BRPI0613676A2 - polipeptìdeo, seu uso e composição farmacêutica compreendendo o mesmo - Google Patents

Abstract

POLIPEPTìDEO, SEU USO E COMPOSIçãO FARMACêUTICA COMPREENDENDO O MESMO. A presente invenção refere-se a agentes terapêuticos antimicrobiais que atuam via um novo processo para tratar infecção são compostos que podem compreender um peptídeo com aminoácidos naturais ou não-naturais, ou uma molécula pequena. O agente pode se ligar à superfície de um microorganismo e produtivamente fixar complemento de modo a causar lise do microorganismo via a montagem de um complexo de ataque de membrana, pelo que disparando remoção do micróbio por fagocitose. Osagentes podem ser fragmentos de TFPI, por exemplo,a partir da região de terminus-C.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍ-DEO, SEU USO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO O MESMO".

Todas as patentes, pedidos de patente, informação online e refe-rências citadas neste relatório descritivo são aqui incorporadas por referên-cia em suas totalidades.

Antecedentes da Invenção

Infecções microbiais podem ser causadas por uma ampla faixade micróbios tais como bactérias, fungos e vírus resultando em doenças su-aves a ameaçadoras de vida que requerem imediata intervenção. Infecçõesbacterianas comuns incluem pneumonia, infecções de ouvido, diarréia, in-fecções de trato urinário, e distúrbios de pele. Infecções virais comuns inclu-em gripe AeB, vírus sincicial respiratório, hepatite C e catapora enquantoinfecções de fungos comuns incluem distúrbios de pele. Há uma contínuanecessidade na técnica de eficazes processos de tratamento de infecçõesmicrobiais e/ou aperfeiçoamento de presentes processos de tratamento des-tas infecções.

Descrição da Invenção

A presente invenção refere-se a agentes terapêuticos antimicro-bianos que atuam via um novo processo para tratar infecção. O agente tera-pêutico é um composto que pode compreender um peptídeo com aminoáci-dos naturais ou não-naturais, ou uma molécula pequena. O agente é eficazcontra microorganismos extracelulares tais como bactérias, fungos ou célu-las infectadas com vírus. O microorganismo pode ser procariótico, eucarióti-co ou celular simples. O agente terapêutico pode trabalhar através de liga-ção da superfície do microorganismo e interação com os componentes dosistema complementar para matar o micróbio. Em uma realização, o agenteterapêutico interage sinergisticamente com os componentes do sistemacomplemento para matar o micróbio. Em uma outra realização o agente te-rapêutico se liga à superfície do microorganismo e produtivamente fica com-plemento de modo a opsonizar o micróbio. Ainda em uma realização, o a-gente terapêutico se liga à superfície do microorganismo e produtivamentefixa complemento de modo a causar Iise do microorganismo via a montagemde um complexo de ataque de membrana (MAC). Isto dispara a remoção domicróbio por fagocitose.

Assim, a invenção provê um composto para tratamento de infec-ção microbial em um animal tendo um sistema complementar, onde o com-posto se liga à superfície microbial e interage com componentes do sistemacomplementar presente no animal (tal como o componente C1q) para matarmicróbios.

O composto pode opsonizar e/ou causar Iise do micróbio.

O composto pode atuar sinergisticamente com o sistema com-plementar presente no animal, tal como C1q. Assim, o efeito antimicrobial docomposto pode ser maior na presença do componente(s) de sistema com-plementar que em sua ausência. Preferivelmente, o efeito antimicrobial docomposto é maior que o efeito agregado do peptídeo sozinho e o componen-te(s) de sistema complemento sozinho.

Compostos particulares de interesse são derivados de inibidorde caminho de fator de tecido (TFPI), como descrito em mais detalhes abai-xo. Ainda compostos podem ser identificados através de processos de sele-ção, por exemplo, através de comparação de efeito antimicrobial de umcomposto na ausência e presença de componentes de complemento.TFPI e Análogos de TFPI

TFPI é um poderoso anticoagulante pensado ter atividade antiin-flamatória [1]. TFPI pode ser usado para inibir angiogênese associada com,por exemplo, tumores [2].

A proteína tem vários domínios principais: três domínios inibido-res de serina protease do tipo Kunitz (K1, K2 e K3), e domínio N-terminal(NTD), e um domínio terminal-C (CTD). O domínio K1 inibe complexo defator de tecido (TF) - fator de coagulação VlIA. O domínio K2 inibe fator Xa.Assim, de longe nenhuma serina protease foi associada com K3, mas recen-tes experimentos sugerem que K3 funciona em ligação de TFPI a um recep-tor ancorado em GPI sobre superfícies de células [3]. O CDT também estáenvolvido em associação de célula, ligação de heparina, e ótima inibição deXa.

"TFPI" como aqui usado refere-se à glicoproteína de soro madu-ra tendo a seqüência de resíduo de 276 aminoácidos mostrada em SEQ ID.NO: 1 e um peso molecular de cerca de 38 000 Dáltons sem glicosilação. Aproteína nativa tem um peso molecular de 45400 Dáltons quando glicosila-ção está presente [4]. A clonagem do ADNc de TFPI é descrita em referên-cia 5. TFPI usado na invenção pode ser não-glicosilado ou glicosilado.

Um "análogo TFPI" é um derivado de TFPI modificado com umaou mais adições ou substituições de aminoácidos, por exemplo, de um a oi-tenta (geralmente conservativas em natureza e preferivelmente em domíniosnão-Kunitz ou na porção terminal-C da proteína), uma ou mais supressõesde aminoácidos, por exemplo, de uma a oitenta (por exemplo, fragmentosTFPI), ou a adição de uma ou mais metades químicas a um ou mais amino-ácidos, tanto quanto as modificações não destruam atividade biológica deTFPI. A atividade que não é destruída pode incluir atividade anticoagulantede TFPI e/ou sua atividade antibacterial, assim como sua atividade no en-saio de protrombina.

Preferivelmente, análogos TFPI compreendem todos dos trêsdomínios Kunitz. TFPI e análogos de TFPI podem ser glicosilados ou não-glicosilados.

Para manter atividade antibacteriana, é preferido que um análo-go de TFPI deve reter seu CTD, quando esta região é onde a atividade anti-bacteriana foi localizada. Tipicamente, é preferido reter substancialmentetodos os aminoácidos a jusante do sítio de clivagem de trombina mais a ju-sante em TFPI (por exemplo, a jusante de aminoácido 254 de SEQ ID NO: 1,onde trombina cliva entre resíduos 254 & 255). Pelo menos 50% (por exem-plo, >60%, >70%, >80%, >90%, >92%, >94%, >96%, >98%, >99%, ou mais)por número das moléculas de análogo de TFPI em uma composição devemser não-clivadas no sítio de clivagem de trombina presente entre aminoáci-dos 254 e 255 de TFPI.

Um análogo de TFPI preferido é N-L-alanil-TFPI (ala-TFPI), cujaseqüência de aminoácidos é mostrada em SEQ ID NO:2. AIa-TFPI tambémé conhecido sob o nome de fármaco internacional "tifacogin". O resíduo ala-nina terminal amino de um TFPI foi engenheirado na seqüência de TFPI pa-ra aperfeiçoar expressão em E. coli [6]. TFPI endógeno é expresso com umpeptídeo sinal. A metionina terminal amino é parte do peptídeo sinal e nãoparte do TFPI maduro. Outros análogos de TFPI são descritos em referência7. Análogos de TFPI possuem alguma medida da atividade de TFPI comodeterminado por um ensaio de bioatividade (por exemplo, vide refs. 8 & 9como descrito abaixo).

TFPI tem três sítios de clivagem de trombina: (i) entre Lys-86 &Thr-87, entre K1 & K2; (ii) entre Arg-107 & Gly-108 (o sítio reativo na direçãode fator Xa em K2); e (iii) entre Lys-254 & Thr-255 na região básica terminal-C. Os inventores verificaram que atividade antibacteriana de TFPI reside noCTD, e em particular na região proximal a e/ou a jusante do sítio de clivagemde trombina entre Lys-254 e Thr-255 em SEQ ID NO: 1. Quando o TFPI cli-vado, carecendo de seu CTD, tem pouca atividade em ensaios de sangueentão a invenção provê um análogo de TFPI onde seu sítio de clivagem detrombina foi removido, por exemplo, através de mutagênese direcionada asítio. O CTD destes análogos não pode ser clivado por trombina, rendendouma molécula que pode reter sua atividade antibacteriana por períodos maislongos que TFPI natural.

Assim a invenção provê: (1) um análogo de TFPI, onde o análo-go carece de sítio de clivagem de trombina encontrado próximo de terminus-C de TFPI natural; (2) um análogo de TFPI, onde o análogo carece de sítiode clivagem de trombina presente entre aminoácidos Lys-254 e Thr-255 deTFPI natural; (3) um análogo de TFPI, onde o análogo compreende (i) pelomenos um domínio Kunitz e (ii) uma região terminal-C, mas onde o análogonão tem um sítio de clivagem de trombina entre seu domínio Kunitz maiorterminal-C e a região terminal-C; (4) um análogo TFPI, onde o análogo nãopode ser clivado por trombina para render um polipeptídeo terminal-N queinclui um domínio Kunitz e um polipeptídeo terminal-C que não inclui umdomínio Kunitz; (5) um análogo TFPI, onde o análogo contém menos quedois (isto é, um ou nenhum) dipeptídeos Lys-Thr.O sítio de clivagem natural (Lys-Thr) pode ser removido de vá-rias maneiras. Por exemplo, a Iisina e/ou a treonina pode ser substituída comdiferentes aminoácidos para render um dipeptídeo que não é reconhecidopor trombina. Como uma alternativa, a Iisina e/ou a treonina pode ser supri-mida. Ainda como uma alternativa, um ou mais aminoácidos podem ser inse-ridos entre a Iisina e a treonina. Após a modificação ter sido feita, o análogode TFPI pode ser incubado com trombina em uma digestão teste para con-firmar que a clivagem de terminus-C natural não mais ocorre.

A invenção também provê: (1) um análogo de TFPI, onde o aná-logo inclui domínio 3 de Kunitz, mas carece de domínio terminus-C; (2) umanálogo de TFPI, onde o análogo é um TFPI que foi truncado por até q (q é1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40) aminoáci-dos a partir de terminus-C. Truncação de terminus-C de TFPI foi previamen-te reportada, mas isto usualmente em combinação com supressão de K3.

