CN103459418A - 细胞粘附性蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供具有高细胞粘附性的蛋白，其用作细胞粘附支持物。本发明提供了包含甲硫氨酸的细胞粘附性蛋白，其中至少部分的甲硫氨酸残基被氧化。
Description
技术领域
本发明涉及其中至少部分甲硫氨酸残基被氧化的具有高细胞粘附性的蛋白，以及使用其的细胞粘附支持物。
背景技术
近年来，关于使用干细胞的细胞移植已经进行了大量临床研究。已经发展出了采用骨髓单核细胞或血管内皮祖细胞的治疗方法，如外周血管再生。然而，很明显的是，细胞移植之后，植入组织的移植细胞的存活率极低，这是需要考虑的问题。因此，通过将细胞粘附至其上的基质材料例如胞外基质与要移植的细胞混合、然后移植因此所得的混合物来试图提高移植细胞的存活率或移植率。例如，对将间充质细胞与基质材料一起移植以治疗软骨已经进行了研究。然而，大部分研究都是处于动物实验水平。至今仍然没有能提供革命性结果的报道。
同时，已知氨基酸半胱氨酸是代表性的蛋白质氧化保护基团。半胱氨酸具有游离的高反应性SH基团，该SH基团可作为自由基等的清除剂或储藏池发挥作用。除了这个半胱氨酸，甲硫氨酸也被认为是氧化应激的必需氨基酸。已经有关于蛋白质中甲硫氨酸氧化的报道，证明甲硫氨酸作为抗氧化氨基酸发挥作用（非专利文献1）。
包含氧化的甲硫氨酸的肽或蛋白质描述于例如专利文献1至3中。专利文献1描述了具有特定共有序列的合成环形肽，其中甲硫氨酸残基被氧化的甲硫氨酸残基取代。专利文献2描述了包含胸腺素β4的药物产品，其中从N末端起是第6个氨基酸的甲硫氨酸残基被氧化成甲硫氨酸亚砜。专利文献3描述了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中大约2.5%或更少的细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)-Ig分子被氧化。然而，上面提到的肽或蛋白质都不具备细胞粘附性。
众所周知明胶是整个再生医学领域中所使用的代表性支架材料。已知明胶是高度生物相容和高度安全的材料，因此其常常应用于医学应用中。而且，已知胶原也是经过证实的材料。然而，胶原的可溶性比明胶低，并且受到其溶液浓度和pH的高度限制（即不能使用胶原制备百分之几十高浓度的中性胶原溶液等）。因此，从胶原可加工、生产或成型的产品往往是有限的。因此，需要开发具有改良的细胞粘附性的包含明胶的支架基质材料。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：JP专利公开号(Kohyo)2010-503613A
专利文献2：JP专利公开号(Kohyo)2002-509893A
专利文献3：JP专利公开号(Kohyo)2009-520503A
非专利文献
非专利文献1：Finch et.al.:Arch.Biochem.Biophys.305,1993,595-599
发明概述
本发明所要解决的目的
本发明的目的是解决现有技术中的上述问题。具体地，本发明的目的是提供具有高细胞粘附性的可用作细胞粘附支持物的蛋白。本发明的特别目的是提供细胞粘附性蛋白，它的细胞粘附性是由细胞粘附性序列之外的其他因素所改良的，以及提供包含所述蛋白的细胞粘附支持物。
解决该目的的手段
经过大量针对实现上述目的而进行的实验，本发明人发现其中甲硫氨酸被氧化的具有衍生自部分胶原氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶的细胞粘附率要高于其中甲硫氨酸氧化程度低的明胶的细胞粘附率。本发明基于这些发现来完成。
因此，本发明提供了包含甲硫氨酸的细胞粘附性蛋白，其中至少部分甲硫氨酸残基被氧化。
优选地，所述蛋白中7%或更多的甲硫氨酸残基被氧化。
优选地，至少部分甲硫氨酸残基被氧化剂所氧化。
优选地，通过氧化甲硫氨酸残基来改良细胞粘附性。
优选地，所述细胞粘附性蛋白是明胶样蛋白。
