CN1423659A - 重组明胶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了重组明胶及其组合物,以及它的生产和使用方法。

Description

重组明胶
本申请要求2000年5月15日提交的美国临时申请号60/204,437和1999年11月12日提交的美国临时申请号09/439,058的权益，其说明书在此完整引入以供参考。
发明领域
本发明涉及重组明胶和含有重组明胶的组合物和药剂，生产重组明胶的方法和在各种应用中这些明胶的用途。
发明背景
明胶是胶原的衍生物，动物的主要结构和结缔蛋白。
明胶衍生自胶原变性，含有具有Gly-X-Y重复的多肽序列，其中X和Y最常见是脯氨酸和羟脯氨酸残基。这些序列形成三链螺旋结构并影响明胶多肽的凝胶化能力。目前可得的明胶是通过通常是牛和猪来源的动物皮毛和骨骼加工提取的。明胶的生物物理性质使它成为多用途的材料，广泛用于各种应用和工业。明胶用于例如许多药物和医学、照像、工业、化妆品和食品饮料产品以及制造过程中。因此明胶是商业上有价值和多用途的产品。
明胶的生产
明胶通常是用牛和猪来源，特别是从皮毛和骨骼中天然存在的胶原制造的。在某些情况下，可从例如鱼、鸡或马来源中提取明胶。典型明胶生产的原料，例如皮和骨骼来自经政府认证的核查并适用于人类消费的动物。因为存在污染因子例如可转移的海绵状脑病(TSE)，特别是牛海绵状脑病(BSE)和羊瘙痒病等(见例如Rohwer，R.G.(1996)Dev Biol Stand 88：247-256)对于该原料的感染性有担心。这种问题对于用于药物和医学用途的明胶尤其关键。
近来，对于这些材料(其中大部分来自牛来源)的安全性的关注增加了，导致各种含明胶的产品成为几项规定措施的焦点，来减少与新变种克-雅氏病(nvCJD)，一种致命的人神经疾病有关的牛海绵状脑病(BSE)扩散的可能危险。有担心目前用于从动物组织和骨骼提取明胶的方法的纯化步骤不足以除去感染性，因为携带SE的组织(如脑组织等)的污染。美国和欧洲制造商规定在动物或人食品或药物、医学或化妆品应用的明胶原料不能是来自数量正在增加的BSE国家的。另外，法规规定在明胶生产中不能使用某些材料，例如牛脑组织。
目前的生产过程涉及几个纯化和净化步骤，可能需要剧烈和冗长的提取模式。用炼油法处理动物皮毛和骨骼，提取的材料经过各种化学处理，包括长时间接触高酸性或碱性溶液。许多纯化步骤涉及洗涤和过滤以及各种热处理。用酸除盐和石灰处理除去杂质，例如非胶原的蛋白质。骨骼必须脱脂。可在过程中加入其它洗涤和过滤步骤，离子交换和其它化学和灭菌处理，来进一步纯化材料。另外，在加工后仍可能存在污染物和杂质，得到的明胶产物因此必须净化，纯化，常常在准备使用前需要进一步浓缩。
商品明胶常常分为A型和B型。这些分类反映了作为提取过程接受的预处理提取物来源。A型通常衍生自酸加工的材料，通常是猪皮，B型通常衍生自碱或石灰加工的材料，通常是牛骨(骨胶原)和皮毛。
在A型明胶的提取中，方法通常涉及连续用水洗涤和用稀释的酸处理新鲜或冷冻的猪皮。酸处理的猪皮再进行洗涤，然后重复提取，其中用热水处理，特别是要部分水解存在的胶原。所得的提取物，明胶的稀溶液经过滤和蒸发将得到的浓缩液冷却或冷冻成凝胶。然后在干燥管道中处理凝胶，或通过连续干燥器或其它干燥装置。
在石灰法中，B型明胶衍生自供体毛皮和皮屑，对其洗涤并用石灰处理。石灰处理可长达1-3个月，通常在60天左右。洗涤经石灰处理的毛皮，并用稀酸处理。然后用热水水解毛皮，得到的提取物用如上面酸处理法所述的方法处理。
还可以从骨胶原来源中加工B型明胶。洗涤硬骨，脱脂，连续用稀酸，例如盐酸处理浸析。酸处理与骨骼的矿物质成分反应，它随着酸溶液被除去，留下骨胶原或软化的骨骼。该骨骼有机物质洗去剩余的酸后，干燥储藏或立即用石灰处理。石灰处理后，如上文从牛皮制备明胶所述处理骨胶原。在所有情况下，在最终过滤，去除矿物质，浓缩和干燥步骤后，将得到的明胶产物分批，进行各种物理、化学和细菌学测试，来确定级别和纯度，并根据商业需求磨碎和混合。在A和B型提取过程中，得到的明胶产物通常是明胶分子的混合物，大小从几千到几十万道尔顿不等。
鱼明胶分为凝胶化或非凝胶化型，和通常作为A型明胶加工，用于一些商业应用。凝胶化型通常衍生自一些温水鱼的皮肤，而非凝胶化型通常衍生自冷水鱼。鱼明胶具有广泛变化的氨基酸组分，与动物明胶不同，脯氨酸和羟脯氨酸残基比例通常较低。与其它动物明胶相反，鱼明胶通常在低得多的温度下，甚至在平均分子量相当时仍保持液态。与动物明胶一样，鱼明胶是从鱼皮中经过处理然后水解提取的。另外，与动物提取过程相同，提取鱼明胶的过程得到不均匀的产物。
总结
明胶是用于各种应用的重要产品。明胶的多种用途在于该独特的蛋白质混合物的不同特征和性能。目前提取的方法得到作为蛋白质不均匀混合物的明胶产品，含有分子量分布广泛的多肽。有时必需混合有时必须混合各种产物批料，来获得含有适用于所需用途的具有物理性能的明胶混合物。
需要更均一的产品和用更可重现的方法产生的明胶。需要能得到具有可重现物理特性的均一物质，例如在各种产品和方法中，可得到具有特定特征，例如固定的分子量范围的明胶将得到可重复和可调控的表现。因此需要制备明胶的可靠和可重复的方法，提供具有可控制特征的均一产品。
另外，在药物、化妆品、食品和饮料工业中，尤其需要除了从动物来源，例如牛、猪骨骼和组织提取获得的以外的明胶来源。另外，由于目前可得的明胶是从动物来源如骨骼和组织生产的，有担心含明胶产品的不良免疫原性和感染性(见例如Sakaguchi，M.等(1999)J.Aller.clin.Immunol.104：695-699；Miyazawa等(1999)Vaccine 17：2176-2180；Sakaguchi等(1999)Immunology 96：286-290；Kelso(1999)J Aller.Clin.Immunol.103：200-202；Asher(1999)Dev Biol Stand99：41-44；和Verdrager(1999)Lancet 354：1304-1305)。另外，可得到不通过动物来源，如组织和骨骼提取的基础物质将克服各种伦理、宗教和社会要求。不需要从动物来源，例如组织和骨骼提取的重组物质可用于例如制造食品和其它食用产品，包括胶囊化的药物，适用于具有饮食限制的人，例如信奉犹太教和伊斯兰教的人。
虽然明胶制造商和最终用户寻找和测试了许多目前可得的动物来源明胶的天然和合成的替代品，但是没有发现通用的替代品。找到了针对一些用途的替代品，例如在VCAPS胶囊中使用纤维质原料(CAPSUGEL；Morris Plains，NJ)，或在照像乳液中用来自小鼠和大鼠胶原序列的非天然的明胶样蛋白质替代(见例如Werten，M.W.等(1999)Yeast 15：1087-1096；和De Wolf，Anton等，欧洲申请号EP 1014176A2)。然而，对于大多数基于明胶的方法和产品来说，该关键物质的性能不能重复，替代品未被接受。因此，需要一种以合成和可重复方式生产明胶的方法，其中得到的产品可作为具有所需性能的合理替代品。
总的说，需要一种能提供明胶性能的通用替代物质，同时实现产品来源的可重复和受控。需要一种无需剧烈和冗长的加工的明胶生产方法，和制造得到更均一产品，能稳定产生大量和不同类型的、适合多种应用的明胶的方法。需要能轻易适合不同用途，并满足现存的保健和其它需求的多用途明胶。
本发明通过提供一种用重组法获得通用的普遍替代材料解决了这些和其它需要，该材料适合用于目前使用明胶的非常广泛的应用领域。本材料可设计成具有特定应用所需的性质和特征，因此能提供新的性能，用于之前不能使用的领域。
发明简述
本发明针对重组明胶，含有重组明胶的组合物和药物，以及制备和使用重组明胶的方法。
在一个方面，本发明提供了一种含有重组明胶的组合物。在一个实施例中，重组明胶具有选自约5kDa、8kDa、9kDa、14kDa、16kDa、22kDa、23kDa、36kDa、44kDa和65kDa的分子量。在另一个实施例中，重组明胶具有约0-50kDa、约10-30kDa、约30-50kDa、约10-70kDa、约50-70kDa、约50-100kDa、约100-150kDa、约150-200kDa、约200-250kDa、约250-300kDa和约300-350kDa的分子量范围。在一个方面，重组明胶具有大于300kDa的分子量。
在另一个方面，本发明包含一种重组明胶，具有选自50、100、150、200、250和300的Bloom强度。在另一个实施例中，Bloom强度在0-100之间。
在一些实施例中，本发明提供了一种含有重组明胶的组合物，其中重组是非羟化的、完全羟化的或部分羟化的。在许多方面，重组明胶具有的羟化百分数，选自20-80％、30-80％、40-80％、60-80％、20-60％、30-60％、40-60％、20-30％、20-40％和30-40％。在其它实施例中，重组明胶被完全羟化，部分羟化或无羟化。
在一个方面，本发明提供了一种含有重组明胶的组合物，其中重组明胶含有重组明胶多肽的均一混合物。在另一个方面，重组明胶是重组明胶多肽的非均质混合物。
在一个实施例中，本发明提供了一种含有重组明胶的组合物，其中重组明胶衍生自一种胶原而不含任何其它胶原。在具体实施例中，此一种胶原选自I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型、IX型、X型、XI型、XII型、XIII型、XV型、XVI型、XVII型、XIX型和XX型胶原。考虑了重组明胶组合物，其中重组明胶具有1.000EU/mg以下，0.500EU/mg以下，0.050EU/mg以下和0.005EU/mg以下的内毒素含量的重组明胶。
在特定实施例中，本发明的重组明胶含有选自SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、31和33的氨基酸序列。还提供了编码这些氨基酸序列的多聚核苷酸，以及含有该多聚核苷酸的表达载体和宿主细胞。在一些方面，本发明的宿主细胞是原核或真核的。在一个实施例中，真核宿主细胞选自酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。本发明还提供了含有该多聚核苷酸的转基因动物和转基因植物。
还提供了含有选自SEQ ID NO：26、27、28和29的氨基酸序列的重组明胶。
在一个方面，本发明包括生产重组明胶的方法。一种方法包括提供重组胶原或原胶原或其片段或变体；加工重组胶原或原胶原或其片段或变体生产重组明胶。在一个方面，加工成重组明胶的重组胶原是重组人胶原。在另一方面，重组胶原是通过与至少一条编码胶原或原胶原的多聚核苷酸和至少一条编码翻译后加工酶或其亚基的多聚核苷酸共表达而生产的。在一个实施例中，翻译后加工酶是脯氨酰羟化酶。
在本发明的另一种方法中，重组胶原是直接从改变的胶原构建物中生产的。在另一个实施例中，重组明胶是通过共表达改变的胶原构建物和至少一条编码翻译后加工酶或其亚基的多聚核苷酸而生产的。在一个实施例中，翻译后加工酶是脯氨酰羟化酶。
还提供了产生具有选定解链温度的重组胶原的重组明胶的方法。在一个实施例中，该方法包括对重组明胶赋予对应所选解链温度的羟化百分数。在另一个实施例中，赋予步骤包括在脯氨酰羟化酶的存在下从改变的胶原构建物中生产重组明胶。在其它方面，赋予步骤包括从羟化的重组胶原中衍生重组明胶，或包括羟化非羟化的重组明胶。
考虑了本发明中重组明胶的各种用途。特别是，本发明包括含有明胶的成胶囊剂、稳定剂、薄膜形成剂、润湿剂、乳化剂、增稠剂、胶凝剂、胶态剂、粘合剂、絮凝剂和精炼剂。
本发明在一个实施例中提供了一种含有重组明胶的药物组合物。在另一个实施例中，重组明胶是人重组明胶。在另一个实施例中，重组明胶无免疫原性。在特定实施例中，本发明提供了一种含有重组明胶的硬明胶胶囊、软明胶胶囊、血浆补充剂、胶体体积置换物质、异植体涂层、医用海绵、医用栓、药物稳定剂和微载体。在一个方面，本发明包括一种试剂盒，它含有含有重组明胶的组合物，以及对个体传输该组合物的装置。
还考虑了含有重组明胶的食用组合物，例如蛋白质补充剂、脂肪替代品、营养补充剂、食用糖衣和各种含有重组明胶的微胶囊。还考虑了含有重组明胶的照像组合物，以及其中重组明胶部分或完全羟化的实施例。本发明还提供了含有重组明胶的化妆品组合物。
在其它实施例中，本发明包括一种含有重组明胶的化妆品组合物，一种含有重组明胶的工业组合物，一种含有重组明胶的细胞培养组合物，和一种含有重组明胶的实验室用组合物。还考虑了其它实施例，例如含有本发明的重组明胶的微阵列或编码这些重组明胶的多聚核苷酸。
附图简述
图1列出了重组明胶表达的结果。
图2A和2B列出了显示重组明胶支持细胞附着的结果。
图3列出了显示蛋白酶解产生稳定的重组明胶的结果。
图4列出了显示羟化的重组明胶生产的结果。
图5列出了显示体外羟化后重组明胶纯化的结果。
图6列出了存在或不存在脯氨酰4-羟化酶时表达的重组明胶的稳定性的结果。
图7列出了显示补充表达培养基增强重组明胶表达的结果。
图8列出了市售明胶与交联的重组明胶比较的结果。
图9列出了市售明胶的分子量分布比较结果。
图10A、10B、10C、10D、10E和10F列出了显示120℃下市售明胶水解的结果。
图11A、11B、11C和11D列出了显示150℃下市售明胶水解的结果。
图12A和12B列出了显示重组I型和III型人胶原酸和热水解的结果。
图13显示了重组人I型胶原酶解的结果。
图14列出了用重组人I型胶原免疫的豚鼠的抗血清蛋白质印迹分析重组人胶原和重组人明胶。
图15A和15B列出了显示用重组人I型胶原免疫的豚鼠的抗血清与I型胶原的特定的溴化氰片段的反应。
图16A和16B显示用重组人I型胶原免疫的豚鼠抗血清不与重组人明胶反应的ELISA结果。
发明详述
在描述本发明的蛋白质、核苷酸序列和方法之前，应理解本发明不限于所述的具体方法、步骤、细胞系、载体和试剂，因为这些可以改变。还应理解本文所用的术语仅为描述特定实施例，而不是为了限制本发明的范围。
必须注意本文和在权利要求中所用的单个“一”、“一个”和“该”包括复数，除非上下文明确说明。因此例如“一个宿主细胞”指一个或多个这样的宿主细胞及其本领域技术人员已知的等价物，“一种抗体”指一种或多种抗体及其本领域技术人员已知的等价物，等等。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意义。虽然在实施和测试本发明中可使用任何与本文所属的相似或等价的方法和材料，现在描述优选的方法、装置和材料。所有本文提到的出版物在此引入以供参考，用于描述和公开细胞系、载体和方法等，它们在可与本发明结合使用的出版物中有所报道。本文中的任何陈述都不被认为是承认本发明无权根据先前的发明提前公开。本文引用的所有文献在此完整引入以供参考。
本发明的实施将使用(除非另外说明)本领域能力范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药物学的方法。这些技术在文献中有完整解释。见例如Gennaro，A.R.编(1990)Remington’s Pharmaceutical Science，第18版，MackPublishing Co.；Colowick，S.等编，Methods in Enzymology，Academic Press，Inc.；Handbook of Experimental Immunology，Vols.I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986，Blackwell Scientific Publications)；Maniatis，T.等编(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版，I-III卷，Cold SpringHarbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等编(1999)Short Protocols inMolecular Biology，第四版，John Wiley & Sons；Ream等编(1998)MolecularBiology Techniques：An Intensive Laboratory Course，Academic Press)；PCR(Introduction to Biotechniques Series)，第二版(Newton & Graham编，1997，Springer Verlag)。
定义
术语“胶原”指任一已知胶原类型，包括胶原I-XX，和任何其它胶原，不论天然、合成、半合成或重组的。该术语也包括原胶原。术语胶原包含任何一条多聚核苷酸编码的单链多肽，和胶原链的同三聚和异三聚集合。术语“胶原”特别包括其变体和片段，及其功能性等价物和衍生物，它们优选保留至少一种胶原的结构或功能特征，例如(Gly-X-Y)n结构域。
术语“原胶原”指对应胶原I-XX型任何一种的原胶原，以及对应任何其它胶原，不论是合成、半合成或重组的原胶原，它们具有额外的C-末端和/或N-末端前肽或端肽，其有辅助三聚体装配、溶解性、纯化或任何其它功能，然后由与胶原产生有关的N-蛋白酶、C-蛋白酶或其它酶(例如蛋白水解酶)切割。术语原胶原特别包含其变体和片段，及其功能性等价物和衍生物，其优选保留胶原的至少一个结构或功能特征，例如(Gly-X-Y)n结构域。
本文所用的“明胶”指任何明胶，不论是用传统方法提取或重组或原生物合成的，或任何具有明胶的至少一种结构和/或功能特征的分子。明胶目前是通过提取衍生自动物(例如牛、猪、啮齿类、鸡、马、鱼)来源，如骨骼和组织的胶原获得的。术语明胶同时包括包含在明胶产物中的一种以上多肽的组合，和形成明胶物质的单独的多肽。因此，本发明所使用的重组明胶同时包括构成本发明明胶多肽的重组明胶物质，和本发明的单独的明胶多肽。
可衍生明胶的多肽是胶原、原胶原和其它具有胶原的至少一种结构和/或功能特征的多肽。该多肽可以含有一条胶原链或胶原同三聚体或异三聚体或其任何片段、衍生物、寡聚体、聚合物或其亚基，含有至少一种胶原结构域(Gly-X-Y区)。该术语特别指天然情况下不存在的经工程改造过的序列，例如经改变的胶原的构建体等。经改变胶原的构建体是含有通过缺失、添加、取代或其它改变从天然存在的胶原基因改变的序列的多聚核苷酸。
“佐剂”是任何加到药物或疫苗中提高、增强或辅助其作用的药剂。在疫苗制剂中使用的佐剂可以是免疫性药剂，它能通过对非特异性刺激因子产生免疫应答来增强免疫应答。佐剂常用于灭活疫苗。
术语“等位基因”或“等位基因序列”指基因序列的交换形式。等位基因可从核酸序列中的至少一个突变得到，可导致改变的mRNA或多肽，其结构或功能可以改变也可以不改变。任何给定的天然或重组基因可以不具有，具有一种或多种等位基因形式。产生等位基因的通常突变改变常常归因于天然缺失、添加或核苷酸的替换。这些改变类型中每一种都可以在给定序列中发生一次或多次单独发生或联合其它改变，。
“改变的”多聚核苷酸序列包括具有不同的核苷酸缺失、插入或取代，得到编码相同或功能上等价的多肽的多聚核苷酸的多聚核苷酸序列。该定义中包括显示多态性的序列，它可用或不可用特定的寡核苷酸探针，或通过除去与等位基因的不正确或预计的杂交可以检测的序列，具有除了该多聚核苷酸序列正常染色体座位以外的基因座。
“改变的”多肽可以含有氨基酸残基的缺失、插入或取代，它产生隐性改变并导致功能上等价的多肽。可在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或残基的两性性质基础上产生精密的氨基酸取代，只要保留编码的多肽的生物学或免疫学活性。例如，带负电的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电的极性头部基团，具有相似的亲水性的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸、甘氨酸和丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸和苯丙氨酸和酪氨酸。
本文所用的这些术语“氨基酸”或“多肽”序列或“多肽”指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段，和天然存在或合成的分子。多肽或氨基酸片段是多肽保留该多肽的至少一种结构和/或功能特征的任何部分。在本发明的至少一个实施例中，多肽片段是保留至少一个(Gly-X-Y)n区的片段。
本文所用的术语“动物”例如在“动物胶原”中包含任何胶原，例如天然，合成，半合成或重组的。动物来源包括例如哺乳动物来源，包括但不限于牛、猪、马、啮齿类和羊来源以及其它动物来源，包括但不限于鸡和鱼来源和非脊椎动物来源。
“抗原性”指当引入体内时，一种物质能够刺激免疫应答并产生抗体的能力。能显示抗原性的因子称为抗原性的。抗原性因子可包括但不限于各种大分子，例如蛋白质、脂蛋白、多糖、核酸、细菌和细菌组分、以及病毒和病毒组分。
本文所用的术语“互补”或“互补性”指多聚核苷酸通过碱基配对的天然结合。例如序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。两条单链分子之间的互补性可以是“部分的”，当仅核酸中的一些可以结合，或完整的，当单链分子之间存在完全互补。核酸链之间的互补程度对核酸链杂交的效力和强度有显著影响。这对扩增反应特别重要，它依赖于核酸链之间的结合，在设计和使用例如肽核酸(PNA)分子中也很重要。
“缺失”是氨基酸或核苷酸序列的改变而导致一个或多个氨基酸残基或核苷酸的缺失。
用于多聚核苷酸的术语“衍生的”指化学修饰编码特定多肽的多聚核苷酸或与编码特定多肽的多聚核苷酸互补的多聚核苷酸。这种修饰包括例如：用烷基、酰基或氨基置换氢。本文用于多肽的术语“衍生的”指通过羟化、糖基化、聚乙二醇化或任何相似方法修饰的多肽。术语“衍生物”包含其有衍生出它的分子的至少一种结构和/或功能特征的分子。
当一个分子含有在正常情况下不是分子一部分的额外化学基团时，它被称为“化学衍生物”。该基团可改善分子的溶解性、吸收性、生物半衰期等。基团还可以降低分子的毒性，消除或弱化分子的任何不良副作用等。能介导这些效果的基团是本领域一般可得的，并可在Remington’s Pharmaceutical Sciences，见上中找到。将这些基团与分子偶联的方法是本领域熟知的。
作为术语用于本文的“赋形剂”是任何在药物、疫苗或其它药物组合物配制中用作稀释剂或载体的惰性物质，来赋予合适的一致性或形成药物、疫苗或药物组合物。
本文所用的术语“功能性等价物”指具有特定多肽或多聚核苷酸的至少一种功能和/或结构特征的多肽或多聚核苷酸。功能性等价物可含有能表现出特定功能的修饰。术语“功能性等价物”将包括分子的片段、突变体、杂交物、变体、同类物或化学衍生物。
“融合蛋白”是其中肽序列来自不同蛋白质并可操纵性地连接的蛋白质。
术语“杂交”指核酸序列与互补序列通过碱基配对结合的过程。杂交条件可用例如预杂交和杂交溶液中盐或甲酰胺浓度，或杂交温度限定，是本领域熟知的。杂交可在各种严格条件下发生。
特别是，可通过降低盐浓度，提高甲酰胺浓度，或提高杂交温度来提高严格度。例如，为了本发明，高严格条件下的杂交发生在约37℃-42℃下，约50％甲酰胺中，降低的严格条件下，在约35％-25％甲酰胺中，约30-35℃下。特别是，杂交在最高的严格条件下，42℃，50％甲酰胺，5X SSPE，0.3％SDS和200微克/毫升剪切和变性的鲑鱼精DNA中发生。
对应具体严格水平的温度范围可用本领域已知的方法进一步缩小，例如，通过计算感兴趣的核酸的嘌呤和嘧啶比，据此调节温度。为了除去非专一信号，可依次洗涤印迹，例如在递增的严格条件下，达0.1X SSC和0.5％SDS在室温下洗涤。上述范围和条件的变化是本领域熟知的。
“免疫原性”涉及在生物体内引起免疫应答的能力。显示免疫原性性质的因子称为免疫原性的。因子可包括但不限于各种大分子，例如蛋白质、脂蛋白、多糖、核酸、细菌和细菌组分，以及病毒和病毒组分。免疫原性因子通常具有较高的分子量(通常大于10kDa)。
“感染性”指能感染或能产生感染，指微生物，例如细菌或病毒在体内的侵袭和复制。
术语“插入”或“添加”指多肽或多聚核苷酸中的改变，分别导致与天然存在的分子相比加入一个或多个氨基酸或核苷酸。
本文所用的术语“分离的”指不仅从存在于来自蛋白质天然来源的蛋白质，还从一般其它成分中分离得到的分子，优选指在如果存在仅一种溶剂、缓冲剂、离子或其它通常存在于该溶液中的组分中发现的分子。本文所用的术语“分离的”和“纯化的”不包括其天然来源中存在的分子。
术语“微阵列”指任何核酸、氨基酸、抗体等在基质上的排列。基质可以是任何合适的载体，例如珠、玻璃、纸、硝基纤维素、尼龙、或任何合适的膜等。基质可以是任何刚性或半刚性的载体，包括但不限于膜、滤膜、晶片、芯片、玻片、纤维、珠，包括磁性或非磁性的珠、凝胶、管材、皿、聚合物、微粒、毛细管等。基质可提供包裹的表面和/或具有各种表面形式，例如小凹孔、针、沟、渠和细孔，在其上可结合核酸和氨基酸等。
术语“微生物”可包括但不限于病毒、细菌、衣原体、立克次氏体、支原体、脲原体、真菌和寄生虫，包括感染性寄生虫例如原生动物。
术语“核酸”或“多聚核苷酸”序列或“多聚核苷酸”指寡核苷酸、核苷酸或多聚核苷酸或其任何片段，天然或合成来源的DNA或RNA，它们可以是单链或双链，并且可代表正义或反义链，肽核酸(PNA)或天然或合成来源的任何DNA样或RNA样物质。多聚核苷酸片段是任何保留多聚核苷酸的至少一种结构或功能特征的多聚核苷酸序列的部分。在本发明的一个实施例中，多聚核苷酸片段是编码至少一个(Gly-X-Y)n区的多聚核苷酸片段。多聚核苷酸片段长度可变，例如长度可大于60个核苷酸，至少长100个核苷酸，至少1000个核苷酸或至少10,000个核苷酸。
词组“相似性百分数”(％相似性)指在比较两条或多条多肽或多聚核苷酸序列中发现的序列相似性百分数。相似性百分数可通过本领域熟知的方法确定。例如氨基酸序列之间的相似性百分数可以用Clustal法计算(见例如Higgins，D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene 73：237-244)。Clustal算法将序列通过检测所有碱基之间的距离分成簇。配对排列簇，然后排列组。通过将序列A的长度减去序列A中缺口残基的数目，减去序列B中缺口残基的数目的差，除以序列A和序列B之间的残基匹配和，乘以100计算两条氨基酸序列，例如序列A和序列B之间的相似性百分数。两条氨基酸序列之间低或无同源性的缺口不包括在相似性百分数的计算中。可用本领域已知的其它方法计算相似性百分数，通过改变杂交条件，并可用MEGALIGN程序(DNASTAR Inc.，Madison，Wisconsin)电子化计算。