Polipeptídeos

TFPI tem três sítios de clivagem de trombina: (i) entre Lys-86 &Thr-87; (ii) entre Arg-107 & Gly-108; e (iii) entre lys-254 & Thr-255. Os inven-tores verificaram que a atividade antibacteriana de TFPI reside na regiãobásica terminal-C e em particular na região proximal a e/ou a jusante do sítiode clivagem de trombina entre Lys-254 e Thr-255 em SEQ ID NO:1. Cliva-gem neste sítio libera um peptídeo de 22 aminoácidos (SEQ ID NO: 3) quefoi mostrado ter atividade antibacteriana e pode se ligar a LPS bacteriano.

Assim a invenção provê peptídeos baseados no CTD de TFPI, para uso co-mo agentes antibacterianos, para uso em processos de tratamento de infec-ções bacterianas, e para uso na fabricação de medicamentos para tratamen-to de tais infecções. A invenção ainda provê peptídeos baseados no CTD deTFPI, para uso como agentes antimicrobiais, para uso em processos de tra-tamento de infecções microbiais e para uso em fabricação de medicamentospara tratamento de tais infecções. Estes peptídeos são particularmente ati-vos na presença de sangue.

Assim a invenção provê: (1) um polipeptídeo consistindo em se-qüência de amionoácidos SEQ ID NO: 3 (peptídeo número 1); (2) um poli-peptídeo compreendendo seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 3, contantoque o polipeptídeo não seja TFPI ou um análogo de TFPI; (3) um polipeptí-deo compreendendo seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, contantoque o aminoácido (se um está presente) para o terminus-N de SEQ ID NO: 3não seja Lys; (4) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de ami-noácidos que é pelo menos 50% (por exemplo, >60%, >70%, >80%, >85%,>90%, >92%, >94%, >96%, >98%, ou mais) idêntica a SEQ ID NO: 3; (5) umpolipeptídeo compreendendo seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3,contanto que pelo menos um dos aminoácidos na dita SEQ ID NO: 3 sejaum D-aminoácido; (6) um polipeptídeo compreendendo um fragmento depelo menos 3 (por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20 ou 21) aminoácidos consecutivos de seqüência de aminoácidos SEQID NO: 3, contanto que o dito polipeptídeo não seja TFPI; (7) um polipeptí-deo compreendendo pelo menos 3 ( por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60,65, 70, 75 ou mais) aminoácidos a partir de terminus-C de seqüência de a-minoácidos de SEQ ID NO: 1, contanto que o dito polipeptídeo não seja TF-Pl ou um análogo de TFPI.

Atividade antimicrobial também foi vista em peptídeos derivadosde CTD, mas não incluindo maioria de resíduos terminais-C de TFPI. Assim,a invenção provê um polipeptídeo compreendendo um fragmento de pelomenos 3 (por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14) aminoácidos con-secutivos de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 5. O polipeptídeo podeou não ele próprio ser um fragmento de TFPI (por exemplo, de SEQ ID NO:1) ou um análogo de TFPI.

A invenção também provê um polipeptídeo compreendendo umfragmento de pelo menos 3 (por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 28, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54,55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,95, 96, 97, 98, 99, 100, ou mais) aminoácidos consecutivos de seqüência deaminoácidos SEQ ID NO: 6. O polipeptídeo pode ou não ele próprio ser umfragmento de TFPI (por exemplo). Fragmentos preferidos de SEQ ID NO: 6também são fragmentos de SEQ ID NO: 5.

A invenção também provê um polipeptídeo compreendendo umfragmento de SEQ ID NO: 1, contanto que (a) o fragmento inclui pelo menos3 (por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14) aminoácidos consecutivosde seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 5, e (b) o polipeptídeo não é TFPIou um análogo de TFPI.

A invenção também provê: (1) um polipeptídeo consistindo emseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (peptídeo número 3); (2) umpolipeptídeo compreendendo seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7,contanto que o polipeptídeo não seja TFPI ou um análogo de TFPI; (3) umpolipeptídeo compreendendo seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7,contanto que o aminoácido (se um está presente) para o terminus-N de SEQID NO: 7 não seja Lys; (4) um polipeptídeo compreendendo uma seqüênciade aminoácidos que é pelo menos 50% (por exemplo, >60%, >70%, >80%,>85%, >90%, >92%, >94%, >96%, >98%, ou mais) idêntica a SEQ ID NO: 7;(5) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ IDNO: 7, contanto que pelo menos um dos aminoácidos na dita SEQ ID NO: 7seja um D-aminoácido; (6) um polipeptídeo compreendendo um fragmentode pelo menos 3 (por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20 ou 21) aminoácidos consecutivos de seqüência de aminoácidosSEQ ID NO: 7, contanto que o dito polipeptídeo não seja TFPI ou um análo-go de TFPI.

A invenção também provê: (1) um polipeptídeo consistindo emseqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 5; (2) um polipeptídeo compreen-dendo seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, contanto que o polipep-tídeo não seja TFPI ou um análogo de TFPI; (3) um polipeptídeo compreen-dendo seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, contanto que o aminoá-cido (se um está presente) para o terminus-N de SEQ ID NO: 5 não é Lys;(4) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos que épelo menos 50% (por exemplo, >60%, >70%, >80%, >85%, >90%, >92%,>94%, >96%, >98%, ou mais) idêntica a SEQ ID NO: 5; (5) um polipeptídeocompreendendo seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, contanto quepelo menos um dos aminoácidos na dita SEQ ID NO: 5 seja um D-aminoácido; (6) um polipeptídeo compreendendo um fragmento de pelo me-nos 3 (por exemplo, 4, 5, 6, 7, ,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17„ 18, 19,20, ou 21) aminoácidos consecutivos de seqüência de aminoácidos SEQ IDNO: 5, contanto que o dito polipeptídeo não seja TFPI ou um análogo de TFPI).

A invenção também provê: (1) um polipeptídeo consistindo emseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (peptídeo número 5); (2) umpolipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ IDNO: 10, contanto que o polipeptídeo não seja TFPI ou um análogo de TFPI;(3) um polipeptídeo compreendendo seqüência de aminoácidos de SEQ IDNO: 10, contanto que o aminoácido (se um está presente) para o terminus-Nde SEQ ID NO: 10 não é Lys; (4) um polipeptídeo compreendendo uma se-qüência de aminoácidos que é pelo menos 50% (por exemplo, >60%, >70%,>80%, >85%, >90%, >92%, >94%, >96%, >98%, ou mais) idêntica a SEQ IDNO: 10; (5) um polipeptídeo compreendendo seqüência de aminoácidosSEQ ID NO: 10, contanto que pelo menos um dos aminoácidos na dita SEQID NO: 10 é um D-aminiácido; (6) um polipeptídeo compreendendo um frag-mento de pelo menos 3 (por exemplo, 4, 5, 6, 7, ,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, ou 21) aminoácidos consecutivos de seqüência de ami-noácidos SEQ ID NO: 10, contanto que o dito polipeptídeo não seja TFPI ouum análogo de TFPI.

Estes polipeptídeos preferivelmente podem se ligar a LPS e/ou abactérias. Estes polipeptídeos também podem se ligar a nanoproteínas en-contradas em parede de célula de fungos patogênicos. Os polipeptídeostambém podem se ligar a proteínas encontradas sobre partículas virais.

Os polipeptídeos preferivelmente consistem em não mais que250 aminoácidos (por exemplo, não mais que 225, 200, 190, 180, 170, 160,150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19,18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, ou mesmo 5 aminoácidos). Poli-peptídeos consistindo em entre 5 e 90 aminoácidos são preferidos (por e-xemplo, consistindo entre 5 e 80, 5 e 70, 5 e 60 aminoácidos, etc.). Particu-Iarmente preferidos são polipeptídeos consistindo entre 8 e 25 aminoácidos.

O polipeptídeo preferivelmente consiste em pelo menos 3 ami-noácidos (por exemplo, pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou pelo menos 50 aminoácidos).

A invenção provê um polipeptídeo tendo fórmula NH2-A-B-C-COOH, onde: A é uma seqüência de polipeptídeo consistindo em a aminoá-cidos; C é uma seqüência de polipeptídeos consistindo em c aminoácidos; Bé uma seqüência de polipeptídeos que é um fragmento de pelo menos b a-minoácidos consecutivos a partir da seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:3, onde b é 3 ou mais (por exemplo, 4, 5, 6, 7, ,8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15,16, 17„ 18, 19, 20, ou 21).

A invenção provê um polipeptídeo tendo fórmula NH2-A-B-C-COOH, onde: A é uma seqüência de polipeptídeos consistindo em a amino-ácidos; C é uma seqüência de polipeptídeos consistindo em c aminoácidos;B é uma seqüência de polipeptídeos que é um fragmento de pelo menos baminoácidos consecutivos da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5,onde b é 3 ou mais (por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14).

A invenção provê um polipeptídeo tendo fórmula NH2-A-B-C-COOH, onde: A é uma seqüência de polipeptídeos consistindo em a amino-ácidos; C é uma seqüência de polipeptídeos consistindo em c aminoácidos;B é uma seqüência de polipeptídeos que é um fragmento de pelo menos baminoácidos consecutivos a partir da seqüência de aminoácidos SEQ IDNO: 7, onde b é 3 ou mais (por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14).

A invenção provê um polipeptídeo tendo fórmula NH2-A-B-C-COOH, onde: A é uma seqüência de polipeptídeos consistindo em a amino-ácidos; C é uma seqüência de polipeptídeos consistindo em c aminoácidos;B é uma seqüência de polipeptídeos que é um fragmento de pelo menos baminoácidos consecutivos da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10,onde b é 3 ou mais (por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 101 11, 12, 13, 14).

