功能性片段的核酸。
在一个实施方案中，经基因修饰的细胞包括编码糖基转移酶或其功能性片段的核酸。
在一个实施方案中，细胞包括表达载体，所述表达载体包括编码胶原蛋白7或其功能性片段的核酸序列。在一个实施方案中，所述表达载体进一步包括编码脯氨酸肽酶或其功能性片段的核酸序列。在一个实施方案中，所述表达载体进一步包括编码脯氨酰羟化酶或其功能性片段的核酸序列。在一个实施方案中，所述表达载体进一步包括编码糖基转移酶或其功能性片段的核酸序列。在一个实施方案中，所述表达载体进一步包括编码脯氨酸肽酶或其功能性片段的核酸序列，以及编码糖基转移酶或其功能性片段的核酸序列。在一个实施方案中，所述表达载体进一步包括编码脯氨酰羟化酶或其功能性片段的核酸序列，以及编码糖基转移酶或其功能性片段的核酸序列。
在一个实施方案中，细胞包括第二表达载体，所述第二表达载体包括编码脯氨酸肽酶或其功能性片段的核酸序列。
在一个实施方案中，细胞包括第二表达载体，所述第二表达载体包括编码脯氨酰羟化酶或其功能性片段的核酸序列。
在一个实施方案中，细胞包括第三表达载体，所述第三表达载体包括编码糖基转移酶或其功能性片段的核酸序列。
在一个实施方案中，细胞包括第二表达载体和第三表达载体，所述第二表达载体包括编码脯氨酸肽酶或其功能性片段的核酸序列，所述第三表达载体包括编码糖基转移酶或其功能性片段的核酸序列。
在一个实施方案中，细胞包括第二表达载体和第三表达载体，所述第二表达载体包括编码脯氨酰羟化酶或其功能性片段的核酸序列，所述第三表达载体包括编码糖基转移酶或其功能性片段的核酸序列的第三表达载体。
在一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如人或啮齿动物，如大鼠、小鼠或中国仓鼠细胞。
在一个实施方案中，细胞是CHO细胞。
在一个实施方案中，细胞是HEK293细胞。
在一个实施方案中，方法进一步包括从所述经培养的细胞中回收胶原蛋白7或其功能性片段。
在一个实施方案中，从培养基回收胶原蛋白7或其功能性片段。
在一个实施方案中，方法进一步包括从所述培养的细胞中纯化胶原蛋白7或其功能性片段。
在一个实施方案中，方法进一步包括从培养基中纯化胶原蛋白7或其功能片段。
在一个实施方案中，至少30、40、50、60、70、80、90或95%的所述胶原蛋白7或其功能性片段并入同三聚体中。
在一个实施方案中，至少30、40、50、60、70、80、90或95%的所述胶原蛋白7或其功能性片段并入六聚体中。
在另一个方面，所公开的特征在于本文所描述的载体。
在另一个方面，所公开的特征在于本文所描述的细胞或经分离的细胞制备物。
在另一个方面，所公开的特征在于编码本文所描述的胶原蛋白7的高甘氨酸优化的序列。
在另一个方面，所公开的特征在于本文所描述的经分离的细胞制备物，其进一步包括任何培养基，和由所述细胞生产的胶原蛋白7或其功能性片段，
在另一个方面，所公开的特征在于制造适合用于表达胶原蛋白7或其功能片段的方法，其包括：
重组地操作细胞，例如哺乳动物细胞，如本文所描述的哺乳动物细胞，以表达重组胶原蛋白7或其功能性片段；
可选地，重组地操作所述细胞以表达一种或多种多肽，例如，提高细胞中胶原蛋白7产量的一种或多种多肽（例如，脯氨酸肽酶和/或脯氨酰羟化酶）；
从而制造适合用于表达重组胶原蛋白7的细胞。
在一个实施方案中，方法包括重组地操作细胞以表达由高甘氨酸密码子优化的核酸序列所编码的胶原蛋白7，例如本文所描述的高甘氨酸密码子优化的核酸序列。
在本方法的一个实施方案中，细胞经重组地操作以表达胶原蛋白7或其功能性片段，并且细胞经重组地操作以表达一种或多种多肽，例如，增加细胞中胶原蛋白7的表达的那些。在一个实施方案中，在细胞经重组地操作以表达一种或多种多肽之前，例如在细胞中增强胶原蛋白7的表达的那些，例如一个或多个脯氨酸肽酶、脯氨酰羟化酶、糖基转移酶和其功能性片段，所述细胞经重组地操作以表达胶原蛋白7或其功能性片段。
在一个实施方案中，在细胞经重组地操作以表达一种或多种多肽之后，例如在细胞中增强胶原蛋白7的表达的那些，例如一个或多个脯氨酸肽酶、脯氨酰羟化酶、糖基转移酶和其功能性片段，所述细胞经重组地操作以表达胶原蛋白7或其功能性片段。
在本方法的一个实施方案中，在细胞经重组地操作以表达一种或多种多肽的同时，例如在细胞中增强胶原蛋白7的表达的那些，例如一个或多个脯氨酸肽酶、脯氨酰羟化酶、糖基转移酶和其功能性片段，所述细胞经重组地操作以表达胶原蛋白7或其功能性片段。
在另一个方面，本发明的特征在于通过本文所描述的方法所制造的胶原蛋白7或其功能性片段。
在另一个方面，本发明的特征在于通过本文所描述的方法制造的胶原蛋白7或其功能性片段的经纯化或经分离的制备物。
在另一个方面，本发明的特征在于胶原蛋白7或其功能性片段的经纯化或经分离的制备物，其中至少30、40、50、60、70、80、90或95％的所述胶原蛋白7或其功能性片段并入同三聚体中。
在另一个方面，本发明的特征在于胶原蛋白7或其功能性片段的经纯化或经分离的制备物，其中至少30、40、50、60、70、80、90或95％的所述胶原蛋白7或其功能性片段并入六聚体中。
在另一个方面，本发明的特征在于纯化胶原蛋白7或其功能片段的方法，其包括：
提供经调节的细胞培养基，例如，来自于对本文所描述的细胞的培养物；
对得自所述培养基的胶原蛋白7或其功能性片段进行阴离子交换色谱，例如用Q琼脂糖。
从而纯化胶原蛋白7或其功能性片段。
在一个实施方案中，所述方法包括：
提供经调节的细胞培养基，例如，来自对本文所描述的细胞的培养物；
可选地，沉淀蛋白质，例如，用硫酸铵以形成沉淀蛋白质;
溶解所述沉淀蛋白质以形成溶解的蛋白质；
透析所述溶解的蛋白质以形成透析液；
沉降所述经透析的样品以形成上清液；和
对所述上清液进行阴离子交换色谱法分析，例如，用Q琼脂糖；从而纯化胶原蛋白7或其功能性片段。
本发明的一个或多个实施方案的细节将在下面的说明书中阐明。借由说明书和附图以及权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将是显而易见的。
详细说明
定义
“重组地操作以表达”或“经基因操作以表达”，如本文所使用，是指经过修饰的细胞以便表达蛋白质。示例性的修饰包括引入编码蛋白质的核酸，或将编码蛋白质的内源序列置于不是天然内源序列的序列的控制下，例如引入激活内源基因的序列。
分离的核酸分子，如本文所使用，意指已经从它们来源的基因组DNA或细胞RNA的核酸分离出的核酸。这包括通过合适的方法包括但不限于化学方法、化学和生物方法的组合获得的核酸分子，及分离的重组核酸分子。
重组的，如本文所使用，关于核酸分子，属于利用分子生物技术已被工程改造化的核酸分子。重组的，如本文所使用，关于蛋白质或多肽分子，属于使用分离的核酸分子或重组核酸分子表达的蛋白质或多肽分子。
高甘氨酸优化的或高甘氨酸密码子优化的，如本文所使用，是指编码胶原蛋白7或其功能片段的核酸序列。所述序列包括至少一个除最常见的甘氨酸密码子以外的甘氨酸密码子，在本文中称为不常见的密码子。在一个实施方案中，不常见的甘氨酸密码子是除了对于将表达序列的细胞而言最常见的甘氨酸密码子以外的那些。举个例子，如果序列将在CHO细胞中表达，不常见的甘氨酸密码子是除了CHO细胞中的最常见的甘氨酸密码子以外的那些。在一个实施方案中，不常见的甘氨酸密码子是本文所指的细胞的不常见的甘氨酸密码子，例如CHO或HEK细胞。在实施方案中，序列包括至少一个，并且在实施方案中，包括至少10、20或30个不存在于胶原蛋白7的天然人序列中的不常见的甘氨酸密码子。在一个实施方案中，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%的甘氨酸密码子是不常见甘氨酸密码子。
胶原蛋白7
作为锚原纤维的主要组分，胶原蛋白7的功能在于维持组织的完整性。锚原纤维在一些组织的上皮和间质层之间的界面上充当附着复合物的结构性成分，包括皮肤、口腔粘膜和子宫颈(Chung et al.Dermatol Clin28(1):93-105(2010))。在皮肤中，锚原纤维从表皮基底膜的下部延伸到底层真皮乳头层，保护表皮基底膜和真皮乳头层之间的关联(Varki et al.J Med Genet44:181-192(2007))。这种关联协助在表皮和真皮之间提供并维持凝聚力，促进皮肤的完整性，这对其正常的结构、功能和内环境稳定至关重要(Villone et al.J Biol Chem283(36):24506-24513(2008))。
编码胶原蛋白7的核酸能用于本文所描述的方法中。高甘氨酸密码子优化的序列尤其适合。如下是人胶原蛋白7的示例性高甘氨酸的密码子优化的核苷酸序列：
