CN101228186A

CN101228186A - 作为抗微生物剂的tfpi片段

Info

Publication number: CN101228186A
Application number: CNA200680027169XA
Authority: CN
Inventors: S·席尔姆; S·哈迪
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2006-07-24
Publication date: 2008-07-23

Abstract

通过治疗感染的新方法而发挥作用的抗微生物治疗剂是可以包含具有天然氨基酸或非天然氨基酸的肽或小分子的化合物。该治疗剂可以与微生物的表面结合并能够吸引补体，以便通过组装膜攻击复合物引起微生物裂解，因而启动通过吞噬作用而清除微生物。该治疗剂可以是TFPI的片段，例如来自羧基末端区域的片段。

Description

作为抗微生物剂的TFPI片段

本公开内引用的全部专利、专利申请、在线信息和参考文献在此完整地引用作为参考。

发明背景

微生物感染可以由类型广泛的微生物如细菌、真菌和病毒引起，产生温和疾病至需要立即干预的致命疾病。常见细菌性感染包括肺炎、耳感染、腹泻、尿道感染和皮肤病。常见的病毒性感染包括流感病毒A和B、呼吸道合胞体病毒、丙型肝炎和禽痘，而常见的真菌性感染包括皮肤病。本领域内持续需要对治疗微生物感染的有效方法和/或改善治疗这些感染的现存方法。

发明描述

本申请描述通过新方法起到治疗感染作用的抗微生物治疗剂。治疗剂是可以包含具有天然氨基酸或非天然氨基酸的肽或者小分子的化合物。该治疗剂有效地对抗细胞外微生物如细菌、真菌或病毒感染的细胞。微生物可以是原核的、真核的或单细胞的生物。治疗剂可以通过与微生物表面结合并与补体系统的成分相互作用而起效以杀死微生物。在一个实施方案中，治疗剂协同地与补体系统的成分相互作用以杀死微生物。在另一个实施方案中，治疗剂与微生物表面结合并能够吸引补体以调理微生物。在又一个实施方案中，治疗剂与微生物表面结合并能够吸引补体以通过膜攻击复合物(MAC)装配而引起微生物裂解。这触发通过吞噬作用而除去微生物。

因此，本发明提供用于治疗具有补体系统的动物内的微生物感染的化合物，其中该化合物与微生物表面结合并与动物内存在的补体系统的成分(如C1q成分)相互作用以杀死微生物。

化合物可以调理和/或引起微生物裂解。

化合物可以协同性地与动物内存在的补体系统成分如C1q作用。因此，该化合物在补体系统成分存在下的抗微生物效应可能比补体系统成分不存在下的抗微生物效应大。优选地，化合物的抗微生物效应比单独的肽或单独的补体系统成分的集合效应大。

具体的目的化合物衍生自组织因子途径抑制剂(TFPI)，如下文进行更详细描述。其它化合物可以通过筛选方法，例如通过比较化合物在补体成分缺乏和存在下的抗微生物效应进行鉴定。

TFPI和TFPI类似物

TFPI是认为具有抗炎活性的有力的抗凝血剂[1]。TFPI可以用来抑制与例如肿瘤有关的血管发生[2]。

该蛋白质具有数个主要结构域：三个丝氨酸蛋白酶抑制物Kunitz型结构域(K1、K2和K3)、一个氨基末端结构域(NTD)和一个羧基末端结构域(CTD)。K1结构域抑制凝血因子VIIa-组织因子(TF)复合体。K2结构域抑制因子Xa。迄今，无丝氨酸蛋白酶与K3结合，但最近实验提示K3具有将TFP结合到细胞表面上的GPI锚定受体的功能[3]。CTD还参与细胞连接、肝素结合和Xa最佳抑制。

如本文中所用，“TFPI”指具有SEQ ID NO：1内所示的276个氨基酸残基序列及非糖基化的38,000道尔顿分子量的成熟血清糖蛋白。这种天然蛋白质在糖基化存在时具有45,400道尔顿分子量[4]。TFPI cDNA的克隆在参考文献5内描述。本发明中所用的TFPI可以是非糖基化的或糖基化的。

“TFPI类似物”是如此的TFPI衍生物，其中所述衍生物受到一个或多个(例如从1至80个)氨基酸添加或置换(通常性质上是保守的并且优选地在非Kunitz结构域内或在该蛋白质的羧基末端部分内)、一个或多个(例如从1至80个)氨基酸缺失(例如TFPI片段)或对一个或多个氨基酸添加一个或多个化学部分的修饰，只要这种修饰没有破坏TFPI的生物学活性即可。未受破坏的活性可以包括TFPI的抗凝血活性和/或其抗菌活性及其在凝血酶原鉴定法内的活性。