O valor de a é geralmente pelo menos 1 (por exemplo, pelo me-nos 2, 3, 4, 5, 6, 7, ,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24, 25, 26, 27,. 28, 29, 30, 35, 40 , 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250,300, 350, 400, 450, 500, etc.). O valor de c é geralmente pelo menos 1 (porexemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 ,90, 100, 150,200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, etc.). O valor de a+c é pelo menos 1 (porexemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, ,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,. 28, 29, 30, 35, 40 , 45, 50, 60, 70, 80, 90,100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, etc.). É preferido que o valor dea+c seja no máximo 1000 (por exemplo, no máximo 900, 800, 700, 600, 500,450, 400, 350, 300, 250, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110,100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10,9,8,7,6,5,4,3,2).

A seqüência de aminoácidos de -A- tipicamente compartilha me-nos que m% de identidade de seqüência aos a aminoácidos que são termi-nais-N de seqüência -B- em SEQ ID NO:2. A seqüência de aminoácidos de -C- tipicamente compartilha menos que n% de identidade de seqüência aos caminoácidos que são terminais-C de seqüência -B- em SEQ ID NO: 2. Emgeral, os valores de m e η são ambos 60 ou menos (por exemplo, 50, 40, 30,20, 10 ou menos). Os valores de m e η podem ser idênticos ou diferentesuns dos outros.

Em algumas realizações da invenção, os polipeptídeos não con-sistem em SEQ ID NO: 4, que foi mostrada por Hembrough et al. em refe-rência 10 como tendo atividade anti-angiogênica e antitumor, mas não comotendo atividade antibacteriana.

Polipeptídeos da invenção podem compreender seqüências deaminoácidos que têm identidade de seqüência a SEQ ID NO: 3, 5, 6, 7 e 10.Estes polipeptídeos incluem homólogos, ortólogos, variantes alélicas e mu-tantes. Identidade entre polipeptídeos é preferivelmente determinada peloalgoritmo de busca de homologia Smith-Waterman como implementado noprograma MPSTCH (Oxford Molecular), usando uma busca de folga afimcom parâmetros de penalidade de abertura de folga =12 e penalidade deextensão de folga = 1.

Estes polipeptídeos podem, comparados a SEQ ID NO 3, 5, 6, 7e 10, incluir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, etc.) substituiçõesconservativas de aminoácidos, isto é, substituições de um aminoácido comum outro que tem cadeia lateral relacionada. Aminoácidos codificados gene-ticamente são geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácidos, isto é,aspartato, glutamato; (2) básicos, isto é, lisina, arginina, histidina; (3) não-polares, isto é, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenil alanina, me-tionina, triptofano; e (4) polares não-carregados, isto é, glicina, asparagina,glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenil alanina, triptofano, e tiro-sina são algumas vezes classificados como aminoácidos aromátiicos. Emgeral, substituição de aminoácidos simples com estas famílias não tem ummaior efeito sobre a atividade biológica. Além disso, os polipeptídeos podemter uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, etc.) supressões de aminoáci-dos simples em relação a uma seqüência referência. Além disso, os polipep-tídeos podem incluir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, etc.) inser-ções (por exemplo, cada de 1, 2 ou 3 aminoácidos) em relação a uma se-qüência referência.

Polipeptídeos da invenção podem ser preparados em muitasmaneiras, por exemplo, através de síntese química (no todo ou em parte),através de digestão de TFPI usando proteases, através de tradução de ARN,através de purificação de cultura de células (por exemplo, a partir de expres-são recombinante), etc. Um processo preferido para produção de peptídeosde < 40 aminoácidos de comprimento envolve síntese química in vitro[11,12]. Síntese de peptídeo de fase sólida é particularmente preferida, taiscomo processos baseados em química de tBoc ou Fmoc [13]. Síntese enzi-mática [14] também pode ser usada em parte ou no todo. Como uma alter-nativa para síntese química, síntese biológica pode ser usada, por exemplo,os polipeptídeos podem ser produzidos por tradução. Isto pode ser realizadoin vitro ou in vivo. Processos biológicos são em geral restritos à produção depolipeptídeos baseado em L-aminoácidos, mas manipulação de maquinariade tradução (por exemplo, de moléculas de amino acil ARNt(??)) pode serusada para permitir a introdução de D-aminoácidos (ou de outros aminoáci-dos como iodo tirosina ou metil fenil alanina, azido homoalanina, etc.)[15].Onde D-aminoácidos são incluídos, entretanto, é preferido usar síntese quí-mica. Polipeptídeos da invenção podem ter modificações covalentes no ter-minus-C e/ou terminus-N.

Polipeptídeos da invenção podem tomar várias formas (por e-xemplo, nativa, fusões, glicosilados, não-glicosilados, lipidados, não-lipidados, fosforilados, não-fosforilados, miristoilados, não-miristoilados, mo-noméricoSj multiméricos, partículas, desnaturados, etc.).

Polipeptídeos da invenção são preferivelmente providos em for-ma purificada ou substancialmente purificada, isto é, substancialmente livresde outros polipeptídeos (por exemplo, livres de polipeptídeos ocorrendo na-turalmente), e são geralmente pelo menos cerca de 50% puros (em peso), eusualmente pelo menos cerca de 90% puros, isto é, menos que cerca de50%, e mais preferivelmente menos que cerca de 10% (por exemplo, 5% oumenos) de uma composição são constituídos por outros polipeptídeos ex-pressos.

Polipeptídeos da invenção podem ser ligados a um suporte sóli-do. Polipeptídeos da invenção podem compreender um marcador detectável(por exemplo, um marcador radioativo ou fluorescente, ou um marcador bio-tina).

O temo "polipeptídeo" refere-se a polímeros de aminoácidos dequalquer comprimento. O polímero pode ser linear, ramificado ou circular,ele pode compreender aminoácidos modificados, e ele pode ser interrompidopor não-aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de amino-ácidos que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo,formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilaçõa, fosforila-ção, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugaçãocom um componente marcador. Também incluídos na definição são, por e-xemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido(incluindo, por exemplo, aminoácidos não-naturais, etc.) assim como outrasmodificações conhecidas na técnica. Polipeptídeos podem ocorrer como ca-deias simples ou cadeias associadas.

A invenção provê polipeptídeos compreendendo uma ou maisseqüências -X-Y- ou -Y-X- ou -X-X-, onde: -X- é uma seqüência de aminoá-cidos como definida acima e -Y- não é uma seqüência como definida acima,isto é, a invenção provê proteínas de fusão. Por exemplo, a invenção provê -X1-Y1-X2-Y2-, ou X1-X2-Y1 ou -X1-X2-, etc. Em uma realização da invenção, Yé uma seqüência líder terminal-N como visto, por exemplo, em SEQ ID NO14 ou 15. Ainda em uma realização, Y é uma seqüência auxiliar-T terminal-Ccomo vista, por exemplo, em SEQ ID NO 16 ou 17.

A invenção provê um processo para produção de polipeptídeosda invenção, compreendendo a etapa de cultura de uma célula hospedeirada invenção sob condições que incluem expressão de polipeptídeo.

A invenção provê um processo para produção de um polipeptí-deo da invenção, onde o polipeptídeo é sintetizado em parte ou no todo u-sando meios químicos.

Combinação de polipeptídeos de terminus-C com TFPI

TFPI tem um efeito anticoagulante e também interrompe sinali-zação de endotoxina potencialmente danosa. Em adição, como aqui descri-to, ele tem um efeito antimicrobial, por exemplo, um efeito antibacteriano,mediado por seu domínio de terminus-C. Para aperfeiçoar o efeito antibacte-riano de TFPI e análogos de TFPI, TFPI (ou um análogo de TFPI) pode seradministrado em conjunção com um polipeptídeo, como definido acima, apartir do terminus-C de TFPI. Alternativamente, ou em adição, para aperfei-çoar o efeito antimicrobial dos polipeptídeos como definidos acima, a partirda região terminus-C de TFPI, eles podem ser administrados em conjunçãocom TFPI e/ou um análogo de TFPI.

Assim, a invenção provê: (1) uma composição farmacêuticacompreendendo TFPI, ou um análogo de TFPI, e um polipeptídeo antimicro-bial da invenção; (2) TFPI ou um análogo de TFPI, e um polipeptídeo antimi-crobial da invenção, para administração simultânea, separada ou seqüencial;(3) um processo para tratamento de um paciente compreendendo adminis-tração simultânea, separada ou seqüencial de TFPI1 ou um análogo de TFPI,e um polipeptídeo antimicrobial da invenção; (4) um processo para tratamen-to de um paciente compreendendo administração de TFPI, ou um análogode TFPI, a um paciente que recebeu um polipeptídeo antimicrobial da inven-ção; (4) um processo para tratamento de um paciente compreendendo ad-ministração de um polipeptídeo antimicrobial da invenção a um paciente querecebeu TFPI, ou um análogo de TFPI. O antimicrobial é preferivelmenteantibacteriano.

Assim, a invenção provê: (1) uma composição farmacêuticacompreendendo um polipeptídeo antimicrobial da invenção e TFPI ou umanálogo de TFPI, e (2) um composto antimicrobial da invenção e TFPI ou umanálogo de TFPI, para administração simultânea, separada ou seqüencial;

(3) um processo para tratamento de um paciente compreendendo adminis-tração simultânea, separada ou seqüencial de um composto antimicrobial dainvenção e TFPI ou um análogo de TFPI, e (4) um processo para tratamentode um paciente compreendendo administração de TFPI ou um análogo deTFPI, a um paciente que recebeu um composto antimicrobial da invenção;

(4) um processo para tratamento de um paciente compreendendo adminis-tração de um composto antimicrobial da invenção a um paciente que rece-beu TFPI ou um análogo de TFPI.

O análogo de TFPI usado nestas combinações pode incluir, oualternativamente pode carecer de, polipeptídeo antimicrobial derivado determinus-C ou polipeptídeo antibacteriano. Assim, o TFPI pode carecer de qaminoácidos de terminus-C, como descrito acima.

Desenho de Fármaco e Miméticos de Peptídeo

Polipeptídeos da invenção são úteis antimicrobiais por si mes-mos. Entretanto, eles podem ser refinados para aperfeiçoamento de ativida-de antimicrobiana (tanto geral como específica) ou para aperfeiçoamento decaracterísticas farmacologicamente importantes como biodisponibilidade,toxicologia, metabolismo, farmacocinéticas, etc. Os polipeptídeos, por isso,podem ser usados como compostos líderes para ainda pesquisa e refino.Polipeptídeos da invenção podem ser usados para desenho demoléculas miméticas de peptídeo [16-21]. Técnicas miméticas de peptídeosforam usadas com sucesso para desenho de inibidores de trombina [22,23].Estes serão tipicamente isostéricos com relação aos polipeptídeos da inven-ção mas carecerão de uma ou mais de suas ligações peptídicas. Por exem-plo, a cadeia principal de peptídeo pode ser substituída por uma cadeia prin-cipal não-peptídeo, enquanto retendo importantes cadeias laterais de ami-noácidos. A molécula mimética de peptídeo pode compreender aminoácidosaçúcares [24]. Peptóides podem ser usados.