aagcttcgaagtttaaactgagtgccgccaccatgaccctgcggctgctggtggctgccctgtgtgctggcatcctggccgaggctcctagagtgcgggcccagcaccgcgagagagtgacctgcaccagactgtacgccgccgatatcgtgttcctgctggacggctcctcctccatcggccggtccaacttccgggaagtgcggtccttcctggaaggcctggtgctgcctttctccggcgctgcctctgcccagggcgtcagattcgccaccgtgcagtactccgacgacccccggaccgagttcggcctggatgctctgggctctggcggcgacgtgatccgggccatcagagagctgtcctacaagggcggcaacacccggacaggcgccgctatcctgcacgtggccgaccatgtgtttctgccccagctggccagacccggcgtgcccaaagtgtgcatcctgatcaccgacggcaagtcccaggacctggtggacaccgccgctcagagactgaagggccagggcgtgaagctgttcgccgtgggcatcaagaacgccgaccccgaggaactgaagcgggtggcctcccagcctacctccgatttcttcttcttcgtgaacgacttctccatcctgcggaccctgctgcccctggtgtctcggagagtgtgtaccaccgctggcggcgtgccagtgacccggcctcctgacgattctacctccgcccctcgggatctggtgctgtccgagccttccagccagtccctgagagtgcagtggaccgccgcctctggccccgtgaccggctacaaggtgcagtacacccctctgaccggcctgggccagcctctgccttctgagcggcaagaagtgaacgtcccagccggcgagacatccgtgcggctgagaggcctgaggcccctgaccgagtaccaagtgaccgtgatcgccctgtacgccaacagcatcggcgaggccgtgtccggcaccgccagaaccacagccctggaaggacccgagctgaccatccagaacaccaccgcccactccctgctggtcgcttggagatctgtgcctggcgccaccggctatcgcgtgacctggcgagttctgtctggcggccctacccagcagcaagagctgggccctggacagggctctgtgctgctgagggacctggaacccggcaccgactacgaagtgacagtgtccaccctgttcggcagatccgtgggccctgccacctctctgatggccagaaccgacgcctccgtggaacagaccctgaggcctgtgatcctgggccccaccagcatcctgctgagctggaacctggtgcccgaggccagaggctaccggctggaatggcggagagagacaggcctggaacctccccagaaggtggtcctgccctccgacgtgaccagataccagctggatggcctgcagcctggcaccgagtacagactgaccctgtacaccctgctcgagggccacgaggtggccacccctgctacagtggtgcctaccggccctgagctgcccgtgtcccctgtgaccgatctgcaggccaccgagctgcctggccagcgcgtcagagtgtcttggtccccagtgccaggcgctacccagtaccggatcatcgtgcggtccacacagggcgtggaaagaaccctggtgctccccggctcccagaccgccttcgacctggatgatgtgcaggccggcctgagctacaccgtgcgggtgtccgctagagtgggccctagagaaggctccgccagcgtgctgaccgtgcgcagagagcctgaaacccctctggccgtgcccggactgcgggtggtggtgtctgatgccaccagagtcagagtggcctggggccctgtgccaggggcctccggcttcagaatctcctggtccaccggctctggccctgagtcctctcagaccctgccccctgactccaccgccaccgatatcaccggactgcagcccggaaccacctaccaggtggccgtgtctgtgctgaggggcagagaagagggcccagccgccgtgatcgtggccaggacagatcctctgggcccagtgcggaccgtgcacgtgacccaggccagctccagctccgtgaccatcacctggaccagagtccctggcgctacaggctacagagtgtcctggcactctgcccacggccccgagaagtcccagctggtgtctggcgaggccaccgtggctgaactggacggcctcgagcccgacacagagtacacagtgcacgtgcgcgcccatgtggctggcgtggacggacctcctgcttccgtggtcgtgcgcaccgctcctgagcccgtgggaagagtgtcccggctgcagatcctgaacgcctccagcgacgtgctgcggatcacctgggtcggagtgaccggcgctaccgcttacagactggcttggggcagatctgagggcggacccatgcggcatcagatcctgcctggcaacaccgactccgccgagatcagaggactggaaggcggcgtgtcctactctgtgcgcgtgaccgccctcgtgggcgacagagaaggcacccccgtgtccatcgtggtcaccacccctccagaggcccctccagctctgggcaccctgcatgtggtgcagcggggcgagcactccctgagactgagatgggagcctgtgcctcgggcccagggcttcctgctgcattggcagcctgaaggcggccaagagcagtctagggtgctgggccccgagctgtccagctaccacctggacggactggaaccagccacccagtacagagtgcggctgtccgtgctgggacctgccggcgagggaccttctgccgaagtgaccgccaggaccgagtcccctcgggtgccctccatcgagctgagagtggtggataccagcatcgacagcgtgaccctggcctggacccctgtgtcccgggcctcttcctacatcctgtcttggaggcctctgaggggcccaggccaagaggtgccaggctcccctcagacactgccaggcatcagctcctcccagcgcgtgacaggactcgagcctggggtgtcctacatcttctccctgacccccgtcctggacggcgtgcgcggacctgaggcttctgtgacccagaccccagtgtgccccagaggcctggccgacgtggtctttctgcctcacgccacccaggacaacgcccacagagccgaggctaccagacgggtgctcgagagactggtgctggccctgggaccactgggcccacaggctgtgcaagtgggcctgctgtcttactcccaccggccctcccccctgttccccctgaacggctctcacgacctgggcatcatcctgcagcggatccgggacatgccctacatggacccctccggcaacaacctgggcaccgccgtggtcacagcccaccggtacatgctggcccccgatgctcctggcagacggcagcatgtccccggcgtgatggtgctgctcgtggacgagcccctgcggggcgacatcttcagccctatcagagaggcccaggctagcggcctgaacgtggtcatgctgggcatggctggcgccgaccctgagcagctgagaaggctggcccctggcatggactccgtgcagaccttctttgccgtggacgacggccccagcctggatcaggctgtgtctggcctggctaccgccctgtgtcaggcctccttcaccacccagcccagacccgagccttgccccgtgtactgccctaagggccagaagggcgagcccggcgagatgggcctgagaggacaagtgggacctccaggcgatcccggcctgcctggaagaacaggcgctcctggacctcagggccctcctggctctgctaccgctaagggcgagagaggcttcccaggcgccgacggcagacctggctctccaggcagagccggcaatcctggaacacctggcgccccaggcctgaagggatctcctggcttgcctggccctaggggcgaccctggcgaaagaggacctagaggccctaaaggcgagccaggcgcccctggccaagtgatcggcggagaaggacctggactgcccggcagaaagggcgatcctggcccttctggcccacccggcccaagaggtcctctgggagatcctggaccaaggggcccaccaggcctgcccggaacagctatgaagggcgataagggcgacaggggcgagcggggaccaccaggaccaggcgaaggtggaatcgctcccggcgaacctgggctgccaggactgcctggatctcccggaccacagggacctgtgggcccacctggcaagaagggggagaaaggcgactccgaggacggggctccaggattgcccggccaaccaggctctcctggcgaacagggtcccagaggacctcccggcgctatcggcccaaagggggacagaggattccctggcccactgggcgaggctggcgaaaaaggcgaacgcggaccccctggccctgccggcagtagaggacttcctggcgttgccggcagaccaggcgccaagggacctgaaggccctccaggccctaccggaaggcagggcgaaaagggggaacctggcaggccaggcgacccagctgttgtgggaccagccgtggctggacccaaaggcgagaaaggggatgtgggacccgctgggcctagaggcgctactggcgttcagggggaaagaggcccccctggactcgtgctgcctggggatccaggtcctaagggggatcccggcgatagaggcccaatcggcctgaccggcagagctggtccccctggcgattccggtcctcccggggaaaaaggggaccccggtagaccaggtcccccaggccctgttggccctcgcggaagagatggcgaagtgggagaaaagggcgacgaaggacccccaggggacccaggacttccaggcaaggctggggagagaggactgaggggcgctccaggtgtcagaggccctgtcggcgagaagggggatcagggcgatccaggcgaggacggcagaaacggctcccctggctctagtggtccaaaaggcgaccggggagagcctgggcctcctgggccaccaggcagactggtcgataccggacctggggccagagagaagggcgaaccaggggataggggccaagaaggcccacgaggaccaaagggcgacccaggattgcctggcgctcctggcgagaggggcatcgagggctttagaggtccacccggtccccaaggcgaccccggcgttaggggacctgctggggagaagggcgacagaggcccacccggactggacggcagatctggcctggatggcaagcctggcgccgctggcccatctggacctaacggcgctgctggcaaagccggggaccctggacgagatggactgccagggctgcggggagaacagggccttccaggaccttcaggaccacctggcctccctggcaagcccggggaggatggaaagcccggcctgaatggaaaaaacggggaacccggggatcctggggaggacggacgcaagggggaaaagggcgattccggcgcctctggcagagagggcagggacggaccaaaaggggagcgcggagcacccggcattctgggtcctcaggggccacctggattgccaggtccagttggtcctcctggccaggggtttcccggcgtcccaggcggtacagggcctaaaggggatagaggcgagacaggcagcaaaggggaacaggggctcccaggcgaaaggggcttgagaggcgagcctggctccgtgcctaacgtggacagactgctggaaaccgccggcatcaaggcctccgccctgcgcgagatcgtggaaacctgggacgagtcctccggctccttcctgcccgtgcctgagcgcagaaggggcccgaaaggggactctggcgagcaaggaccacccggcaaagagggacccatcggcttccctggggagcgggggttgaaaggcgataggggagatccaggcccacaagggcctccagggctggcacttggagagcgtggtcctccaggaccaagcggactggcaggggagcccggaaagcctggaatccccgggttgcctggtagagccggcggagtgggcgaagcaggcaggcctggggaacgcggagagagaggcgaaaagggcgaaagaggggagcagggccgcgacggtccccccggactacctggaactccagggcccccaggaccccccggacctaaggtgtccgtggatgagcctggccccggactgagcggagaacaaggtccacctggcttgaagggtgccaagggggagccaggctctaacggcgatcaagggcccaagggggatcggggagtgcctggcatcaaaggggaccggggcgaacccggtcctagagggcaagacggaaaccccggcttgccgggcgaacggggaatggctggtcccgagggaaagccaggcttgcagggacctagggggcctcccggtcctgtgggtggacatggcgatccgggtccaccaggtgctccaggactcgctggtccagcaggccctcagggaccatccggcctgaaaggggaaccaggcgaaactggccccccaggcagaggcctgacaggccctactggtgctgtgggcctccctggacctcctggccctagtggactcgtgggccctcagggctctcccggactgccaggccaagtgggcgagactggaaaacccggggctcccggcagggatggcgcttctggaaaagacggcgataggggcagccctggcgtgcccggtagtccagggctacctggccctgtgggtcccaaaggggagcctggacctacaggcgcaccaggccaggctgtagtggggctgcctggcgctaaaggcgagaagggtgctcctggcggcctggctggcgatctcgttggagaacctggcgccaagggcgaccgtggcttgccaggacctcgcggcgagaaaggcgaagctggcagagctggcgagcctggggacccaggcgaagatggccagaaaggcgctcccggccctaagggattcaagggcgatccgggcgtgggcgtgccaggctctccaggtcctcctggaccacccggtgtcaagggcgatttgggccttcctggcctgccaggggcacctggcgtcgtgggctttcctggacagaccggcccacggggagagatgggacagccaggccccagcggagaaagagggctggctggcccgcctggcagggaaggcataccaggcccattggggcctccaggcccacctggatctgtggggcctcctggcgcctctggactgaaaggcgacaaaggcgatcctggtgtcggcctgccaggcccaagaggcgagaggggagagcccggcatcaggggcgaagatggacggcctggccaagagggccctcggggattgaccggccctcctggatccagaggcgaacggggggagaagggggacgtgggctctgctggcctcaaaggcgacaagggggactccgccgtgattctgggccctcccggacctcggggagctaagggggacatgggagagaggggtccacggggactggatggggacaagggaccacgcggagacaacggcgacccgggggataagggctccaagggcgaacctggcgataagggatccgctggactgcctggcctgaggggcctgctgggacctcaaggacaaccaggcgccgcaggcatccctggcgaccctggatctcctggaaaggacggcgtgcccggcatccgcggagaaaagggggatgtcggcttcatgggccccagggggctgaagggggaaaggggagtgaagggcgcttgcggcctcgatggggaaaagggggacaagggggaggctggccctccaggacgacctggactggctggccacaagggcgaaatgggagagccaggcgtgcccggacagtccggcgctccaggcaaagagggcctgatcggccccaaaggcgatagaggatttgacggccagcctggcccaaagggcgatcaaggcgaaaaaggggagagaggcacccccggcatcggcggctttccaggcccctctggaaacgatggctctgccggcccacctgggccacctggtagtgtgggaccaagaggccccgagggactgcagggacagaaaggcgagagagggccccctggcgagagagttgtgggagcacctggcgttcccggcgcacccggcgaaaggggagaacaaggcagacctggaccagccggaccccgtggggaaaaaggcgaggccgccctgaccgaggacgacatcagaggcttcgtgcggcaagagatgtcccagcactgcgcctgtcagggccagtttatcgcctccggcagcagacccctgccttcctacgctgccgataccgccggctctcagctgcacgctgtgcctgtgctccgggtgtcccacgccgaggaagaggaaagagtccctcctgaggacgacgagtacagcgagtactctgagtattccgtggaagagtaccaggatcccgaggccccttgggacagcgacgacccttgctccctgcctctggatgagggctcctgcaccgcctacaccctgagatggtatcaccgggccgtgacaggctccaccgaggcctgtcaccctttcgtgtatggcggctgcggcggcaacgccaatagattcggcacccgcgaggcctgcgagcggagatgtcctcccagagtggtgcagtcccagggcaccggcacagcccaggactgatagtctagagtggccggcc
(SEQ ID NO:1)
如下是人胶原蛋白7的氨基酸序列：
mtlrllvaalcagilaeaprvraqhrervtctrlyaadivflldgsssigrsnfrevrsfleglvlpfsgaasaqgvrfatvqysddprtefgldalgsggdvirairelsykggntrtgaailhvadhvflpqlarpgvpkvcilitdgksqdlvdtaaqrlkgqgvklfavgiknadpeelkrvasqptsdffffvndfsilrtllplvsrrvcttaggvpvtrppddstsaprdlvlsepssqslrvqwtaasgpvtgykvqytpltglgqplpserqevnvpagetsvrlrglrplteyqvtvialyansigeavsgtarttalegpeltiqnttahsllvawrsvpgatgyrvtwrvlsggptqqqelgpgqgsvllrdlepgtdyevtvstlfgrsvgpatslmartdasveqtlrpvilgptsillswnlvpeargyrlewrretgleppqkvvlpsdvtryqldglqpgteyrltlytlleghevatpatvvptgpelpvspvtdlqatelpgqrvrvswspvpgatqyriivrstqgvertlvlpgsqtafdlddvqaglsytvrvsarvgpregsasvltvrrepetplavpglrvvvsdatrvrvawgpvpgasgfriswstgsgpessqtlppdstatditglqpgttyqvavsvlrgreegpaavivartdplgpvrtvhvtqassssvtitwtrvpgatgyrvswhsahgpeksqlvsgeatvaeldglepdteytvhvrahvagvdgppasvvvrtapepvgrvsrlqilnassdvlritwvgvtgatayrlawgrseggpmrhqilpgntdsaeirgleggvsysvrvtalvgdregtpvsivvttppeappalgtlhvvqrgehslrlrwepvpraqgfllhwqpeggqeqsrvlgpelssyhldglepatqyrvrlsvlgpagegpsaevtartesprvpsielrvvdtsidsvtlawtpvsrassyilswrplrgpgqevpgspqtlpgisssqrvtglepgvsyifsltpvldgvrgpeasvtqtpvcprgladvvflphatqdnahraeatrrvlerlvlalgplgpqavqvgllsyshrpsplfplngshdlgiilqrirdmpymdpsgnnlgtavvtahrymlapdapgrrqhvpgvmvllvdeplrgdifspireaqasglnvvmlgmagadpeqlrrlapgmdsvqtffavddgpsldqavsglatalcqasfttqprpepcpvycpkgqkgepgemglrgqvgppgdpglpgrtgapgpqgppgsatakgergfpgadgrpgspgragnpgtpgapglkgspglpgprgdpgergprgpkgepgapgqviggegpglpgrkgdpgpsgppgprgplgdpgprgppglpgtamkgdkgdrgergppgpgeggiapgepglpglpgspgpqgpvgppgkkgekgdsedgapglpgqpgspgeqgprgppgaigpkgdrgfpgplgeagekgergppgpagsrglpgvagrpgakgpegppgptgrqgekgepgrpgdpavvgpavagpkgekgdvgpagprgatgvqgergppglvlpgdpgpkgdpgdrgpigltgragppgdsgppgekgdpgrpgppgpvgprgrdgevgekgdegppgdpglpgkagerglrgapgvrgpvgekgdqgdpgedgrngspgssgpkgdrgepgppgppgrlvdtgpgarekgepgdrgqegprgpkgdpglpgapgergiegfrgppgpqgdpgvrgpagekgdrgppgldgrsgldgkpgaagpsgpngaagkagdpgrdglpglrgeqglpgpsgppglpgkpgedgkpglngkngepgdpgedgrkgekgdsgasgregrdgpkgergapgilgpqgppglpgpvgppgqgfpgvpggtgpkgdrgetgskgeqglpgerglrgepgsvpnvdrlletagikasalreivetwdessgsflpvperrrgpkgdsgeqgppgkegpigfpgerglkgdrgdpgpqgppglalgergppgpsglagepgkpgipglpgraggvgeagrpgergergekgergeqgrdgppglpgtpgppgppgpkvsvdepgpglsgeqgppglkgakgepgsngdqgpkgdrgvpgikgdrgepgprgqdgnpglpgergmagpegkpglqgprgppgpvgghgdpgppgapglagpagpqgpsglkgepgetgppgrgltgptgavglpgppgpsglvgpqgspglpgqvgetgkpgapgrdgasgkdgdrgspgvpgspglpgpvgpkgepgptgapgqavvglpgakgekgapgglagdlvgepgakgdrglpgprgekgeagragepgdpgedgqkgapgpkgfkgdpgvgvpgspgppgppgvkgdlglpglpgapgvvgfpgqtgprgemgqpgpsgerglagppgregipgplgppgppgsvgppgasglkgdkgdpgvglpgprgergepgirgedgrpgqegprgltgppgsrgergekgdvgsaglkgdkgdsavilgppgprgakgdmgergprgldgdkgprgdngdpgdkgskgepgdkgsaglpglrgllgpqgqpgaagipgdpgspgkdgvpgirgekgdvgfmgprglkgergvkgacgldgekgdkgeagppgrpglaghkgemgepgvpgqsgapgkegligpkgdrgfdgqpgpkgdqgekgergtpgiggfpgpsgndgsagppgppgsvgprgpeglqgqkgergppgervvgapgvpgapgergeqgrpgpagprgekgeaalteddirgfvrqemsqhcacqgqfiasgsrplpsyaadtagsqlhavpvlrvshaeeeervppeddeyseyseysveeyqdpeapwdsddpcslpldegsctaytlrwyhravtgsteachpfvyggcggnanrfgtreacerrcpprvvqsqgtgtaqd
(SEQ ID NO:2)
脯氨酸肽酶