本文所用的术语“植物”包括指一种或多种植物，即任何真核自养生物，例如被子植物和裸子植物、单子叶和双子叶植物等，包括但不限于大豆、棉花、苜蓿、亚麻、番茄、甘蔗、甜菜、向日葵、马铃薯、烟草、玉米、小麦、水稻、莴苣、香蕉、木薯、红花、含油种子、油菜、芥菜、芸苔、大麻、藻类、海草等。术语“植物”还包括一种或多种植物细胞。术语“植物细胞”包括但不限于植物组织和器官，如种子、悬浮培养物、种胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉、块茎、球茎、鳞茎、花、果、球花、小孢子等。
术语“翻译后加工酶”指任何催化例如任何胶原或原胶原翻译后修饰的酶。术语包括但不限于脯氨酰羟化酶、肽基脯氨酰异构酶、胶原半乳糖苷羟赖氨酰葡糖转移酶、羟赖氨酰半乳糖苷转移酶、C-蛋白酶、N-蛋白酶、赖氨酰羟化酶和赖氨酰氧化酶。
本文所用的术语“启动子”通常指能引发，指导和介导多聚核苷酸序列转录的核酸序列的调控区。启动子可以另外含有识别序列，例如上游或下游启动子元件，它们可以影响转录速率。
术语“非组成型启动子”指通过特定组织诱导转录的启动子，或可以在环境或发育调控下诱导转录，并包括抑制型和诱导型启动子，例如倾向组织的，组织专一性的和细胞类型特异性的启动子。这种启动子包括但不限于可被低氧或冷压力诱导的AdH1启动子，被热压力诱导的Hsp70启动子和可被光诱导的PPDK启动子。
“倾向组织的”启动子是在某些组织中优先引发转录的启动子。“细胞类型特异性”的启动子是主要在例如血管细胞的至少一个器官中的某些细胞类型中驱动表达的启动子。
“诱导型”或“抑制型”启动子是那些在环境控制下，例如转染受到例如环境条件，如缺氧条件，存在光，生物压力等，或内部、化学或生物信号，如甘油醛磷酸脱氢酶、AOX1和AOX2甲醇诱导启动子或物理损伤的影响。
本文所用的术语“组成型启动子”指引发、指导、介导转录，并且在大部分环境条件下和在发育或细胞分化的状态下具有活性的启动子。组成型启动子的例子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMv)35S，衍生自根瘤土壤杆菌T-DNA的1’-或2’-启动子、遍在蛋白1启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子、甘油醛脱氢酶启动子和Nos启动子等。
本文所用的术语“纯化”描述了指定的分子存在于基本不存在其它生物大分子，例如多聚核苷酸、蛋白质等的状态下。术语优选考虑感兴趣的分子存在于溶液中或至少占80％重量；优选至少85％重量；更优选至少95％重量；和最优选至少99.8％重量。可存在水、缓冲液和其它小分子，尤其是具有小于1kDa的分子量的分子。
本文所用的术语“基本纯化的”指从其天然环境取出的，分离或分开，并至少60％，优选75％，最优选90％无其它天然结合成分的核酸或氨基酸序列。
“取代”是一个或多个氨基酸或核苷酸被不同的氨基酸或核苷酸分别置换。
本文所用的术语“转染”指在细胞中引入表达载体的过程。各种转染技术是本领域已知的，例如显微注射、脂质转染或用基因枪。
本文限定的“转化”描述了外源核酸序列，例如DNA进入和改变受体细胞的过程。转化可以在天然或人工条件下用各种本领域已知的方法发生。转化可以依赖于任何已知方法，用于在原核或真核宿主细胞中插入外源核酸序列。基于要转化的宿主细胞的类型选择方法，并且可包括但不限于病毒感染、电泳、热休克、脂转染和颗粒轰击。这种“经转染的”细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的DNA能作为自动复制质粒或作为宿主染色体的一部分来复制，还包括瞬时表达插入的核酸一段有限时间的细胞。
本文所用的术语“疫苗”指已杀死的或改变的微生物、活的减毒生物或活的完全烈性生物或任何其它因子，包括但不限于肽、蛋白质、生物大分子或核酸的天然、合成或半合成的制备物，施用该制备物产生或人工提高对特定疾病的免疫力，以防止类似物质的另一次感染。疫苗可以是活的或灭活的微生物或制剂，包括病毒和细菌，以及亚基、合成的、半合成或基于重组DNA的病毒和细菌。
疫苗可以是单价(一种菌株/微生物/疾病疫苗)的，含有一种微生物或因子(例如脊髓灰质炎病毒)，或一种微生物或因子的多种抗原。疫苗还可以是多价的，例如二价，三价等(混合的疫苗)，含有一种以上的微生物或制剂(例如麻疹-腮腺炎-风疹(MMR)疫苗)或一种以上微生物或因子的抗原。
从活微生物制备活的疫苗。减毒的疫苗是从微生物制备的活疫苗，它经过物理改变或在实验室动物宿主中系列传代，或感染组织/细胞培养物，这种处理产生无毒的株或毒性减弱的株，但维持其产生保护性免疫的能力。活的减毒疫苗的例子包括麻疹、腮腺炎、风疹和犬瘟热疫苗。灭活的疫苗是其中通过例如化学或物理处理(例如甲醛、β-丙内酯或γ辐照)破坏了感染性微生物组分，而不影响病毒包被或膜蛋白下的细菌的抗原性或免疫原性。灭活的或亚基疫苗的例子包括流感、甲肝和脊髓灰质炎(IPV)疫苗。
亚基疫苗由来自病毒、细菌或其它能引起免疫应答的关键大分子组成。这些成分可用许多方法获得，例如通过从微生物纯化，用重组DNA技术产生等。亚基疫苗可含有任何感染因子的合成模拟物。亚基疫苗可包括大分子，例如细菌蛋白读数(如破伤风、白喉)、病毒蛋白(如流感病毒)、荚膜细菌(如流感嗜血菌和肺炎链球菌)的多糖和重组DNA技术产生的病毒样颗粒(如乙肝表面抗原)等。
合成的疫苗是模拟病原体表面抗原的小合成肽构成的，是免疫原性的，或可以是在重组DNA技术帮助下制造的疫苗，包括核酸经过修改的完整病毒。
半合成疫苗或偶联疫苗由与蛋白质载体分子结合的源于微生物的多糖构成。
DNA疫苗含有编码抗原的重组DNA，在摄取DNA的宿主细胞中表达后，诱导针对所编码的抗原的体液和细胞免疫应答。
对于多种感染性因子已经开发了疫苗。本发明针对不论所涉及的因子，可用于疫苗制剂的重组明胶，因此不限于本文为了说明特别描述的疫苗。疫苗包括但不限于痘病毒(天花)、脊髓灰质炎病毒(Salk和Sabin疫苗)。腮腺炎、麻疹、风疹、白喉、破伤风、水痘-带状疱疹(水痘/带状疱疹)、百日咳(百日咳)、卡介苗(BCG，结核病)、流感嗜血杆菌、脑膜炎、狂犬病、流行性霍乱、日本脑炎病毒、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、甲肝、乙肝、腺病毒、黄热病、口蹄疫、单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、登革热、西尼罗河热病毒、土耳其疱疹病毒(马立克氏病)、流感和炭疽。本文所用的术语疫苗包括指各种已经发生或将要发生的感染性和自身免疫病，以及癌症的疫苗，例如针对各种感染性和自身免疫疾病的疫苗，如针对HIV、HCV、疟疾的疫苗，和对乳腺、肺、结肠、膀胱和卵巢癌的疫苗。
多肽或氨基酸“变体”是改变自一种或多种来自特定氨基酸序列的氨基酸序列。多肽变体可以具有保守改变，其中取代的氨基酸具有与被置换的氨基酸具有类似的结构或化学性能，例如用异亮氨酸取代亮氨酸。变体还可以具有非保守取代，其中取代的氨基酸可居于与被取代的氨基酸不同的生理性质，例如用色氨酸置换甘氨酸。类似的小变化还可以包括氨基酸缺失或插入，或同时包括两者。优选氨基酸变体维持特定多肽的某些结构或功能特征。确定取代、插入或除去哪些氨基酸残基的指导可用本领域熟知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTAR，Inc.Madison，WI)找到。
多聚核苷酸变体是一种特定多聚核苷酸序列的变体，优选与特定的多聚核苷酸序列具有至少约80％、更优选至少约90％，最优选至少约95％。本领域技术人员应理解由于基因编码的简并性，可产生编码特定蛋白质的多种不同的多聚核苷酸序列，其中一些与任何已知和天然存在的基因的多聚核苷酸序列的同源性最小。因此，本发明考虑可通过根据可能的密码子选择选择组合制备的每一种可能的多聚核苷酸序列变体。可根据标准密码子三个一组的基因编码产生这些组合，所有都被视为特别公开。
发明
本发明提供了重组明胶和生产这些明胶的方法。本发明的重组明胶提供了稳定和改善的表现，能克服各种健康和其它的担心。用本发明的方法，可直接制造明胶而不用从动物来源通过剧烈和冗长的过程提取。本发明的重组明胶无病原体，例如病原性细菌，可传染性海绵状脑病(TSE)等。本发明的方法使可变性最小化，并在一定程度上实现了目前提取方法中不可获得的可重复性。
对于使用动物衍生的产品，安全性因素，例如对可能的免疫原性，例如抗原性和过敏原性反应的关注提高了。目前使用的动物来源的明胶混合物不能完全确定特征，纯化或复制目前在药物和医学领域中一直受到关注。其它的安全性关注在于提取和纯化过程中导致的细菌污染和内毒素混入。
本发明的重组明胶克服了这些问题，因为它们基本上无细菌污染或内毒素。另外，本发明的重组人明胶与目前使用的动物衍生的相似产品相比提供了明显的优点，因为使用从天然人序列衍生的明胶可消除由于使用非人的动物衍生的蛋白引起免疫应答的危险。
另外，本发明的明胶可以各种不同的物质产生，具有针对不同应用优化的特征。得到的产品比目前可得的衍生自动物的明胶内部更一致和均匀。
在一个实施例中，本发明提供了一种重组明胶。可用各种物种的序列产生明胶，包括但不限于人、牛、猪、马、啮齿类、鸡、羊和鱼物种，或来自无脊椎动物。本发明的明胶与目前制备方法产生的明胶产品相比纯度提高，蛋白质负荷减少，内毒素和其它污染物，包括核酸、多肽、朊病毒等的水平减少。该明胶因此比目前的方法制备的明胶安全，可以高剂量施给人和动物，同时使不良副反应的危险最小化。
本发明的明胶与商品明胶相比具有更高的活性和实用性，因为该明胶是直接制备的，具有针对于具体用途优化的特征，提高了人们使用和配制明胶的能力。虽然目前从动物来源提取的明胶是不均一的产物，分子量在给定的批或样品中差异很大，本发明的明胶包括一致、均匀和可重复的产品。
本发明的重组明胶可用各种方法生产。在一个方法中，重组明胶通过重组胶原生产(见实施例7、10、11)。在另一种方法中，重组明胶是通过表达经改变了的胶原构建物，即含有编码至少一个胶原结构域，但不编码天然存在的胶原的多聚核苷酸直接产生的(见例如实施例1、4和6)。在另一个方面，重组明胶衍生自不是全长天然存在的胶原或原胶原，但含有至少一个胶原结构域的多肽(见例如SEQ IDNO：15-25、30、31和33)。重组明胶还可以是含有其它N-末端或C-末端前肽的序列(见例如SEQ ID NO：26-29)。
在一个方面，本发明重组明胶衍生自重组胶原或原胶原。胶原分子通常是含有(Gly-X-Y)n重复(它在正常生物学体积下形成三链螺旋结构域)的多肽链三聚体装配而成的。(见例如van der Rest等(1991)FASEB J.5：2814-2823)。目前，在脊椎动物中已鉴定出约二十种不同的胶原类型，包括牛、羊、猪、鸡和人胶原。天然存在的胶原各种不同类型的结构和生物功能的详细描述是本领域可得的，例如在Ayad等(1998)The Extracellular Matrix Facts Book，Academic Press，San Diego，CA；Burgeon，R.E.和Nimmi(1992)“胶原类型：分子结构和组织分布”于Clin.Orthop.282：250-272；Kielty，C.M.等(1993)“胶原家族：胞外基质中的结构，装配和组织”Connective Tissue And Its Heritable Disorders，Molecular Genetics，AndMedical Aspects，Royce，P.M.和B.Steinmann编，Wiley-Liss，NY，pp.103-147；和Prockop，D.J.和K.I.Kivirikko(1995)“胶原：分子生物学，疾病和治疗性能”，Annu.Rev.Biochem.64：403-434。
I型胶原是骨骼和肌肉的主要纤维胶原，占生物体全部胶原的约80-90％。I型胶原是多细胞生物胞外基质的主要的结构大分子，占总蛋白质量的约20％。I型胶原是杂三聚分子，含有两条α1(I)链和一条α2(I)链，分别由COL1A1和COL1A2基因编码。其它胶原类型比I型胶原少，显示不同的分布情况。例如，II型胶原是软骨和玻璃液中的主要胶原，而III型胶原以高水平存在于血管中，而在皮肤中较少一些。
III型胶原是皮肤和血管中的主要纤维胶原。III型胶原是同三聚胶原，含有三条相同的α1(III)链，由COL3A1基因编码。纯化的II型胶原可从组织中通过本领域已知的方法，例如Byers等(1974)Biochemistry 13：5243-5248和Miller和Rhodes(1982)Methods in Enzymology 82：33-64的方法制备。
翻译后加工酶是原胶原和胶原蛋白生物合成重要的。例如，脯氨酰4-羟化酶是细胞合成原胶原或胶原必需的翻译后加工酶。该酶将重复的-Gly-X-Y-序列中Y位置的脯氨酰残基羟化成4-羟脯氨酸(见例如Prockop等(1984)N.Engl.J.Med.311：376-386)。新合成的链不能维持稳定的三链螺旋构形，除非合适数量的Y-位置脯氨酰残基被羟化。另外，如果不发生羟化或羟化不够，多肽不能正确分泌，可能会降解。
脊椎动物脯氨酰4-羟化酶是α2β2四聚体(见例如Berg和Proekop(1973)J.Biol.Chem.248：1175-1192；和Tuderman等(1975)Eur.J.Biochem.52：9-16)。α亚基含有与脯氨酰残基羟化有关的催化位点，但在缺乏β亚基的情况下是不溶的。β亚基，蛋白质二硫键异构酶催化巯基-二硫键互换，导致形成对建立稳定蛋白必需的二硫键。当作为脯氨酰4-羟化酶四聚体的一部分时，β亚基保留50％蛋白质二硫异构酶活性(见例如Pihlajaniemi等(1987)Embo J.6：643-649；Parkkonen等(1988)Biochem.J.256：1005-1011；和Koivu等(1987)J.Biol.Chem.262：6447-6449)。
在例如Sf9昆虫细胞和酵母细胞中通过同时表达α和β亚基产生了活性重组人脯氨酰4-羟化酶(见例如Vuori等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7467-7470；美国专利号5,539,859)。除了脯氨酰4-羟化酶，在文献中已鉴定和报道了其它胶原翻译后加工酶，包括C-蛋白酶，N-蛋白酶，赖氨酰氧化酶和赖氨酰羟化酶等(见例如Olsen等(1991)Cell Biology of Extracellular Matrix，第二版，Hay编，Plenum Press，New York)。
本发明特别考虑了如需要，用任何能够羟化，例如脯氨酸羟化和/或赖氨酸羟化的生物学或化学化合物羟化本发明的重组明胶。这包括例如内源性或外源性补充的来自任何物种的脯氨酰4-羟化酶，包括脯氨酰4-羟化酶的各种同工型，和具有所需活性的脯氨酰4-羟化酶的任何变体或片段或亚基，不论是天然的，合成的或半合成的，和脯氨酰3-羟化酶等其它羟化酶(见例如美国专利号5,928,922，在此完整引入以供参考)。在一个实施例中，脯氨酰羟化酶活性是由衍生自编码重组胶原或明胶的多聚核苷酸，或编码可衍生重组明胶的多肽的相同物种的脯氨酰羟化酶赋予的。在另一个实施例中，脯氨酰4-羟化酶来自人，所编码的多聚核苷酸衍生自人序列。
本发明提供了操纵明胶的热塑性，产生具有所需物理特征的物质的方法。在一种方法中，在具有内源脯氨酰羟化酶或其它羟化酶的宿主系统，例如某些哺乳动物或昆虫细胞，或转基因动物或植物或植物细胞中表达编码的多聚核苷酸。在这样的系统中，本发明提供了产生具有各种羟化百分数，即无羟化，部分羟化和完全羟化的重组明胶混合物的方法。
例如，在一种具有不同羟化百分数的重组明胶中，通过在例如转基因动物中通过内源脯氨酰羟化酶赋予羟化，羟化百分数的分布从无羟化到完全羟化，产生的物质的解链温度在28℃-36℃，Tm中间值约30-32℃。如需要，可沿温度梯度分离不同的物质组分，因为如果下游用途需要筛选例如羟化更完全的物质，例如充分羟化，在例如体温下(37℃)维持三链螺旋结构的物质，这是必需的。
在另一个实施例中，重组明胶在某一系统，例如转基因动物中产生，其中用外源脯氨酰羟化酶提供羟化。在一个方面，这种产生重组明胶的方法提供了重组明胶，范围在非羟化到完全羟化。羟化更完全的重组明胶的部分在外源脯氨酰羟化酶的存在下，比仅存在内源性脯氨酰羟化酶产生的重组物质要多得多。因此，产生的物质的解链温度可在例如28-40℃，具有约34-36℃的Tm中值。这种明胶混合物适用于各种应用，例如明胶胶囊制造，而不需要任何羟化部分的分级和分离。
上述方法提供了具有各种解链温度的重组物质的生产，它们不难分离，例如可用温度梯度将在特定温度，如36℃下是固态的物质与在特定温度下是液体的物质分开。另外，本发明提供了成本低廉的生产物质的方法，该物质不经过分离就适合在大批量用途中使用。例如，凝胶胶囊的制造与使用上述方法产生的重组明胶有关，其中具有一定解链温度范围的重组物质具有约33℃的理想解链温度。在本方法中，可直接在所需系统，例如转基因动物中产生重组明胶，或通过水解，例如酸、热或酶，在所需系统中从重组胶原衍生。
在一个实施例中，本发明提供了一种产生含有重组胶原的重组明胶，和从重组胶原生产重组明胶的方法。在一个方面，该方法包括表达至少一条编码胶原或原胶原，或其片段或变体的多聚核苷酸，和翻译后加工酶或其亚基的多聚核苷酸，和至少一条编码胶原翻译后加工酶或其亚基的多聚核苷酸(见例如美国专利号5,593,859，在此完整引入以供参考)。本发明的重组明胶可用本领域已知的方法衍生自重组胶原(见例如Veis，A.(1965)Int Rev Connect Tissue Res.，3：113-200)例如所有胶原到明胶提取法的共同特征是胶原蛋白的二级结构丧失，在大部分情况下是胶原结构改变。用于产生本发明的明胶的胶原可用不同方法加工，视所需明胶类型决定。
可从重组产生的胶原或原胶原或其它胶原性多肽，或从细胞培养物，例如脊椎动物细胞培养物，用各种本领域已知的方法衍生本发明的重组动物明胶。例如，明胶可直接从细胞团块或培养液中通过利用明胶在升温下的溶解度，及其在低或高pH，低或高盐浓度和高温下的稳定性衍生出来。从胶原产生明胶组合物的方法、过程和技术包括在升温下用蛋白水解酶消化，利用去污剂、热或各种本领域熟知的变性剂使胶原的三链螺旋结构变性。另外，可用与从动物和屠宰场来源提取明胶有关的各种步骤，包括用石灰或酸处理，在水溶液中热提取，离子交换层析、交流过滤和各种干燥方法，从重组胶原中衍生本发明的明胶。
在一个方面，本发明的明胶由三链螺旋构成，含有至少一种胶原亚基，胶原链或其片段。特定胶原链、亚基或其片段中的Gly-X-Y单元可以是相同或不同的。优选X和Y是脯氨酸或羟脯氨酸，组成链的每第三个残基是甘氨酸。X和Y的氨基酸是脯氨酸或羟脯氨酸，各Gly-X-Y是相同或不同的。在另一个实施例中，本发明的重组明胶含有(Gly-X-Y)n的氨基酸序列，其中X和Y是任何氨基酸。
在一个实施例中，该明胶衍生自一种基本无其它类型的胶原的重组胶原。在一个方面，重组胶原是I型胶原。在另一个方面，重组胶原是III型胶原。在本发明的另一个方面，重组胶原是人重组胶原。考虑了本发明的其它实施例，其中重组胶原是任何一种胶原类型，例如胶原类型I-XX的任何一种，或任何其它胶原，天然、合成或半合成的胶原。特别考虑了实施例，其中重组明胶衍生自胶原I-XX型任何一种或多种，或任何其它天然、合成或半合成的胶原。
本发明产生重组明胶的方法比传统的明胶提取法有许多优点。最重要的是，该方法提供了含有天然胶原序列的可靠的非组织来源的明胶。另外，目前的提取方法不能使用任何人明胶的天然来源，例如那些在各种医学应用中可能是有利的。本发明特别提供了衍生自人序列的重组明胶。重组人明胶在医学和药学方法中使用是非免疫原性的，还考虑了它的各种用途。
在另一个方面，本发明提供了从能表达经各种形式的工程改造的构建物中生产该明胶。本发明特别考虑了用重组脯氨酰羟化酶和各种合成构建物，包括非天然胶原构建物产生明胶。另外，本发明提供了可设计成具有特定应用所需的特定特征的重组明胶。还考虑了产生这些明胶的方法。用目前的方法，可以产生具有所需凝胶强度、粘度、解链特征、等电情况、pH、羟化程度、氨基酸组成、味道、颜色等的明胶。在本发明的一个方法中，产生了非水解的明胶，然后如需要可以完全或部分水解。
明胶性能
明胶的各种物理性能限定了它在特定应用中的用途。明胶提供了基于例如其两性性质、其形成热-可逆凝胶、其保护性胶态和表面活性性能，及其对粘度和稳定性的作用的独特表现。在各种应用中使用明胶，例如乳化剂、增稠剂或稳定剂；作为薄膜或糖衣的形成剂；作为接合剂；作为粘合剂或胶水；或作为絮凝剂。
原料，预处理的形式和提取过程都影响在传统过程中获得的明胶多肽的组成。目前可得的动物产品因此是不均一多肽链的蛋白质混合物。明胶分子可以相当大，一种特定样品中的分子量范围从几百到几千kDa。特定批中的明胶分子量分布可以是关键的，因为分子量分布可影响例如明胶样品的粘度和/或凝胶强度。
总的说，明胶溶液的粘度随着浓度升高和温度降低提高。对于用作稳定剂或增稠剂，优选粘度更高的溶液。在一些应用中，例如在各种乳化液中。优选液态明胶，明胶溶液的粘度随着明胶组分的分子量提高而提高。因此高粘度明胶溶液可以组成高浓度的低分子量明胶，或低浓度的高分子量明胶。粘度还影响凝胶特性，包括凝结和融化点。高粘度明胶溶液提供了具有比低粘度明胶溶液融化和凝结速率高的明胶。
明胶的热可逆性和热塑性是在许多应用中被探索过的性质，例如在凝胶胶囊和片剂的制造中。可适当加热、塑造或成型，并冷却形成胶囊或片剂糖衣，它们在稳定温度下具有独特性质。明胶在口腔温度下开始融化。方便吞服，在体温下变为液体。
各种凝胶强度的明胶适用于不同应用。通常通过计算Bloom值测量特定凝胶的坚固度或强度，它可以用国际标准和方法确定。简单说，Bloom强度是以6.67％明胶溶液在恒温水浴中放置18小时形成的凝胶强度的量度。用标准纹理分析仪测量将一标准AOAC(法定农业化学家协会)插棒压入凝胶4毫米的重量，以克计。如果压入插棒所需的以克计算的重量是200克，特定的明胶具有200的Bloom值。(见例如，United States Pharmacopoeia and Official Methods of Analysis of AOACInternational，17版，卷II)。
因此可根据Bloom强度对商品明胶分析并出售。不同范围的Bloom值适合不同的明胶用途；例如用于各种工业应用，例如混凝土稳定，砂型铸造、模具、胶水、涂层等的明胶可从各种不同Bloom强度中选择，视所需的表现特征而定。在各种药物产品的制备中还需要各种Bloom强度的明胶。例如，软明胶胶囊通常用具有约150-175Bloom值的骨胶原或皮明胶，和/或用Bloom值约190-210的猪衍生的明胶，或其混合物制造，而硬明胶胶囊可使用具有约220-260的Bloom值的明胶。在食品应用中，作为棉花糖或其它糖果制品中的增稠剂的明胶可具有约250的Bloom强度。各种应用，包括某些照像应用中的乳化液和各种工业涂层涉及使用非凝结明胶。
本发明提供了具有不同Bloom强度的重组明胶的生产方法。在一个方面，本发明提供了例如具有约50，100，150，200，250和300的Bloom强度的明胶。在一个实施例中，本发明提供了具有约400的Bloom强度的重组明胶的生产方法。这样的明胶可用于例如制造凝胶胶囊，可制造更轻和更薄的胶囊，因为需要使用较少材料来提供具有足够强度的凝胶。还考虑了Bloom强度低于100，包括从0-100的重明胶。
本发明提供了设计具有具体应用所需的物理特性的重组明胶。在一个实施例中，本发明提供了含有特定分子量或分子量范围的单一分子的重组明胶，和生产这些重组明胶的方法。该均匀和单一的物质是有利的，因为它们提供了具有可预测表现的可靠产品来源，使产品表现和制造参数中的可变性最小化。目前，来自不同批量的明胶有时必需混合，来产生具有所需物理性质，例如由特定分子量或分子量范围提供的粘度和凝胶强度等的混合物。
在对于具有特定分子量范围的重组明胶比具有特定分子量的重组明胶更好的应用领域中，本发明提供了这种物质。用本发明的重组明胶，制造商可以例如将批量的具有特定分子量的重组明胶以一定的百分数混合，以得到具有所需分子量范围的混合物。另外，该重组明胶本身比目前市售的产品更均匀，具有更好的一致性。在本发明的一个方法中，用酸或热水解加工重组具有，以产生分子量范围比目前出售的明胶产品分子量范围窄的重组明胶。用合适和受控的水解条件，该方法产生分子量分布与市售明胶类似的重组人明胶，以及范围比目前出售的产品分子量范围窄的重组明胶(见实施例9和10)。
本发明提供了单一分子量或特定分子量范围的重组明胶，除去可变性和不可预见性，能够微调过程和可预见的行为。该方法能够出售具有任何所需分子量或分子量范围的重组明胶。例如，在一个实施例中，重组明胶具有大于300kDa的分子量。在另一个实施例中，重组明胶具有约150-250kDa、或约250-350kDa的分子量范围。特别考虑了其它分子量范围，包括但不限于下列分子量范围：约0-50kDa、约50-100kDa、约100-150kDa、约150-200kDa、约200-250kDa、约250-300kDa和约300-350kDa。
在另一个方面，可产生具有与市售明胶类似的分子量，约10-70kDa的重组明胶。在优选例中本发明提供了分子量范围较小的重组明胶，它目前未出售，例如约10 30kDa、约30-50kDa和约50-70kDa。在具体实施例中，提供了链长赋予适用于所要的领域的特定性能的重组明胶。在本发明的各个实施例中，考虑了具有约1kDa、5kDa、8kDa、9kDa、14kDa、16kDa、22kDa、23kDa、44kDa和65kDa的单一分子量的重组明胶。
特别是，在本发明的一种方法中，从截短的胶原序列，例如表2中列出的序列产生明胶。这些序列代表特定胶原结构域，编码明胶的短形式。
该明胶能维持明胶有价值的物理特性，例如薄膜形成性，虽然比常规衍生的动物明胶平均分子量小或大。可制造各种胶原序列的改变，包括例如胶原、胶原链、亚基或其片段的变性，或改变羟化的程度，产生具有特定物理性能的明胶，即比常规明胶的融化点高或低，具有不同的氨基酸组成，特定的分子量或范围等，这些变化在本文中特别考虑。
典型形成原纤维的胶原分子，例如I型胶原的分子量是300kDa。在一些应用中，例如使用高分子量明胶的那些，可能需要产生比目前提取的明胶更大的分子量。因此，在本发明的一个实施例中，可产生含有比目前抽提出商品明胶的胶原大的分子的明胶。可直接将所得到的高分子量明胶产品用于各种其物理性质所需的用途，或可分离和随后处理，产生较小的分子。
在一个实施例中，可用大于常规动物来源的胶原生产明胶。例如，可修改该产生方法适应衍生自vestimentiferan管虫(Riftia pachyptilla)(分子量约2600kDa)和环节动物(Alvinella pompejana)(分子量约1700kDa)的体壁的酸可溶性表皮胶原。这些胶原可适应该生产方法，生产比从其提取目前可得的明胶的分子产生更大的分子，可处理得到的产物以产生所需的明胶。