优选地，所述明胶样蛋白是明胶，胶原，纤连蛋白，pronectin，玻连蛋白，或其组合。
优选地，所述明胶样蛋白是具有衍生自部分胶原氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。
优选地，所述重组明胶具有由Gly-X-Y（其中X和Y各自独立代表任意氨基酸）所示的胶原特征性序列的重复（其中多条Gly-X-Y序列相互之间可以是相同的或不同的），并且其分子量为2KDa或以上且100KDa或以下。
优选地，所述重组明胶具有由Gly-X-Y（其中X和Y各自独立代表任意氨基酸）所示的胶原特征性序列的重复（其中多条Gly-X-Y序列相互之间可以是相同的或不同的），并且其分子量为10KDa或以上且90KDa或以下。
优选地，所述重组明胶具有由Gly-X-Y（其中X和Y各自独立代表任意氨基酸）所示的胶原特征性序列的重复（其中多条Gly-X-Y序列相互之间可以是相同的或不同的），并且在单个分子中包含两条或更多条细胞粘附信号序列。
优选地，所述细胞粘附信号是由Arg-Gly-Asp所示的氨基酸序列。
优选地，所述重组明胶的氨基酸序列不包含任何的丝氨酸和苏氨酸。
优选地，所述重组明胶的氨基酸序列不包含任何的丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸。
优选地，所述重组明胶的氨基酸序列不包含由Asp-Arg-Gly-Asp所示的氨基酸序列。
优选地，所述重组明胶由下式表示：
A-[(Gly-X-Y)n]m-B
其中，A代表任意给定氨基酸或氨基酸序列，B代表任意给定氨基酸或氨基酸序列，n个X每个都独立地代表任意氨基酸，n个Y每个都独立地代表任意氨基酸，n代表3至100的整数，m代表2至10的整数，n个Gly-X-Y相互之间可以是相同的或不同的。
优选地，所述重组明胶由下式表示：
Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly
其中63个X每个都独立地代表任意氨基酸，63个Y每个都独立地代表任意氨基酸，n个Gly-X-Y相互之间可以是相同的或不同的。
优选地，所述重组明胶具有（1）SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或（2）与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有80%或更高同源性并且具有细胞粘附性的氨基酸序列。
优选地，所述重组明胶是交联的。
优选地，使用醛、缩合剂、热交联、光交联或酶进行交联。
本发明还提供了包含如上所述的本发明的细胞粘附性蛋白的细胞粘附支持物。
本发明还提供了生产如上所述的本发明的细胞粘附性蛋白的方法，包括用氧化剂处理包含甲硫氨酸的细胞粘附性蛋白。
发明效果
与甲硫氨酸未被氧化的细胞粘附性蛋白相比，本发明的其中至少部分甲硫氨酸残基被氧化的细胞粘附性蛋白具有改良的细胞粘附率。包含本发明细胞粘附性蛋白的细胞粘附支持物具有高细胞粘附性。因此，通过允许这种细胞粘附性支持物来保留细胞、然后将所述细胞粘附支持物施用给活体内可以稳定地将细胞供应给活体。
附图简述
图1示出制备后立即测量重组明胶以及氧化的重组明胶的细胞粘附性获得的结果。
用于实施发明的具体实施方式
在下文中将详细描述本发明的具体实施方式。
本发明的细胞粘附性蛋白是包含甲硫氨酸的细胞粘附性蛋白，其特征在于至少部分甲硫氨酸残基被氧化。
甲硫氨酸残基的氧化程度并没有特别限定，只需达到本发明改良细胞粘附性的作用即可。氧化程度优选是7%或更多、更优选10%或更多、进一步优选15%或更多、仍进一步优选20%或更多、仍进一步优选30%或更多、仍进一步优选40%或更多、及特别优选50%或更多的甲硫氨酸残基。
考虑到氧化过程所需的时间和工作量与细胞粘附性改良之间的平衡，甲硫氨酸残基的氧化程度优选是7%至50%、更优选7%至30%、进一步优选7%至15%、及特别优选7%至10%的甲硫氨酸残基。