Para auxiliar no desenho de moléculas miméticas de peptídeos,uma farmacoforo (isto é, uma coleção de características químicas e restri-ções 3D que expressam características específicas responsáveis por ativi-dade) pode ser definido para os peptídeos. O farmacoforo preferivelmenteinclui características acessíveis de superfície, mais preferivelmente incluindodoadores e receptores de ligação de hidrogênio, grupos carregados / ionizá-veis, e/ou emplastros hidrofóbicos. Estes podem ser pesados dependendode sua relativa importância em conferir atividade [25].

Farmacoforos podem ser determinados usando software tal co-mo CATALYST (incluindo HypoGen ou HipHop), CERIUS2, ou construídosmanualmente a partir de uma conformação conhecida de um polipeptídeo dainvenção. O farmacoforo pode ser usado para seleção de bibliotecas estrutu-rais, usando um programa tal como CATALYST. O programa CLIX tambémpode ser usado, que busca orientações de moléculas candidatas em basesde dados estruturais que rendem máxima coincidência espacial com gruposquímicos que interagem com o receptor.

A superfície de ligação ou farmacoforo pode ser usado para ma-pear favoráveis posições de interação para grupos funcionais (por exemplo,prótons, grupos hidroxila, grupos amina, grupos hidrofóbicos) ou fragmentosde moléculas pequenas. Compostos então podem ser desenhados de novoonde os grupos funcionais relevantes são localizados substancialmente namesma relação espacial como em polipeptídeos da invenção.

Grupos funcionais podem ser ligados em um composto simplesusando fragmentos de ligação com o correto tamanho e geometria ou estru-turas que podem suportar os grupos funcionais em orientações favoráveis,pelo que provendo um composto mimético de peptídeo de acordo com a in-venção. Embora ligação de grupos funcionais desta maneira possa ser feitamanualmente, talvez com o auxílio de software como QUANTA ou SYBYL1abordagens de desenho de novo automatizadas ou semi-automatizadastambém são disponíveis, tais como:

- MCSS/HOOK [26,27], que liga múltiplos grupos funcionais commoldes moleculares tomados de uma base de dados.

- LUDI [28], que computa os pontos de interação que podem i-dealmente ser satisfeitos por um ligante, colocada fragmentos no sítio Iigantebaseado em sua habilidade para interagir com o receptor, e então conectaos mesmos para produção de um ligante.

- MCDLNG [29], que satisfaz um sítio ligante de receptor comum arranjo empacotado hermético de átomos gerais e usa um procedimentoMonte Cario para variar randomicamente vários tipos de átomos, posições,arranjos de ligação e outras propriedades.

- GROW [30], que inicia com um fragmento 'semente' inicial (co-locado manualmente ou automaticamente) e cresce o ligante para fora.

- SPROUT [31], processo que inclui módulos para: identificarfavorável ligação de hidrogênio e regiões hidrofóbicas dentro de um bolso deligação (módulo HIPPO); seleciona grupos funcionais e posiciona os mes-mos em sítios alvos para formação de fragmentos de partida para geraçãode estrutura (EIeFAnT); gera esqueletos que satisfazem as restrições esté-reas do bolso ligante através de desenvolvimento de fragmentos espaçado-res sobre os fragmentos iniciadores e então conectando os resultantes es-queletos partes (SPIDeR); substitui heteroátomos nos esqueletos para gerarmoléculas com as propriedades eletrostáticas que são complementares à-quelas do sítio receptor (MARABOU). As soluções podem ser feitas cachose classificadas usando o módulo ALLigaTOR.

- CAVEAT [32], que desenha unidades Iigantes para restringirmoléculas acíclicas.- LEAPFROG [33], que avalia Iigantes fazendo pequenas mu-danças estruturais em etapas e avaliando rapidamente a energia de ligaçãodo novo produto. Mudanças são mantidas ou descartadas baseadas na e-nergia de ligação alterada, e estruturas evoluem para aumentar a energia deinteração com o receptor.

- GROUPBUILD [34], que usa uma biblioteca de moldes orgâni-cos comuns e uma descrição de campo de força empírica completa das inte-rações não-ligantes entre um Iigante e um receptor para construir Iigantesque têm estrutura quimicamente razoável e têm propriedades estéreas eeletrostáticas complementares ao sítio de ligação de receptor.

- RASSE [35]

Estes processos identificam compostos relevantes. Estes com-postos podem ser desenhados de novo, podem ser compostos conhecidos,ou podem ser baseados em compostos conhecidos. Os compostos podemser úteis por si mesmos, ou eles podem ser protótipos que podem ser usa-dos para ainda refino farmacêutico (isto é, compostos líderes) de modo aaperfeiçoar afinidade Iigante ou outras características farmacologicamenteimportantes (por exemplo, biodisponibilidade, toxicologia, metabolismo, far-macocinéticas, etc.).

Assim como sendo compostos individualmente úteis, miméticosde peptídeo identificados in silico através das técnicas de desenho baseadasem estrutura também podem ser usados para sugerirem bibliotecas de com-postos para 'tradicionais' processos de seleção in vitro ou in vivo. Importan-tes motivos farmacêuticos nos Iigantes podem ser identificados e imitadosem bibliotecas de compostos (por exemplo, bibliotecas combinatoriais) paraseleção para atividade antimicrobial.

A invenção provê: (i) um composto identificado usando estesprocessos de desenho de fármaco; (ii) um composto identificado usando es-tes processos de desenho de fármaco, para uso como um composto farma-cêutico; (iii) o uso de um composto identificado usando estes processos dedesenho de fármaco na fabricação de um antimicrobial tal como um antibac-teriano; e (iv) um processo de tratamento de um paciente com uma infecçãobacteriana, tal como, microbial, compreendendo administração de umaquantidade eficaz de um composto identificado usando estes processos dedesenho de fármaco.

Processos Terapêuticos e Composições

A invenção provê composições compreendendo: (a) compostos,polipeptídeos, e/ou miméticos de peptídeos da invenção; e (b) um veículofarmaceuticamente aceitável. As composições da invenção são úteis paratratamento de pacientes em risco de desenvolvimento, ou diagnosticadoscomo tendo, uma infecção microbial ou para diminuir o risco do desenvolvi-mento de infecção em uma severa infecção para um ou um grupo de pacientes.

Componente (a) é o ingrediente ativo na composição, e este es-tá presente em uma quantidade terapeuticamente eficaz, isto é, uma quanti-dade suficiente para inibir crescimento e/ou sobrevivência microbial em umpaciente, e preferivelmente uma quantidade suficiente para eliminar infecçãomicrobial. A precisa quantidade eficaz para um dado paciente dependerá deseu tamanho e saúde, a natureza e extensão de infecção, e a composiçãoou combinação de composições selecionadas para administração. A eficazquantidade pode ser determinada através de experimentação de rotina eestá dentro do julgamento do médico. Para propósitos da presente invenção,uma dose eficaz será geralmente de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 5mg/kg, ou cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 50 mg/kg ou cerca de 0,05 mg/kga cerca de 10 mg/kg. Composições farmacêuticas baseadas em polipeptí-deos são bem-conhecidas na técnica. Polipeptídeos podem ser incluídos nacomposição na forma de sais e/ou ésteres.

Um Veículo farmaceuticamente aceitável' inclui qualquer veículoque por si próprio não induz a produção de anticorpos danosos para o indi-víduo recebendo a composição. Apropriados veículos são tipicamente ma-cromoléculas lentamente metabolizadas, grandes, tais como proteínas, po-lissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméri-cos, copolímeros de aminoácidos, sacarose, trealose, lactose, e agregadosde lipídeos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas). Tais veículos sãobem-conhecidos por aqueles versados na técnica.

A composição farmacêutica pode ser administrada por meiosconhecidos na técnica. Estes podem incluir, mas não são limitados a, aplica-ção tópica e rotas intravenosas, aerossóis, subcutâneas e intramusculares.

A composição farmacêutica pode ser dada como uma dose simples ou emmútliplas doses.

A infecção microbial pode ser com uma espécie microbial sim-ples, ou com vários micróbios. Ela pode ser uma combinação de infecçõesatravés de quaisquer de duas ou mais bactérias, vírus, ou fungos. Quando ainfecção bacteriana resulta de bactérias, ela pode ser uma bactéria Gram-positiva e/ou uma bactéria Gram-negativa. Típicas bactérias Gram-negativasenvolvidas em severas infecções incluem Escherichia coli, Bacteroides fragi-lis, Pseudomonas aeruginosa, espécies Klebsiella, e espécies Proteus. Típi-cas bactérias Gram-positivas envolvidas em severas infecções incluem S-treptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epider-midis, espécies Enterócoccus, Streptococcus agalactiae e Streptococcuspyogenes. Várias infecções com fungos podem envolver Candida albicans,candida glabrata, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Cryptococcusneoformans e espécies Fusarium. Infecções virais podem ser associadascom vírus de imunodeficiência humana (HIV), herpes simplex, vírus papilo-ma humano, vírus de hepatite, reovírus, adenovírus, gripe e vírus de leuce-mia de céIuIa-T humana. Infecções de protozoários parasitas podem ser as-sociadas com Trypanosoma cruzi, e Leishmania, Giárdia, Entamoeba e es-pécies Plasmodium.

Infecções microbiais incluem, por exemplo, pneumonia, infec-ções de ouvido, diarréia, infecções de trato urinário, distúrbios de pele, infec-ções de fungos invasivas disseminadas assim como de mucosa e tópicas.

Composições da invenção podem incluir um adicional antimicro-bial, particularmente se embalado em um formato de dose múltipla.