特别考虑可通过本发明的方法生产各种分子量的明胶。例如，可改变该重组明胶的特征，如羟化百分数，交联程度等，生产具有所需分子量的重组明胶。在一个方面，例如，本发明提供了一种通过使用本领域已知的交联剂，交联明胶多肽产生大分子量重组明胶的方法(见讨论，下文)。
在本发明的另一个方面，从含有多拷贝的完整或片段的天然胶原序列表达可衍生明胶的多肽。例如在一个实施例中，本发明提供了一种经改变的胶原构建物，它含有I型胶原的胶原结构域的多个拷贝。在另一个实施例中，构建物含有I型和III型胶原结构域的拷贝。本发明提供了单个或多个编码任何胶原，包括胶原I-XX型的全部或部分序列的拷贝。特别考虑本发明能产生衍生自一种以上胶原类型的明胶。在一个实施例中，在表达系统，例如宿主细胞，转基因动物等中表达衍生自一种以上胶原的重组明胶，从而产生明胶混合物。
在另一个实施例中，本发明提供了一种产生明胶，而不从胶原或原胶原三链螺旋阶段衍生的方法。在一个方面，这涉及通过在高温表达系统，例如依赖嗜热性生物的系统中表达各种构建物，产生重组明胶。该系统不能形成三链螺旋，而使得脯氨酰羟化酶具有活性。该明胶还可以衍生自含有突变、添加或缺失，防止三链螺旋形成的胶原构建体。在另一个方面，这涉及从截短的构建物产生明胶，该构建物不能在常温，如37℃下形成三链螺旋。另外，可在三链螺旋形成的抑制剂，例如聚阴离子(与生物合成性胶原构建物一起表达)存在下产生明胶。另外，本发明的生物合成的明胶可以衍生自重组产生的胶原链，它们不形成三链螺旋。
在另一个实施例中，本发明提供了一种从非羟化胶原或其中脯氨酰残基只是部分而未完全羟化的胶原中衍生明胶的方法。在一个方面，该方法包括从在不存在脯氨酰羟化酶条件下，例如在没有脯氨酰羟化酶的昆虫表达系统中表达的胶原衍生明胶(见例如，Myllyharju等(1997)J.Biol.Chem.272，21824-21830)。在本发明的一个方法中，明胶衍生自部分羟化或非羟化的胶原。可通过体外施用羟化酶赋予羟化。在一个方法中，可对细菌或酵母宿主细胞提供羟脯氨酸来使得低程度的羟脯氨酸替代脯氨酸。
本发明包括完全羟化的、部分羟化的和非羟化的重组明胶。在另一个实施例中，本发明的方法包括生产具有特定羟化程度的明胶或明胶前体。在另一个方面，本发明涉及生产20-80％羟化，优选约30-60％羟化，最优选约40％羟化的明胶。(见实施例4和5)。可通过混合特定百分数的具有不同羟化程度的重组明胶获得本发明的部分羟化的重组明胶，或可以直接获得(见实施例4和5)。另外，本发明提供了通过对非羟化的重组明胶体外施用脯氨酰羟化酶，并控制反应长短，实现重组明胶的部分羟化。
目前可得的动物来源的明胶的热特性可变程度有限。本发明特别提供了产生重组明胶的方法，其中重组明胶具有针对于特定应用理想的特定热特性。用本发明的方法，例如可用各种方法操纵重组明胶的融化点和/或凝胶强度。可用各种本领域熟知的技术测量重组明胶的温度稳定性和/或凝胶强度。
一般而言，明胶的融化点随着羟化程度的提高而升高。用本发明的方法，可能通过操纵羟化和/或交联产生高分子量的明胶，它比目前出售的动物来源的明胶凝胶强度低和/或融化点低。因此，本发明提供了具有在各种商品中不能获得的性能的重组明胶，它适用于需要高分子量明胶，以获得提高的薄膜强度等，但需要不凝结或低凝胶强度的产品的用途。在一个实施例中，本发明提供了由于脯氨酸残基的不完整羟化具有低温稳定性的重组明胶。
这些重组明胶可用于各种用途。在用目前的提取方法产生的明胶中，仅鱼明胶提供了不凝结的高平均分子量的膜形成蛋白。非凝结的鱼明胶的非凝结和冷水熔解性能可与目前可得的水解牛和猪明胶相当，但后两者的薄膜强度和柔性相应丧失，因为水解的明胶平均分子量低。因此在一个实施例中，本发明提供了比目前可得的动物来源的物质具有较低凝胶强度和较高分子量的部分羟化的重组明胶。
具有更高的分子量，更低的凝胶强度的重组明胶还可以用于各种需要稳定性，但需要无凝结性或低凝结性，以维持药物产品的延展性和完整性的药物领域。这种重组明胶可用作例如血浆容量扩张剂，因为其分子量可以提供稳定性，提高在循环中的保留时间，改变的凝固点将防止物质在室温下凝结，使得不用施用容量扩张剂保温。在一个实施例中，本发明提供了一种部分羟化的重组明胶，它适合用于药物领域，例如，作为血浆容量扩张剂。
在另一个方面，通过在不存在脯氨酰羟化酶的条件下，例如在没有脯氨酰羟化酶的昆虫表达系统中，表达重组明胶，或表达衍生出该重组明胶的多肽获得部分羟化的重组明胶。(见例如Myllyhar ju等(1997)J.Biol.Chem.272，21824-21830)。在生产的时候发生羟化，或随后可通过体外生物学或化学修饰施加。在本发明的一种方法中，重组明胶可衍生自部分羟化或完全羟化的明胶。
组成的胶原分子的赖氨酸残基之间的共价交联的存在大大强化了用目前可得的方法从天然来源衍生的明胶。交联天然在胞外空间中，在交联分泌和原纤维形成后发生。胞外酶赖氨酰氧化酶随后除去胶原分子中的某些赖氨酸和羟赖氨酸的氨基，得到高度反应性的醛基，它自发反应形成共价键。得到的交联胶原产生凝胶强度和粘性提高的明胶。特别是，高度的交联导致具有更高融化温度和更高凝胶强度的明胶。
在一个方面，本发明提供了交联的重组明胶，得到更高分子量的明胶(见实施例7)。可用不同方法实现交联，例如用生物学或化学修饰。例如在一个实施例中，在赖氨酰羟化酶和赖氨酰氧化酶存在下，表达可衍生明胶的重组明胶或多肽。在另一个实施例中，在表达后通过交联修饰多肽。在另一个方面，本发明提供了通过化学方法，例如通过反应性化学交联剂，例如1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)实现交联。(见实施例7)。还可用其它化学交联剂，例如二(磺基琥珀酰氨基)软木酸酯(BS3)、3，3’-二硫二(磺基琥珀酰氨基)丙酸酯(DTSSP)和Tris-磺基琥珀酰氨基氨基三乙酸酯(磺基-TSAT)，如本领域已知的各种试剂。另外，本发明提供了生产具有各种程度的交联的重组明胶的方法，用于获得所需融化点、凝胶强度和粘度的重组明胶。
本发明提供了操纵重组明胶的分子量、羟化水平和交联程度的方法，使得建立不同和特别的Bloom强度，以及不同和特定水平的粘度的重组明胶。
脯氨酸羟化在天然胶原形成中起到中心作用。序列X-Lys-Gly中的特定赖氨酰残基的羟化也在胶原合成和原纤维形成中起到了重要的作用。修饰的赖氨酸残基上的羟基作为糖类的结合位点和作为形成稳定分子间交联的中心位点。这些修饰需要特定酶，赖氨酰羟化酶和赖氨酰氧化酶的表达。
因此在本发明的一个方面，考虑了这些酶与本发明的多肽的共表达。在宿主细胞中表达编码赖氨酰羟化酶的基因(Hautala等(1992)Genomics 13：62-69)，然后通过引入编码明胶或衍生出明胶的多肽的序列进一步修饰，如本发明所述。本发明的重组明胶因此能由内源表达的赖氨酰羟化酶和赖氨酰氧化酶的活性进行翻译后修饰。本发明的重组明胶还可通过表达外源的赖氨酰羟化酶和赖氨酰氧化酶修饰。在一个实施例中，产生的重组明胶是非羟化的，随后通过赖氨酰羟化酶的酶活性，产生所需的赖氨酸残基的羟化程度。改变赖氨酰羟化程度的能力是生产明胶和可衍生出明胶的多肽中必需的，不同程度的交联导致所需的凝胶强度和粘度。
在另一个实施例中，含有羟赖氨酸残基的多肽还可以在例如酵母细胞中表达，其中通过脯氨酰羟化酶的活性产生了羟脯氨酸(见实施例1和4)。在一些实施例中，可配制经修饰的重组明胶或能衍生出明胶的多肽，并施给动物或人，作为内源性酶活性的底物，例如赖氨酰氧化酶，使得胶原多肽以稳定的交联形式掺入组织。因此，本发明的一个方面提供了具有商品用途的所需凝胶强度和粘度，而不需要赖氨酰羟化酶或赖氨酰氧化酶的重组明胶的生产方法。
本发明还提供了产生具有特定胶凝点的明胶的方法。在一个实施例中，本方法提供了具有15-35℃的凝结或胶凝点的明胶。在另一个实施例中，重组明胶具有15-25℃，25-35℃和20-30℃的胶凝点。
在各种方面，本发明提供了非水解，完全水解或水解到不同程度的重组明胶，例如作为水解或非水解产品混合物的明胶。另外，本发明提供了生产具有不同水解程度的重组明胶的方法(见实施例9和10)。明胶水解物通常是冷水可溶的，用于各种用途，特别是药物和食物工业，其中具有非胶凝性质的明胶是理想的。用于药物工业的明胶水解物是薄膜形成剂、微囊化过程、关节炎和关节减压配方、压片和各种营养制剂。在化妆品工业，在洗发水和护发素、乳液和其它配方，包括唇膏和指甲配方等中使用明胶水解物。明胶水解物在蛋白质和机能饮料和食品中作为营养补充物；用作酒、啤酒和果汁澄清的澄清剂；用作添加剂，例如食品调味剂和色素的微囊化。明胶水解物由于其薄膜形成特征被用于工业应用，例如对半导体制备中的元件涂层。
在本发明的一个实施例中，从胶原序列产生明胶，其中特定的天然结构域有缺失或添加，以改变表达产品的行为。本发明还考虑生产重组明胶的方法，其中明胶是直接从经改变了的明胶构建物中产生的，不产生完整的三链垂直螺旋。特别是，本发明考虑产生含有表达各种工程改造的构建物的方法。这些构建物不编码标准的三链螺旋胶原。例如，特定缺失可消除胶原酶反应性区域，和各种引起免疫原性，如抗原性和免疫原性反应的方法。
各种胶原的特定结构域与特定活性有关(见例如Shahan等(1999)Con.Tiss.Res.40：221-232；Raff等(2000)Human Genet 106：19-28，都在此完整引入以供参考)。特别的是，本发明特别提供了生产衍生自改变了的胶原构建物的方式，这构建物消除或减少，或提高了与特定活性有关的一种胶原基因的特定区域。特别是，该区域能够完全或部分缺失，来产生缺乏或减少特定活性的明胶，或可加入特定区域的额外拷贝，来产生具有增强的活性的明胶。例如，鉴定了血小板细胞表面上α2β1整合蛋白受体识别的I型和III型胶原序列(Knight等，(1998)J.Biol.Chem.其参考文献在此完整引入以供参考)。
这些明胶可包含在例如与吻合术和血管移植有关的产品中，包括伸展的包被和移植装置。该产品与不良副作用相关，例如血栓形成，它的发生与使用这些产品有关，因为胶原产品中存在而小板聚集区。在一个方面，本发明提供了一种产生重组明胶的方法，该明胶不包括血小板反应区，因此使血小板聚集的危险最小化(见实施例2)。因此，本发明在一个实施例中提供了含有重组明胶的伸展涂层。在一个优选例中，重组明胶是重组人明胶。在一些情况下，例如各种伤口护理用途中，理想的是提供含有能诱导特定聚集活性的结构域的重组明胶。
可从不编码α2β1受体识别的区域的胶原构建物，或从具有一个或多个这些区域的拷贝的构建物表达本发明的明胶，从而提供均匀和一致的明胶产品。在一个方面，本发明提供了通过高效重组表达生产重组明胶的方法。该生产方法与目前的提取方法相反，提供了高超的适应性，因为可使用多种表达系统的任何一种。例如可在酵母或植物生物团块中获得生产原料。可通过例如指定本发明方法产生的特定明胶分子的独特大小，来优化一些生产系统的分泌。在许多实施例中，衍生出这些明胶的明胶或多肽在表达系统中产生，这些表达系统包括但不限于酵母、动物、植物和昆虫表达系统。考虑了转基因动物和转基因植物等表达系统。
本发明提供了表达至少一种编码明胶的多聚核苷酸或在细胞中衍生出明胶的多聚核苷酸。在一个实施例中，本发明提供了表达多种编码明胶或在细胞中衍生出明胶的多肽的多聚核苷酸，例如产生了作为同源或异源多肽的重组明胶。本发明还提供了编码胶原加工或翻译后加工酶或其亚基在细胞中的表达。不同的翻译后修饰和不同的翻译后加工酶，例如脯氨酰羟化酶、赖氨酰羟化酶等可影响例如本发明明胶的Bloom强度和其它物理性质。
本发明的重组明胶衍生自胶原序列。衍生出本发明的多聚核苷酸的编码序列可选自人或非人序列，视最终明胶产品的用途所需的性能而定。对于药物学和医学用途，重组人明胶是优选的。非人来源包括非人哺乳动物来源，如牛、猪和马来源，以及其它动物来源，例如鸡和鱼。特别考虑了非天然序列。
本领域一般描述了编码胶原的核酸序列。(见例如Fuller和Boedtker(1981)Biochemistry 20：996-1006；Sandell等(1984)J Biol Chem259：7826-34；Kohno等(1984)J Biol Chem.259：13668-13673；French等(1985)gene39：311-312；Metsaranta等(1991)J Biol Chem 266：16862-16869；Metsaranta等(1991)Biochem Biophys Acta 1089：241-243；Wood等(1987)Gene 61：225-230；Glumoff等(1994)Biochem Biophys Acta 1217：41-48；Shirai等(1998)MatrixBiology 17：85-88；Tromp等(1988)Biochem J.253：919-912；Kuivaniemi等(1988)Biochem J.252：633-640；和Ala-Kokko等(1989)Biochem J.260：509-516)。另见同时申请的共同拥有的美国临时申请＿＿＿，题为“动物胶原和明胶”，2000年11月10日提交，在此完整引入以供参考)。
本发明的核酸序列可经工程改造，为了各种目的改变用于产生重组明胶或从其衍生重组明胶的多肽的编码序列，包括但不限于：修改基因产物加工和表达的改变。例如，可用另一种分泌信号取代天然的分泌信号。用本领域熟知的技术，例如定点诱变、PCR-定向诱变、盒式诱变和其它本领域熟知的技术来插入新限制性位点，或改变糖基化模式，磷酸化，蛋白水解转换/破坏等。另外，当在使用特定宿主细胞的表达系统中产生明胶时，本发明的多聚核苷酸在任何三联体氨基酸密码子的沉默位置改变，从而更好的符合特定宿主生物体的密码子倾向。
可根据本发明使用的改变的多聚核苷酸序列包括在天然胶原序列中含有缺失、添加或取代不同的核苷酸残基的序列。这些多聚核苷酸可编码相同或功能上等价的基因产物。基因产物本身可在胶原序列中含有氨基酸残基的缺失、添加或取代。
将本发明的多聚核苷酸进一步与编码多肽的变体的序列有关。可用各种本领域已知的方法引入合适核苷酸改变编码多肽变体，制备编码的氨基酸变体。氨基酸序列变体构建中的两个重要变量是突变的位置和突变的性质。优选通过多聚核苷酸突变得到自然界不存在的氨基酸序列，构建本发明明胶或衍生出本发明明胶的氨基酸序列变体。在与来自不同物种的胶原中不同的位置(可变位置)或在高度保守的区域(恒定区域)中制备这些氨基酸改变。这些位置上的位点通常系列修饰，例如通过用保守选择取代第一个(例如用不同的疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸)，然后用更加不同的选择(例如用疏水性氨基酸取代带电的氨基酸)然后可在靶位点制造缺失和插入。
由于基因密码固有的简并性，本发明的实施中还可使用基本编码相同或功能上等价的氨基酸序列或多肽的其它天然、合成、半合成或重组起源的多聚核苷酸序列。本发明还特别考虑了所有简并变体和密码子优化的序列。另外本发明特别提供了能与特定序列在严格条件下杂交的多聚核苷酸。
表达
该方法适用于本领域可得的表达系统范围。虽然下文描述了许多这样的重组系统，但是应理解本方法的应用不限于下文举例说明的系统。
可利用各种表达系统来包含和表达编码本发明的重组明胶或编码能衍生出这些明胶的多肽的序列。这些包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒核酸表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒病毒载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用真菌载体转化的丝状真菌；用病毒病毒载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或用细菌表达载体(如pET或pBR322质粒)；或动物细胞系统转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
适合用于表达本发明的多聚核苷酸的控制元件或调控序列是载体的非翻译区，包括增强子、启动子和5’和3’非翻译区，它们与宿主细胞蛋白反应，来进行转录和翻译。这些元件的强度和专一性可变。视利用的载体系统和宿主，可使用任何数量的合适的转录和翻译元件。
启动子是位于结构基因起始密码子上游的非翻译序列，它控制核酸在其控制下转录。可诱导启动子是响应培养条件的改变，例如因存在或不存在一种营养物而改变其转录起始水平的启动子。本领域技术人员知道许多可在适合本发明的宿主中被识别的启动子。
可由本领域技术人员选择合适的启动子、增强子和其它控制元件。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用可诱导启动子，例如BLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene，La Jolla，Calif.)或pSPORT1质粒(GIBCO BRL)杂交lacZ启动子等。在昆虫细胞中，可使用杆状病毒多角体启动子。在植物系统中，可将衍生自植物细胞基因组的启动子或增强子(例如热休克启动子、RUBISCO小亚基启动子；叶绿素a/b结合蛋白启动子)的启动子或增强子；各种储藏蛋白基因的启动子或来自植物病毒(如病毒启动子或前导序列，CaMV的35S RNA启动子；TMV的外被蛋白启动子等)克隆入载体。在哺乳动物细胞系统中，优选来自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子，肌动蛋白启动子等)或来自哺乳动物病毒(如腺病毒晚启动子、CMV、SV40、LTR、TK和痘病毒7.5K启动子)的启动子。如需要产生含有多个编码所需多肽的序列拷贝的细胞系时，可与合适的可选择标记一起使用基于SV40或EBV的载体。
这些启动子可与编码本发明的明胶或明胶前体的多聚核苷酸可操纵性连接，例如通过从其天然基因除去启动子，将编码多聚核苷酸置于启动子序列的3’末端。用于本发明的启动子包括但不限于，原核启动子、包括例如乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酶启动子、色氨酸启动子和杂合启动子，例如tac启动子、酵母启动子，包括例如3-磷酸甘油酸激酶、其它糖酵解酶启动子(己糖激酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶等)、醇脱氢酶启动子、醇氧化酶(AOX)1或2启动子、金属硫蛋白启动子、麦芽糖启动子和半乳糖启动子；和真核启动子，包括例如病毒多瘤、传染性上皮瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、SV40病毒的启动子和靶真核细胞的启动子，例如黑曲霉的葡糖淀粉酶启动子，肌动蛋白或遍在蛋白启动子、哺乳动物的免疫球蛋白启动子和天然胶原启动子(见例如Boer等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25；Hitzeman等(1980)J.Biol.Chem.255：2073；Fiers等(1978)Nature 273：113；Mulligan和Berg(1980)Science 209：1422-1427；Pavlakis等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：7398-7402；Greenway等(1982)Gene 18：355-360；Gray等(1982)Nature 295：503-508；Reyes等(1982)Nature 297：598-601；Canaani和Berg(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5166-5170；Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6777-6781；和Nunberg等(1984)Mol.andCell..Biol.11(4)：2306-2315)。
本方法编码明胶和明胶前体的多肽序列可以在组成型启动子的转录控制下，广泛指导表达。另外，用于本方法的多聚核苷酸在特定的组织或细胞类型，或在更精确的环境条件或发育控制下表达。在这些情况下指导表达的启动子称作可诱导启动子。就使用组织特异性启动子的情况而言，蛋白质表达在需要提取蛋白质的组织中特别高。视所需组织而定，表达可靶向胚乳、糊粉层、种胚(或其部分如胚鳞和子叶)、果皮、茎、叶、块茎、根等。已知的组织特异性启动子的例子包括指向块茎的I类patatin启动子，与马铃薯块茎ADPGPP基因相关的启动子，大豆β-conglycinin(7S蛋白)启动子，它驱动针对种子的转录，和来自玉米胚乳玉米蛋白基因的针对种子的启动子(见例如Bevan等(1986)Nucleic Acids Res.14：4625-38；Muller等(1990)Mol.Gen.Genet.224：136-46；Bray(1987)Planta 172：364-370；和Pederson等(1982)Cell 29：1015-1026)。
通常通过在载体中插入增强子序列提高本发明编码明胶或明胶前体的序列的转录。增强子是顺式激活元件，通常约10-300bp，它起到提高启动子转录起始速率的作用。许多增强子对于真核细胞和原核细胞都是已知的，普通技术人员可为感兴趣的宿主细胞选择合适的增强子(见例如Yaniv(1982)Nature 297：17-18)。
本发明的明胶和明胶前体可以表达成分泌蛋白。当用于表达蛋白质的是经工程改造的细胞是非人宿主细胞，用另一种能被宿主细胞的分泌靶向机制更有效识别的分泌信号肽替换胶原蛋白的分泌信号肽常常是有利的。合适的分泌信号序列对于获得最佳真菌表达哺乳动物基因特别重要。例如见Brake等(1984)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 81：4642。原核、酵母、真菌、昆虫或哺乳动物细胞的其它信号序列是本领域熟知的，本领域普通技术人员能够简单的选择适合所选宿主细胞的信号序列。
在使用的特定细胞系统中包含合适的增强子可增强表达效力，如文献中所述的那些(见例如，Scharf，D.等(1994)Results Probl.Cell Differ 20：125-162)。另外，可选择宿主细胞株调节插入的序列的表达或以所需的方式加工表达的蛋白质的能力。这种多肽的修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化、异戊二烯化和酰化。切割蛋白质“前/预”形式的翻译后加工还可用于促进正确的插入、折叠和/或功能。可选择不同的宿主细胞，例如CHO、HeLa、MDCK、HEK293和WI38，它具有该翻译后活性的特定的细胞机制和特征性机制，并可选择用于确保外源蛋白质的正确修饰和加工。
根据本发明，可在合适的宿主细胞中表达编码重组明胶或可衍生出明胶的多肽的多聚核苷酸序列。在本发明的优选例中，重组明胶是人明胶。在本发明的其它优选例中，多肽序列衍生自I型胶原序列，无任何其它类型的胶原的编码序列，或II型胶原序列，无任何其它类型的胶原的编码序列，或III型胶原序列，无任何其它类型的胶原的编码序列。在另一个实施例中，编码多聚核苷酸衍生自特定数量的I型和III型胶原，例如编码的多肽产生或衍生的明胶含有确定数量的I型和III型胶原的混合物。
为了表达衍生出该明胶的胶原，或表达导致生产该明胶的天然胶原序列，将编码胶原的核苷酸序列，或功能性等价物，或其它序列，例如截短的胶原序列，例如存在于表2的那些插入合适的表达载体中，即含有掺入的编码序列转录和翻译必需的元件，或在RNA病毒载体情况下，复制和翻译必需的元件的载体中。
可用本领域技术人员熟知的方法构建含有本发明的多聚核苷酸和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括标准DNA克隆技术，例如体外重组技术，合成技术和体内重组。见例如，Maniatis等，见上和Ausubel等，见上；和Ausubel，F.M.(1997)Short Protocols in Molecular Biology，第四版，John Wiley& Sons，New York，NY所描述的技术。
可用各种表达载体表达该多肽。例如，典型的表达载体含有编码复制起始点的元件；插入外源核苷酸序列的克隆位点；控制外源基因转录起始的元件，例如启动子，和控制转录过程的元件，例如转录/终止/聚腺苷酸序列。用于本发明的表达载体还含有载体最终插入染色体所需的序列。另外，编码与控制转录起始的启动子功能性连接的选择标记的基因还可以在表达内，例如，抗生素抗性基因，提供在宿主中表达载体的生长和选择。
本发明的载体可在宿主细胞中自动复制，或可以整合入宿主基因组。对于原核细胞和真核细胞的各种细菌、酵母和各种病毒复制序列，具有自主复制序列的合适载体是熟知的。当载体和宿主细胞基因组DNA中发现的序列同源时，可整合到宿主细胞中。
为了长期、高产率产生重组蛋白，优选稳定表达。例如，可用含有病毒复制起始位点或合适的表达控制元件(例如启动子、增强子序列，转录终止子、聚腺苷酸位点等)和在相同或不同载体上的可选择标记的表达载体转化稳定表达该多肽的细胞系。引入外源DNA后，在富集培养基中使细胞生长1-2日，然后切换到选择性培养基。重组质粒中的选择性标记对选择赋予抗性，使成功表达引入序列的细胞生长和回收。稳定转化细胞的抗性克隆可以用适合细胞类型的组织培养技术增殖。本方法可有利的用于产生表达所需多肽的细胞系。
例如，由半乳糖启动子驱动的用于本发明方法的各种序列的表达可通过在非抑制、非诱导糖上培养，从而在加入半乳糖后非常迅速的诱导；在葡萄糖培养基中培养培养物，然后通过离心和洗涤细胞除去葡萄糖，重新悬浮在半乳糖培养基中；通过使细胞在含有葡萄糖和半乳糖的培养基中生长，从而在半乳糖诱导发生前倾向代谢葡萄糖。
可用任何数量的选择系统回收转化细胞系。这些包括但不限于可分别用于tk-或aprf细胞中的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶和腺苷酸磷酸核糖转移酶基因(见例如Wigler，M.等(1977)Cell 11：223；Lowy，I.等(1980)Cell 22：817)另外，可用抗代谢物、抗生素或除草剂抗性作为选择的基础。因此，本发明考虑使用这些可选择标记，例如：赋予氨甲蝶呤抗性的dhfr；赋予氨基糖苷新霉素和G-418抗性的npt；和分别赋予绿黄隆和膦基麦黄酮乙酰转移酶抗性的als或pat(见例如Wigler，M.等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77：3567；和Colberre-Garapin，F.等(1981)J.Mol.Biol.150：1-14)。