氧化甲硫氨酸残基的处理方法并没有特别限定。例如，可以使用合适的氧化剂氧化甲硫氨酸残基。本文使用的氧化剂的实例包括过氧化氢溶液、溴酸钠、溴酸钾、次氯酸钠、高锰酸钾和臭氧。其中优选过氧化氢溶液。
本发明的细胞粘附性蛋白的类型并没有特别限定，只要其包含甲硫氨酸残基并具有细胞粘附性即可。具有细胞粘附性的蛋白的具体实例包括具有细胞粘附序列（由氨基酸的单字母代码来表示的序列，例如序列RGD、序列LDV、序列REDV、序列YIGSR、序列PDSGR、序列RYVVLPR、序列LGTIPG、序列RNIAEIIKDI、序列IKVAV、序列LRE、序列DGEA以及序列HAV）的肽。具有细胞粘附性的蛋白的其他具体实例包括明胶样蛋白（例如明胶、胶原、纤连蛋白、pronectin或玻连蛋白）以及层粘连蛋白。这些蛋白可以是重组蛋白或天然蛋白。重组蛋白的具体实例包括重组明胶、重组纤连蛋白、重组pronectin、重组玻连蛋白和重组层粘连蛋白。在上述蛋白中，最优选重组明胶。
下文对重组明胶进行解释。
本发明所用的重组明胶具有由Gly-X-Y（其中X和Y每个独立地表示任意氨基酸）所示的胶原特征性序列的重复（其中多条Gly-X-Y序列相互之间可以是相同的或不同的）。优选地，其在单个分子中包含两条或更多条细胞粘附信号序列。作为本发明所用的重组明胶，可以使用具有衍生自部分胶原氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。可以使用的重组明胶的实例包括但不限于EP1014176A2、US6992172、WO2004-85473和WO2008/103041中所述的重组明胶。下文描述了优选作为本发明所用重组明胶的重组明胶。
本发明中所用的重组明胶具有天然发生明胶的原始特性，因此其是高度生物相容的。此外，所述重组明胶并不是直接从天然来源获得的，因此没有引起BSE等的风险。在这方面，其具有非感染性的优异特性。此外，本发明所用的重组明胶比天然发生的明胶更均质。另外，所述重组明胶具有预定序列。因此，通过交联或如下所述方法，根据强度和降解性来毫无误差地精确设计所述重组明胶是可能的。
本发明中所用的重组明胶的分子量优选是2KDa至100KDa、更优选2.5KDa至95KDa、进一步优选5KDa至90KDa、最优选10KDa至90KDa。
优选地，所述重组明胶含有由Gly-X-Y所示的胶原特征性序列的重复。在此，每条都由Gly-X-Y所示的多条序列可以是相同或不同的。Gly在Gly-X-Y中代表甘氨酸。X和Y在Gly-X-Y中代表任意氨基酸（优选代表除甘氨酸之外的任意氨基酸）。当根据氨基酸组成或序列将明胶/胶原与其他蛋白进行比较时，GXY序列对于胶原是特征性的并形成高度特异性部分结构。甘氨酸约占所述整个部分结构的三分之一。在氨基酸序列中重复发现甘氨酸的频率为每3个氨基酸中1个。甘氨酸是最简单的氨基酸。甘氨酸分子链的排列并没有什么限制，因此当明胶化时，甘氨酸为螺旋结构的再生做出了巨大贡献。优选地，由X或Y所示的氨基酸富含亚氨基酸（脯氨酸或羟脯氨酸），亚氨基酸占整个氨基酸序列的10%至45%。形成GXY重复结构的氨基酸占整个氨基酸序列的优选为80%或以上、更优选95%或以上、最优选99%或以上。
一般可用的明胶包含的荷电极性氨基酸和非荷电极性氨基酸的比例为1:1。在此，术语“极性氨基酸”具体是指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或精氨酸。特别地，术语“非荷电极性氨基酸”是指半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸。极性氨基酸相对于组成本发明所用重组凝胶的所有氨基酸的百分比是10%至40%，优选20%至30%。此外，非荷电极性氨基酸相对于极性氨基酸的百分比优选为5%至少于20%，更优选少于10%。优选地，所述氨基酸序列不含有选自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸中的一中氨基酸、优选两种氨基酸或更多种。
通常，已知多肽含有作为细胞粘附信号序列发挥功能的最小氨基酸序列（例如，"Pathophysiology"(Byotai Seiri)Vol.9,No.7(1990),p.527,NagaiShoten Co.,Ltd.）。优选本发明中所用的重组明胶的单个分子具有至少两条细胞粘附信号序列。鉴于粘附细胞类型增加，此类序列的实例是：优选RGD序列,LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列和HAV序列（由单字母标记所示的氨基酸），更优选RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列和HAV序列；特别优选RGD序列。在RGD序列中，优选ERGD序列。
就RGD序列在本发明所用的重组明胶中的排列而言，存在于两个RGD序列之间的氨基酸数目优选为0至100，更优选25至60。优选地，所述氨基酸的数目并不是统一确定的。
基于细胞粘附/生长，这种最小氨基酸序列在单个蛋白质分子中的数目优选为3至50，更优选4至30，特别优选5至20，最优选为12。
RGD基序与本发明所用重组明胶中氨基酸总数的百分比优选为至少0.4%。如果所述重组明胶包含350个氨基酸或更多，则350个氨基酸的每一段都优选含有至少一个RGD基序。RGD基序与所述氨基酸总数的百分比更优选为至少0.6%，进一步优选为至少0.8%，仍然进一步优选为至少1.0%，甚至进一步优选为至少1.2%，最优选为至少1.5%。RGD基序在重组明胶中的数量优选为每250个氨基酸至少4个、更优选6个、进一步优选8个、甚至进一步优选12至16个。RGD基序的百分比为0.4%对应每250个氨基酸至少1个RGD序列。RGD基序的数量用整数来表示。因此，为了使RGD基序的百分比达到0.4%，需要包含251个氨基酸的明胶含有至少两个RGD序列。优选地，本发明的重组明胶每250个氨基酸含有至少2个RGD序列、更优选每250个氨基酸含有至少3个RGD序列、进一步优选每250个氨基酸含有至少4个RGD序列。在另一个的实施方案中，本发明的重组明胶包含至少4个、优选6个、更优选8个、进一步优选12至16个RGD基序。
此外，所述重组明胶可以被部分水解。
优选地，本发明所用的重组明胶具有包含A-[(Gly-X-Y)n]m-B重复的结构。在此，“m”是优选2至10、更优选3至5的整数。此外，“n”是优选3至10、更优选15至70、最优选50至65的整数。
优选地，多个天然发生的胶原序列单元结合形成重复单元。本文所用术语“天然发生的胶原”可以指任何天然发生的胶原。然而，其优选实例包括I型、II型、III型、IV型和V型胶原。更优选地，使用I型、II型和III型胶原。在另一个的实施方案中，这种胶原的来源优选是人类、牛、猪、小鼠或大鼠，更优选来源于人类。
本发明所用的重组明胶的等电点优选是5至10、更优选6至10、进一步优选7至9.5。
优选地，所述重组明胶没有去氨基化。
优选地，所述重组明胶不包含端肽。
优选地，所述重组明胶是由编码天然发生胶原的核酸制备的基本上纯的胶原材料。
特别优选地，本发明所用的重组明胶是具有下列（1）或（2）的重组明胶：
（1）SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或
（2）与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80%或更高同源性（更优选90%或更高、最优选95%或更高）并具有细胞粘附性的氨基酸序列。
本发明所用的重组明胶可通过本领域技术人员已知的基因重组技术生产。例如，可根据EP1014176A2、US6992172、WO2004/85473或WO2008/103041中描述的方法生产。特别地，可通过以下来生产转化子：获得编码预先确定的重组明胶的氨基酸序列的基因，将该基因整合到表达载体中以制备重组表达载体，将该载体引入到合适的宿主中。在合适的培养基中培养所获得的转化子以产生重组明胶。因此，通过从培养产物中收集所产生的重组明胶可以制备本发明所用的重组明胶。