A invenção também provê o uso dos compostos e polipeptídeosda invenção na fabricação de um medicamento para tratamento de um paci-ente em risco de desenvolvimento ou diagnosticado como tendo uma infec-ção microbial.

Pacientes preferidos para tratamento são seres humanos, inclu-indo crianças (por exemplo, uma começando a andar ou infante), adolescen-tes e adultos.

Geral

O termo "compreendendo" abrange "incluindo" assim como"consistindo", por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode con-sistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X+Y.

O termo "cerca" em relação a um valor numérico χ significa, porexemplo, χ ± 10%. Onde necessário, o termo "cerca" pode ser omitido.

A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", porexemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode sercompletamente livre de Y. Onde necessário, a palavra "substancialmente"pode ser omitida da definição da invenção.

A porcentagem de identidade de seqüência pode ser determina-da usando o algoritmo de busca de homologia de Smith-Waterman usandouma busca de folga afim com uma penalidade de abertura de folga de 12 euma penalidade de extensão de folga de 2, matriz BLOSUMde 62. O algo-ritmo de busca de homologia de Smith-Waterman é ensinado na ref. 36.

Como indicado no texto acima, ácidos nucléicos e polipeptídeosda invenção podem incluir seqüências que:

(a) são idênticas (isto é, 100% idênticas) às seqüências mostra-das na listagem de seqüências;

(b) compartilham identidade de seqüência com as seqüênciasmostradas na listagem de seqüências;

(c) têm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 alterações (supressões, in-serções, substituições) de aminoácidos ou nucleotídeos simples, que podemestar em localizações separadas ou podem ser contíguas, como compara-das às seqüências de (a) ou (b); e

(d) quando alinhadas com uma particular seqüência da listagemde seqüências usando um algoritmo de alinhamento em pares, uma janelamóvel de χ monômeros (aminoácidos ou nucleotídeos) movendo a partir doinício (terminus-N ou 5') para extremidade (terminus-C ou 3'), de modo quepara um alinhamento que se estende para ρ monômeros (onde p>x) existemp-x+1 tais janelas, cada janela tem pelo menos x.y monômeros alinhadosidênticos, onde: χ é selecionado de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, y é selecionado de 0,50,0,60, 0,70, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98,0,99; e se x.y não é um inteiro então ele é arredondado para o inteiro maispróximo. O algoritmo de alinhamento de pares preferido é o algoritmo dealinhamento global de Needleman-Wunsch [37], usando parâmetros default(por exemplo, com penalidade de abertura de folga = 10,0, e com penalidadede extensão de folga = 0,5, usando a matriz de escore EBLOSUM62). Estealgoritmo é convenientemente implementado na ferramenta needle no paco-te EMBOSS [38].

Os ácidos nucléicos e polipeptídeos da invenção adicionalmenteainda podem ter seqüências para o terminus-N/5' e/ou terminus-C/3' destasseqüências (a) a (d).

Os termos "microbial" e "microorganismo" abrangem todos osmicróbios incluindo bactérias, vírus e fungos.

O termo "animal" refere-se a um membro do reino animal inclu-indo seres humanos. Compostos da invenção são úteis em animais que têmum sistema complementar.

A prática da presente invenção empregará, a menos que de ou-tro modo indicado, processos convencionais de química, bioquímica, biologiamolecular, imunologia e farmacologia, dentro do conhecimento da técnica.Tais técnicas são inteiramente explicadas na literatura, por exemplo, videreferências 39-46, etc.

O sistema complementar é uma cascata bioquímica do sistemaimune que auxilia limpeza de patógenos microbiais de um organismo atravésde interrupção de membrana de plasma de células alvos ou através de au-mentada opsonização. O caminho complementar clássico é disparado atra-vés de ativação do complexo C1 (composto por C1q, C1r e C1s). Ativaçãopode envolver mudanças conformacionais na molécula C1q, que conduzemà ativação de moléculas C1r serina protease e subseqüente clivagem deC1s. O resultante complexo C1 pode ligar C2 e C4, produzindo C2b e C4bpor clivagem. O caminho complemento alternativo é disparado por hidrólisede C3 diretamente sobre a superfície de um patógeno. O caminho comple-mentar Iectina é homólogo ao caminho clássico, mas com a opsonina, Iecti-na de ligação de mannan (MBL) e ficolinas, ao invés de C1q. O produto finalcitolítico de complemento é o complexo de ataque de membrana (MAC),consistindo em C5b, C6, Cl, C8, e C9. O MAC forma um canal transmem-brana, que causa Iise osmótica da célula alvo. Compostos da invenção po-dem interagir com complemento, ou um seu componente como C1q.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra atividade assassina bacterial de TFPI digeridoproteoliticamente em sangue integral. TFPI foi proteolizado com plasmina,trombina (1 A), elastase (1B) ou catepsina G (1C). TFPI proteolizado comcatepsina G mostrou a mais alta atividade antibacteriana em comparação acatepsina G sozinha ou TFPI integral.

A Figura 2 mostra que aumentando o tempo de incubação deproteólise resulta em aumentada atividade antibacteriana. 2A mostra umafigura SDS-PAGE da digestão proteolítica sobre tempo enquanto 2B mostrao aumento em atividade antibacteriana das digestões. 2C demonstra que amorte não é devida a catepsina G.

A Figura 3 mostra os principais fragmentos proteolíticos geradospor digestão. TFPI foi digerido com catepsina G e frações de filtração em gelcoletadas.

A Figura 4 demonstra a atividade antibacteriana das frações defiltração em gel seguindo a proteólise de TFPI.

A Figura 5 mostra as frações de filtração em gel quando a filtra-ção em gel é realizada na presença de NaCI a 1 M.

A Figura 6 mostra as frações de filtração de gel com NaCI a 1 M(6A) após precipitação de sais, e demonstra a recuperação de atividade an-tibacteriana a partir da coluna (6B). 6C mostra a atividade antibacteriana dosfragmentos de TFPI purificados mostrados em 6A.A Figura 7 mostra os peptídeos selecionados para seqüencia-mento de terminal-N e análises de espectrometria de massa a partir de ban-das nas frações de filtração de gel com atividade antibacteriana.

A Figura 8 mostra que a atividade antibacteriana é dependentede complemento ativo. 8A e 8B demonstram que atividade assassina é dimi-nuída com inativação térmica de plasma (A) ou soro (B). 8C demonstra quea atividade assassina também pode ser diminuída através de tratamentocom fator de veneno de cobra. 8D demonstra que a atividade assassina depeptídeo em soro é similar àquela em sangue integral.

A Figura 9 demonstra que o caminho complementar clássico éessencial para a atividade antibacteriana dos peptídeos TFPI.

A Figura 10 mostra a ligação de peptídeo marcado fluorescen-temente a bactérias, e demonstra que a ligação pode ser inibida pela pre-sença de heparina. As Figuras 10A-10D são 1000x, fluorescentes; Figuras10E-1OH são 1 OOOxi Iuz branca.

A Figura 11 mostra a importância da região terminal-C de TFPIpara a atividade antibacteriana de TFPI.

Exemplos

A presente invenção será agora ilustrada por referência aos se-guintes exemplos que mostram realizações particularmente vantajosas. En-tretanto, deve ser notado que estas realizações são ilustrativas e não sãopara serem construídas como restrições da invenção em qualquer maneira.

Nos exemplos que se seguem, todo TFPI exógeno é o análogode TFPI, ala-TFPI.

Exemplo 1. Efeitos antibacterianos de TFPI proteolizadoExperimento I

TFPI foi incubado com alfa-trombina, plasmina, elastase e ca-tepsina G em sangue 10% e testado para atividade assassina bacterianacontra E.coli 018:K1:H7 como se segue. TFPI recombinante em 5 μΜ (amenos que indicado de outro modo), foi tratado com plasmina (100 nM, faixa3) e alfa-trombina (100 nM, faixa 7; 1 μΜ, faixa 8) (A), elastase (100 nM, fai-xas 3 e 4) (B), e catepsina G (100 nM, faixa 4; 1 μΜ, faixas 5, 6, e 7) (C) emum volume total de 180 μL. A reação conteve TFPI diluído em RPMI semvermelho fenol, Hepes 25 mM, pH 7,5 (RPMI)1 3000 CFU de E. coli018:K1 :H7 em 40 μL de PBS1 e enzima diluída em 20 μL de RPMI. O volu-me foi ajustado com RPMI. As amostras foram pré-incubadas por 15-30 mi-nutos antes de adição de sangue fresco isento de anticoagulante para umvolume final de 200 μl. Controles foram sangue 10% em RPMI, TFPI em 1,2 e 5 μΜ, e as enzimas sozinhas nas respectivas concentrações. As amos-tras foram incubadas por 4 horas a 37°C com CO2 5% em uma incubadoraumedecida e diluições seriais revestidas sobre placas de ágar soja Triptase.

O número de colônias bacterianas foi determinado após incubação por todanoite a 37°C. Todas as condições experimentais são corridas em duplicatas.Os dados representam o número médio de colônias.

Experimento II

TFPI foi digerido proteoliticamente usando catepsina G e testadopara atividade assassina bacteriana contra E.coli 018:K1:H7 na presença desangue 10% como se segue. TFPI (1,2 mg) em 10 mg/mL em tampão deformulação (L-arginina 300 mM, metionina 5 mM, Na-citrato 20 mM, Ph 5,5)foi digerido com catepsina G (em NaCI 150 mM, acetato de Na 50 mM, pH6,5) em 10 μΜ e alíquotas de 1 μL e 18 μL foram tomadas sobre 5 dias. Asalíquotas de 1 μL foram analisadas por eletroforese de gel SDS-PAGE sobregéis de glicina 10-20%.

Como visto na Figura 2A, incubação de TFPI com catepsina Gpor 5 dias resultou em digestão parcial (M, padrão pré-manchado; S, iníciode digestão).

As alíquotas de 18 μl foram diluídas para 10 μΜ TFPI com 445μL de RMPI 1640 sem vermelho fenol, Hepes 25 mM, pH 7,5 (RPMI) e en-saiadas em uma concentração final de 5 μΜ em 200 μl de reações conten-do 3000 CFU E.coli em 40 μL de PBS, sangue não-coagulado 10%, e ajus-tado para o volume final com RPMI. Controles negativos foram sangue 10%em RPMI, TFPI em 5 μΜ e catepsina G em 400 nM. Sangue isento de anti-coagulante foi recentemente retirado e adicionado à reação como o últimocomponente. As amostras foram manipuladas como descrito acima.Como visto em Figuras 1 e 2, TFPI digerido interferiu com ocrescimento bacteriano, com um aumento de atividade com o tempo. Catep-sina G e TFPI não-digerido não exibem uma atividade similar. Assim, frag-mentação de TFPI resulta na liberação de uma nova atividade.