描述了其它可选择基因，例如trpB，它使细胞利用吲哚而不是色氨酸；hisD，它使细胞利用组氨醇而不是组氨酸。(见例如Hartman，S.C.和R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8047-51)。近来，使用可见标记获得了流行，这些标记例如花色素苷、β-半乳糖苷酶及其底物GUS，和荧光素酶及其底物荧光素，目前广泛使用，不仅用于鉴定转化物，还用于定量测定特定载体系统的瞬时或稳定蛋白表达。(见例如Rhodes，C.A.等(1995)Methods Mol.Biol.55：121-131)。
如上所述，用于本生产方法的表达载体通常含有一标记基因，它赋予细胞可选择表型。通常可选择标记基因编码抗生素抗性，合适的基因包括编码至少一种基因，选自对抗生素大观霉素抗性，编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTH)基因，潮霉素抗性基因，编码对抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)作用的除草剂，特别是硫脲型除草剂抗性的基因，(如S4和/或Hra突变)，编码对抑制谷氨酰胺合成酶作用的除草剂的抗性的基因，例如膦基麦黄酮或basta(例如bar基因)或其它本领域已知的类似基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因编码对除草剂绿黄酮的抗性。
其它检测宿主细胞在转化后含有感兴趣的多聚核苷酸的方法包括本领域技术人员已知的多种方法。这些方法包括但不限于核酸杂交，包括DNA-DNA或DNA-RNA杂交，和各种蛋白质活体鉴定或免疫分析技术，包括基于膜-、溶液-或芯片得到技术，用于检测和/或定量多聚核苷酸或多肽。
另外，可选择宿主细胞株，它调节插入序列的表达，或以所需的特定方式修饰和加工基因产物。这种蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可以对于是蛋白质功能重要的。不同宿主细胞具有蛋白质翻译后加工和修饰的特征性和专一性的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统确保表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。对此，可使用具有正确加工初级转录物，糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38等。
专一性起始信号也可用于实现本发明多聚核苷酸的更有效的翻译。这些信号包括ATG起始密码子和邻接的序列。就编码该多肽和任何翻译所需的起始或上游序列插入合适的表达载体而言，不需要额外的翻译控制信号。然而对于仅插入编码序列或其部分的情况下，必须提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。另外，起始密码子必须在正确的阅读框中，来确保整个插入物的翻译。这些外源翻译元件和起始密码子可以是各种来源，包括天然和合成的(见例如Bittner等(1987)Methods in Enzymol，153：516-544)。
可用编码翻译后加工酶的至少一种多聚核苷酸和至少一种编码本发明的明胶或可衍生出明胶的多肽的多聚核苷酸感染、转染或转化本发明的宿主细胞。这些多聚核苷酸包括编码胶原翻译后加工酶，例如脯氨酰4-羟化酶、胶原糖基转移酶、C蛋白酶、N-蛋白酶、赖氨酰氧化酶或赖氨酰羟化酶的多聚核苷酸，可插入天然中不产生翻译后加工酶的细胞，例如酵母细胞，或天然不产生足量翻译后加工酶的细胞，例如各种昆虫和哺乳动物细胞，例如外源酶可需要产生某些翻译后影响。在本发明的一个实施例中，翻译后加工酶是脯氨酰4-羟化酶，多聚核苷酸编码脯氨酰羟化酶的α亚基和β亚基。在一个优选例中，编码脯氨酰4-羟化酶的α亚基和β亚基的多聚核苷酸插入产生生物活性脯氨酰4-羟化酶的细胞，与编码明胶或可衍生出明胶的多肽的多聚核苷酸共同表达。
编码翻译后加工酶的多聚核苷酸可衍生自任何来源，不论天然、合成或重组的。在一个优选例中，翻译后加工酶衍生自产生重组明胶的相同物种。在一个实施例中，产生的重组明胶是人重组明胶，翻译后加工酶是人脯氨酰4-羟化酶。
本发明表达的明胶或明胶前体优选分泌入培养基，并可用各种本领域已知的方法，例如通过层析纯化到均一。在一个实施例中，重组明胶或明胶前体用尺寸排阻层析纯化。然而，还可用其它本领域已知的纯化技术，包括但不限于离子交换层析、疏水作用层析(HIC)和反相层析。(见例如Maniatis等，见上，Ausubel等，见上和Scopes(1994)Protein Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag New York Inc.，NY)。
原核
在原核系统，例如细菌系统中，可根据表达的多肽所要的用途选择许多表达载体中的任一种。例如，当要产生大量重组明胶或可衍生出这些明胶的多肽时，可使用指导能高水平表达可轻易纯化的融合蛋白产物的载体。这些载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中可以将编码序列连接到载体的阅读框内，与氨基酸末端Met序列和随后的7个β-半乳糖苷酶的残基连接，从而产生杂交蛋白；pIN载体(Van Heeke，G.和S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264：5503-5509)等。pGEX载体(Promega，Madison，Wis.)和pET(Invitrogen)载体也可用于表达作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。一般这些融合蛋白是可溶的，并可轻易的用本领域的各种已知方法从裂解细胞中纯化出来，例如通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠上，然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱。这些系统中的蛋白质可设计成包含凝血酶或凝血因子Xa蛋白酶切割位点，从而克隆的感兴趣多肽可从GST分子上释放。
酵母
在优选例中，本方法提供了用酵母表达系统产生重组明胶的方法。在优选例中，直接从改变的胶原构建物或从胶原多肽的加工中直接产生明胶。在酵母系统中可使用含有组成型、非组成型或诱导型的启动子的载体。(见例如Ausubel等，见上，13章。)在一些方面，用含有指导DNA整合入染色体的序列的载体在酿酒酵母中表达。
在一个实施例中，本发明的重组明胶或可衍生出这些明胶的多肽可用来自例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的宿主细胞表达。酿酒酵母可与本领域中可得的许多表达载体中的任一个一起使用，包括许多含有组成型或诱导型启动子的载体，例如α因子、AOX、GAL1-10和PGH(见例如Ausubel等，见上和Grant等(1987)Methods Enzymol.153：516-544)。常用表达载体是含有在酵母中增殖的2μ复制起始点和大肠杆菌中的Col E1起始点的穿梭载体，包括用于有效转录外源基因的酵母启动子和终止子。掺入2μ质粒的载体包括但不限于pWYG4和pYES2，它们具有2μORI-STB元件，GAL1-10启动子等。在本发明的一个需要羟化产物的方法中，涉及共同表达胶原翻译后加工酶，例如脯氨酰4-羟化酶。在本发明的一个方法中，用pWYG4载体，用Nco1克隆位点插入脯氨酰4-羟化酶的α或β亚基的基因，并提供α或β亚基的ATG起始密码子。在一个方法中，用指导整合入宿主染色体的表达载体
还可用表达载体是pWYG7L，它具有完整的2αORI、STB、REP1和REP2，和GAL7启动子，和FLP终止子。当与翻译后加工酶，例如脯氨酰4-羟化酶表达时，脯氨酰4-羟化酶的α或β亚基的基因以其5’末端在BamH7或Nco1位点插入多接头。含有脯氨酰4-羟化酶的载体基因在除去细胞壁，以产生原生质球前后转化入酿酒酵母，该原生质球在在用钙和聚乙二醇处理后或用锂离子处理完整的细胞后摄取DNA。可用具有可选择标记基因例如LEU2、TRP1、URA3、HIS3或Leu2-D的亮氨酸、色氨酸、尿嘧啶或组氨酸营养缺陷的宿主酵母细胞选择转化子。
在本发明的另一个实施例中，本发明产生重组明胶的方法使用来自毕赤酵母或其它非酿酒酵母，具有在大批量生产的过程中生产高产量的重组蛋白质的优点的株的宿主细胞。毕赤表达系统包括利用原核(例如大肠杆菌)表达系统-高水平表达，容易放大和低廉的生长-和真核表达系统-蛋白质加工、折叠和翻译后修饰的优点。这些表达系统可用各种本领域技术人员已知的方法和试剂盒构建，例如Invitrogen Corporation(San Diego，CA)可购得毕赤表达盒。
在甲醇向性的酵母，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或(Pichiamethanolica)等中有许多甲醇反应性基因，它们各自的表达受到甲醇反应性调控区(也称为启动子)控制。这些甲醇反应性启动子任一适合用于实施本发明。特定调控区的例子包括巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶AOX1基因的启动子、巴斯德毕赤酵母第二醇氧化酶AOX2启动子、FLD1启动子、巴斯德毕赤酵母的二羟基丙酮合成酶(DAS)的启动子、P40启动子的启动子等。通常，巴斯德毕赤酵母中的表达是通过精密调节AOX1基因的启动子获得的(见例如Ellis等(1985)Mol.Cell.Biol.5：1111和美国专利号4,855,231)。还可用GPH启动子实现组成型表达。
本发明方法中优选使用的另一种酵母表达系统利用甲醇向性酵母多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。该系统可用于例如本发明需要高产量的生产方法。在甲醇生长导致诱导甲醇代谢的关键酶，例如MOX(甲醇氧化酶)、DAS(二羟丙酮合成酶)和FMHD(甲酸脱氢酶)。这些酶可占全部细胞蛋白质的30-40％。编码MOX、DAS和FMDH生产的基因受到强启动子的控制，它受到在甲醇上生长的诱导，在葡萄糖上生长的抑制。根据本领域已知的方法，这三种启动子中的任一可用于获得异源基因在多形汉逊酵母中的高水平表达。
在本发明的一种方法中，编码的多聚核苷酸被克隆入在诱导型多形汉逊酵母的控制下表达载体。如果需要分泌产物，将编码酵母分泌信号序列的多聚核苷酸，例如MFα1与本发明的多肽的编码序列在阅读框中融合。表达载体优选含有营养缺陷的标记基因，例如URA3或LEU2，或任何本领域已知的标记，它们可用于补偿营养缺陷宿主的缺陷性。另外，可使用显性可选择标记，如zeocin或blastacin。
然后用本领域技术人员已知的技术用表达载体转化多形汉逊酵母宿主细胞。多形汉逊酵母转化的一个有趣而有用的特征是将多达100个表达载体的拷贝自发整合到基因组中。在大多数情况下，整合的多聚体序列显示头-尾排列。整合的外源DNA在几种重组菌株中，甚至在非选择性条件下也显示稳定的有丝分裂。该高拷贝整合的现象也帮助了系统的高生产力性能。
植物
本发明还考虑在植物表达系统中，包括植物宿主细胞和转基因植物中产生本发明的重组明胶或可以衍生出重组明胶的多肽(见例如Transgenic Plants：AProduction System for Industrial and Pharmaceutical Proteins，Owen和Pen编，John Wiley & Sons，1996；Transgenic Plants，Galun and Breiman编，ImperialCollege Press，1997；和Applied Plant Biotechnology，Chopra等编，SciencePublishers Inc.1999)。在使用植物表达载体的情况下，序列的表达可由许多启动子中的任一个驱动。例如，可单独或联合TMV的ω前导序列使用病毒启动子，如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(见例如Brisson等，(1984)Nature 310：511-514；和Takamatsu等(1987)EMBO J.6：307-311)。植物表达载体和报道基因是本领域公知的(见例如Gruber等(1993)Methods of Plant Biology and Biotechnology，CRC Press)。
另外可使用植物启动子，例如RUBISCO的小亚基或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B。(见例如Coruzzi，G.等(1984)EMBO J.3：1671-1680；Broglie，R.等(1984)Science 224：838-843；Winter，J.等(1991)Results probl.Cell Differ 17：85-105；和6urley等(1986)Mol.Cell.Biol.6：559-565)。这些构建物可用Ti噬菌体、Ri噬菌体、植物病毒载体、DNA直接转化、显微注射、电穿孔、病原体介导的转染、颗粒轰击或任何其它本领域已知的方法，例如一般可得的综述所述的那些(见例如Hobb，S.或Murry，L.E.在McGraw Hill Yearbook ofScience and Technology(1992)McGraw Hill，New York，N.Y.pp.191-196；Weissbach & Weissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology，AcademicPress，NY，VIII节，pp.421-463；和Grierson和Corey，Plant Molecular Biology，第二版，Blackie，London，Ch.7-9(1988)。)
在许多实施例中，本发明的重组明胶或可以衍生出重组明胶的多肽通过基于种子的生产技术，使用例如芸苔、玉米、大豆、水稻和大麦种子在种子中生产。在这些实施例中，在种子发芽/蜕皮中回收蛋白质。在其它实施例中，蛋白质直接表达入胚乳或进入植物的其它部分，因此明胶是非提取的，植物本身作为蛋白质来源等的饮食补充。
可用于指导多聚核苷酸表达的启动子可以是异源或非异源的。这些启动子还可以用于驱动反义核酸的表达如所需减少、增加或改变表达。在植物或植物细胞中的转录最大化的其它修改是本领域已知的。例如，与一启动子可操纵连接的多聚核苷酸序列还可包含至少一种因子，它改变编码的多肽或相关翻译后加工酶的转录速度，例如肽输出信号序列、密码子使用、内含子、聚腺苷酸和转录终止位点。修饰构建物提高植物表达水平的方法是本领域已知的(见例如Rogers等(1985)J.Biol.Chem.260：3731；和Cornejo等(1993)Plant Mol Biol 23：567-58)。在工程改造影响多聚核苷酸转录速率的植物系统中，各种本领域已知的因素，包括调控序列，例如正或负激活序列、增强子和沉默子，以及染色质。
用于在植物中表达外源基因的典型载体是本领域熟知的，包括但不限于衍生自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导性(Ti)质粒的载体。这些载体是植物整合载体，它们在转化后，将一部分DNA整合入宿主植物的基因组(见例如Rogers等(1987)Meth.In Enzymol.153：253-277；Schardl等(1987)Gene61：1-11；和Berger等；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8402-8406)。
本领域可得转化植物细胞的方法，包括例如直接基因转移，体外原生质体转化，植物病毒介导的转化，脂质体介导的转化，显微注射，电穿孔，土壤杆菌介导的转化和颗粒轰击。(见例如Paszkowski等(1984)EMBO J.3：2717-2722；美国专利号4,684,611；欧洲申请号0 67 553；美国专利号4,407,956；美国专利号4,536,475；Crossway等(1986)Biotechniques 4：320-334；Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606；Hinchee等(1988 Biotechnology6：915-921；和美国专利号4,945,050)。本领域描述了转化例如水稻、小麦、玉米、高粱和大麦的标准方法(见例如Christou等(1992)Trends in Biotechnology10：239和Lee等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：6389)。可用与转化玉米或水稻类似的技术转化小麦(见例如Fromm等(1990)Bio/Technology 8：833；和Gordon-kamm等，见上)。
在本领域建立了其它可用于生产表达本发明中的重组明胶或可以衍生出重组明胶的多肽的植物的方法。(见例如美国专利号5,959,091；美国专利号5,859,347；美国专利号5,763,241；美国专利号5,659,122；美国专利号5,593,874；美国专利号5,495,071；美国专利号5,424,412；美国专利号5,362,865；美国专利号5,229,112。)
本发明还提供了一种通过提供植物或植物细胞的生物质产生多肽的方法，该生物质含有至少一种编码重组明胶或可衍生出重组明胶的多肽的多聚核苷酸序列，其中该多聚核苷酸序列与有效表达多肽的启动子可操纵性连接。在另一个实施例中，本方法还包括共同表达至少一种编码催化翻译后修饰的酶或其亚基的多聚核苷酸序列，其中多聚核苷酸序列与启动子可操纵性连接。在这些方法中，重组明胶或胶原性多肽从生物质中提取。
真菌
还用丝状真菌生产该多肽。在丝状真菌中表达和/或分泌重组蛋白质的载体是本领域熟知的，本领域技术人员可用本领域可得的方法和产品，在引用的这些方法中使用这些载体。(见例如美国专利号5,834,191)。
昆虫
昆虫细胞系统能大量产生本发明的多肽。在一种这样的系统中，使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体，在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉斑夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因。本发明编码明胶或明胶前体的序列可克隆入病毒的非必需区域(例如多角体基因)，置于AcNPV启动子(例如多角体启动子)的控制下。编码序列的成功插入将导致多角体基因失活，产生非闭合的重组病毒(即缺乏多角体基因蛋白质包被的病毒)。然后用这些重组的病毒感染草地夜蛾细胞或粉斑夜蛾幼虫，在其中表达编码明胶或明胶前体的多聚核苷酸。(见例如Englhard，E.K.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：3224-3227；Smith等，(1983)J.Virol.46：584；和美国专利号4,215,051)。该表达系统的其它例子可在例如Ausubel等见上中发现。
可在昆虫细胞，例如通过感染含有合适多聚核苷酸序列，包括那些编码任何可能需要的翻译后加工酶的多聚核苷酸序列的杆状病毒载体，实现本发明多肽的重组生产。杆状病毒是在昆虫细胞中大量生产各种重组蛋白的非常有效的载体。可使用各种本领域已知的方法来构建含有编码本发明的明胶或明胶前体和合适的转录/翻译控制信号的序列的表达载体。(见例如Luckow等(1989)Virology 170：31-39和Gruenwald，S.和Heitz，J.(1993)Baeulovirus Expression VectorSystem：Procedures & Methods Manual，Pharmingen，San Diego，CA)。
动物
本发明提供了在动物系统中表达本发明的重组明胶或可以衍生出重组明胶的多肽的方法。这些系统包括哺乳动物和无脊椎动物宿主细胞和转基因动物。在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多表达系统。就使用腺病毒作为表达载体而言，本发明编码多肽的序列可与腺病毒转录/翻译复合物，包括晚期启动子和三联前导序列连接。然后可将该嵌合的基因通过体外或体内重组插入腺病毒基因组。在病毒基因组的非必需区(如E1或E3区)插入将得到活的重组病毒，它能在感染的宿主中编码本发明中的多肽(见例如Logan，J.和Shenk，T.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：3655-3659)。另外，可使用痘病毒7.5K启动子。(见例如Mackett等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：7415-7419；Mackett等(1982).J.Virol.49：857-864；和Panicali等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：4927-4931)。另外，各种本领域已知的转录增强子，例如Rous肉瘤病毒(RSV)增强子，可用于增强哺乳动物宿主细胞中的表达。
Semliki Forest病毒是优选的表达系统，因为该病毒具有广谱的宿主范围，从而可能感染哺乳动物细胞系。用这种病毒载体感染哺乳动物宿主细胞，例如幼仓鼠肾(BHK)细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞可得到非常高的重组表达水平。更特别的是，考虑Semliski Forest病毒可用于各式各样的宿主，因为系统不基于染色体整合，因此将是在针对鉴定结构-功能关系和测试各种杂交分子的效果的研究中获得重组动物胶原修饰的快速途径。Olkkonen等(1994)Methods Cell biol 43：43-53描述了构建用于在哺乳动物宿主细胞中表达外源蛋白质的Semilki Forest病毒载体的方法。
另外，可用含有dhfr基因和所需多聚核苷酸的表达质粒转染二氢叶酸还原酶缺陷(dhfr)的CHO细胞。对提高氨甲蝶呤浓度抗性的CHO细胞的筛选将经过基因扩增，如本领域已知的提供了所需重组蛋白的更高的表达水平。
还可用转基因动物系统表达本发明的重组明胶或可以衍生出重组明胶的多肽。可在哺乳动物中通过可操纵性连接编码多肽和启动子以及其它能在哺乳动物腺体中有效表达其它所需或任选的调控序列，构建这些系统。类似的，可同时在使用合适的表达系统的靶细胞中产生影响翻译后修饰的所需或任选的翻译后加工酶。用转基因动物重组产生动物的方法是本领域已知的(见例如美国专利号4,736,866；美国专利号5,824,838；美国专利号5,487,992；和美国专利号5,614,396；和同时申请的美国临时申请号08/987,292)。
明胶的用途
明胶在各种药物或医学产品和装置的制造中作为一种组分。估计85％的药物产品含有某种形式的牛衍生的物质，包括目前在各种产品中使用的牛明胶，例如药物稳定剂、血浆补充剂、海绵、硬和软明胶胶囊、栓剂等。利用明胶的成膜性。在特别设计用于药物口服固体剂型，包括缓释胶囊和片剂的各种薄膜包装系统中，明胶在药物产业中，例如在药物和疫苗，食品和饮料产品和工艺中，在工业引用中，例如混凝土稳定化中作为各种形式的稳定剂，和在各种实验室溶液中，例如各种细胞制剂中作为稳定剂。
在食品和饮料工业中长期使用各种可食形式的明胶。明胶广泛用于各种糖果和甜点工业，特别是布丁、糖霜、奶油夹心和乳品和冷冻产品中。明胶在各种裱花料和汤和调味汁中作为乳化剂和增稠剂。明胶用于各种饮料，包括酒和果汁的澄清剂和净酒剂。明胶用于各种低脂和脱脂产品，例如蛋黄酱和沙拉酱中用作增稠剂和稳定剂，并在其它地方作为脂肪替代品。明胶还广泛用于调味剂、色素和维生素的微囊化。明胶还可在各种高能和营养饮料和食品(例如那些在减肥和运动产业中流行的)中用作蛋白质补充物。作为薄膜形成物，明胶用于对水果。肉类、熟食上衣，和各种糖果制品，包括硬糖和口香糖等。
在化妆品工业中，明胶出现在各种护发和护肤品中。明胶在许多洗发精、摩丝、霜、乳液、面膜、唇膏、指甲水和产品，和其它美容装置和用途中用作增稠剂和基础剂。明胶还在化妆品工业中用于微囊化和包装各种产品。
明胶用于各式各样的工业用途。例如，明胶在各种制造过程中广泛用作胶水和粘合剂。明胶可用于各种粘合剂和胶水制剂，例如用于制造可重新水化的胶纸包装带、木胶贴、各级纸板箱和纸的纸面粘合，和提供各种可在重新湿润后重新活化的粘性表面的应用。
明胶在各种电子装置中作为光敏感性涂层，在各种光刻法中作为光致抗蚀基底，例如在彩色电视机和摄像机制造中。在半导体制造中，明胶用于构建引线框和涂覆各种半导体元件。明胶用于各种印刷用途和制造特殊质量的纸，例如用于债券和股票证明等。
长期确定了明胶在各种照像应用中的用途。明胶用作照像溶液中的各种活性成分，包括用于X光和照像胶片显影的溶液。长期用于各种照像蚀刻法的明胶也作为各种类型胶片的成分，并大量用于各种胶片层和纸制品的卤化银化学中。银明胶胶片是缩微胶片形式和其它信息储藏形式。用明胶作为各种薄膜的自密封元件等。
明胶还是用于各种实验室应用的有价值物质。例如，明胶可用于各种细胞培养用途，提供细胞附着和生长的合适表面，例如平板和烧杯涂层，微珠或其它底物，或提供生长介质中合适的细胞来源。用水解或低凝胶强度的明胶作为各种方法中的生物缓冲液，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和其它免疫测定的涂层和封阻溶液。明胶还在各种用于生物化学和电泳分析的凝胶，包括酶显影凝胶中作为组分。
药物
本发明还考虑了重组明胶在各种药物和医学应用中的用途。特别是在一个实施例中，本发明提供了含有重组明胶的药物组合物。在一个优选例中，重组明胶衍生自人来源。该重组明胶提供了之前在本领域中没有的优点：用衍生自天然人胶原序列的明胶，减少了明胶物质免疫原性的危险，因为该明胶在受控环境中重组产生，因此最大程度减少了引入加工过程中TSE或病原体和内毒素等因子的感染性的危险。
商品物质的内毒素水平通常在约1.0-1.5EU/mg明胶(见例如Schaegger，H.和G.von Jagow(1987)anal.Biochem.166：368-379；Friberger，P.等(1987)在“Detection of Bacterial Endotoxins with the Limulus Ameocyter LysateTest”，Prog.Clin.Biol.Res.231：149-169)。在本发明的方法中，内毒素水平可减少2-3个数量级。(见实施例8)。本发明因此在一个实施例中提供了衍生自人来源，基本无内毒素的重组明胶。
除了提供不含与动物衍生的物质有关的免疫原性和感染性因素的明胶材料，本发明提供了可重复的组合型产物来源。特别是，本发明的明胶可作为相同分子的同源混合物存在。可特别引入和组合型实现特定医学用途中所需的物理特征。本发明因此能提供可靠和组合型的产物，，最大程度减少与可获得性和使用目前明胶产物有关的可变性。
在特定实施例中，本发明的重组明胶可用于制造胶囊，包括硬壳或硬胶囊，通常从明胶溶液生产，和软壳和软胶囊，通常从明胶薄膜制备。在本发明的特定实施例中，作为制造这些胶囊的方法，提供了含有重组明胶的硬凝胶胶囊和软凝胶胶囊。明胶的热可逆性是许多应用，例如制造这些凝胶胶囊和片剂中利用的特性。可适当加热、成型或塑造明胶，可用于在稳态温度下形成具有特定性质胶囊或片剂糖衣。所选的明胶可在口腔温度下开始融化，方便吞服，在体内温度，例如胃内变为液体。在一个实施例中，本发明提供了具有市售明胶和糖衣的熔解速度的重组明胶。在另一个实施例中，本发明提供了具有改进的弹性，适用于胶囊和糖衣的重组明胶。
在某些应用，例如制造凝胶胶囊中，明胶随着时间发脆和发硬是限制目前销售的动物来源明胶的储藏期和实用性的重要参数。随时间保持粘性是宝贵的优点，尤其对于含明胶产品的制造商而言。另外，一些制造过程，例如硬明胶胶囊的制造目前需要不同类型明胶的混合物，例如A型和B型明胶，以产生具有所需性质的物质，因为在硬明胶胶囊中单独使用B型明胶会太脆，不适合制造和使用。
本发明重组明胶具有更高的纯度，比目前可得的材料特性更好。因此，本发明的明胶可提供稳定的物质，和行为更可重复和预测的物质。另外，用本发明的方法，可以工程改造重组明胶，它在一个分子或在分子的明确混合物中具有两类明胶的结构特征。
本发明的重组明胶还可在各种药物产品中，例如在药物或疫苗中用作稳定剂。(见例如共同申请，同时拥有的美国临时申请号＿＿＿，题为“疫苗中的重组明胶”，2000年11月10日提交，在此完整引入以供参考)。
各种胶原的不同区域与不同活性有关，例如III型明胶的不同区域与凝血级联中的活性位点有关。因此在一个实施例中，本发明考虑使用编码含有特定胶原或一些特定胶原的特定活性位点的重组明胶的多聚核苷酸。这些多聚核苷酸可以各种方式，例如在微阵列中使用。因此，这些多聚核苷酸可用作诊断工具，来鉴定对应于样品中感兴趣的胶原结构域的mRNA多聚核苷酸改变的连接。编码的多肽可用于各种筛选药物和化合物的方法，这些药物和化合物可抑制或增强与特定胶原结构域有关的活性和/或表达。
本发明还可用于衣壳包装，包括微囊化、压片、栓剂和各种药物制剂。本发明还考虑使用本文提供的明胶在医用海绵，例如止血海绵等中在伤口处理和各种手术应用中的用途，例如作为用于防止在胎儿镜检查和其它手术中除去孔后的渗漏。因此，在一个方面，本发明包括含有重组明胶的海绵，其中海绵适用于医药过程。在一个优选例中，重组明胶是重组人明胶。
本发明的重组明胶可设计成适用于特定应用的具有特定物理性质。本发明提供了改变分子量、凝胶强度和最终明胶制剂的pH，来提供具有所需特定性质的明胶，从而以目前可得的物质不能达到的程度满足消费者的特定需要。
市售动物衍生的溶液明胶，例如用于疫苗制剂的分子量分布在约0-30kD和约0-60kD之间(见实施例7和9)。本发明提供了一种在合适的水解条件下产生重组人明胶的方法，从而得到具有对应于市售明胶的分子量分布的重组人明胶，可用于相同的目的。另外，本发明提供了产生具有不能从商业物质获得的更窄的分子量分布，例如约10-30kDa或约30-50kDa的明胶的方法。
本发明的重组明胶及其组合物还可用于各种外科手术，包括用于引导和支持神经再生的生物可降解导线，用于大手术中的胶体体积置换，用于密封各种孔部位，例如导管插入位点和其它切割和伤口的明胶海绵塞，和在聚酯移植物中，例如作为抗感染密封材料。(见例如Mligilche，N.L.等(1999)East.Afr.Med.J.76(7)：400-406；Beyer等(1997)Br.J.Anaesth.781(1)：4-50；Luks等(1999)Am.J.Obstet.Gynecol.181(4)：995-996；和Farooq等(1999)J.Surg.Res.87(1)：57-61)。
本药物组合物可施给个体，用于治疗各种关节病症，包括关节炎、关节病和其它与软骨降解和关节灵活性有关的病况。在一个优选例中，重组明胶含有一种修饰的氨基酸序列，它具有更高浓度的精氨酸、羟脯氨酸和羟赖氨酸，和其它与在软骨中产生胶原和蛋白糖苷有关的其它氨基酸(见例如Oesser等(1999)J.Nutr.129(10)：1891-1895)。还考虑了用本发明的明胶合成的微球。这些微囊化的颗粒可用于例如定向传递治疗性蛋白或小分子，提供非炎症性和生物适合的传递系统。(见例如Brown等(1998)Arthritis Rheum，41：2185-2195)。在另一个方面，本发明考虑口腔施用本发明的重组明胶，来环节类风湿性关节炎的疾病作用(Arborelius等(1999)Rheumatol Int 18：129-135)。在内服药制品中，理想的是提供重组明胶，它在胃肠道的酸性环境中具有能抵抗降解的稳定性。
本领域可得的各种微囊化、各种制剂和药物输送系统技术在各种来源中有描述(见例如Gennaro，A.R.编，(1990)Remington’s Pharmaceutical Sciences，18版，Mack Publishing Co.，Easton PA)。用本领域已知的方法不难确定给药的最有效和便利的途径，和特定情况最合适的制剂。
合适的给药途径可以包括例如口腔、直肠、透粘膜或小肠内给药和胃肠外给药，包括肌肉内、皮下、腹膜内、鼻内、或眼内注射。可静脉内、皮或口腔内传递疫苗，并采用活的减毒、亚基、单价、二价、三价等形式。也考虑了肠内缓释制剂等。可以局部而不是以全身方式施用组合物。本发明还提供了一种含有重组明胶的药物组合物，其中组合物适合作为喷雾传递，用于舌或鼻内传递。
食品
在食品工业中，明胶的物理性质和纯蛋白组合物使它适合各种用途，包括作为各种食用产品和营养补充剂的组分。明胶可以本身是食品，提供无糖的纯蛋白来源。另外，明胶的物理和结构特征对于各种食品制造和包装用途是有用的。例如，用明胶作为凝结剂和增稠剂；作为乳化剂和发泡剂；防止乳凝聚或蛋白液体分离；用于“感觉”，或改进稳定性和质地；维持湿度；和在粘合和包装中用作可食用薄膜。
食用明胶可作为纯蛋白质的很有价值的来源。因此，在一个方面，本发明提供了含有重组明胶的蛋白补充剂。本发明的明胶可用例如特定和理想量的必需氨基酸制备。本发明提供了生产各种凝胶、箔或粉末形式，具有对于特定应用或终产物特别优化的特征的食用明胶的方法。
本发明提供了含有不同比例的氨基酸残基的重组明胶产物。通常明胶含有大部分人必需氨基酸，包括例如：赖氨酸、精氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在一个实施例中，本发明提供了含有特定比例的氨基酸的所需明胶。例如，用于要补充运动员饮食的食品的明胶含有较高水平的赖氨酸，它对于肌肉生长是有益的，和精氨酸，它作为肌动蛋白的前体，与肌肉细胞的能量代谢有关。总的来讲明胶可用于提高食品的营养价值，补充和提高其它蛋白质来源，例如肉和乳制品的氨基酸组分。
明胶几乎无味或具有淡味，因此作为美味和有营养的食品补充剂。用水解的明胶作为甜点和糖果以及其它含热量的食品中作为浓缩糖溶液的替代品，减少热量的含量。明胶还可用作具有高营养价值的食品中蛋白质的来源，例如在减肥食品工业或高能食品中产生的低热量食品。另外作用一种蛋白质来源的添加物，明胶可作为喷雾或干燥的方便食品和调味剂中的无糖载体或填充物质，或作为酒和果汁中的澄清剂和净酒剂。
明胶赋予的所需要的性能，包括例如质地、颜色和澄度的能力具有高度价值。这些产品的质地在很大程度上由使用成分的类型、制剂变化和加工和储藏产品的方法决定。在糖果应用中，明胶出现在各种凝胶制品中，例如软果糕和流行的口香糖产品。明胶用作胶凝剂，提供了从柔软而有弹性到松脆和硬的质地。最终产物的质地和口感由所用明胶的Bloom强度、浓度和配方决定。另外，明胶的胶体性质提供了颜色和染料的基质，获得终产物所需的不透明性或澄度，以及颜色。因此，在一个方面，本发明能够在胶凝糖果制品的制造中提供所需质地性质、量度和澄度的明胶。在另一个方面，选择合适的明胶，它具有较低的粘度，因为高粘度会使沉淀的糖浆在制造过程中产生不理想的拖尾，导致有缺陷的产物。一般来说，明胶bloom值越高，产品越硬，因此提高明胶含量可使产品质地变得更硬，更容易咀嚼。
在生产泡泡糖产品中广泛利用的一种明胶是它能产生和支持泡沫，并促使在气/液界面糖果在包裹的气泡周围形成薄膜迅速凝固。泡泡糖产品是糖果产品中的一个大家族，包括棉花糖、糖霜、牛轧糖和饼干和薄脆饼中的夹心。特定产品所需的充气程度和凝固时间由使用的明胶的类型和级别，以及最终产品中明胶的浓度决定。改变所用明胶的类型和部分将改变充气产品的质地。例如，具有高Bloom值或凝胶强度的明胶产生较脆的口感，而具有较低bloom值的明胶提供了更有弹性的质地。
明胶在水果糖和其它类型的用丝光糖的糖果制品，例如太妃糖和饴糖(它们含有脂肪，轻微发泡)的制造中有许多功能。例如，明胶帮助脂肪的乳化；改善分布和稳定性；提供所需的质地和咀嚼性，以及发泡能力；并对终产物的储藏期有作用，例如通过控制蔗糖结晶。具有约150-200 Bloom值的明胶通常以0.5-1.5％w/w的用量水平用于这些产品。因此，在一个方面，本发明考虑用于食品的具有约150-200Bloom值的重组明胶。
明胶为稀奶油提供了粘性质地，它同时具有固相和液相界面，由分散在糖浆中的粉末糖和脂肪构成。明胶作为粘合剂，防止形成易碎的质地，并抑制破裂。在甘草等产品中，明胶常常和小麦粉等物质混合作为粘合剂，大大改善了水分保持，并防止在制造中破裂或碎裂。明胶还帮助防止糖果制品，例如甘草在储藏中干燥，延长产品的储藏期限。本发明因此在一个实施例中提供了一种含有重组明胶的粘合剂，该粘合剂可以是食品的一部分。本发明还提供了含有重组明胶的湿润剂，该湿润剂能用于食品。
可得到各种形式的胶凝产品，包括快餐制品，干燥混合的粉末混合物，或片剂，其中溶解并凝结了糖、明胶、酸、调味剂和色素。在这些用途中利用了明胶形成熔点在25-35℃的弹性质地，热可逆性凝胶的能力。最终的质地、硬度和这些凝胶产品的沉淀速度由明胶的浓度和物理性质，具体是bloom强度和粘度水平控制。在明胶甜点的生产中，用较低浓度的较高疾病的明胶产生具有特定硬度的胶凝产品，与使用较高浓度的较低强度的明胶可提供优点，包括经济上的优点，以及可改进的澄度和颜色的显示。因此在一个实施例中，本发明提供了含有重组明胶的胶凝剂，其中胶凝剂适用于可食用产品。
明胶常用于制造各种乳制品，例如冰淇淋、酸奶和布丁，其中需要特定的质地和口感；特别是明胶提供了柔软、质地均匀的稳定和奶油口感。明胶应用于与其它水状胶体混合，作为低脂蛋黄酱和沙拉调料。
随着低脂或脱脂乳制品数量和需求的广泛增长，明胶可对产品质地、稠度、和最终产品的口感有突出的贡献。由于其脂肪样的融化特性，具有约25-35℃的融点的明胶提供了所需的感官性质，或“融于口”的特征，因此模仿了全脂产品的质地。
在一个关心健康的社会中，明胶非常适合用作低脂或脱脂酸奶产品的稳定剂，提高稠度和口感，并在无脂肪的条件下建立柔软、柔和和奶油般的质地。另外，明胶通过防止脱水收缩或分离乳清蛋白稳定这些产品。在该方面，明胶的作用是形成与水结合的凝胶网络，防止乳清蛋白的渗出和分离，从而对产品的储藏期有帮助。明胶还可用于制备增稠的奶油，其中明胶的胶凝和乳化性质用于提高奶油粘度。明胶在制造软冰淇淋、软干酪产品、酸牛奶甜点，例如乳酪蛋糕中，和调味的基于牛乳的甜点，例如奶油冻、chiffon和蛋奶酥中具有广泛的用途。奶油粘度可以通过改变所用的明胶的浓度和凝胶性质随需要变化。通常这些用途的明胶水平范围是0.2-0.8％w/w，虽然更高或更低的凝胶强度在各种产品中是理想的。本发明提供了含有重组明胶的稳定剂。
在食品和健康工业中对少脂肪或无脂肪的产品具有正在增长的需求。明胶的减肥饮食性质，包括其在不存在脂肪的情况下提供蛋白质的能力使其在减肥产业中，以及为病人设计的产品、恢复期病人和具有特定饮食敏感性或需要的个人中是有用的。明胶的蛋白质含量增加了无糖营养价值。除了其营养价值，明胶是可高度消化的，并可因此在易于吸收的液态食品中使用。纯明胶不含脂肪、糖、嘌呤或胆固醇。明胶的物理性质、蛋白含量、没有强烈的味道使得它在许多产品中是优选的脂肪替代品。明胶在例如低脂黄油和人造黄油中用作乳液稳定剂。作为增稠和粘合剂，明胶可完全或部分替代许多食品中所含的脂肪。例如，脂肪可以代替高热量的粘合剂，例如奶油、黄油和其它乳制品脂肪；蛋黄；和其它淀粉产品。另外，明胶的水分保持性能帮助结合大量水分，使得膳食后更有满足和胀慢感。
明胶的感觉或口感是关键的，因为许多无脂肪或低脂产品寻求尽可能的模拟脂肪的口感，以及味道。通过在低脂配方中使用明胶，可能实现优选的质地和口感。所用的明胶量由在最终产品中如存在的脂肪含量决定。例如，在60％的脂肪含量，使用0.5％w/w的明胶，而在25％的低脂水平，用约3.5％w/w的明胶维持产品完整和感觉表现。根据本发明产生的明胶可具有与包含其的食品相似的融点，或优选人的体温或口腔温度，导致明胶在食用时的温度下融化，和相应的浓厚口感。另外，明胶的清淡味道不影响特定食品的味道。最后，明胶是高度可消化的。用明胶作为脂肪替代品使得热量减少，而质地和丰富度不相应减少，没有对味觉和消化性的不良影响。本发明在一个方面提供了一种含有明胶的脂肪替代品，其中脂肪替代品用于可食用产品。在一个优选例中，重组明胶具有约25-35℃的融点。
明胶通过渗透和填充组织中的任何空穴改善各种罐头和保藏食品，包括熟火腿等肉类的外观和切片特性。在罐头肉类产品中，明胶用于吸收在高压杀菌过程中释放的汁液，提高剪切性能并提供产品令人满意的外观。在这些情况下，应选择具有低钙含量的明胶，因为会发生肉汁中磷酸钙从磷酸盐中沉淀出来。在罐头应用，例如海鲜罐头中，用具有高凝胶强度的明胶抵抗在灭菌过程中的热处理。依赖灭菌的程度和所选的凝胶强度，凝胶水平通常范围在0.5-5.0％w/w。凝胶还作为罐头海鲜和肉类，以及各种胶冻(肉冻)产品中的粘合剂和胶凝剂。
明胶在香肠肠衣中有用，其中它用作将调味品与萨拉米香肠等产品的切片结合起来的粘合剂。香肠浸在明胶的浓缩溶液中包衣，该明胶一般具有高bloom强度和高粘度，给明胶足够的时间凝固并抑制从产品表面流走。这种肠衣还可用于例如制造大豆和其它替代肉制品，和各种水果、肉类和熟食的涂层。在一个方面，本发明提供了含有重组明胶的可食用涂层。
明胶还用于各种调味剂、色素和其它添加剂、维生素的微囊化。
特别考虑了各种可用作稳定剂、增稠剂、膜形成剂、粘合剂、可食用涂层、胶凝剂、蛋白补充剂、乳化剂、色素、调味剂和维生素的微囊化剂等，可用于各种食品补充，包括营养和饮食补充物，以及脂肪替代品的各种重组明胶。在一个实施例中，本发明的明胶用于为了具有犹太教、伊斯兰、素食或其它饮食习惯，限制含有特定动物来源产品的食物摄取的消费者所制备的食物的加工或包装，或其成分。
除了用于人类消费的可食用产品，明胶在制造宠物食品、零食和口香糖中用作粘合剂。除了在这些产品中提供了明胶的结构优点，明胶的高蛋白含量还对减轻动物骨骼系统的变性疾病有缓解征兆，并改善了毛皮生长和质地。
照像
在另一个方面，本发明包括含有重组明胶的照像组合物。优选重组明胶是部分羟化的。明胶是各种照像术和产品，包括例如胶卷和像纸的关键成分。明胶用作光感性产品的粘合剂，其中它的凝胶沉淀和薄膜形成特性提供了澄清、均一和耐久的涂层，它可涉及一次应用中的多个涂层。明胶作为粘合剂建立和提供了均一的稳定性固化和所需的粘合性。明胶还稳定偶联物并在彩色照像产品中干燥乳剂。
明胶在照像涂层，包括卤化银乳液涂层。顶部涂层或表面涂层、中间层和背涂层中是不可缺少的。明胶的化学和胶体性质能精确预测，并化学熟化照像用卤化银乳液。一些乳化液使用非凝结鱼明胶，它可在高达40％的浓度下，低至20℃的温度下的溶液中维持液态。
在一个实施例中，重组明胶具有低分子量和低凝结温度。在另一个实施例中，重组明胶具有比目前非凝结鱼衍生的明胶或动物衍生的明胶水解物中更低的凝结温度，而更高的分子量。
本发明的重组明胶可用于各种照像用途，例如支持胶片和像纸上的卤化银。在一个实施例中，重组明胶具有15-25℃之间的凝结温度。重组明胶可喷雾干燥或允许是低密度、冷水可溶的粉末或薄膜，因此有利于各种技术应用，例如光致抗蚀系统。本发明还用于明胶滤膜。例如，本发明考虑为客户特别设计的照像明胶产品，来符合各种特别需要的确切性能，以及制备这些明胶的方法。
其它
由于本发明明胶更特别和完整的化学组成，以及其相应的物理性质稳定性，它提供了与市售明胶相比各种技术优点。本发明的重组明胶因此可用于目前涉及提取的明胶的技术应用。例如，该明胶可用于各种工艺过程，包括但不限于纸上浆和照相凹版印刷、珂罗版、丝网印刷工艺、微囊化染料、转印纸和其它通过与阿拉伯树胶形成凝聚复合物用明胶涂层的纸张和纸板。本发明的明胶还可用于电镀，来确保光滑沉积，并在一些聚合反应中作为保护性胶体，以及作为半导体制造中的薄膜形成剂。
在另一个实施例中，该明胶用作特定质量的纸张，包括股票证书、银行支票等的粘合剂。该明胶还用作火柴胶的粘合剂，对火柴提供较低的密度和更均匀的燃烧，以及加固帆布或纸张衬底上的粘性颗粒，来制造粘性纸。
明胶的不同性能，包括其作为保护性胶体，和随着pH的改变改变其电荷的能力，合起来使得明胶适用作微囊化中的材料。明胶及其衍生物因此可用于各种微囊化装置和技术，例如用于无碳纸的微囊化墨水；广告和制备中的香料；用于多组分粘合剂的化学物质；和维生素和营养补充剂。明胶及其衍生物的微囊化能力还用于制造包装材料，包括使氧、香味和水蒸气渗透性最小化的包装。明胶因此广泛用于软包装，例如食品、药物和其它敏感产品的包装。
明胶提供的粘合作用和表面张力的减少使得它们能用于根外肥料。由于明胶氨基酸的稳定性和低降解，因此维持了肥料提供的确切氮浓度，并使得长期维持。明胶还在肥料颗粒的制造中用作生物可降解粘合剂。
由于其氨基酸组成，明胶可作为氮的复合来源，用于例如产黄青霉合成青霉素，例如各种起始培养物和抗生素的制备(见例如Leonhartsberger等(1993)JBiotechnol 30：299-313)。
本发明的重组明胶可用于各种实验室用途，其中本发明重组明胶的复制性和均一性受到了高度评价，使得最大限度减少实验室过程和组合物中的不良可变性。例如，本发明的明胶可用于各种组织培养用途，在生长培养液中提供合适的蛋白质来源，并在一些应用中提供细胞生长基质或支架，或其它细胞结合和生长的表面。本发明还提供了含有重组明胶的细胞保存制剂。例如，这些制剂能用于保存血小板细胞的制备物，保护溶液直到施用和使用。本发明考虑含有水解或低凝胶强度的重组明胶的生物缓冲液，例如各种封阻和涂层溶液。在其它实施例中，本发明提供了可重现的重组明胶，用于各种生物化学和电泳分析用的凝胶，包括酶学用凝胶。
本发明还包括用重组明胶包裹的微载体珠。这些用于哺乳动物细胞培养的微载体提供了结合依赖性细胞的生长表面。例如，可用本发明的重组明胶包裹的多糖和聚苯乙烯珠提供细胞结合和生长的合适表面。在一个实施例中，本发明的微载体珠被能诱导特定细胞分化和生长的含有活性胶原结构域特定重组明胶包裹。
各种胶原的不同区域与不同活性有关，例如III型明胶的不同区域与凝血级联中的活性位点有关。因此在一个实施例中，本发明考虑使用编码含有特定胶原或一些特定胶原的特定活性位点的重组明胶的多聚核苷酸。这些多聚核苷酸可以各种方式，例如在微阵列中使用。
重组明胶、多肽和编码本发明的重组明胶的多聚核苷酸可用于新颖微阵列技术和筛选方法。胶原原纤维和固定化的胶原与血小板牢固结合，因为血小板具有胶原的多个结合位点，将多个胶原分子彼此聚合在一起。血小板和胶原通过其胶原受体的相互作用导致血小板活化，和随后形成血小板聚集物。
例如，可作为具有目前胶原和明胶来源不能获得的均一性、纯度和可复制性的微纤维，制备含有III型胶原的生物活性区域的重组明胶。从该重组明胶衍生出的微纤维可存在于基质，例如阵列或芯片中，用于筛选通过与例如III型胶原或其它形成胶原的纤维相互作用防止血小板聚集的化合物。可筛选化合物、小分子、肽或其它生物分子(例如抗体)防止、减少或减慢血小板与特定胶原纤维内部的特定区域，例如RGD序列的相互作用介导的凝血形成或血小板聚集的能力。另外，微阵列还可用于检测不同整合蛋白与不同的胶原和明胶微纤维区域的相互作用。任何形成原纤维的胶原，例如I、II、III、V或XI型胶原的重组明胶产生的微纤维可用于筛选胶原诱导的血小板聚集物拮抗剂。
还考虑了编码重组明胶或其片段的多聚核苷酸的微阵列。这些微阵列用于筛选和分离编码胶原或明胶的多聚核苷酸，例如DNA或RNA的变体，确定在正常对疾病组织中不同水平表达。
在另一个实施例中，本发明提供了用于祖细胞分化、组织再生治疗、组织工程的纯化的人明胶。胞外基质的组分与细胞增殖和分化的调节有关。用植入碱性成纤维细胞生长因子的明胶微球加速增殖和人工表皮模型中的毛细血管形成(Kawai等(2000)Biomaterials，21：489-499)。IV型胶原抑制细胞增殖和神经胶质细胞分化，同时促进神经元祖细胞的分化(Ali等(1998)Brain Res Dev Brain Res110：31-38)。另外，I型胶原诱导骨髓基质细胞的成骨分化，而II、III和V型胶原不诱导(Mizuno和Kuboki(1995)Biochem Biophys Res Commun 211：1091-1098；和Mizuno等(1997)Bone 20：101-107)。
总的说，在细胞培养物中使用明胶导致更高的细胞密度，并提高和延长造血干细胞和其它祖细胞中的细胞存活率(Tun等(2000)ASAIO J 46：522-526)。用作载体基质或传递载体的明胶支持了传递骨髓衍生的间充质祖细胞和基于软骨再生治疗的间充质细胞传递的骨软骨分化(Angele等(1999)Tissue Eng 5：545-554：Ponticiello等(2000)J Biomed Mater Res 52：246-255；和Young等(1998)J OrthopRes 16：406-413)。本发明提供了重组明胶，用于细胞培养，例如促进细胞结合，细胞增殖和细胞分化。在一些实施例中，本发明提供了生产设计提供所需细胞结合、细胞增殖或细胞分化活性的特定重组明胶的方法。例如，如果需要促进神经元祖细胞的分化，可产生含有负责该活性的IV型胶原的特定区域的重组明胶。
本发明提供了一种含有重组明胶的化妆品组合物。该组合物可施给个体，来改善和修复粗糙和开裂的指甲，并改善头发的质地。明胶的低过敏原性和水合性质，及其提供质地、颜色和澄度，以及成膜的能力，使其在许多化妆品和洗涤用品中成为必需的成分。例如，明胶是护发产品，例如洗发水和护发素的有价值成分。在一个实施例中，本发明提供了一种含有重组明胶的湿润剂，该湿润剂适用于化妆品应用。明胶的薄膜形成作用可改善头发，尤其是之前用化学制剂处理过的损伤了的头发的光泽和易梳理性。明胶还用于各种化妆过程，包括头发护理过程，例如永久波浪和漂染，其中用明胶等蛋白质保护头发结构。还考虑了重组明胶在乳液、面膜、霜、唇膏和其它化妆产品中的用途，因为明胶的薄膜形成性能对皮肤的光滑和柔软有贡献。在一个方面，本发明考虑了一种含有重组明胶的化妆组合物，它施用治疗磨损或脆弱的指甲等。
明胶的不同性质，包括其作为保护性胶体，和随pH改变改变其电荷的性质，合起来使得明胶成为一种适用于微囊化的物质。明胶及其衍生物因此可用于各种微囊化装置和技术，例如在广告和样品制造中香料的微囊化。
下列实施例更详细的描述了本发明。提供了下列制备物和实施例使本领域技术人员能更清楚的理解，并实施本发明。然而本发明不限于示范实施例的范围，它们仅为了说明本发明的一个方面，功能上等价的方法在本发明范围内。事实上，除了本文描述的那些，本领域技术人员根据上文的描述和附图可理解本发明的各种修改。这些修改也将在权利要求的范围内。
实施例
除非另外说明，在本发明的实施例中使用了下列材料和方法。
实施例1：重组明胶的直接表达
用PCR扩增人I型胶原α1(I)cDNA的特定片段并克隆入质粒pPICZαA或pPIC9K中(Invitrogen Corp.Carlsbad，CA)。用于克隆的特定PCR引物列于下文表1。表2中用SEQ ID NO：15-25和30、31和33列出了特定明胶。另外根据人前-α1(I)胶原原另外鉴定出这些重组明胶(Genbank登录号CAA98968)。所用的表达质粒含有不同长度的α1(I)cDNA序列，它与酵母杂交因子α前分泌原序列融合。还可使用其它本领域已知的信号序列，例如酵母转化酶(SUC2)、酵母酸性磷酸酶(PHO)序列，天然前胶原信号序列和人血清白蛋白的信号序列。应选择在特定表达系统中提供特定明胶片段表达的最佳水平的信号序列。
                            表1
 SEQ ID NO：                           序列
 1  GTATCTCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTGGTCTGCCTGGTGCCAAGGGT
 2  TAGACTATTATCTCTCGCCAGCGGGACCAGCAGG
 3  GTATCTCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAGGCTGGAGCTCAGGGACCCCCTGGC
 4  ATGCTCTAGATTATTACTTGTCACCAGGGGCACCAGCAGG
 5  GTATCTCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTGGCCCCATGGGTCCCTCTGGTCCT
 6  TGCTCTAGATCATTAAGCATCTCCCTTGGGCACCATCCAA
 7  TGCTCTAGACTATTAAGGCGCGCCAGCATCACCCTTAGCACCATC
 8  TGCTCTAGATCATTAAGGCGCGCCAGGTTCACCGCTGTTACCCTTGGG
 9  TGCTCTAGATCATTATCTCTCGCCTCTTGCTCCAGAGGG
 10  GTGCCCGTGGTCAGGCTGGTGTGATGGGATTCCCTGGACCTAAAGGTGCTGCTTAAT
 11  CTAGATTAAGCAGCACCTTTAGGTCCAGGGAATCCCATCACACCAGCCTGACCACGGGCACCAG
 12  ATGCTCTAGATTATTAAGGAGAACCGTCTCGTCCAGGGGA
 13  CTAGTCTAGATTATCTTGCTCCAGAGGGGCCAGGGGC
 14  CTAGTCTAGATTAGCGAGCACCTTTGGCTCCAGGAGC