本发明所用的重组明胶可以是交联的或可以不是交联的，优选是交联的。本领域中任何已知方法如热交联、化学交联、使用醛（例如甲醛和戊二醛）的交联、使用缩合剂（碳二亚胺、氰胺等）的交联、酶交联、光交联、UV交联、疏水相互作用、氢键或离子相互作用可以用作交联方法。最优选使用戊二醛的交联方法。
光交联的实例包括那些基于含有光反应基团引入其中的聚合物光照射或在存在光敏剂下的光照射的方法。光反应基团的实例包括肉桂基、香豆素基团、二硫代氨甲酰基、呫吨染料和莰醌。
在使用酶进行交联的情况下，对酶没有特别限定，只要它在重组明胶之间具有交联作用即可。可优选使用转谷氨酰胺酶和漆酶、最优选转谷氨酰胺酶进行所述交联。用转谷氨酰胺酶进行酶交联的蛋白质的特别实例没有特别限定，只要其是具有赖氨酸残基和谷氨酰胺残基的蛋白质即可。转谷氨酰胺酶可以来源于哺乳动物或可以来源于微生物。其特别实例包括由Ajinomoto Co.,Inc.制造的ACTIVA系列，作为试剂出售的哺乳动物来源的转谷氨酰胺酶例如由Oriental Yeast Co.,ltd.,Upstate USA Inc.或BiodesignInternational制造的豚鼠肝脏来源的转谷氨酰胺酶、山羊来源的转谷氨酰胺酶以及兔来源的转谷氨酰胺酶以及人类来源的凝血因子（因子XIIIa，Haematologic Technologies,Inc.）。
重组明胶的交联包含两个步骤：将重组明胶溶液与交联剂混合的步骤，以及使所得到的均质溶液进行反应的步骤。
在本发明中，用交联剂处理重组明胶的混合温度并没有特别限定，只要所述溶液能够均匀混合即可。温度优选0℃至40℃、进一步优选0℃至30℃、进一步优选3℃至25℃、进一步优选3℃至15℃、进一步优选3℃至10℃、特别优选3℃至7℃。
在重组明胶与交联剂混合之后，可以升高温度。反应温度并没有特别限定，只要交联能够进行即可。考虑到重组明胶的变性或降解，温度基本上为0℃至60℃、更优选0℃至40℃、进一步优选3℃至25℃、进一步优选3℃至15℃、进一步优选3℃至10℃、特别优选3℃至7℃。
由于上述本发明的细胞粘附性蛋白具有高细胞粘附性，其可以用作细胞粘附支持物。本发明的细胞粘附支持物在再生医学中可以用作支架基质材料或治疗剂。本发明的细胞粘附支持物可以单独用作再生医学中的治疗剂。疾病类型并没有限制，只要是由于该疾病使得组织或器官需要再生或新生即可。
本发明的细胞粘附支持物可用作将细胞移植到活体中的支架以用于再生医学的目的。也就是说，本发明的细胞粘附支持物可以用作再生医学材料。当本发明的细胞粘附支持物用作再生医学材料时，细胞可以散布在本发明的细胞粘附支持物上，其中含有所述细胞的细胞粘附基材可被移植到活体中。即，含有待移植细胞的本发明的细胞粘附支持物可以用作再生医学材料。然而，本发明的细胞粘附支持物的预期用途不局限于再生医学，它也可用于培养不以移植为目的的细胞。
可根据目的来适当地选择被本发明的细胞粘附支持物保持的细胞。对细胞的类型没有特别限定。优选地，可以使用动物细胞，特别地可以使用人类来源的细胞。动物细胞的类型（特别地，人类来源的细胞）可以是多能细胞、体干细胞、祖细胞和成熟细胞的任意类型。可用于本文的多能细胞的实例包括ES细胞、GS细胞和iPS细胞。可用于本文的体干细胞的实例包括间充质干细胞（MSC）、造血干细胞和神经干细胞。可用于本文的祖细胞和成熟细胞的实例包括来源于皮肤、真皮、表皮、肌肉、心肌、神经、骨、软骨、内皮、脑、上皮、心脏、肾、肝、胰腺、脾、口腔、角膜或毛发的细胞。可用于本文的人类来源的细胞的实例包括ES细胞、iPS细胞、MSC、软骨细胞、成骨细胞、骨祖细胞、间充质细胞、成肌细胞、心肌细胞、神经细胞、肝细胞、β-细胞、成纤维细胞、角膜内皮细胞、血管内皮细胞、角膜上皮细胞和造血干细胞。对于治疗目的，可以使用宿主来源的细胞或获自外界的移植细胞。此外，细胞的来源可以是自体细胞或异体移植细胞。