Experimento Ill

Para definir as regiões ativas dos fragmentos proteolíticos deTFPI, TFPI foi digerido em escala preparativa e submetido a filtração em gelem RPMI como se segue. TFPI (12 mg ou 23 mg) foi digerido com catepsinaG como antes por 2 dias e amostras paralelas fracionadas por filtração emgel sobre uma coluna Hiload Superdex 30 16/60 em RPMI1 ou alternativa-mente em RPMI com NaCI adicionado para uma concentração final de 1 M.Frações de 1 mL foram coletadas e analisadas por eletroforese de gel deSDS-PAGE sobre géis de tricina 16%.

As Figuras 3 e 5 mostram a separação obtida em RPMI comNaCI a 1 M, respectivamente. Como pode ser visto através de comparaçãode Figura 3 e Figura 5, uma separação aperfeiçoada de fragmento 1 de frag-mento 3 é obtida em NaCI a 1 M e fragmento 2 é eluído em um número defi-nido de frações em NaCI a 1 M, somente.

As frações foram testadas para atividade assassina bacterianacomo se segue: alíquotas de 100 μΙ_ das frações derivadas de filtração emgel em RPMI foram diretamente adicionadas a reações de 200 μΙ_ como a-cima e o efeito sobre o crescimento de colônias bacterianas foi ensaiado. Asfrações contendo NaCI a 1 M foram dessalinizadas em RPMI para cerca deNaCI 155 mMe um tamanho de fração de 600 μΙ_ usando Centrifugai Devi-ces com o corte de 1 KDa. Mostradas na Figura 6A são as frações derivadasde filtração em gel em NaCI a 1 M. Alíquotas de 25 μΙ_ ou 100 μΐ das fraçõesforam adicionadas a reações de 200 μΐ_ como acima para ensaiar para umefeito sobre sobrevivência bacteriana.

Como pode ser visto na Figura 4, após filtração em gel em RPMItodas as frações ensaiadas exercem somente menor atividade no ensaio demorte bacteriana. Em contraste, como mostrado na Figura 6B, várias dasfrações derivadas de filtração com gel em NaCI a 1 M exibem forte atividadeassassina bacteriana. A mais alta atividade é encontrada em frações 21 e22. Frações 27 e 28 mostraram fraca atividade quando adicionadas em umamaior concentração (volume de fração aumentado 4 vezes). Estes dadosdemonstram que TFPI digerido contem atividade antibacteriana.

Experimento IV

Fragmentos 1, 2 e 3 identificados na Figura 6A foram ainda puri-ficados. Resumidamente, colunas Mono-S foram usadas para troca de cá-tions com um gradiente de NaCI 0,5 M - 1 M em Hepes 50 mM, pH 7 parapurificar fragmentos 1 e 2. Uma coluna Mono-Q foi usada para troca de ani-ons com um gradiente de NaCI 50 mM - 1 M para purificação de fragmento3. Frações de 1 mL foram coletadas e analisadas por eletroforese de gel deSDS-PAGE, como antes. Fragmentos purificados foram então trocados comtampão em RPMI, como antes, e ensaiados para atividade assassina bacte-riana.

Como mostrado na Figura 8C, fragmentos purificados a partir doterminus-C de TFPI têm atividade assassina bacteriana. Concentraçõesdescendentes (diluições 1:2) de fragmento 1 (identificado como aa161/165-276; faixas 1, 2, 3) mostram decrescentes níveis de atividade. Fragmento 2(identificado como 183-268/276, faixa 4) em uma concentração similar afragmento 1 (faixa 2, determinada por eletroforese de gel de SDS-PAGEcomparativa) exerce similar atividade. Fragmento 3 (identificado como aa1-90) está sem atividade.

Exemplo 2. Seaüenciamento terminal-N de fragmentos proteolíticos de TFPI

Para identificar a identidade molecular dos fragmentos biologi-camente ativos, específicas bandas proteolíticas das frações de filtração emgel 21, 23 e 25 foram isoladas e submetidas a seqüenciamento terminal-Ncomo se segue. Alíquotas das frações foram separadas por eletroforese deSDS-PAGE sobre um gel tricina 16% e manchadas sobre uma membrana dePVDF em CAPS 10 mM, metanol 10%, pH 11. A membrana foi manchadapor 1 minuto com azul brilhante Coomassie G 0,025% em metanol 40%,mancha retirada por 30 minutos com várias mudanças de metanol 50%, e asbandas de interesse excisadas como indicado por caixas na Figura 7. Es-pectroscopia de massa também foi realizada sobre estas frações usandoLC-ESI-MS.

Os resultados da determinação de seqüência terminal-N de-monstram que as frações com atividade antibacteriana contêm fragmentosderivados da região terminal-C de TFPI. Resultados foram como se segue:as principais espécies identificadas por seqüenciamento de terminal-N emfração 21 começa com aminoácido 161 e 165, em fração 23 com aminoácido1, e em fração 25 com aminoácido 183. Estes resultados, e as espécies i-dentificadas por espectrometria de massa, são resumidas abaixo.

Tomados juntos os resultados indicaram que as principais espé-cies de proteína nas frações ativas são derivadas do domínio terminal-C deTFPI e incluem aminoácidos 161-269, aminoácidos 165-269, aminoácidos183-276 e aminoácidos 183-269. Um fragmento derivado do terminus-N deTFPI (aminoácidos 1-90) também foi encontrado nas mesmas frações mas éinativo.

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Exemplo 3: Importância de região terminal-C de TFPI

A habilidade de TFPI induzir secreção de IL-6 na presença deLPS foi testada usando TFPI e análogos de TFPI, incluindo: (i) TFPIm61,tendo justo resíduos 1-161 de TFPI; (ii) TFPI com mutante K1; (iii) TFPI commutante K2; (iv) TFPI com mutantes K1 e K2.

Quando o sangue integral retirado recentemente, diluído é incu-bado com LPS derivado da parede de célula de bactérias Gram-negativas,uma cascata de citocina é induzida dentro de poucas horas. Como mostradona Figura 11a, perda do domínio K2 ou de aminoácidos 162-276 (uma regiãoincluindo o domínio terminal C) resulta em perda da habilidade para induzirsecreção de IL-6, conduzindo à conclusão de que o domínio K2 e algumacoisa no terminal-C 1/3 de TFPI são essenciais para esta atividade.

A Figura 11b mostra resultados de um experimento similar. Ahabilidade de ala-TFPI para induzir IL-6 é imitada de perto por Des-K3-TFPI,que carece somente de domínio K3. Em contraste, truncação do terminus-Cpara deixar 161aas ou 252aa rende uma molécula com um perfil de induçãode IL-6 similar a proteína fluorescente verde, o controle negativo. Assim, ahabilidade para induzir IL-6 pode envolver aminoácidos a jusante de resíduo252, no terminus-C de TFPI.

Um peptídeo consistindo nos 22 aminoácidos terminais-C deTFPI (isto é, SEQ ID NO: 3) foi testado em um ensaio de IL-6 na presençade LPS. Como mostrado na Figura 11c, inclusão do peptídeo reverteu com-pletamente o efeito de LPS sobre produção de citocina, em uma maneiradependente de dose de LPS e peptídeo. Assim, este peptídeo parece sercapaz de neutralizar a atividade de endotoxina de LPS.

A Figura 11 d mostra os resultados de incubação de 22-mer comE.coli 018ac:K1 :H7 (ATCC). Um inoculum de bactérias vivas foi adicionadoa sangue integral diluído no ensaio de indução de IL-6. O 22-mer reduziudependentemente de dose a sobrevivência bacteriana, indicado pela su-pressão do crescimento de colônias bacterianas. 300 nM de peptídeo matoutodas as bactérias.

Assim, o 22-mer pode neutralizar LPS, e também tem um efeitobactericida direto sobre bactérias vivas. Estas atividades podem ser parte daresposta imunoinata em defesa contra infecção por bactérias. Os ensaioselucidam um aspecto do mecanismo de ação da molécula de TFPI e indicaTFPI e seus análogos como uma molécula capaz de modular a progressãode infecção bacteriana através de neutralização de endotoxina e prevençãode interação com soro e receptores celulares. Esta atividade pode desem-penhar um papel importante em um estágio inicial de sepsia, ou após libera-ção de endotoxinas após tratamento com agentes antimicrobianos. Altosníveis em soro de LPS foram associados com resultado fatal em pacientescom choque séptico [47].

Exemplo 4. Efeitos antibacteranos de peptídeos terminal-C TFPI

Experimento I

Peptídeos foram desenhados para testarem para atividade as-sassina bacteriana no domínio terminal-C de TFPI. Atividade foi medida con-tra bactérias Gram negativas (Ecoli 018:K1:H7. ATCC 700973) na presençade sangue 10% como descrito acima. Controles foram RPMI com sangue10% e Tifacogin 100 mM. A atividade biológica foi determinada a partir daredução de colônias bacterianas, como acima

Os efeitos antibacterianos do 22-mer (SEQ ID NO: 3; 'peptídeonúmero 1') foram comparados a um peptídeo controle misturado (SEQ IDNO:8; peptídeo número 2') e a um fragmento de TFPI tendo um terminus-Ndesviado 13 aminoácidos ainda à montante a um terminus-C desviado 8 a-minoácidos à montante (isto é, SEQ ID NO: 7; 'peptídeo número 3'). Peptí-deo número 3 inclui o sítio de clivagem de trombina que está localizado àmontante de SEQ ID NO: 3 em TFPI natural. A sobreposição de 14-mer depeptídeos número 1 e número 3 é SEQ ID NO:5. Peptídeo número 5 (SEQID NO: 10) inclui os aminoácidos de peptídeo número 3 e adicionalmente oterminus-C de 8 aminoácidos de peptídeo número 1. As seqüências e seuscorrespondentes números de peptídeos são mostrados abaixo:

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Os três peptídeos número 1, número 2, & número 3 foram diluí-dos em H2O para 10 vezes sua concentração de ensaio final e incubadoscom bactérias por 4 horas, nas concentrações de 3 μΜ, 300 nM, 100 nM e 10 nM. E. coli foi usada em 3000 CFU/200 μΐ_. Números de colônias sobrevi-ventes foram determinados como descrito no Exemplo 1. Como mostrado naTabela 1, peptídeos número 1, número 3 foram ambos ativos contra umalinhagem 018ac:K1:H7 de E. coli. Peptídeo número 3 mostrou melhor ativi-dade que peptídeo número 1, rendendo uma morte total de bactérias quandoincubado em 3000 nM com sangue, sugerindo que clivagem no sítio de cli-vagem de trombina é inativante. TFPI de inteiro comprimento não tem ativi-dade contra bactérias Gram negativas nestes ensaios nas concentraçõestestadas. A Tabela 2 mostra atividade biológica de peptídeo número 3 e pep-tídeo número 5 após diluição serial para 300 nM, 100 nM e 10 nM. A ativida-de de peptídeo número 5 é similar, mas levemente reduzida, comparada apeptídeo número 3.