优选地，TFPI类似物包含全部三个Kunitz结构域。TFPI和TFPI类似物可以是糖基化的或是非糖基化的。

为维持抗菌活性，优选TFPI类似物应当保留它的CTD，因为该区域是抗菌活性所在区域。一般地，优选保留TFPI内最下游凝血酶切割位点的下游的基本上全部氨基酸(例如SEQ ID NO：1的氨基酸254的下游，其中凝血酶在残基254与255之间作切割)。在组合物内，至少50％(例如≥60％、≥70％、≥80％、≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％、≥99％或更多)的TFPI类似物分子应当未在TFPI的氨基酸254和255之间的凝血酶切割位点上被切割。

优选的TFPI类似物是N-L-丙氨酰-TFPI(ala-TFPI)，它的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2内。Ala-TFPI还已知具有国际药物名称“tifacogin”。将ala-TFPI的氨基末端丙氨酸残基设计到TFPI序列内以改善大肠杆菌(E.coli.)表达[6]。表达并分泌了带信号肽的内源性TFPI。氨基末端的甲硫氨酸是信号肽的部分而不是成熟TFPI的部分。TFPI的类似物在参考文献7中描述。TFPI类似物具有如通过生物活性鉴定法所确定的TFPI的某些活性(例如见如下文所述的参考文献8和9)。

TFPI具有三个凝血酶切割位点：(i)在K1和K2之间的Lys-86与Thr-87之间；(ii)在Arg-107与Gly-108之间(在K2内的对因子Xa的活性位点)和(iii)在羧基末端碱性区域内的Lys-254与Thr-255之间。发明人已经发现TFPI的抗菌活性在CTD内并且尤其在SEQ ID NO：1内的Lys-254与Thr-255之间的凝血酶切割位点附近的区域和/或其下游区域内。因为缺少CTD的已切割TFPI在血液鉴定法内具有很少活性，故本发明提供其中已经例如通过位点定向诱变除去这种凝血酶切割位点的TFPI类似物。这些类似物的CTD不能被凝血酶切割，产生可以比天然TFPI保留更长时间抗菌活性的分子。

因此，本发明提供：(1)TFPI类似物，其中该类似物缺少在天然TFPI的羧基末端附近存在的凝血酶切割位点；(2)TFPI类似物，其中该类似物缺少在天然TFPI的氨基酸Lys-254与Thr-255之间存在的凝血酶切割位点；(3)TFPI类似物，其中该类似物包含(i)至少一个Kunitz结构域和(ii)羧基末端区，但是其中该类似物在其最靠近羧基末端的Kunitz结构域与羧基末端区之间没有凝血酶切割位点；(4)TFPI类似物，其中该类似物不能被凝血酶切割以产生包括Kunitz结构域的氨基末端多肽和不包括Kunitz结构域的羧基末端多肽；(5)TFPI类似物，其中该类似物含有少于2个的(即一个或无)Lys-Thr二肽。

可以通过多种方式去除天然切割位点(Lys-Thr)。例如赖氨酸和/或苏氨酸可以用不同氨基酸置换以产生不受凝血酶识别的二肽。作为备选，可以缺失赖氨酸和/或苏氨酸。作为又一个备选，可以在赖氨酸和苏氨酸之间插入一个或多个氨基酸。在已经进行修饰后，TFPI类似物可以在试验消化内与凝血酶温育以证实不再发生天然羧基末端切割。

本发明还提供：(1)TFPI类似物，其中该类似物包括Kunitz结构域3，但是缺少羧基末端结构域；(2)TFPI类似物，其中该类似物是已经从距羧基末端至多q(q是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)个氨基酸截短的TFPI。TFPI羧基末端的截短先前已经得到报道，但是这通常已经组合有K3的缺失。