 32  AGCTTCTAGATTATTAGGGAGGACCAGGGGGACCAGGAGGTCC
                                      表2
 SEQ ID NO：  所用的PCR引物 氨基酸序列  分子量
 15  SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6 残基179-280  9,447Da
 16  SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8 残基179-439  23,276Da
 17  SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：9 残基179-679  44.737Da
 18  SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11 残基531-589  5,250Da
 19  SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2 残基531-631  8,947Da
 20  SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2 残基531-715  16,483Da
 21  SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4 残基531-781  22,373Da
 22  SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：12 残基531-1030  44,216Da
 23  SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7 残基615-715  8,213Da
 24  SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4 残基615-781  14,943Da
 25  SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：12 残基615-1030  36,785Da
 30  SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13 残基615-676  5,517Da
 31  SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：14 残基615-865  22,126Da
 33  SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：32 残基531-1192  约65kDa
用电穿孔将表达质粒引入巴斯德毕赤酵母，通过与his4营养缺陷型(pPIC9K载体)互补或通过zeocin抗性(pPICZαA载体)筛选转化株。通过甲醇诱导的醇氧化酶启动子(PAOX1)调节重组蛋白质表达。已描述了巴斯德毕赤酵母宿主细胞含有人脯氨酰4-羟化酶(P4H)，负责胶原内羟脯氨酸翻译后合成的酶的α和β亚基整合拷贝，(见例如Vuorela，M.等(1997)EMBO J 16：6702-6712)。
酵母菌株在缓冲的极限甘油培养基中生长，用含有甲醇(0.5％)取代甘油作为碳源的相同培养基诱导重组蛋白表达，如Invitrogen毕赤表达手册上所述的。用10-20％ Tricine SDS-PAGE分析条件培养基和摇瓶培养物中提取物的脯氨酰4-羟化酶活性鉴定产明胶的菌株。共同表达脯氨酰4-羟化酶和胶原片段导致具有天然人序列的重组明胶表达。
表达片段并分泌入培养基。从培养基中通过丙酮沉淀、阴离子或阳离子交换层析或其任何组合回收和纯化重组明胶。在4℃，通过经无细胞培养上清液中加入丙酮至最终浓度40％，进行丙酮沉淀。通过离心收集主要含有内源性酵母蛋白的所得的沉淀物。然后在该上清液中加入丙酮至最终浓度80％，导致明胶沉淀，然后通过离心收集，对水透析过夜并冻干。通过阴离子和阳离子混合交换层析获得高纯度的明胶。在室温下进行层析纯化。
用电泳估测胶原蛋白的大小，与基于氨基酸组分的分子量计算比较是本领域已知的(Butkowski等(1982)Methods Enzymol 82：410-423)。重组明胶的N-末端序列分析显示与明胶片段融合的前原序列的正确加工，将蛋白质定向到酵母分泌途径。在该系统中产生的明胶仅含人胶原衍生的序列。另外，重组明胶代表了条件培养基中的主要成分，因为巴斯德毕赤酵母细胞分泌很少的蛋白质。
所表达的重组明胶具有确定的大小，用SDS-PAGE测量范围在约5kDa-65kDa之间，对应于例如约5kDa(泳道2，SEQ ID NO：18)、约10kDa(泳道3，SEQ ID NO：19)、约16kDa(泳道4，SEQ ID NO：24)、约18kDa(泳道5，SEQ ID NO：20)、约20kDa(泳道6，SEQ ID NO：28)(也具有计算分子量17,914Da，未在表I中列出)、约33kDa(泳道7，SEQ ID NO：27)(也具有计算分子量29,625Da，未在表1中列出)、约41kDa(泳道8，SEQ ID NO：25)和约50kDa(泳道9，SEQ ID NO：22)的明胶，如图1所表明(泳道10代表水解的重组人胶原I型，如实施例10所述制备的)。
实施例2：重组人明胶支持细胞结合活性
本发明的重组人明胶片段显示体外细胞结合活性。在下列实验中，用下列来自人I型胶原(如实施例1所述，列于表2，SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：22)的α1链的重组人明胶结构域包裹96-孔Maxisorp板(Nunc)。VITROGEN牛胶原(Cohesion Technologies；Palo Alto CA)和牛血清白蛋白分别作为阳性和阴性对照。各蛋白在0.1M NaHCO3、pH10.0中稀释到0.1mg/ml，包裹板4℃过夜。人包皮成纤维细胞(HFF)或人脐带静脉内皮细胞(HUVEC，来自Clonetics，第5代)接种于包裹的平板，37℃培养60分钟。一式三份进行实验。
然后用试剂WST-1测量细胞结合程度，在ELISA阅读仪中450mM处阅读吸光度。图2A显示重组人明胶支持HFF与Maxisorp板的结合，对于这些细胞，结合直接与包裹各孔的人重组明胶的分子量成正比。特别是，SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21的重组明胶支持HFF比用BSA所见的结合程度更高。图2B显示不同的重组人明胶支持内皮细胞结合。还用通过热水解重组人胶原(如下文实施例9所述)制备的重组人明胶显示细胞结合活性，使用分子量范围在0-30kDa和0-50kDa的重组明胶。
实施例3：蛋白水解稳定性明胶片段的鉴定
发现重组明胶片段在其表达和积聚在重组巴斯德毕赤酵母细胞的培养基中时有蛋白水解修饰。I型胶原α1链的螺旋结合域的几个不同部分的表达导致鉴定出一种具有高超的蛋白水解稳定性的重组明胶。三种不同的明胶片段被克隆入质粒pPICZαA，在巴斯德毕赤酵母细胞中表达重组蛋白时评估了其相对稳定性。
在上文实施例2中叙述了第一种菌株，对应于SEQ ID NO：19。用编码人α1(I)螺旋结构域氨基酸残基179-280(SEQ ID NO：15)和615-715(SEQ ID NO：23)构建了其它菌株。如实施例1所述，用引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7构建了这些重组明胶。用XhoI和XbaI消化PCR产物，克隆并如上所述制备用于电穿孔。培养菌株，诱导蛋白质表达，用SDS-PAGE比较表达的明胶片段。图3显示了经过蛋白水解的SEQ ID NO：15(泳道2)的重组明胶和SEQ IDNO：19(泳道3)的重组明胶，而SEQ ID NO：23(泳道4)的重组明胶仍然是完全完整的。该结果显示能够产生具有高度稳定性的本发明的重组明胶片段。
实施例4：羟化的重组人明胶表达
在酵母中尚未检测到脯氨酰4-羟化酶。工程改造巴斯德毕赤酵母来表达活性脯氨酰4-羟化酶，先前用于产生羟化的胶原(见美国专利号5,593,859)。为了表达羟化的重组人明胶，用编码人α1(I)胶原重组物(SEQ ID NO：19，表2)100个氨基酸的明胶表达盒转化该菌株，该序列是用引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2通过PCR产生的。用XhoI-XbaI消化PCR DNA产物(约330bp)连接入pPICZαA(Invitrogen)的XhoI-XbaI位点，建立质粒pDO7。
从pDO7分离出1048bp Cel II-AgeI片段，它含有含有AOX1启动子区域的3’部分、交配因子α的分泌信号、SEQ ID NO：19的重组明胶、来自pPICZαA的多接头序列、和56个碱基对的AOX1转录终止子。该片段连接入pPIC9K(Invitrogen)的Cel II-AgeI位点，来建立pDO41。用StuI-线性化的质粒pDO41通过电穿孔转化巴斯德毕赤酵母菌株αβ8(his4)，铺在右旋糖苷极限平板上，选择与his4营养缺陷型互补的转化株。长出了约20个his+转化株，并用实施例1所述的甲醇诱导。用SDS-PAGE分析条件培养基鉴定出表达SEQ ID NO：19的菌株(图4)。
从培养基通过丙酮沉淀纯化来自阳性菌株的重组明胶片段，并用如Hare，P.E.(1977)Methods in Enzymology 47：3-18所述的氨基酸分析进一步分析。从这些菌株之一的明胶产品的氨基酸分析显示在分泌的重组明胶中存在羟脯氨酸。在图4，分离物#2中所示，从该菌株分离的明胶测定出羟脯氨酸对脯氨酸得到比值是0.29，表明明胶和脯氨酰4-羟化酶共表达。
从不表达脯氨酰4-羟化酶的巴斯德毕赤酵母中表达和纯化了非羟化的重组明胶。该重组明胶内的脯氨酸残基然后在体外用脯氨酰4-羟化酶活性转化成羟脯氨酸残基。通过PCR，用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4建立明胶表达，导致SEQ IDNO：24的重组明胶的表达。用XhoI-XbaI消化并纯化了525碱基对的PCR产物，连接到XhoI-XbaI消化的pPICZαA。用PmeI使质粒成为线性，电穿孔进入巴斯德毕赤酵母株X-33(Invitrogen)。在含有500微克/毫升zeocin的YPD平板上生长选择转化株。如上所述测试菌株的明胶表达，从阳性分离物的培养基中纯化重组的非羟化明胶。通过压力透析过10kDa分子量截留膜浓缩条件培养基，将样品针对缓冲液A(50mM Tris-HCl pH9.0，50mM NaCl)。透析物质在用缓冲液A平衡的Q-琼脂糖柱上层析。在这些条件下明胶不与柱结合，因此存在于流出组分中。大部分污染的酵母蛋白与柱结合，并用缓冲液B(缓冲液A+0.5M NaCl)洗脱。
对50mM乙酸钠，pH4.5透析流出组分，重组明胶进一步在用相同缓冲液中平衡的SP-琼脂糖上纯化。重组明胶与柱结合，分步用0.2M NaCl洗脱。热变性1mg/ml的纯化的明胶(100℃10分钟)，与纯化的P4H以酶：底物1∶30的比值在下列组分存在下混合：50mM Tris-HCl pH7.8、2mM维生素C、2mMα-酮戊二酸、0.1mM FeSO4、10μM DTT、10mg/ml牛血清白蛋白和100单位催化酶(Sigma Chmical Co.，St.Louis，MO)(见例如Kivirikko，K.I.和Myllyla，R.(1982)Methods in Enzymol.82：245-304；和Vuori，K.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89：7467-7470)。反应在37℃进行16小时。
然后用层析在Q-琼脂糖上如上所述纯化重组明胶。用0.5M NaCl从柱上洗脱结合的蛋白质，并收集(图5，泳道7、8和9)。用SDS-PAGE分析流出和洗脱组分，来显示回收明胶的纯度(图5)。在流过透析组分后进行明胶的氨基酸分析(图5；泳道3-6)。氨基酸分析显示87％明胶被羟化。当明胶在羟脯氨酸摩尔数/脯氨酸摩尔数+羟脯氨酸摩尔数等于0.5时实现了100％的羟化。
实施例5：存在或不存在脯氨酰4-羟化酶下明胶的稳定性
根据上述方法表达了18kDa的重组明胶(SEQ ID NO：20)。用凝胶电泳分析表达的片段。在脯氨酰4-羟化酶存在下表达的重组明胶比在不存在脯氨酰4-羟化酶的条件下表达的明胶的稳定性显著高(见图6)。
在表达脯氨酰4-羟化酶的巴斯德毕赤酵母株中探索了脯氨酰羟化对重组人明胶稳定性的作用，和稳定性的增强。用引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7通过PCR构建编码SEQ ID NO：20(pDO32)的质粒。如上所述纯化、消化和克隆PCR产物。在缺乏脯氨酰羟化酶的宿主细胞中和含有α和β脯氨酰4-羟化酶亚基的宿主细胞中表达相同的α1(I)cDNA。用PmeI打开的pDO32：株X-33(野生型巴斯德毕赤酵母)、两种表达脯氨酰4-羟化酶的株：株P4H-2和株αβ8电穿孔三种巴斯德毕赤酵母株，如美国专利号5,593,859中和Vourela等(1997)EMBO J 16：6702-6712所述。
用针对500微克/毫升zeocin的抗性选择转化株。如上所述生长和诱导了各转化的8个分离物，用SDS-PAGE分析表达的重组人明胶的稳定性(见图6)。在野生型巴斯德毕赤酵母株X-33中，观察到约等摩尔量的完整重组明胶和蛋白水解片段(在凝胶上就在重组明胶下迁移，在图右侧用箭头标出)(图6，株X-33)。在共表达脯氨酰4-羟化酶的两种株中，蛋白水解片段量显著下降，显示脯氨酰4-羟化酶与重组人明胶共同表达通过显著减少明胶的蛋白水解，增强明胶稳定性(图6，株P4H-2和株αβ8)。
实施例6：表达培养基补充物增强重组人明胶表达
先前的报道已经表明补充酪蛋白氨基酸的培养基减少巴斯德毕赤酵母中某些蛋白表达过程中可见的蛋白水解量(Clare，J.J.等(1991)Gene 105：202-215)。在用各种补料丰富表达培养基后测量巴斯德毕赤酵母中表达的该重组明胶的破坏。在该具体研究中，使用实施例5中所述的巴斯德毕赤酵母株αβ8，其表达重组人明胶片段SEQ ID NO：20(实施例5和表2)。在补充了不同浓度(0-20％)各种补充成分，包括酪蛋白氨基酸、酪胨、酵母抽提液、蛋白胨、肽胺、胰蛋白胨、Gelatone、乳清蛋白和大豆胨的培养基中诱导重组明胶。几种配方，包括乳清蛋白水解物、大豆胨、肽胨和肽胺(Difco laboratories，Detroit，MI)提高了重组明胶表达水平(图7，乳清蛋白和大豆胨)。
这些结果表明在重组明胶表达过程中使用特定的培养基补充物可导致生产增加。在一个方面，使用大豆胨作为培养基补充物提供了一种导致重组明胶表达增加的植物衍生的培养基成分(而不是动物衍生的)。这可以提供无动物材料的环境，用于生产可以用于各种应用的重组明胶。
实施例7：重组人明胶的交联
通过将10.8毫克重组人胶原I型溶于5毫升水，然后针对20mM磷酸钠，pH7.2透析，制备重组人胶原的浆液(如美国专利号5,593,859所述获得)。浆液的最终重组人胶原浓度是2毫克/毫升。将10微升或5微升20％1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，Pierce Chemical Co.)溶液加到1毫升上述的人胶原浆液中，进行交联重组人明胶的制备。交联反应在室温下过夜发生。针对水透析除去未反应的EDC。
用6％甘氨酸SDS-PAGE分析分析得到的交联重组人明胶。图8显示重组人明胶(泳道，标记UNL5-4)、交联重组人明胶(泳道6、标记的UNL-5-4)、交联的重组人明胶(泳道5、标记的UNL-5-4，0.1％EDC；泳道4，标记的UNL-5-4，0.2％EDC)、从Sigma Chmical Co.获得的市售的硬胶囊明胶(泳道3)和市售的明胶(A型，来自猪皮，约300Bloom，泳道2)。如图8的SDS-PAGE分析所示，商品胶囊明胶和Sigma明胶含有作为主要成分的α链(分子量约110kDa)，以及分子量稍小或稍大的明胶成分(分子量范围约200-250kDa)。重组人胶原经由α链构成。然而交联后，交联的重组明胶由α链和分子量更高的明胶成片条带构成，与市售明胶市售胶囊明胶相似。这表明显示与市售胶囊明胶具有相似分子量分布的重组人明胶可以通过交联重组人胶原制备。交联的重组明胶可在需要更高的凝胶强度和更高的粘性的应用中使用。
实施例8：市售明胶和可溶性重组人明胶的内毒素水平
用Limulus Ameobocyte裂解液测试，如本领域已知(见例如Friberger，P.等(1987)Prog.Clin.Biol.Res.231：149-169)测定了Kind&Knox(K&K)出售的可溶性明胶和本发明重组明胶(如实施例9所述制备)的内毒素水平。测试了三种不同的明胶浓度。如表3所示，热水解本发明的重组人胶原I型(rhcI)产生的重组人明胶基本上无内毒素。市售材料的内毒素水平是约1-1.5EU/毫克蛋白。如本发明所述制备明胶的方法得到的明胶比市售制品的内毒素水平低得多，大约是2-3个数量级。该低内毒素水平使得本发明的重组明胶特别在某些应用中，例如药物稳定化中具有吸引力。
                            表3
    明胶浓度(mg/ml)     K&K明胶(EU/mg)     重组人明胶(EU/mg)
    3     1.03     ＜0.005
    1.5     1.41     ＜0.005
    0.75     1.29     ＜0.006
实施例9：通过热和酸水解衍生的明胶
开发了水解方法(酸、热和酶)产生分子量分布与目前可得的可溶性动物衍生的明胶相似的可溶性重组人明胶，用于例如疫苗制剂中的稳定剂。对于这些实验，用完整的重组人I型和III型胶原作为起始材料。通过改变水解条件，可能改变最终材料的分子量，产生具有确定分子量的材料。
市售明胶的分子量分布
将这些重组人明胶与市售明胶作了比较。获得Leiner Davis，Great Lake，Kind&Knox和Dynagel产生的4种低分子量明胶用于确定特征。所有检测的明胶在室温下是可溶的。图9和表4中显示了Tricine SDS-PAGE凝胶上明胶的分子量分布。凝胶图样表明市售明胶的分子量分布大约是0-55kDa，除了Dynagel-1样品，它具有0-30kDa的分子量分布。凝胶图样还解释了分子量分布的两种情况。在一个例子中，衍生自Leiner Davis和Great Lake的样品，用SDS-PAGE观察到7条明显的条带。第二个样品中的图样，衍生自Dynagel和Kind&Knox样品，显示在凝胶上连续的物质分布，没有明显的条带分离。Dynagel-1和Dynagel-2的分子量分布很不同，尽管是同一厂商由于同一应用制备的。该结果表明目前可得的明胶中批与批之间的变动可能是十分显著的。
                               表4
    公司     相对迁移率   最大表观分子量(Da)    分子量*分布(Da)
    K&K     0.3410   70,000    0-55,500
    Leiner Davis     0.3410   70,000    0-55,500
    Great Lake     0.3693   60,000    0-47,600
    Sol-U-Por，#1     0.3483   65,000    0-51,600
    Sol-U-Por，#2     0.4972   37,000    0-29,400
*分子量用1.26的系数调整，它是标准蛋白质的平均残基分子量(115)对胶原蛋白的平均残基分子量(91.6)的比。
如下进行明胶的热水解。将市售干明胶溶于40-50℃的水，制备5％明胶溶液。用0.1N NaOH或0.1N HCl在制备热水解中调节溶液的pH。在巴斯德毕赤酵母中表达I型和III型重组人胶原，并如美国专利号5,593,859中所述纯化。最终的重组人胶原溶于10mM HCl，针对水透析并冻干。冻干的重组人胶原溶于40-50℃的水，制备3％溶液。如下在热水解前调节溶液的pH。
在1毫升Reacti-Vials(Pierce)中进行热水解。水解温度在100-150℃变动，视实验而定。水解溶液的pH如表明的从pH2-7变动。水解时间也从1-32小时变动，视溶液的温度和pH而定。在各时间间隔对明胶水解物取样，用SDS-PAGE分析。
120℃市售明胶的水解
将来自Sigma的高分子量样品溶于6种不同的pH溶液中(5％明胶)并在120℃水解。pH2和pH3溶液水解2.5个小时，每半小时取样。pH4溶液水解5个小时，每小时取样。pH5、pH6和pH7溶液水解24小时，水解14小时后每两小时取样。
在Tricine10-20％SDS-凝胶上如图10A、10B、10C、10D、10E和10F所示分析水解情况。凝胶情况显示溶液pH越低，明胶水解发生越快。凝胶图样还揭示在水解物中有两种水解情况。一种图样显示基于凝胶的几种明显分子条带(见pH2和pH3溶液的水解结果，图10A和10B)，虽然其它图样显示凝胶上材料的连续分布(见pH4、pH5、pH6和pH7溶液水解结果，图10C、10D、10E和10F)。
这些结果显示上面描述的方法或其变体产生两种不同类型的材料，如所示明胶的分析所见(SDS-PAGE上物质的清晰条带对连续分布)。这些实验结果还表明各种大小的可溶性明胶产生的高分子量明胶的降解。表5显示用Sigma明胶在pH6.0的溶液中120℃水解后获得的分子量分布。
                              表5
    水解时间(小时)     相对迁移率   最大表观分子量(Da)   分子量分布(Da)
    4     0.2356   140,000   0-111,000
    8     0.2890   90,000   0-71,400
    11.5     0.3375   75,000   0-59,500
    16     0.3837   47,000   0-37,300
    20     0.4186   40,000   0-31,700
    24     0.4525   33,000   0-26,200
市售明胶150℃的水解：
将Sigma的高分子量明胶样品(来自猪皮的A型，250kDa)溶于4种不同的pH溶液(5％明胶)，在150℃水解达10小时。每两小时对水解物取样用于分析。用Tricine 10-20％SDS-PAGE凝胶如图11A、11B、11C和11D所示分析水解图样。凝胶图样表明150℃明胶降解比120℃更快。另外，在150℃进行的明胶水解产生较低分子量的明胶片段。表6显示Sigma明胶在150℃，pH6的溶液中水解后的分子量分布。
                              表6
    水解时间(小时)     相对迁移率   最大表观分子量(Da)   分子量分布(Da)
    2.5     0.2833   95,000   0-75,400
    4.5     0.4555   41,000   0-32,500
    6     0.5277   32,000   0-25,400
    8     0.5833   24,000   0-19,000
    10     0.6611   15,000   0-11,900
实施例10：重组人胶原I和III的酸和热水解
在中性pH条件(pH7)下水解重组人I型胶原达8小时，或在酸性pH条件(pH2)下达3小时。还在中性和酸性条件下120℃水解重组人III型胶原达6小时。如实施例9所述进行水解。用Tricine 10-20％SDS-PAGE凝胶分析人I型和III型重组水解物，如图12A和12B中所示。SDS凝胶水解图样表明重组人胶原的热水解与衍生自天然来源的高分子量明胶的水解情况是相同的(图9，图10A-10F和图11A-11D，到12A和12B)。与天然明胶(pH7)的水解相似，重组人胶原的酸水解显示几条明显的分子量条带，虽然中性水解显示更连续的分子量分布。重组人明胶的中性水解物分子量分布在热降解6-8个小时后是约0-70kDa。酸性条件下水解发生得更快。重组人明胶的酸性水解物的分子量分布更窄，在2-3个小时热处理后是约0-10kDa。
为了进一步精炼所讨论的热水解的重组人明胶，我们证明了酵母多基因重组表达方法对于产生具有明显的人I型α1(I)链分泌片段的可用性。该技术使我们能产生明确的，高度同源的明胶片段，大小范围在6-65kDa之间。这代表可用于特定用途的明胶的大小和生物物理性质。
实施例11：I型重组人胶原的酶水解
用表7所列的蛋白酶酶水解重组人I型胶原。重组人I型胶原与各种酶一起在37℃培养，使用表7中所列出的底物酶比(w/w)。用Tricine 10-20％SDS-PAGE凝胶分析处理过获得的重组I型水解物。SDS-PAGE凝胶图样表明酶水解重组人胶原得到不同的明胶分子量分布。用木瓜蛋白酶酶得到连续的水解条带，如图13和表7所示，而用蛋白酶X水解得到几条明显的分子量条带。如表7所示，该方法产生的重组明胶具有不同的水解图样，作为特定酶水解的结果。这代表了在产生可用于不同应用的明胶的尺寸和生物物理性质中的灵活性。
                                    表7
    酶  酶活性/mg蛋白     底物对酶比     水解图样
    木瓜凝乳蛋白酶  1U@37℃，pH6.5     500∶1     连续
    菠萝蛋白酶  8U@37℃，pH4.6     5,000∶1     分离条带和连续
    蛋白酶VIII  12U@37℃，pH8.5     7,000∶1     分离条带
    木瓜蛋白酶  17U@37℃，pH6.5     10,000∶1     连续
    蛋白酶X  42U@37℃，pH8.5     20,000∶1     分离条带
实施例12：针对不同重组明胶的针对重组人I型胶原的抗体
测试了在巴斯德毕赤酵母中产生人重组I型胶原作为豚鼠的接触致敏剂的可能过敏反应，称为最大化研究。在研究过程后，收集血清调查重组人I型胶原在豚鼠中的免疫原性。将1克rHC I浸入10毫升0.9％氯化钠注射液(SCI)或芝麻油中，37℃保温72小时。提取物然后在3000rpm离心15分钟，收集上清液用于给药。