Tabela 1

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Tabela 2

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Experimento II

Peptídeo número 3 foi testado para atividade em 3 uM sobre a-dicionais linhagens de E.coli usando soro humano normal como um controle.Como mostrado na Tabela 3, E. coli 02a, 2b:K5(L):H4 (ATCC 23500) e07:K1 (L):NM (ATCC 23503) foram afetadas por peptídeo número 3, em umamaneira similar a E.coli 018:K1 :H7.Tabela 3

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Ν.D.= não-detectável

Experimento Ill

Peptídeos número 1, número 3 e número 4 foram testados parasua atividade sem sangue sobre E.coli018.K1.H7. Os peptídeos foram en-saiados em 3 μΜ. Os mesmos controles TFPI e sangue foram incluídos co-mo no Experimento I.

Tabela 4

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N.D.= não-detectável

Na ausência de sangue, os peptídeos mostraram pequena ativi-dade antibacteriana em E. coli 018:K1:H7. Como mostrado na Tabela 4, oimpacto dos peptídeos sobre sobrevivência de E.coli foi similar àquele demeio de crescimento sozinho, mesmo em 3000 nM. Em contraste, um co-nhecido peptídeo antibacteriano LL37 (peptídeo número 4; SEQ ID NO:9)mostrou inteira inibição de bactérias nesta concentração. Assim, os peptí-deos derivados de TFPI podem atuar em cooperação com um fator ligado nosangue para obter seu efeito antibacteriano.Experimento IV

Os efeitos antibacteriarWs de peptídeo número 1 (SEQ ID NO:3),peptídeo número 2 (SEQ ID NO:8), peptídeo número 3 (SEQ ID NO: 7) epeptídeo número 4 (SEQ ID NO: 9), foram ainda avaliados no seguinte en-saio.

Dependência de Tempo: Peptídeos foram incubados com 3000CFU de E. coli 018:K1:H7 nas concentrações finais indicadas na presençade sangue 10% em três reações de 200 μΙ_ paralelas como descrito acima.RPMI com sangue 10% foi usado como controle negativo. Após incubaçãopor 1, 3, ou 5 horas, amostras foram ensaiadas para o efeito sobre sobrevi-vência bacteriana através de revestimento de diluições seriais sobre placasde ágar. A Tabela 5 demonstra uma dependência de tempo da depuraçãobacteriana de modo que nenhuma depuração foi vista em 1 hora emboradepuração fosse demonstrada por peptídeos número 1, número 3, e número4 após 3 e 5 horas. O efeito de peptídeos sobre sobrevivência bacterianaaumenta com o a extensão de tempo estudada. Novamente, peptídeo núme-ro 3 mostrou atividade maior que peptídeo número 1, em ambas, 3 e 5 horasde incubação.

Tabela 5

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N.D.= não-detectável

Os efeitos antibacterianos de peptídeo número 1 (SEQ ID NO:3), peptídeo número 2 (SEQ ID NO: 8), peptídeo número 3 (SEQ ID NO: 7) epeptídeo número 4 (SEQ ID NO: 9), foram ainda avaliados nos seguintesensaios.Capacidade: A Tabela 6 demonstra a capacidade de depuraçãobacteriana através de titulação bacteriana. Nestes experimentos, concentra-ções variáveis de E.coli018:K1:H7 (3x103, 3x104 ou 3x105 CFU/200 μ!_) fo-ram desafiados com peptídeo número 3 3 μΜ ou 100 nM em RPMI/sangue10%, e incubadas por 3 ou 5 horas antes de diluição e revestimento. Em re-sumo, as bactérias foram diluídas para a CFU indicada em 40 μΙ_ de PBS1 asreações montadas em um volume final de 200 μ!_ como acima, e incubadasa 37°C. Diluições seriais das reações foram revestidas e o número de colô-nias determinado após incubação por toda noite. Em 3 horas peptídeo nú-mero 3 exibiu um efeito em todas CFU usadas. Em 5 horas nenhum efeitosobre a cultura de alta CFU foi discernível, indicando uma titulação da ativi-dade assassina e a cultura de alta CFU excedendo a capacidade.

Tabela 6

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N.D. = não-detectável

Exemplo 5. Atividade assassina bacteriana é dependente de complementoativo

Experimento I

Os peptídeos terminal-C TFPI têm atividade biológica contrabactérias Gram negativas (E. coli 017:K1:H7)quando em combinação com afração celular de sangue (plasma ou soro) como mostrado na Figura 8A. AsFiguras 8A, 8B e 8C mostram que a atividade pode ser eliminada através detratamento térmico do plasma ou soro a 56°C por 30 minutos e através detratamento com fator de veneno de cobra (CVF). CVF foi mostrado esgotarsoro de complemento mediado por atividade lítica através de esgotamentode todos os componentes de complemento terminal [48]. Na Figura 8C, osresultados são mostrados para experimentos nos quais soro foi tratado com10 U ou 1 U de CVF como se segue: Uma solução estoque de CVF em 100U/mL e 10 U/mL foi preparada por diluição em PBS. Soro foi tratado emtemperatura ambiente por 30 minutos em uma razão 10:1 com estoque CVF.

Para reações controles, RPMI foi tratado com 10 U/mL de CVF, e soro foiincubado na ausência de CVF em temperatura ambiente, em paralelo. Ossoros tratados foram usados em 10% do volume de reação total como antes.A reação com soro não-tratado foi suplementada com RPMI tratado comCVF 10%. Controles indicam que peptídeo número 3 é ativo em soro não-tratado ou em soro que foi incubado por 30 minutos em temperatura ambien-te sem CVF. Atividade de peptídeo número 3 foi perdida em soro que foi tra-tado com 10 U/mL de CVF, e assim esgotado de atividade lítica mediada porcomplemento. Em 1 U/mL de CVF, a atividade assassina em combinaçãocom peptídeo número 3 é ainda preservada, sugerindo que a baixa concen-tração não é suficiente para esgotar atividade complemento.

E.coli 018:K1 :H7 possui uma cápsula K1 de ácido polissiálicoque é pensada conferir resistência a morte mediada por complemento [49].Os dados indicam que peptídeos catiônicos derivados do terminus-C de TF-Pl podem ser capazes de modificar a resistência.

Experimento Il

Para avaliar se a atividade assassina bacteriana em soro é re-presentativa daquela em sangue, peptídeos número 1, número 2, número 3,e número 5 foram diluídos serialmente para 3 uM, 300 nM, e 30 nM. Comocontroles soro e soro com TFPI 300 nM foram incluídos. Como mostrado naFigura 8D, peptídeo número 3 em conjunção com soro tem o efeito mais for-te, seguido por peptídeo número 5, e então por peptídeo número 1 com ati-vidade grandemente reduzida. Peptídeo número 2 é inativo. As atividades depeptídeos em soro estão na mesma magnitude como aquelas previamenteobservadas em sangue (vide, exemplo 4, Experimento I, Tabela 2).

Experimento Ill

Para avaliar se rTFPI digerido por catepsina G atua em combi-nação com componentes de soro, rTFPI digerido em uma concentração finalde 5 μΜ foi incluído em ensaios assassinos bacterianos com sangue em 20μL ou soro em 40 μL. Peptídeo número 3 foi usado em amostras em parale-lo. Faixas controles indicam amostras de sangue ou soro sem adição depeptídeo ou rTFPI digerido. Como mostrado na Tabela 7, TFPI digerido comprotease atua junto com componentes de soro, similar ao peptídeo terminal-CTFPI.

Tabela 7

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Exemplo 6. Identificação de fatores de complemento envolvidos em ativida-de assassina bacteriana

Experimento I

Para identificar o específico alvo de sinergia com peptídeo nú-mero 3, experimentos assassinos bacterianos foram realizados usando soroesgotado ou deficiente para fatores de complemento simples. Soros huma-nos esgotados de C3, C1q-, C2-, C6-, e C9, soro de porquinho-da-índia defi-ciente de C4 (derivado de animais geneticamente deficientes) e soro huma-no normal foram adquiridos. Experimentos foram realizados como acima. AsFiguras 9A-D mostram os resultados dos experimentos onde soro esgotadopara fatores de complemento C1q, C3, C6, C2, C9, ou deficiente para C4foram testados separadamente. Estes experimentos revelaram que remoçãoou falta dos fatores de complemento acima resultou em perda de atividadeassassina bacteriana de peptídeo número 3. Notavelmente, soros mais es-gotados tiveram alguma atividade assassina residual, enquanto o soro defi-ciente de C4 foi completamente destituído de atividade assassina bacteria-na, sugerindo que remoção incompleta do fator de complemento pode ser acausa de atividade residual. Além disso, quando complexo de proteína C1purificada ou fator C4 é adicionado de volta às respectivas reações em apro-ximadamente concentrações fisiológicas atividade assassina é restaurada(Figuras 9C e D). Com uma concentração de soro assumida de 117 μg/mLpara C1q, e 310 μg/mL para C4, as reações foram suplementadas com 2,34μς de complexo C1, e 6 ug de fator C4, respectivamente. Fator C1q é o ini-ciador do caminho complementar clássico [50]. Fatores C6(C6b, após cliva-gem enzimática de C6 em C6a e C6b) e C9 são componentes estruturais docomplexo de ataque de membrana, que forma o poro lítico responsável pormorte independente de fagócito através de complemento. Assim, parece quepeptídeo número 3 interage de alguma maneira com o caminho complemen-tar clássico, e que a morte complemento associada com peptídeo número 3é dependente da formação do complexo de ataque de membrana.