多肽

TFPI具有三个凝血酶切割位点：(i)在Lys-86与Thr-87之间；(ii)在Arg-107与Gly-108之间和(iii)在Lys-254与Thr-255之间。发明人已经发现TFPI的抗菌活性在CTD内并且尤其在SEQ ID NO：1内Lys-254与Thr-255之间的凝血酶切割位点附近的区域和/或其下游区域内。在该位点的切割释放了已证实具有抗菌活性并可以与细菌LPS结合的22个氨基酸的肽(SEQ ID NO：3)。因此，本发明提供以TFPI的CTD为基础的肽，其用作抗菌剂、用于治疗细菌性感染的方法内并用于制造用来治疗此类感染的药物。本发明还提供以TFPI的CTD为基础的肽，其用作抗微生物剂、用于治疗抗微生物感染的方法中并用于制造用来治疗此类感染的药物。这些肽特别在血液存在下是活性的。

因此，本发明提供：(1)由氨基酸序列SEQ ID NO：3组成的多肽(肽#1)；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的多肽，前提是该多肽不是TFPI或TFPI类似物；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的多肽，前提是与SEQ ID NO：3的氨基末端相连的氨基酸(如果存在一个氨基酸的话)不是Lys；(4)包含与SEQ ID NO：3具有至少50％(例如≥60％、≥70％、≥80％、≥85％、≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％或更多)同一性的氨基酸序列的多肽；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的多肽，前提是在所述SEQ ID NO：3内的至少一个氨基酸是D-氨基酸；(6)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的至少3个(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个)连续氨基酸的片段的多肽，前提是所述多肽不是TFPI；(7)包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的从羧基末端始至少3个(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75个或更多个)氨基酸的多肽，前提是所述多肽不是TFPI或TFPI类似物。

抗微生物活性还已经在衍生自CTD的但不包括TFPI羧基最末端残基的肽内观察到。因此，本发明提供包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的至少3个(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个)连续氨基酸的片段的多肽。多肽本身可以是或可以不是TFPI(例如SEQ ID NO：1)的片段或TFPI类似物。

本发明还提供包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：6的至少3个(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个)连续氨基酸的片段的多肽。多肽本身可以是或可以不是TFPI(例如SEQID NO：1)的片段。SEQ ID NO：6的优选片段还是SEQ ID NO：5的片段。

本发明还提供包含SEQ ID NO：1的片段的多肽，前提是(a)该片段包括氨基酸序列SEQ ID NO：5的至少3个(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个)连续氨基酸，和(b)该多肽不是TFPI或TFPI类似物。

本发明还提供：(1)由氨基酸序列SEQ ID NO：7组成多肽(肽#3)；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的多肽，前提是该多肽不是TFPI或TFPI类似物；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的多肽，前提是与SEQ ID NO：7的氨基末端相连的氨基酸(如果存在一个氨基酸的话)不是Lys；(4)包含与SEQ ID NO：7具有至少50％(例如≥60％、≥70％、≥80％、≥85％、≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％或更多)同一性的氨基酸序列的多肽；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的多肽，前提是在SEQ ID NO：7内的至少一个氨基酸是D-氨基酸；(6)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：7内至少3个(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个)连续氨基酸的片段的多肽，前提是所述多肽不是TFPI或TFPI类似物。

本发明还提供：(1)由氨基酸序列SEQ ID NO：5组成的多肽；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：5的多肽，前提是该多肽不是TFPI或TFPI类似物；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO：5的多肽，前提是与SEQ ID NO：5的氨基末端相连的氨基酸(如果存在一个氨基酸的话)不是Lys；(4)包含与SEQ ID NO：5具有至少50％(例如≥60％、≥70％、≥80％、≥85％、≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％或更多)同一性的氨基酸序列的多肽；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO：5的多肽，前提是SEQ ID NO：5内的至少一个氨基酸是D-氨基酸；(6)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的至少3个(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个)连续氨基酸的片段的多肽，前提是所述多肽不是TFPI或TFPI类似物。

本发明还提供：(1)由氨基酸序列SEQ ID NO：10组成多肽(肽#5)；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽，前提是该多肽不是TFPI或TFPI类似物；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽，前提是与SEQ IDNO：10氨基末端相连的氨基酸(如果存在一个氨基酸的话)不是Lys；(4)包含与SEQ ID NO：10具有至少50％(例如≥60％、≥70％、≥80％、≥85％、≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％或更多)同一性的氨基酸序列的多肽；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的多肽，前提是在SEQ ID NO：10内的至少一个氨基酸是D-氨基酸；(6)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：10内至少3个(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个)连续氨基酸的片段的多肽，前提是所述多肽不是TFPI或TFPI类似物。