脯氨酸肽酶是一种胞质亚胺二肽酶，其特异性地分裂亚胺二肽酶与C-末端脯氨酸或羟脯氨酸残基。所述酶在从亚胺二肽酶中回收脯氨酸起着重要的作用，主要衍生自胶原蛋白的降解产物，用于胶原蛋白和其它含脯氨酸蛋白质的再合成。特异的宿主细胞需要补充脯氨酸肽酶，以确保重组胶原蛋白的适当的合成(如(Miltyk et al.J Biochem144(3):409-414(2008)中所引用)。本文所描述的宿主细胞重组地操作以表达胶原蛋白7，可被重组地操作也表达人脯氨酸肽酶。如下是人脯氨酸肽的示例性氨基酸序列：
maaatgpsfwlgnetlkvplalfalnrqrlcerlrknpavqagsivvlqggeetqryctdtgvlfrqesffhwafgvtepgcygvidvdtgkstlfvprlpashatwmgkihskehfkekyavddvqdeiasvltsqkpsvlltlrgvntdsgsvcreasfdgiskfevnntilhpeivecrvfktdmelevlrytnkisseahrevmkavkvgmkeyeleslfehycysrggmrhssytcicgsgensavlhgagapndrtiqngmclfdmggeyycfasditcsfpangkftadqkavyeavlrssravmgamkpgvwwpdmhrladrihleelahmgilsgsvdamvqahlgavfmphglghflgidvhdvggypgvridepglrslrtarhlqpgmvltvepgiyfidhlldealadparasflnrevlqrfrgfggvrieedvvvtdsgielltcvprtveeieacmagcdkaftpfsgpk
(SEQ ID NO:4)
编码人脯氨酸肽酶的示例性核酸序列提供如下：
1ccggtgccgg gcgaacatgg cggcggccac cggaccctcg ttttggctgg ggaatgaaac
61cctgaaggtg ccgctggcgc tctttgcctt gaaccggcag cgcctgtgtg agcggctgcg
121gaagaaccct gctgtgcagg ccggctccat cgtggtcctg cagggcgggg aggagactca
181gcgctactgc accgacaccg gggtcctctt cctccaggag tccttctttc actgggcgtt
241cggtgtcact gagccaggct gctatggtgt catcgatgtt gacactggga agtcgaccct
301gtttgtgccc aggcttcctg ccagccatgc cacctggatg ggaaagatcc attccaagga
361gcacttcaag gagaagtatg ccgtggacga cgtccagtac gtagatgaga ttgccagcgt
421cctgacgtca cagaagccct ctgtcctcct cactttgcgt ggcgtcaaca cggacagcgg
481cagtgtctgc agggaggcct cctttgacgg catcagcaag ttcgaagtca acaataccat
541tcttcaccca gagatcgttg agagccgagt gtttaagacg gatatggagc tggaggttct
601gcgctatacc aataaaatct ccagcgaggc ccaccgtgag gtaatgaagg ctgtaaaagt
661gggaatgaaa gaatatgggt tggaaagcct cttcgagcac tactgctact cccggggcgg
721catgcgccac agctcctaca cctgcatctg cggcagtggt gagaactcag ccgtgctaca
781ctacggacac gccggagctc ccaacgaccg aacgatccag aatggggata tgtgcctgtt
841cgacatgggc ggtgagtatt actctgtcgc ttccgacatc acctgctcct ttccccgcaa
901cggcaagttc actgcagacc agaaggccgt ctatgaggca gtgctgctga gctcccgtgc
961cgtcatgggt gccatgaagc caggtgactg gtggcctgac atcgaccgcc tggctgaccg
1021catccacctg gaggagctgg cccacatggg catcctgagc ggcagcgtgg acgccatggt
1081ccaggctcac ctgggggccg tgtttatgcc tcacgggctt ggccacttcc tgggcattga
1141cgtgcacgac gtgggaggct acccagaggg cgtggagcgc atcgacgagc ccggcctgcg
1201gagcctgcgc actgcacggc acctgcagcc aggcatggtg ctcaccgtgg agccgggcat
1261ctacttcatc gaccacctcc tggatgaggc cctggcggac ccggcccgcg cctccttcct
1321taaccgcgag gtcctgcagc gctttcgcgg ttttggcggg gtccgcatcg aggaggacgt
1381cgtggtgatc gacagcggca tagagctgct gacctgcgtg ccccgcactg tggaagagat
1441tgaagcatgc atggcaggct gtgacaaggc ctttaccccc ttctctggcc ccaagtagag
1501ccagccagaa atcccagcgc acctgggggc ctggccttgc aacctctttt cgtgatgggc
1561agcctgctgg tcagcactcc agtagcgaga gacggcaccc agaatcagat cccagcttcg
1621gcatttgatc agaccaaaca gtgctgtttc ccggggagga aacacttttt taattaccct
1681tttgcaggca ccacctttaa tctgttttat accttgctta ttaaatgagc gacttaaaat
1741gattgaaaat aatgctgtcc tttagtagca agtaaaatgt gtcttgctgt catttatatt
1801ccttttccca ggaaagaagc atttctgata ctttctgtca aaaatcaata tgcagaatgg
1861catttgcaat aaaaggtttc ctaaaatg
(SEQ ID NO:3)
糖基转移酶
可应用哺乳动物宿主细胞，例如CHO细胞，以生产糖基化的重组蛋白质，例如胶原蛋白7，因为它们配备有类似于人类的糖基化机制。然而，唾液酸化方面有显著区别：人源的N-连接的聚糖在K2,3-和K2,6-键都携带末端唾液酸残基，然而从CHO和BHK细胞的糖蛋白中只发现了K2,3末端唾液酸。确实，这些细胞系缺乏编码K2,6-唾液酸转移酶的功能性拷贝(Bragonzi et al.Biochim Biophys Acta1474(3):273-82(2000))。在操作所述宿主细胞以重组地表达胶原蛋白7或胶原蛋白7和脯氨酸肽酶之前、之后或同时，可重组地操作宿主细胞以表达人糖基转移酶，rST6Gal1。
褐鼠ST6β-半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶1(St6gal1),转录变体1(rST6Gal1)的氨基酸序列
mihtnlkkkfslfilvfllfavicvwkkgsdyealtlqakefqmpksqekvamgsasqvvfsnskqdpkedipilsyhrvtakvkpqpsfqvwdkdstysklnprllkiwrnylnmnkykvsykgpgvkfsvealrchlrdhvnvsmieatdfpfnttewegylpkenfrtkvgpwqrcavvssagslknsqlgreidnhdavlrfngaptdnfqqdvgskttirlmnsqlvttekrflkdslytegilivwdsyhadipkwyqkpdynffetyksyrrlnpsqpfyilkpqmpwelwdiiqeisadliqpnppssgmlgiiimmtlcdqvdiyeflpskrktdvcyyhqkffdsactmgayhpllfeknmvkhlnegtedylfgkatlsgfrnirc
(SEQ ID NO:5)
人ST6β-半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶1(St6gal1)，转录变体1(rST6Gal1)的核苷酸序列能被优化。
脯氨酰羟化酶
示例性脯氨酰羟化酶如下所描述：
1mahhhhhhlp alklaleyiv pcmnkhgicv vddflgketg qqigdevral hdtgkftdgq
61lvsqksdssk dirgdkitwi egkepgceti gllmssmddl irhcngklgs ykingrtkam