Hartley豚鼠在诱导期内接触治疗物和对照溶液。该时期涉及在钳住的区域上成对三次皮下注射(ID)。第一对ID注射(头部)由等体积的SCI中弗氏完全佐剂(FCA)的乳液构成。ID注射的第二对(中间)由测试提取物(重组人I型胶原)构成。第三对(尾部)含有测试提取物和等体积的FCA的乳液。以相同方式处理阳性和阴性对照动物，除了测试提取物不包括第二对和第三对注射。
在ID注射后的第6日，评估了测试位点的刺激证据。然后用10％SLS的石油醚溶液预处理，并用玻璃棒按摩使皮肤吸收，敞开放置24小时。在第7日，在各测试动物剃去毛的部位局部施用浸有0.4毫升测试目标提取物的4.25厘米直径的Whatman3号滤纸盘。局部诱导涂用后第13天，攻击动物。钳住各动物右侧的某个部位。翌日，将含有0.3毫升测试提取物、载体对照提取物或阳性对照溶液的HillTop室加到钳住的部位并放在动物上24小时。除去室24、48和72小时后对给药位点的红斑和水肿评分。
72小时后，收集血液并使其凝结，然后在2800rpm离心15分钟。从各试管除去血清，将血清样本储藏在-70℃直到使用。
然后分析免疫接种的豚鼠血清中针对重组人I型胶原(rhcI)、重组人III型胶原(rhcIII)、VITROGEN牛胶原(Cohesion Technologies；Palo Alto，CA)和各种本发明的重组人明胶片段，包括6kDa(SEQ ID NO：18)、10kDa(SEQ ID NO：19)、18kDa(SEQ ID NO：20)、33kDa(SEQ ID NO：27)、50kDa(SEQ ID NO：22)和65kDa(SEQID NO：33)(见表2和实施例1)片段的抗体的存在。重组胶原和重组明胶在8％Tris-甘氨酸或10-20％Tricine SDS-PAGE凝胶上电泳。用研究中使用的各豚鼠的抗血清作蛋白质印迹分析。图14显示重组人I型胶原特异性抗体存在于用重组人I型胶原接种的豚鼠血清中。在任何检测的血清中用蛋白质印迹分析未观察到任何针对重组明胶的抗体反应性。图14显示了该研究中1只豚鼠抗血清的蛋白质印迹分析结果。分析了来自至少4只不同豚鼠的血清，各显示与图14公开的相同的结果。
理想的是阐明了在rhcI注射入豚鼠后观察到的引起抗原性反应的I型胶原的可能表位。重组人胶原I型在变性和柱层析后分离成α1(I)和α2(I)成分。如Bornstein和Piez(1966)Biochemistry 5：3460所述进行重组I型胶原α1(I)和重组I型胶原α2(I)链的由溴化氰(CNBr)切割。如上所述，用SDS-PAGE分离完整的α链和得到的肽片段，并用蛋白质印迹分析其对于豚鼠血清的反应性。图15A显示了重组人I型胶原的完整和经CNBr切割的α1(I)和α2(I)链的考马斯染色的SDS-PAGE。蛋白质印迹分析显示对rhcI反应的豚鼠抗血清针对I型胶原的α2链及其特定的CNBr片段。未检测到针对I型胶原α1链的反应性(图15B)。
上述蛋白质印迹分析利用在SDS-PAGE上电泳检测了豚鼠血清对于重组人I型胶原、CNBr片段和重组人明胶的反应性。为了检测豚鼠抗血清对于这些多肽在非变性条件下的诱导，进行了直接ELISA分析(图16)。数据显示豚鼠抗血清识别rhcI的天然构象。本发明的重组明胶在ELISA中都不和豚鼠抗血清反应，不论明胶片段在热变性之前或之后是否存在。如果热变性在分析前，rhcI在ELISA中甚至更具反应性(数据未显示)。这表明血清中的多克隆抗体主要识别序列表位，而不是螺旋结构。总的说，这些结果表明如这些例子中所示，可用本发明的方法免除与存在于人胶原I型上的抗原性表位，特别是α2链有关的担心。本发明因此提供了产生缺乏抗原表位的重组明胶的方法，它在需要低抗原性明胶的特定应用中是有用的。
本发明所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员是明白的，不违背本发明的范围和精神。虽然本发明已联系特别的优选例进行了描述，应理解所要求的本发明不会不恰当的被这些具体实施例所限。对于本领域和相关领域的技术人员明显的实施本发明的各种模式的各种变化在权利要求的范围内。本文引用的全部文献在此完整引入以供参考。
                                    序列表
                               序列表<110>法布罗根股份有限公司(FIBROGEN，INC.)<120>重组明胶<130>FG0219PCT<140><141><160>33<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>51<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1gtatctctcg agaagagaga ggctgaagct ggtctgcctg gtgccaaggg t   51<210>2<211>34<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>2tagactatta tctctcgcca gcgggaccag cagg                      34<210>3<211>51<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>3gtatctctcg agaagagaga ggctgaggct ggagctcagg gaccccctgg c   51<210>4<211>40<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>4atgctctaga ttattacttg tcaccagggg caccagcagg                40<210>5<211>54<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>5gtatctctcg agaagagaga ggctgaagct ggccccatgg gtccctctgg tcct        54<210>6<211>39<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>6tgctctagat cattaagcat ctcccttggc accatccaa                         39<210>7<211>45<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>7tgctctagac tattaaggcg cgccagcatc acccttagca ccatc                  45<210>8<211>48<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>8tgctctagat cattaaggcg cgccaggttc accgctgtta cccttggg               48<210>9<211>39<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>9tgctctagat cattatctct cgcctcttgc tccagaggg                         39<210>10<211>57<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>10gtgcccgtgg tcaggctggt gtgatgggat tccctggacc taaaggtgct gcttaat     57<210>11<211>64<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>11ctagattaag cagcaccttt aggtccaggg aatcccatca caccagcctg accacgggca  60ccag                                                               64<210>12<211>40<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>12atgctctaga ttattaagga gaaccgtctc gtccagggga                  40<210>13<211>37<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>13ctagtctaga ttatcttgct ccagaggggc caggggc                     37<210>14<211>37<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>14ctagtctaga ttagcgagca cctttggctc caggagc                     37<210>15<211>102<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>15Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly1                5                  10                  15Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Glu
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        100<210>16<211>261<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>16Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly1                5                  10                  15Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Glu
         20                  25                  30Pro Gly Ala Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro
     35                  40                  45Gly Lys Asn Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly
 50                  55                  60Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Thr65                  70                  75                  80Ala Gly Leu Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Asp
             85                  90                  95Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly
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130                 135                 140Gly Asn Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly145                 150                 155                 160Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys Gly Glu
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210                 215                 220Pro Gly Ile Ala Gly Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Pro Ser225                 230                 235                 240Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly
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         20                  25                  30Pro Gly Ala Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro
     35                  40                  45Gly Lys Asn Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly
 50                  55                  60Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Thr65                  70                  75                  80Ala Gly Leu Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Asp
             85                  90                  95Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly
        100                 105                 110Ser Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg Gly Leu
    115                 120                 125Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg
130                 135                 140Gly Asn Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly145                 150                 155                 160Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys Gly Glu
            165                 170                 175Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly Val Arg
        180                 185                 190Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly
    195                 200                 205Asn Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ala
210                 215                 220Pro Gly Ile Ala Gly Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Pro Ser225                 230                 235                 240Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly
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    355                 360                 365Pro Gly Pro Asp Gly Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp
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450                 455                 460Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro465                 470                 475                 480Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly
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         20                  25                  30Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala Gly
     35                  40                  45Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys
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     35                  40                  45Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys
 50                  55                  60Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala65                  70                  75                  80Gly Lys Asp Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
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130                 135                 140Ala Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro145                 150                 155                 160Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp
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         20                  25                  30Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala Gly
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        100                 105                 110Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro
    115                 120                 125Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly
130                 135                 140Ala Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro145                 150                 155                 160Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp
            165                 170                 175Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly
        180                 185                 190Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu
    195                 200                 205Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp
210                 215                 220Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly225                 230                 235                 240Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Asp Lys
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         20                  25                  30Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala Gly
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             85                  90                  95Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Phe
        100                 105                 110Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro
    115                 120                 125Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly
130                 135                 140Ala Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro145                 150                 155                 160Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp
            165                 170                 175Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly
        180                 185                 190Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu
    195                 200                 205Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp
210                 215                 220Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly225                 230                 235                 240Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Pro
            245                 250                 255Ser Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Asp Arg
        260                 265                 270Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly
    275                 280                 285Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly Ala
