JP5635771B2 - 抗炎症性及び抗アレルギー性環状ペプチド - Google Patents
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Description
1)迅速に作用するβ2アゴニスト;4級アンモニウム抗コリン薬であり臭化イプラトロピウム;及び、細気管支の平滑筋を弛緩させるキサンチン誘導体であるアミノフィリンで代表される、急性症候(喘息患者の60%)を改善するための薬剤、及び
2)吸入投与される全身性コスチコステロイドで代表される、喘息の症候を予防するために用いられるメンテナンス薬。
配列番号1を用いたトリプシンの阻害についての研究を行い、図1に示したような,簡単な競合阻害(competitive inhibition)を得ると共に、10μMないし 0.1 nMのKi値を得た。基質として、純度が95%(単一ピーク)超となるまでに、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製したブラジキニンの蛍光性類似体(fluorescent analog)、Abz-Phe-Arg-Ser-Ser-Arg-Gln-EDDnpが用いられた。
a)Km and kcatを決定するための酵素反応
基質溶液の濃度は、トリプシンによる完全な加水分解後に形成された産物Abzに対し蛍光定量分析を行うことによって、決定した。加水分解反応は、日立製のF−2000蛍光光度計によって行われた。ここで、励起(excitation)、及び、発光スリット(emission slit)は、それぞれ10nm、及び20nmに設定され、そして、励起、及び、発光波長はそれぞれ320nm、及び、420nmに設定された。反応キュベット(cuvette)の温度は、サーモスタットで調節されたコンパートメントにおいて37℃で維持された。
本発明のペプチドを用いてトリプシンの阻害動力学(inhibition kinetics)を決定(測定)するために、以下のような3つの異なる基質濃度を用いた:a) Km値の半分に当たる濃度(0.8 μM); b) Km値に当たる濃度(1.6 μM);及び c) Km値の2倍を若干超える濃度(3.5 μM). 濃度3.0nmの酵素を用い、各基質の濃度を異ならせることに加えて、3つの異なる濃度(10nM,100nM、及び、1μM)の阻害剤(配列番号1〜9)を用いた。ここで、基質の消費(量)は、最初の濃度の10%未満であった。37℃のTris−HCl緩衝液(pH8.0、37℃で20mMのNaClを含有する。)でインキュベートを行った。酵素阻害の特性付けのために、ラインウィーバァー-ブルクプロット(lineweaver-burk plot)を用いた(1/V対1/S)。また、見掛け阻害常数(Ki(app))と、基質のKm値との関係からKi値を決定することができた。
a)本発明のペプチドに対する白血球の転がり(rolling)
白血球の接着及び転がりを証明するためのテストは、マウス(3匹/グループ)を対象に行った。マウスを、ペンとバルビタールナトリウム(HypnolR, 50 mg/Kg)で麻酔させ、温度調節されたプレート(37℃)においた。陰嚢(scrotal sac)に対し外科手術を行い、挙睾筋(cremaster muscle)を露出させた。その挙睾筋を前記プレートの透明な領域を囲むように(around)固定させた。これを、局所微小循環(local microcirculation)のインビボ視覚化(in vivo visualization)を可能にするために、光学顕微鏡のキャリオット(chariot)上に載せた。0.15MのPBS(燐酸塩緩衝液)で灌注(irrigation)することによって、暖かくて湿っている状態を保持した。濃度1μg/mLの炎症剤LPS(リポ多糖類)を20μLとなるように希釈し、その希釈した炎症剤を前記挙睾筋に局所的に塗布(適用)した。後毛細血管静脈(post-capillary venule)の特徴(aspect)を、LPS(リポ多糖類)の塗布前後に登録しておいた。LPSを塗布してから15分後、ペプチド(配列番号1〜9)(1μM)を局所塗布した。その後30分間にわたって、前及び後毛細血管静脈(pre and post capillary venule)、細動脈(arteriole)、筋繊維における変化を観察した。白血球における転がり、確実な接着、及び、後毛細血管静脈における漏れ(直径20〜40μm)が見られ、そして、それを10分間1分単位で定量化された。移住(transmigration)は、100μm程度のセグメント上に存在する血管外の組織における白血球の数として定義される。挙睾(cremaster)の微小循環は、スペランジノ(Sperandio)らの文献[J. Exp. Med., 19; 197(10): 1355-1363, 2003]に記載されたような生体内蛍光顕微鏡(ドイツのカルゼリスに所在するアクシオイメゼルエイ・アイ社製)を用いる落射法(epi−illumination)によって分析された。
次のように第1,2、及び3番のアミノ酸を除去した改質ペプチド(modified peptide)(Mod-3)(表2参照)を用いて上記テストを繰り返し行った。
本発明のペプチドの活性におけるLys11残基の必要性を知るために、本発明のペプチドのうち1つのペプチドの第11番アミノ酸であるリシンをアラニンに置き換えた改質ペプチド(ModLys/Ala、以下の表を参照)を対象にし、実施例2と同様の白血球の転がりテストを繰り返し行った。