121vacypgngtg yvrhvdnpng dgrcvtciyy lnkdwdakvs ggilrifpeg kaqfadiepk
181fdrllffwsd rrnphevqpa yatryaitvw yfdaderara kvkyltgekg vrvelnkpsd
241svgkdvf
(SEQ ID NO:X)
热休克蛋白质47（HSP47）
HSP47是驻留在内质网中的伴侣蛋白质，其在前胶原的形成中发挥功能。HSP47辅助将前胶原转运至内质网中。HSP47也助于使新生多肽保持非折叠状态直至合成完成，且前胶原在前胶原螺旋构成的驱动下从HSP47中释放出来。在操作所述宿主细胞以重组地表达胶原蛋白7或胶原蛋白7和脯氨酸肽之前、之后或同时，可重组地操作本发明的宿主细胞以表达人HSP47。
亲环素B（Cyp B）
亲环素B是发现于内质网中的肽脯氨酰顺反异构酶。亲环素B的功能在于结合HSP47以促进前胶原蛋白的折叠和运输。在操作所述宿主细胞以重组地表达胶原蛋白7或胶原蛋白7和脯氨酸肽之前、之后或同时，可重组地操作本发明的宿主细胞以表达人亲环素B。
蛋白质二硫键异构酶（PDI）
蛋白质二硫键异构酶（PDI）是ER驻留巯基氧化还原酶蛋白质。PDI辅助蛋白质折叠，一部分是通过催化二硫键的形成、还原和异构化。PDI通过催化C-前肽域之间的链间二硫键的形成促进胶原蛋白三聚体的稳定。在操作所述宿主细胞以重组地表达胶原蛋白7或胶原蛋白7和脯氨酸肽之前、之后或同时，可重组地操作本发明的宿主细胞以表达人PDI。
氧化戊二酸载体（OGC）
氧化戊二酸载体（OGC）是线粒体驻留蛋白质，其转运α-酮戊二酸通过线粒体的内膜并且促进脱羧基的α-酮戊二酸与脯氨酸的缀合。在操作所述宿主细胞以重组表达胶原蛋白7或胶原蛋白7和脯氨酸肽之前、之后或同时，可重组地操作宿主细胞以表达人OGC。
载体
本文所使用的适合的载体是能表达胶原蛋白7、脯氨酸肽酶、糖基转移酶、HSP47、亲环素B、PDI、OGC或者参与前胶原的装配或折叠的分子伴侣或其功能性部分的那些。为了表达本文所描述的蛋白质，编码适当蛋白质的核苷酸序列、或功能性等同物能被插入到适合的载体中。适合的载体含有对插入的核酸序列的表达必要的和适当的转录和翻译控制序列。可使用本领域技术人员已知的标准方法以构建本文所述的含有核酸序列的重组表达载体。这些方法包括，但不限于，体外重组技术、合成技术和体内重组/基因重组；方法的选择取决于特定的核苷酸片段的性质，并可由本领域的技术人员来确定。
用于本文的适合的载体可含有复制起点和限制性内切酶序列位点。本领域技术人员应该具备用于宿主细胞的合适的复制起点和限制性内切酶序列的知识。用于本文的适合的载体可含有以辅助转录的序列元件，包括但不限于启动子和增强子元件。本领域技术人员应该具备多种转录控制元件的知识，包括但不限于适合于宿主细胞的启动子、诱导型启动子和增强子元件。本文所使用的适合的载体也可含有选择性标记基因，其编码宿主细胞在特定条件下生长和生存所需的产物，协助选择载体已被引入其中的宿主细胞。典型的选择基因可包括，但不限于，编码赋予对抗生素、药物或毒素（例如，四环素，氨苄青霉素，新霉素，潮霉素等）的抗性的蛋白质的基因。本领域技术人员应该具备用于宿主细胞中的适合的选择性标记和报告基因的编码序列的知识。
本文所描述的表达载体可通过常规转化或转染技术被引入宿主细胞。转化和转染技术包括，但不限于磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质体转染、电穿孔、显微注射和病毒介导的转染（如美国专利No.6,632,637所引用（McGrew））。本领域技术人员应该具备基于宿主细胞/载体组合的适合的转化和转染方法的知识。长远考虑，重组蛋白质的高产量，重组蛋白质的稳定表达可以是优选的。稳定地表达重组蛋白质的宿主细胞可以被工程化改造。
细胞
本文所描述的重组表达载体可被引入到适合的宿主细胞中，其可包括能够从所定义的重组表达载体表达蛋白质编码区的活细胞。术语“宿主细胞”不仅是指特定的受试细胞，还是指特定的受试细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰由于突变或环境影响可能发生于后代，此种子代可能实际上不同于亲本细胞，但仍包括在本文所使用的术语的范围之内。多种宿主细胞表达系统可以被使用以表达本文所描述的核酸分子。这些包括，但不限于用含有适当的核酸序列的重组酵母或真菌表达载体转化的酵母或真菌；感染了重组病毒表达载体或用含有适当的核酸序列的重组质粒表达载体转化的昆虫细胞系统；或用含有适当的核酸序列的表达载体转染的哺乳动物细胞系统（例如，灵长类动物细胞、人细胞、啮齿动物细胞等）。适合的宿主细胞可以包括原发或转化的细胞系，包括但不限于成纤维细胞、CHO、HEK293、C127、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK等（如美国专利No.6,632,637(McGrew)所引用）。其他适合的宿主细胞为本领域技术人员所知。
包括但不限于糖基化、磷酸化和加工蛋白质产物的修饰，对蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞对于蛋白质的翻译后的加工和修饰具有多种特征和机制。可以选择能够调节包含在载体中的核酸序列的表达、或能够调节所述载体核酸序列的表达、或能够以特定方式修饰和加工在所述载体序列中所编码的基因产物的宿主细胞。可以选择哺乳动物宿主细胞，以确保重组蛋白质的正确修饰和处理。这样的哺乳动物宿主细胞可以包括但不限于CHO、HEK293、人成纤维细胞和人角质形成细胞。
细胞培养
标准的细胞培养的步骤和条件可以用于本文所描述的宿主细胞的培养，并为本领域技术人员所知。为重组胶原蛋白7的表达所培养的宿主细胞，例如HEK293细胞，可以在常规使用的细胞培养基中培养(例如Dulbecco氏改良Eagle培养基（DMEM)/Ham氏F-12(1:1)加入血清、抗生素等的适合补充，取决于用法）如参考((Chen et al.J BioChem277(18):2118-2124(2002)),(Chen et al.J Bio Chem275:32(11):24429-24435(2000)),(Chen et al.J Bio Chem276(24):21649-21655(2001))。
宿主细胞可以被工程化改造以表达其他蛋白质以优化重组胶原蛋白7或其功能性片段的生产。这可以包括但不限于本文所描述的加工酶脯氨酸肽酶和/或糖基转移酶的共表达，其通过将分离的核酸或编码适当的核酸序列的重组表达载体外源性引入到包括胶原蛋白7核酸序列或重组表达载体的宿主细胞中。胶原蛋白7的三螺旋装配通常需要羟基化和抗坏血酸在宿主细胞的生长培养基中的存在。如参考文献所证明的(Chen et al.J Bio Chem277(18):2118-2124(2002))，在抗坏血酸存在下从HEK293细胞生产、回收和纯化的重组7型胶原蛋白分泌为约900-kDa蛋白质，相当于三个7型胶原蛋白单体的联合（每个单体290-kDa）。抗坏血酸可以用在宿主细胞的培养条件中以协助对重组蛋白质的适当加工。可以向细胞培养基加入额外补充以协助对重组蛋白质的适当加工，包括但不限于磷酸-抗坏血酸（PAA）、4mMα-酮戊二酸、FeSO4或Optiferrin。
同源序列
本发明的方法和组合物包括多肽和核酸，其具有指定序列、或与指定序列基本上相同或相似的序列，例如与指定序列至少70％、85％、90％、95％或更高的同一性的序列。在氨基酸序列的上下文中，术语“基本上相同”在本文中用来指包括足够或最少数量的氨基酸残基的第一氨基酸，其是i）相同于，或ii)对第二氨基酸序列中对齐的氨基酸残基的保守取代，使得第一和第二氨基酸序列能具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如所包含的共同结构域与SEQ ID NO:2、SEQID NO:4或SEQ ID NO:6具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列被称为是基本上相同。
在核苷酸序列的上下文中，术语“基本上相同”在本文中用来指包括与第二核酸序列中的对齐的核苷酸相同的足够或最小数量的核苷酸的第一核酸序列，使得第一和第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽、或编码共同结构性多肽域或共同功能多肽活性。例如，具有与SEQ ID NO:1、3或5至少70%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列被称为是基本上相同。
术语“功能性变体”是指与天然存在的序列具有基本上相同的氨基酸序列的多肽，或由基本上相同的核苷酸序列所编码的多肽，且能够具有天然存在的序列的一个或多个活动的多肽。
序列之间的同源性或序列同一性的计算（该术语在本文可互换使用）执行如下。