290                 295                 300Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro305                 310                 315                 320Gly Pro Ile Gly Asn Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala Arg Gly
            325                 330                 335Ser Ala Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg
        340                 345                 350Val Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro
    355                 360                 365Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu Thr Gly
370                 375                 380Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro385                 390                 395                 400Ala Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro
            405                 410                 415Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly
        420                 425                 430Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro
    435                 440                 445Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Arg
450                 455                 460Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly465                 470                 475                 480Glu Ser Gly Arg Glu Gly Ala Pro Ala Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg
            485                 490                 495Asp Gly Ser Pro
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         20                  25                  30Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly
     35                  40                  45Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Arg Gly Glu
 50                  55                  60Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala65                  70                  75                  80Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp Gly Ala Lys Gly
             85                  90                  95Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu
        100                 105                 110Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys
    115                 120                 125Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly
130                 135                 140Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro145                 150                 155                  160Ala Gly Ala Pro Gly Asp Lys
            165<210>25<211>416<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>25Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu1               5                  10                  15Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro
         20                  25                  30Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly
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 50                  55                  60Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala65                  70                  75                  80Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp Gly Ala Lys Gly
             85                  90                  95Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu
        100                 105                 110Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys
    115                 120                 125Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly
130                 135                 140Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro145                 150                 155                 160Ala Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Pro Ser Gly Pro Ala
            165                 170                 175Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Asp Arg Gly Glu Pro Gly
        180                 185                 190Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Gln
    195                 200                 205Pro Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly Ala Lys Gly Asp Ala
210                 215                 220Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ile Gly225                 230                 235                 240Asn Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala Arg Gly Ser Ala Gly Pro
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370                 375                 380Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Arg385                 390                 395                 400Glu Gly Ala Pro Ala Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro
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        100                 105                 110Ala Arg Gly Ala Pro Gly Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro
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    115                 120                 125Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly
130                 135                 140Ala Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro145                 150                 155                 160Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp
            165                 170                 175Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly
        180                 185                 190Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu
    195                 200                 205Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp
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        260                 265                 270Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly
    275                 280                 285Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly Ala
290                 295                 300Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro305                 310                 315                 320Gly Pro Ile Gly Asn Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala Arg Gly
            325                 330                 335Ser Ala Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg
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370                 375                 380Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro385                 390                 395                 400Ala Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro
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450                 455                 460Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly465                 470                 475                 480Glu Ser Gly Arg Glu Gly Ala Pro Ala Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg
            485                 490                 495Asp Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala
        500                 505                 510Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly
    515                 520                 525Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro
530                 535                 540Ala Gly Pro Val Gly Pro Val Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro Gln545                 550                555                  560Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp Arg Gly
            565                 570                 575Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro
        580                 585                 590Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Pro Ala
    595                 600                 605Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly
610                 615                 620Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg625                 630                 635                 640Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro
            645                 650                 655Gly Pro Pro Gly Pro Pro
        660

Claims (74)

1.一种含有重组明胶的组合物。
2.一种重组明胶，其特征在于，该重组明胶具有选自约5kDa、约8kDa、约9kDa、kDa、约14kDa、约16kDa、约22kDa、约23kDa、约36kDa、约44kDa和约65kDa的分子量。
3.一种重组明胶，其特征在于，该重组明胶具有选自约0-50kDa、约10-30kDa、约30-50kDa、约10-70kDa、约50-70kDa、约50-100kDa、约100-150kDa、约150-200kDa、约200-250kDa、约250-300kDa和约300-350kDa的分子量范围。
4.一种分子量大于300kDa的重组明胶。
5.一种重组明胶，其特征在于，该重组明胶具有选自50、100、150、200、250和300的Bloom强度。
6.一种Bloom强度在0-100之间的重组明胶。
7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，该重组明胶部分羟化。
8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，该重组明胶具有选自20-80％、30-80％、40-80％、60-80％、20-60％、30-60％、40-60％、20-30％、20-40％和30-40％的羟化百分数。
9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述重组明胶未羟化。
10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述重组明胶水解。
11.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述重组明胶水解。
12.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述重组明胶是重组明胶多肽的均一混合物。
13.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述重组明胶是重组明胶多肽的不均一混合物。
14.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述重组明胶衍生自不含其它胶原的一类胶原。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述一类胶原选自I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型、IX型、X型、XI型、XII型、XIII型、XIV型、XV型、XVI型、XVII型、XVIII型、XIX型和XX型胶原。
16.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述重组明胶具有低于1.000EU/毫克的内毒素水平。
17.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述重组明胶具有低于0.500EU/毫克的内毒素水平。
18.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述重组明胶具有低于0.050EU/毫克的内毒素水平。
19.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述重组明胶具有低于0.005EU/毫克的内毒素水平。
20.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述重组明胶是重组人明胶。
21.一种重组明胶，其特征在于，该重组明胶含有选自SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、31和33的氨基酸序列。
22.一种分离和纯化的多聚核苷酸，其特征在于，该多聚核苷酸编码选自SEQID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、31和33的氨基酸序列。
23.一种含有权利要求22所述的多聚核苷酸的表达载体。
24.一种含有权利要求22所述的多聚核苷酸的宿主细胞。
25.如权利要求24所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是原核细胞。
26.如权利要求24所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是真核细胞。
27.如权利要求24所述的真核宿主细胞，其特征在于，真核宿主细胞选自酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。
28.一种含有权利要求22所述的多聚核苷酸的转基因动物。
29.一种含有权利要求22所述的多聚核苷酸的转基因植物。
30.一种重组明胶，其特征在于，该重组明胶含有选自SEQ ID NO：26、27、28和29的氨基酸序列。
31.一种产生重组明胶的方法，其特征在于，该方法包括：
(a)提供了重组胶原或原胶原，或其片段或变体；和
(b)加工重组胶原或原胶原，或其片段或变体，产生重组明胶。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，重组胶原是重组人胶原。
33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，重组胶原或原胶原是通过共表达至少一种编码胶原或原胶原的多聚核苷酸和至少一种编码胶原翻译后加工酶或其亚基的多聚核苷酸产生的。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述翻译后加工酶是脯氨酰羟化酶。
35.一种产生重组明胶的方法，其特征在于，该方法包括直接从改变的胶原构建物产生重组胶原。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述重组明胶是通过共表达经改变了的胶原构建物和至少一条编码翻译后加工酶或其亚基的多聚核苷酸产生的。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述翻译后加工酶是脯氨酰羟化酶。
38.一种产生具有所选融化温度的重组明胶的方法，其特征在于，该方法包括对重组明胶进行对应于所选融化温度的一定百分数的羟化。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，进行步骤包括在脯氨酰羟化酶的存在下，从改变的胶原构建物中产生重组明胶。
40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，进行步骤包括从羟化的重组胶原中衍生出重组明胶。
41.如权利要求38所述的方法，其特征在于，进行步骤包括羟化未羟化的重组明胶。
42.一种含有重组明胶的粘合剂。
43.一种含有重组明胶的胶囊。
44.一种含有重组明胶的稳定剂。
45.一种含有重组明胶的成膜剂。
46.一种含有重组明胶的湿润剂。
47.一种含有重组明胶的乳化剂。
48.一种含有重组明胶的增稠剂。
49.一种含有重组明胶的胶凝剂。
50.一种含有重组明胶的胶态剂。
51.一种含有重组明胶的粘合剂。
52.一种含有重组明胶的药物组合物。
53.如权利要求52所述的药物组合物，其特征在于，所述重组明胶是重组人明胶。
54.一种含有重组明胶的硬凝胶胶囊。
55.一种含有重组明胶的软凝胶胶囊。
56.一种含有重组明胶的血浆容量扩张剂。
57.一种含有重组明胶的胶体体积置换物质。
58.一种含有重组明胶的移植物涂层。
59.一种含有重组明胶的医用海绵。
60.一种含有重组明胶的医用栓。
61.一种含有重组明胶的药物稳定剂。
62.一种含有重组明胶的微载体。
63.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有：
(a)含有重组明胶的组合物；和
(b)用于将组合物传递给个体的装置。
64.一种含有重组明胶的可食用组合物。
65.一种含有重组明胶的蛋白质补充剂。
66.一种含有重组明胶的脂肪替代品。
67.一种含有重组明胶的营养补充剂。
68.一种含有重组明胶的可食涂层。
69.一种含有部分羟化的重组明胶的照相组合物。
70.一种含有完全羟化的重组明胶的照相组合物。
71.一种含有重组明胶的化妆品组合物。
72.一种含有重组明胶的工业组合物。
73.一种含有重组明胶的细胞培养组合物。
74.一种含有重组明胶的实验室用组合物。
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