当需要将细胞种植至本发明的细胞粘附支持物上时，可以根据常规方法种植细胞。可以以细胞悬浮液的形式将细胞种植到放置在合适容器中的本发明的细胞粘附支持物上。
下文将在随后的实施例中对本发明进行更具体地描述。然而，这些实施例不是试图限制本发明的范围。
实施例
实施例1：重组明胶
作为重组明胶，制备如下的CBE3（描述于WO2008-103041中）
CBE3
分子量：51.6kD
结构：Gly-Ala-Pro[(Gly-X-Y)63]3Gly
氨基酸数目：571
RGD序列数目：12
亚氨基酸含量：33%
基本上100%的氨基酸都形成了Gly-X-Y重复结构。
CBE3的氨基酸序列不含有任何的丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸。
CBE3具有ERGD序列。
等电点：9.34
氨基酸序列（序列表中的SEQ ID NO：1）（该氨基酸序列对应于WO2008/103041中SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。注意末端的“X”被修饰成了“P”）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
在下述实施例中，上述CBE3用作重组明胶。
（1）氧化重组明胶的生产
为生产氧化的重组明胶，用过氧化氢溶液处理上述CBE3两小时。之后，为确认在因此产生的样品中包含的甲硫氨酸的氧化，进行氨基酸组成分析。作为对比对照，使用还没有放置过任何一段时间的CBE3（新鲜的重组明胶）。该检测的实施外包给Toray Research Center。具体地，用6M盐酸水解重组明胶，根据茚三酮法使用氨基酸分析仪（L-8500，Hitachi，Ltd.）对所得产物进行定量。包含在氧化的重组明胶以及新鲜重组明胶每种中的甲硫氨酸氧化率如下表1所示。
[表1]
表1：重组明胶的氧化率
| 样品 | 每分子重组明胶的甲硫氨酸氧化率 |
| 氧化的重组明胶 | 7% |
| 新鲜的重组明胶 | 6% |
（2）细胞粘附测试
用重组明胶包被
首先，将氧化的重组明胶和新鲜的重组明胶分别溶解于PBS（Invitrogen）中，制备含有0.005μg/ml重组明胶的溶液。将64μl制备的溶液加入到96孔板中（BD Falcon），在37℃下孵育2小时。之后，用PBS洗涤所得物两次。假设全部量的包被的重组明胶都吸附到板上，氧化的重组明胶中氧化的甲硫氨酸残基的数目要比新鲜的重组明胶中的数目多出约1×109个残基。
细胞种植
Vero细胞培养于含有10%FBS（Invitrigen）的MEM培养基（Invitrigen）中。一旦细胞变成亚融合，就使用0.25%胰蛋白酶-EDTA（Invitrigen）将它们移出，再向其中加入培养基，随后离心。将所得细胞用无血清培养基洗涤一次。之后，制备成细胞悬浮液，将其细胞密度调整至1×105细胞/ml。然后，各取出100μl细胞种植到预先制备的96孔板中。
细胞粘附性的评估
在孵箱中，将细胞静止放置于37℃下1小时。随后，移除培养基，用已经加热至37℃的PBS洗涤细胞两次。所得物被用于评估细胞粘附性。
使用Quant-iTTM PicoGreen Kit(Invitrogen)评估粘附细胞的数量。主要是根据该试剂盒制造商推荐的实验方法进行评估。下文将会描述该实验方法。
将100μl 0.2%的Triton-X溶液加入到已经种植所述细胞的每孔中。然后，通过冻/融作用将细胞完全溶解到溶液中。用TE缓冲液稀释PicoGreen试剂，将100μl稀释的溶液加入到每孔中，用振荡器进行搅拌。然后，以激发波长485nm和发射波长535nm来进行测量。
细胞粘附性
细胞粘附性测试的结果是用氧化的RCP包被的平板比用新鲜重组明胶包被的平板具有更高的粘附性（图1）。因此，可以证实氧化的重组明胶通过细胞粘附序列之外的因素提高了细胞粘附性。
Claims (21)