滅菌食塩水500μLに溶かした配列番号7で同定されたペプチド4nmol又は40nmolの溶液をマウスの腹腔内に注射した。それから30分後、滅菌食塩水500μLで希釈したLPS(O55:BR 20 (g/mL, Sigma社製)をマウスに腹腔内投与した。食塩水だけを注射した動物を対照群とみなした。LPSを注射してから24時間後、高容量の抱水クローラルで動物を致死させ、腹腔の洗浄液(washing)を得た。その洗浄液に含まれた(A)細胞数、(B)好中球の数、及び、(C)マクロファージの数を数えた。腹膜(peritoneum)から除去された物質を4℃にて1500rpmで遠心分離を行った。上清(supernatant)を分離し、今後の分析のために−20℃で凍結させた。細胞を含有する残留物質をPBS0.1%BSAに再び懸濁させた。ノイバウアー(Neubauer)チャンバで計数(total count)を行った。白血球百分率(differential count)のために、細胞の縣濁液のアリコート(aliquot)をスライド上に載せて、遠心分離(Citospin)を行い、ヘマ(Hema)3で染色し、そして、光学顕微鏡下での観察を行った。その結果、総細胞数は300個であった。各細胞集団の絶対数(absolute number)は、サンプル体積(sample volume)において見つかった総細胞数に前記百分率をかけることによって求めた。
Claims (9)
- 13個のアミノ酸からなる抗炎症性、及び/又は、抗アレルギー性合成環状ペプチドであって、
第4番、及び、第13番にシステインを有し、
第1番にバリン、ロイシン、又は、イソロイシンを有し、
第3番にアルギニン、又は、グルタミンを有し、
第5番にアルギニン、トレオニン、セリン、又は、アスパラギン酸塩を有し、
第7番にメチオニン、又は、イソロイシンを有し、
第9番にグリシン、又は、アスパラギン酸塩を有し、
第11番にリシンを有し、そして、
前記第4番及び前記13番のシステイン残基間のジスルフィド結合によって前記環状の構造が形成されている
ことを特徴とする合成環状ペプチド。 - 13個のアミノ酸からなる抗炎症性、及び/又は、抗アレルギー性合成環状ペプチドで
あって、
第4番、及び、第13番にシステインを有し、
第11番にリシンを有し、
前記第4番及び前記13番のシステイン残基間のジスルフィド結合によって前記環状の
構造が形成され、そして、
以下に示す配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する
ことを特徴とする合成環状ペプチド:
Ile1-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro8-Gly9-Val10-Lys11-Met12-Cys13(配列番号
1);
Val1-Glu2-Gln3-Cys4-Thr5-Ile6-Ile7-Gly8-Asp9-Glu10-Lys11-Asp12-Cys13(配列番号
2);
Val1-Glu2-Gln3-Cys4-Thr5-Ile6-Ile7-Gly8-Asp9-Ala10-Lys11-Asp12-Cys13(配列番号
3);
Val1-Gln2-Gln3-Cys4-Ser5-Glu6-Ile7-Ala8-Gly9-Ala10-Lys11-Pro12-Cys13(配列番号
4);
Leu1-His2-Arg3-Cys4-Asp5-Lys6-Ile7-Ala8-Asp9-Ala10-Lys11-Pro12-Cys13(配列番号
5);
Ile1-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Ala6-Met7-Pro8-Gly9-Val10-Lys11-Met12-Cys13(配列番号
6);
Ile1-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro8-Gly9-Val10-Lys11-Met12-Cys13NH2(配列番
号7);
Ac-Ile1-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro8-Gly9-Val10-Lys11-Met12-Cys13(配列番
号8);及び、
Ac-Ile1-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro8-Gly9-Val10-Lys11-Met12-Cys13NH2(配
列番号9)。 - 前記プロリン残基が、ヒドロキシプロリン残基によって置き換えられていることを特徴
とする請求項2に記載の合成環状ペプチド。 - 前記メチオニン残基が、酸化型メチオニン残基によって置き換えられていることを特徴
とする請求項2に記載の合成環状ペプチド。 - 前記ペプチドが、抗喘息性を有していることを特徴とする請求項1又は2に記載の合成
環状ペプチド。 - 前記ペプチドが、トリプシンの阻害剤であることを特徴とする請求項1又は2に記載の
合成環状ペプチド。 - 急性、及び/又は、慢性の炎症性、及び/又は、アレルギー性疾患を治療するのに有効
量の請求項1又は2に記載のペプチド、又は、2以上の前記ペプチドからなる組み合わせ
、或いは、医薬的に許容されるそれらの塩、及び、1以上の医薬的に許容される賦形剤を
含有することを特徴とする医薬組成物。 - 前記医薬組成物が、経口投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、又は、静脈内投与用に供され
るものであることを特徴とする請求項7に記載の医薬組成物。 - 喘息、鼻炎、関節炎、及び、アトピー性皮膚炎からなる群から選択される、急性、及び
/又は、慢性の炎症、及び/又は、アレルギー性疾患の治療又は予防に使用される医薬の
製造のための請求項1又は2に記載のペプチドの使用。
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