Experimento Il

Ativação de complexo C1 é dependente de ligação dependentede Ca2+ de C1r e C1s, enquanto a Iectina e caminho alternativo são inde-pendentes de Ca2+, e todos os caminhos complementos são dependentes deMg2+. Para ainda suportar a identificação do caminho complemento clássicocomo o mediador para a atividade assassina bacteriana observada, um ex-perimento de quelação foi realizado em EGTA 10 mM, suplementado comMgCI2 5 mM. Como mostrado na Tabela 8, peptídeo número 3 não tem ativi-dade assassina bacteriana em soro contendo EGTA 10 mM e MgCI2 5 mM,enquanto a reação controle em soro pleno foi ativa.

Tabela 8

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N.D.=não detectável

Exemplo 7. Identificação do sítio de liaacão de peptídeo

Experimento I

Dois sítios de ligação de heparina estão localizados no terminus-C de TFPI e interações de heparina foram notadas em estudos clínicos [51].

Assim, experimentos foram desenhados para avaliação de interação de he-parina com a atividade assassina bacteriana. Peptídeos número 1 e número3 foram usados em 3 uM em experimentos como descrito acima, com e semheparina ou heparina de baixo peso molecular em 3 U/mL e 0,3 U/mL. Aindacontroles foram sangue tratado sob as mesmas condições em reações para-lelas. Heparina não-fracionada em 0,3 U/mL resultou em perda parcial deatividade assassina bacteriana de ambos peptídeos (dados não mostrados),e 3 U/mL eliminou esta atividade (vide Tabela 9). Os dados na Tabela 9 indi-cam que a presença de heparina de baixo peso molecular em 0,3 U/mL in-terfere fortemente e em 3 U/mL elimina a atividade assassina. Isto sugereque interações do sítio de ligação de heparina no terminus-C de TFPI sãorequeridos para a atividade biológica dos peptídeos.

Tabela 9

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N.D.= não detectável

Experimento Il

Interações do terminus-C de TFPI com LPS foram descritas [52].Para mostrar interação direta de peptídeo número 3 com a superfície de cé-lula bacteriana, peptídeo marcado com fluorescente foi incubado com umestoque de bactérias em crescimento com e sem heparina em crescentesconcentrações. Detalhes do experimento são como se seguem: um estoquecongelado de E.coli018:K1:H7 (1x109 CFU/mL) foi diluído 1:5 em meio decrescimento LB e incubado por 40 minutos a 37°C. Alíquotas de 0,7 mL(3x108 CFU) foram lavadas duas vezes com Tris 10 mM (pH 7,5) e ressus-pensas em 100 uL de Tris 10 mM (pH 7,5) com soro termoinativado 10%.Heparaina não-fracionada foi adicionada em uma concentração de 1 vezespara resultar em 30, 3 e 0,3 U/mL, ou foi omitida e as amostras incubadaspor 30 minutos em temperatura ambiente. Peptídeo número 3 marcado comcorante Hilyte Flúor 555 foi adicionado em uma concentração de 100 vezes(1 uL) para resultar em 300 nM e incubado no escuro por 5 minutos. As a-mostras foram lavadas duas vezes com Tris 10 mM (pH 7,5), ressuspensasem 200 uL de paraformaldeído 4% e incubadas por 15 minutos no escuro.

Após lavagem em Tris 10 mM (pH 7,5), as amostras foram ressuspensas em100-300 uL, e 10 uL carregados sobre uma cobertura de vidro e secados aar. A cobertura de vidro foi montada sobre uma lâmina com meios de mon-tagem. Análises microscópicas foram realizadas usando um microscópiofluorescente invertido Zeiss Axiovert 200 com uma câmera AxioCam.

Como mostrado na figura 10, bactérias incubadas com peptídeonúmero 3 marcado com fluorescente sem heparina mostraram ligação (A).

Em 0,3 U/mL de heparina o sinal fluorescente é reduzido (B), e em 30 e 3U/mL de heparina elimina ligação (C e D). As Figuras 10 E a 10 H mostramas correspondentes imagens Nomarski.

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<110> NOVARTIS AG

<120> Agentes antimicrobiais que interagem como sistema complementar<130> PP028246.0001

<140> PCT/US2006/.<141> 2006-07-24

<150> USSN 60/702,049<151> 2005-07-22

<150> USSN 60/722,512<151> 2005-09-29

<160> 18

<170> SeqWin99, versão 1.02

<210> 1<211> 276<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1 T τ

Aso Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu1 ' 5 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Pne Thr

35 40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn65 70 75 80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105

Tvr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

I30 135 140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly145 150 155 160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys

165 170 175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro180 185 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

195 200 205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

210 215 220

Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys225 230 235 240

Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys

245 250 255

Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe

260 265 270

Val Lys Asn Met<210> 2 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr GluAla Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp 1 5 10 15 Leu Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp 20 25 30 Asp Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe 35 40 45 Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln50 55 60 Thr Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Arg Asp65 70 75 80Asn Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp 85 90 95 ThrPhe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile 100 105 110 Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr 115 120 125 Glu Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Le u Glu Cys130 135 140 Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr145 150 155 Gln 160Gly Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Ser Thr 165 170 175 ThrLys Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu 180 185 190 Pro Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr 195 200 205 GlyAsn Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys 210 215 220 Ala Gly Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Cys225 230 235 240Lys Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Beu Ile Lys Thr 245 250 255 IleLys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu 260 265 270 Phe Val Lys Asn Met

275

<210> 3<211> 22<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 3

Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Xle Ala Tyr

15 10

Ile Phe Val Lys Asn Met20

<210> 4<211> 23<212> PRT

<213> Homo sapiens

Glu Glu15Lvs Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu

1 5 1° 15

Glu Ile Phe Val Lys Asn Met20

<210> 5<211> 14<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5 „ n

Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ij.e Ala Tyr1 5 10

<210> 6<211> 187<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6 -n

Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile

1 5 10 15

Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln

20 25 30

Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe

35 40 45

Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn lie Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly

50 55 60

Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser65 70 75 80

Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly

85 90 95

Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn

100 105 11°

Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe

115 120 125

Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln

130 135 140

Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys145 150 155 160

Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys

165 170 175

Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met180 185

<210> 7

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys1 5

Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys20

Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg

10 15

Ile Ala Tyr25

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiensAsn Phe Gln Arg Lys Glu Lys Arg Glu Val He Tyr Lys Val Lys Thr1 5 -0 15

Lys Ile Lys Ala Met Arg20

<210> 9

<211> 37

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15

Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val20 25 30

Pro Arg Thr Glu Ser35

<210> 10

<211> 35

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10 -UT^

Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg1 5 10 15 ■

Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val20 25 30

Lys Asn Met35

<210> 11<211> 11<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 11

Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys1 5 10

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Resultado de seqüenciamento terminal-N<400> 12

Gly Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser15 10 15

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Resultado de seqüenciamento terminal-NAsn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln1 5 10<210> 14<211> 15<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <223> Resultado de seqüenciamento terminal-N<400> 14

15

10

15

<210><211><212><213>

<220><223>

1515PRT

Seqüência artificial

Resultado de seqüenciamento terminal-N

<400> 15

Gly Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Xaa Xaa Xaa Xaa

10

15

<210><211><212><213>

<220><223>

1615PRT

Seqüência artificial

Resultado de seqüenciamento terminal-N

<400> 16

Asn Xaa Val Asn Xaa Xaa Leu Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

10

15

<210> 17<211> 15<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <223> Resultado de seqüenciamento terminal-N<400> 17Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Xaa Leu Thr1 5 10<210> 18<211> 15<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <223> Resultado de seqüenciamento terminal-N<400> 18Ala Asp Ser Glu Glu Asp Glu Xaa Xaa Xaa1 5 10

15

15

Claims (15)

1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que consiste dos a-minoácidos 90-276 da SEQ ID NO: 1, ou um fragmento dos mesmos com-preendendo pelo menos 14 aminoácidos consecutivos e compreendendo osaminoácidos 161-269, 161-276, 165-269, 165-276, 183-269 ou 183-276 daSEQ ID NO: 2, ou os aminoácidos 255-276, 255-268, 242-268 ou 242-276da SEQ ID NO: 1.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o referido polipeptídeo consiste de uma seqüência de ami-noácido selecionada do grupo que consiste nos aminoácidos 161-269, 161--276, 165-269, 165-276, 183-269 e 183-276 da SEQ ID NO: 2 e os aminoáci-dos 255-276, 255-268, 242-268, 242-276 e 90-276 da SEQ ID NO: 1.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o referido polipeptídeo consiste de uma seqüência de ami-noácido mostrada na SEQ ID NO: 3, 5, 6, 7 ou 10.

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que é selecionado do grupo que consiste nos aminoácidos 255--276, 255-268, 242-268 e 242-276 da SEQ ID NO: 1.

5. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo é um fragmentode TFPI humano.

6. Composição farmacêutica para uso no tratamento de uma in-fecção bacteriana em um animal, caracterizada pelo fato de que compreen-de o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5,em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.

7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que a referida infecção bacteriana é uma infecçãobacteriana Gram-negativa.

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que a referida infecção bacteriana Gram-negativaé uma infecção bacteriana por E. coli.

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a referida infecção bacteriana resulta em sepsia.

10. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que a referida composiçãofarmacêutica está isenta de heparina.

11. Uso do polipeptídeo, como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para a preparação deum medicamento para tratar uma infecção bacteriana em um mamífero.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelofato de que a referida infecção bacteriana é uma infecção bacteriana Gram-negativa.

13. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelofato de que a referida infecção bacteriana Gram-negativa é uma infecçãobacteriana por E. coli.

14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelofato de que a referida infecção bacteriana resulta em sepsia.

15. Uso do polipeptídeo, como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para a preparação deum medicamento para matar bactéria em um animal tendo um sistema com-plementar.