为了测定两个氨基酸序列、或两个核酸序列的百分比同一性，出于最佳比较的目的来比对序列（例如，可将缺口引入第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中为获得最佳比对，且非同源序列可以出于比较的目的不予以考虑）。在一个优选的实施方案中，出于比较的目的比对的参照序列的长度是参照序列长度的至少30%，优选地至少40%，更优选地至少50%、60%，并且甚至更优选地至少70%、80%、90%、100%。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中相应位置的相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么所述分子在那个位置是相同的（如本文所使用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”）
两个序列之间的百分比同一性是在考虑到为了所述两个序列的最佳比对而需要引入的缺口数和各个缺口的长度的条件下，这些序列所共享的相同位置的数的函数。
序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的测定可以使用数学算法完成。在一个优选地实施方案中，两个氨基酸序列之间的百分比同一性使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法测定，该算法已经纳入GCG软件包（可在http：//www.gcg.com获得）的GAP程序中，其使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、6或4的缺口加权和1、2、3、4、5或6的长度加权。在又一个优选的实施方案中，两个核苷酸序列之间的百分比同一性使用GCG软件包（可在http：//www.gcg.com获得）中的GAP程序测定，其使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口加权和1、2、3、4、5或6的长度加权。特别优选的参数设定（也是未另外指明时应该使用的参数设定）是Blossum62得分矩阵，且缺口罚分为12，缺口延伸罚分为4，而移码缺口罚分为5。
两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS,4：11-17)的算法测定，该算法已经纳入ALIGN程序(2.0版），其使用PAM120重残表，缺口长度罚分为12且缺口罚分为4。
本文所描述的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”针对公共数据库进行检索，例如，以鉴定其他家族成员或相关序列。这类检索可以使用Altschul，等（1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来进行。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序，得分=100，字长=12来进行以获得与本发明的BMP-10/BMP-10受体核酸（SEQ ID NO:1)分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序，得分=50，字长=3来进行以获得与本发明的BMP-10/BMP-10受体（SEQ ID NO:1)蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得为了比较的目的的含缺口的比对，可以利用如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所描述的GappedBLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序的缺省参数（例如，XBLAST和NBLAST)。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
本发明还包括在低、中或高严格性下杂交至所述核酸的序列。如本文所使用，术语“在低严格性、中严格性、高严格性或极高严格性条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。执行杂交反应的指导可在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到，其通过引用合并入本文。含水和不含水的方法均在该参考中描述且任意一种都可以使用。本文提及的具体杂交条件如下：1）低严格性杂交条件是在6X氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中在约45℃，然后在0.2X SSC，0.1％SDS中在至少50℃下洗涤两次（对于低严格性条件洗涤液的温度可提高到55℃）；2）中等严格性杂交条件是在6X SSC中在约45℃，然后在0.2X SSC，0.1％SDS在60℃中洗涤一次或多次；3）高严格性杂交条件是在6X SSC中在约45℃，然后在0.2X SSC，0.1％SDS在65℃洗涤一次或多次；以及优选地4）极高严格性杂交条件是在0.5M钠磷酸盐，7％SDS在65℃，然后在0.2X SSC，1％SDS在65℃洗涤一次或多次。极高严格条件（4）是优选的条件，且是未另外指明时应该使用的条件。
胶原蛋白7或其功能性片段的纯化
通过本文所描述的重组方法生产的蛋白质可从宿主细胞培养系统根据现有技术的标准规程（如沉淀、离心等）进行回收。本文所描述的重组胶原蛋白7可分泌到宿主细胞培养基中并通过硫酸铵沉淀和随后的离心进行回收；如以下参考中所阐释(Chen et al.J Bio Chem277(18):2118-2124(2002))。本文所描述的通过重组和分子生物学的方法所生产和回收的蛋白质，可根据现有技术的标准规程（例如，透析、离子交换层析、亲和层析、SDS凝胶电泳等）进行纯化。本文所描述的重组胶原蛋白7可通过离子交换层析纯化；如以下参考中所阐释(Chen et al.J Bio Chem277(18):2118-2124(2002))。
实施例
实施例1胶原蛋白7的生产和纯化
继代培养和冷冻细胞
1.用PBS（10毫升P150板）洗涤细胞。
2.加入6ml胰蛋白酶（PBS中0.05％胰蛋白酶-EDTA），并在37℃培养箱中孵育4至6分钟。细胞将分离为层。
3.加入6ml生长培养基，然后在圆锥形离心机以2K旋转5分钟。4.在生长培养基中重悬细胞并以1:5比例继代培养细胞。
5.为冷冻细胞，我们使用含10%DMSO的生长培养基。一个融合P150板将产生大约2千万个细胞。
解冻和细胞再生长
1.取病毒RDEB/FB/C7(5X106)并在37℃水浴中简单解冻。
2.放入含20ml生长培养基的P150板中并孵育过夜。
3.第二天更换新鲜的培养基。细胞应在2至3天后到达融合。
4.直接取出30μl培养基并接受抗VII型胶原蛋白抗体的免疫印迹以确保VII型胶原蛋白在培养基中的存在。
生长和收获培养基
生长培养基：DMEM/F12(1:1)添加L-谷氨酰胺和L碳酸氢钠(Mediatech,Inc.,DMEM以13.48g/L Cat.No.50-003-PB制备10L和Ham’s F-12培养基以10.64g/L Cat.No.50-040-PB制备10L)，10%FBS(Omega Scientific Cat#FB-02)和200μg/ml抗坏血酸(SigmaCAT#A4544)（1ml100mg/ml的储备溶液加入到500ml培养基）
无血清培养基：无血清和抗坏血酸的DMEM/F12。
1.在P150板中20ml生长培养基中培养基因校正RDEB成纤维细胞，直至融合。
2.早上加入15ml无血清培养基（例如周一早上）。
3.第二天下午收获培养基并加回20ml生长培养基至细胞（周二下午）。
4.两天后，还在早上加入无血清培养基（周四早上）。
5.第二天下午收获培养基（周五下午）。
6.在下周一重复这个循环至少3至4个月，直至细胞分离（一段时间细胞可以持续6个月，并仍分泌大量Ⅶ型胶原蛋白）。
基因校正成纤维细胞的无血清培养基中含有大约4至8mg/LⅦ型胶原蛋白。纯化后，0.7至1mg的Ⅶ型胶原蛋白通常从1升培养基获得。
Ⅶ型胶原蛋白的纯化
材料：
硫酸铵
EDTA：500mM,pH8
NEM：100mM
PMSF：100mM
Q琼脂糖TM Fast Flow(GE Healthcare CAT#17-0510-01)
1X缓冲液A:65mM NaCl
2mM Tris-HCl pH8.6
1mM EDTA
对于2L10X缓冲液A:76.11g NaCl
250ml2M Tris-HCl pH8.6
40ml0.5M EDTA
缓冲液B:50mM Tris pH7.8 缓冲液C:50mM Tris pH7.5
150mM NaCl 2M尿素
5mM EDTA 0.5M NaCl
2mM MEM 1mM EDTA
2mM PMSF 2mM MEM
2mM PMSF
第1天
1.收集经调节的细胞培养基并在4℃下以3000rpm旋转10分钟以除去细胞碎片。
2.测量收获体积（收集的完全培养基）
3.加入抑制剂：5mM EDTA（100倍）、50μM NEM和50μM PMSF(2000倍)