1.包含甲硫氨酸的细胞粘附性蛋白，其中至少部分甲硫氨酸残基被氧化。
2.权利要求1的细胞粘附性蛋白，其中所述蛋白中7%或更多的甲硫氨酸残基被氧化。
3.权利要求1或2的细胞粘附性蛋白，其中至少部分甲硫氨酸残基被氧化剂氧化。
4.权利要求1至3任一项的细胞粘附性蛋白，其细胞粘附性通过氧化甲硫氨酸残基被提高。
5.权利要求1至4任一项的细胞粘附性蛋白，其是明胶样蛋白。
6.权利要求5的细胞粘附性蛋白，其中所述明胶样蛋白是明胶、胶原、纤连蛋白、pronectin、玻连蛋白、或其组合。
7.权利要求5或6的细胞粘附蛋白，其中所述明胶样蛋白是具有衍生自部分胶原氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。
8.权利要求7的细胞粘附性蛋白，其中所述重组明胶具有由Gly-X-Y（其中X和Y各自独立地代表任意氨基酸）所示的胶原特征性序列的重复（其中多条Gly-X-Y序列相互之间可以是相同的或不同的），并且分子量为2KDa或以上且100KDa或以下。
9.权利要求7或8的细胞粘附性蛋白，其中所述重组明胶具有由Gly-X-Y（其中X和Y各自独立地代表任意氨基酸）所示的胶原特征性序列的重复（其中多条Gly-X-Y序列相互之间可以是相同的或不同的），并且分子量为10KDa或以上且90KDa或以下。
10.权利要求7至9任一项的细胞粘附性蛋白，其中所述重组明胶具有由Gly-X-Y（其中X和Y各自独立地代表任意氨基酸）所示的胶原特征性序列的重复（其中多条Gly-X-Y序列相互之间可以是相同的或不同的），并且在单个分子中包括两条或更多条细胞粘附信号序列。
11.权利要求10的细胞粘附性蛋白，其中所述细胞粘附信号是由Arg-Gly-Asp所示的氨基酸序列。
12.权利要求7至11任一项的细胞粘附性蛋白，其中所述重组明胶的氨基酸序列不包含任何的丝氨酸和苏氨酸。
13.权利要求7至12任一项的细胞粘附性蛋白，其中所述重组明胶的氨基酸序列不包含任何的丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸。
14.权利要求7至13任一项的细胞粘附性蛋白，其中所述重组明胶的氨基酸序列不包含由Asp-Arg-Gly-Asp所示的氨基酸序列。
15.权利要求7至14任一项的细胞粘附性蛋白，其中所述重组明胶由下式所示：
A-[(Gly-X-Y)n]m-B
其中，A代表任何给定氨基酸或氨基酸序列，B代表任何给定氨基酸或氨基酸序列，n个X每个都独立地代表任意氨基酸，n个Y每个都独立地代表任意氨基酸，n代表3至100的整数，m代表2至10的整数，n个Gly-X-Y相互之间可以是相同的或不同的。
16.权利要求7至15任一项的细胞粘附性蛋白，其中所述重组明胶由下式所示：
Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly
其中63个X每个都独立地代表任意氨基酸，63个Y每个都独立地代表任意氨基酸，n个Gly-X-Y相互之间可以是相同的或不同的。
17.权利要求7至16任一项的细胞粘附性蛋白，其中所述重组明胶具有（1）SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或（2）与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有80%或更高同源性并且具有细胞粘附性的氨基酸序列。
18.权利要求7至17任一项的细胞粘附性蛋白，其中所述重组明胶是交联的。
19.权利要求18的细胞粘附性蛋白，其中所述交联用醛、缩合剂、热交联、光交联或酶进行。
20.包含权利要求1至19任一项的细胞粘附性蛋白的细胞粘附支持物。
21.生产权利要求1至19任一项的细胞粘附性蛋白的方法，包括用氧化剂处理包含甲硫氨酸的细胞粘附性蛋白。
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