4.在冰上缓慢加入硫酸铵粉：0.3g/mL
5.4℃搅拌过夜。
第2天
6.在Beckman J2-M1转子14中以13,000rpm旋转1.5–2小时
7.弃上清液，然后风干沉淀10-15分钟。
8.把沉淀加入缓冲液A中：每50ml的收获体积使用1ml的缓冲液。
9.用DI H2O冲洗透析膜。
10.针对1X缓冲液A透析3次：每2小时更换一次，每次更换用2升。最新更换用于过夜。将1ml NEM和PMSF加入缓冲液。
第3天
11.以9k旋转透析培养基20分钟。注意体积改变。
12.除去上清液(S1)并放入单独的试管中。
13.重悬沉淀于等体积的缓冲液B中作为透析体积。
14.将其放置于实验台上约10分钟。
15.以9k离心20分钟。
16.除去上清液(S1')并放入另一个试管中。
17.重悬该沉淀于2ml的缓冲液C中以9k离心20分钟并收集上清液(S2)。Ⅶ型胶原蛋白将以不同的纯度在所有馏分中出现。S1馏分含有约50%Ⅶ型胶原蛋白但非常脏。通常该S1馏分不再用于进一步的纯化。良好的透析下，大部分胶原蛋白将在S1’中更纯。次优的透析下，大部分胶原蛋白将在S1馏分中，且非常脏。通常对该S1'馏分进行进一步Q-琼脂糖柱纯化。
来自S1'的Ⅶ型胶原蛋白柱纯化
18.用琼脂糖珠填充柱（（使用前珠必须摇匀入溶液），并令其沉淀成所需体积。该柱的体积应是来自S1'的样品的约1/2装填量。
19.不能让该柱变干。用5x柱体积的缓冲液B进行洗涤（因此，如果是4ml柱则用20ml缓冲液B进行洗涤）
20.准备具有与柱体积的等体积的洗涤和洗脱试管。
21.在小eppendorf中保留200μl蛋白质样品并储存在冰上（以在最后运行凝胶作为对照）
22.制成试管并贴标签：2Xwash（缓冲液B），0.3M、0.4M和1.0M。凡是前面有2X的是指2倍柱体积（因此，如果柱体积为4ml，那么就用8ml）。装填样品上柱，小心不要过度搅乱柱表面。放置标有“流过物”的试管以收集流过物
23.所有东西保存在冰上。当样品已被流过一次，装填流过物使其再流一次并用标有“流过物”的试管收集流过物。
24.在柱运行干燥之前，用缓冲液B进行洗涤（相当于样品体积）两次并用标有洗涤的试管（因此如果是4ml，那么就用8ml缓冲液B）收集。继续用不断增加的盐浓度洗脱且以1.0M.2X洗涤(缓冲液B)、2X0.3M、2X0.4M和1.0M A,1.0M B结束。（注：大部分C7在1.0M出现）。凡是前面有2X的是指2倍柱体积（因此如果柱体积是4ml那么使用8ml）。
25.加入抑制剂PMSF和NEM。1:100倍稀释到各个洗脱试管（因此如果是40ml使用40μl）。大部分C7将在0.5-1M经洗脱的馏分出现。26.使样品在凝胶上运行（凝胶每次仅容纳9个样品）。给9个小eppendorf管贴标签X2（1个用于western印迹而另一个用于Coomassie染色）：装填上样，持续运行，0.3M、0.4M...1.0M。
27.对上样染色：12μl BME/100μl的4X样品缓冲液→旋涡。
28.向所有试管加入10μl染料。
29.向试管中加入10ul样品用于ECL，40μl用于Coomassie亮蓝染色。30.在6％丙烯酰胺凝胶上运行经收集的馏分用于Western印迹分析和Coomassie亮蓝染色。
VII型胶原蛋白的浓度和过滤
1.混合来自0.5、0.7和1.0M洗脱的VII型胶原蛋白馏分，用缓冲液B3倍（例如，17ml到50ml）进行稀释。
2.装填50ml经稀释的馏分到1.5ml的Q-琼脂糖柱中两次。
3.用1.5ml缓冲液B洗涤柱两次。
4.用缓冲液B在1.0M盐中洗脱柱三次（将试管标为1.0A、1.0B和1.0C）。
5.用PBS透析浓缩物。
6.用0.2μm Super Membrane Acrodisc Syringe Filter(Pall LifeSciences)过滤。
7.冻存于－80℃冰箱中
其它实施方案包含在以下权利要求范围内。
Claims (42)
1.制造胶原蛋白7的方法，包括：
提供细胞，其经重组地操作以表达胶原蛋白7或其功能性片段，以及，可选的一种或多种增强胶原蛋白7的表达的多肽，例如，脯氨酸肽酶；
在足够用于生产胶原蛋白7和脯氨酸肽酶的条件下培养所述细胞，
从而制造胶原蛋白7。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞经基因操作以表达糖基转移酶。
3.权利要求2的方法，其中所述糖基转移酶是唾液酸转移酶。
4.权利要求1的方法，其中所述细胞包括外源引入的、编码胶原蛋白7或其功能性片段的核酸，例如，本文所描述的高甘氨酸密码子优化的核酸序列。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞包括外源引入的、编码脯氨酸肽酶的核酸。
6.权利要求1的方法，其中所述细胞包括外源引入的、编码糖基转移酶的核酸。
7.权利要求1的方法，其中所述细胞包括表达载体，其包括编码胶原蛋白7的序列。
8.权利要求7的方法，其中所述细胞包括第二表达载体，其包括编码脯氨酸肽酶的序列。
9.权利要求7的方法，其中所述细胞包括第三表达载体，其包括编码糖基转移酶的序列。
10.权利要求7的方法，其中所述细胞包括第二表达载体和第三表达载体，所述第二表达载体包括编码脯氨酸肽酶的序列，所述第三表达载体包括编码糖基转移酶的序列。
11.权利要求7的方法，其中所述表达载体进一步包括编码脯氨酸肽酶的序列。
12.权利要求7的方法，其中所述表达载体进一步包括编码糖基转移酶的序列。
13.权利要求7的方法，其中所述表达载体进一步包括编码脯氨酸肽酶的序列和编码糖基转移酶的序列。
14.权利要求1的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
15.权利要求1的方法，其中所述细胞是CHO细胞。
16.权利要求1的方法，其中所述细胞是HEK293细胞。
17.权利要求1的方法，其中所述胶原蛋白7是人胶原蛋白7。
18.权利要求1的方法，其中所述脯氨酸肽酶是人脯氨酸肽酶。
19.权利要求2的方法，其中所述糖基转移酶是人糖基转移酶。
20.权利要求1的方法，进一步包括从所述已培养的细胞回收胶原蛋白7或其功能性片段。
21.权利要求1的方法，其中所述胶原蛋白7或其功能性片段回收自培养基。
22.权利要求1的方法，进一步包括从所述已培养的细胞纯化胶原蛋白7或其功能性片段。
23.权利要求1的方法，进一步包括从培养基纯化胶原蛋白7或其功能性片段。
24.权利要求23的方法，其中至少30、40、50、60、70、80、90或95％的所述胶原蛋白7或其功能性片段并入同三聚体中。
25.权利要求23的方法，其中至少30、40、50、60、70、80、90或95％的所述胶原蛋白7或其功能性片段并入六聚体中。
26.本文所描述的载体。
27.载体的集合，包括至少两种本文所描述的载体。
28.本文所描述的细胞。
29.本文所描述的细胞的经分离的制备物。
30.细胞培养物，包括上述权利要求中任一项的细胞、培养基和由所述细胞生产的胶原蛋白7。
31.制造适合用于表达胶原蛋白7或其功能性片段的细胞的方法，包括：
重组地操作所述细胞以表达重组胶原蛋白7或其功能性片段；以及
可选地，重组地操作所述细胞以表达重组脯氨酸肽酶；
从而制造适合于表达重组胶原蛋白7或其功能性片段的细胞。
32.权利要求31的方法，其中在所述细胞经重组地操作表达重组糖基转移酶之前，所述细胞经重组地操作以表达胶原蛋白7或其功能性片段。
33.权利要求31的方法，其中在所述细胞经重组地操作表达重组糖基转移酶之后，所述细胞经重组地操作以表达胶原蛋白7或其功能性片段。
34.权利要求31的方法，其中在所述细胞经重组地操作表达重组糖基转移酶的同时，所述细胞经重组地操作以表达胶原蛋白7或其功能性片段。
35.权利要求31的方法，其中在操作所述细胞以重组地表达胶原蛋白7或其功能性片段之前，所述细胞经重组地操作以表达重组糖基转移酶。
36.权利要求31的方法，进一步包括重组地操作所述细胞以表达重组糖基转移酶。
37.权利要求31的方法，其中在操作所述细胞以重组地表达胶原蛋白7或其功能性片段之前、之后或同时，所述细胞经重组地操作以表达重组糖基转移酶。
38.通过本文所描述的方法所制造的胶原蛋白7或其功能性片段。
39.通过本文所描述的方法所制造的胶原蛋白7或其功能性片段的经纯化或经分离的制备物。
40.胶原蛋白的经纯化或经分离的制备物，其中至少30、40、50、60、70、80、90或95%的所述胶原蛋白7或其功能性片段并入同三聚体中。
41.胶原蛋白的经纯化或经分离的制备物，其中至少30、40、50、60、70、80、90或95%的所述胶原蛋白7或其功能性片段并入六聚体中。
42.纯化胶原蛋白7或其功能性片段的方法，包括：
提供经调节的细胞培养基；
沉淀蛋白质，例如，用硫酸铵;
溶解所述沉淀的蛋白质;
透析所述溶解的蛋白质;
沉降所述透析的样品以形成上清液;和
对上清液进行阴离子交换色谱法分析，例如，用Q琼脂糖;
从而纯化胶原蛋白7或其功能性片段。
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