这些多肽可以优选地与LPS和/或与细菌结合。这些多肽还可以与病原性真菌的细胞壁内存在的甘露糖蛋白结合。多肽还可以与病毒粒子表面内存在的蛋白质结合。

多肽优选地由不多于250个氨基酸(例如不多于225、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6个或甚至5个氨基酸)组成。优选由5-90个之间的氨基酸(例如由5-80、5-70、5-60等个之间的氨基酸组成)组成的多肽。特别优选由8-25个之间的氨基酸组成的多肽。

多肽优选地由至少3个氨基酸(例如至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45个或至少50个氨基酸)组成。

本发明提供具有式NH₂-A-B-C-COOH的多肽，其中：A是由a个氨基酸组成的多肽序列；C是由c个氨基酸组成的多肽序列；B是具有来自氨基酸序列SEQ ID NO：3内至少b个连续氨基酸的片段，其中b是3或更大的数字(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21)。

本发明提供具有式NH₂-A-B-C-COOH的多肽，其中：A是由a个氨基酸组成的多肽序列；C是由c个氨基酸组成的多肽序列；B是具有来自氨基酸序列SEQ ID NO：5内至少b个连续氨基酸的片段，其中b是3或更大的数字(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14)。

本发明提供具有式NH₂-A-B-C-COOH的多肽，其中：A是由a个氨基酸组成的多肽序列；C是由c个氨基酸组成的多肽序列；B是具有来自氨基酸序列SEQ ID NO：7内至少b个连续氨基酸的片段，其中b是3或更大的数字(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14)。

本发明提供具有式NH₂-A-B-C-COOH的多肽，其中：A是由a个氨基酸组成的多肽序列；C是由c个氨基酸组成的多肽序列；B是具有来自氨基酸序列SEQ ID NO：10内至少b个连续氨基酸的片段，其中b是3或更大的数字(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14)。

a的值通常是至少1(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500等)。c的值通常是至少1(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500等)。a+c的值是至少1(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500等)。优选a+c的值是至多1000(例如至多900、800、700、600、500、450、400、350、300、250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2)。

-A-的氨基酸序列一般与作为SEQ ID NO：2内序列-B-的氨基末端的a个氨基酸共享少于m％的序列同一性。-C-的氨基酸序列一般与作为本发明抗体的SEQ ID NO：2可变区内(例如SEQ ID NO：2内)序列-B-的羧基基末端的c个氨基酸共享少于n％的序列同一性。通常，m和n的值均是60或更小(例如50、40、30、20、10或更小)。m和n的值可以彼此相同或彼此不同。

在本发明的一些实施方案中，多肽不由SEQ ID NO：4组成，其中所述的SEQ ID NO：4由Hembrough等(参考文献10)公开为有抗肿瘤活性和抗血管发生活性，但没有抗菌活性。

本发明的多肽可以包含与SEQ ID NO：3、5、6、7和10具有序列同一性的氨基酸序列。这些多肽包括同系物、直向同源物、等位基因变体和突变体。多肽之间的同一性优选地通过如在MPSRCH程序(OxfordMolecular)内执行的Smith-Waterman同源性搜索算法，使用带空位开口罚分＝12和空位延伸罚分＝1参数的affine空位搜索法确定。

与SEQ ID NO 3、5、6、7和10相比，这些多肽可以包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6个等)保守性氨基酸置换(即一个氨基酸用另一个具有相关侧链的氨基酸替换)。遗传编码的氨基酸通常分成4个家族：(1)酸性家族，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)酸性家族，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性家族，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和(4)不带电荷的极性家族，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时候划分在一起作为芳香族氨基酸。通常，在这些家族内单个氨基酸的置换对生物学活性没有重大影响。此外，多肽可以相对于参考序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6等)单氨基酸缺失。另外，多肽可以相对于参考序列包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6等)插入(例如每个插入有1、2或3个氨基酸)。

本发明的多肽可以用多种方式例如通过(完全或部分)化学合成、通过使用蛋白酶消化TFPI、通过从RNA中翻译、通过从细胞培养(例如从重组表达)中纯化等进行制备。用于产生长度小于40个氨基酸的肽的优选方法包括体外(in vitiro)化学合成法[11，12]。特别优选固相肽合成法，如基于tBoc或Fmoc化学的方法[13]。还可以部分或完全地使用酶合成法[14]。作为对化学合成法的替代，可以使用生物合成法，例如可以通过翻译产生多肽。这可以在体外或体内(in vivo)实施。生物方法通常限于基于L-氨基酸的多肽产生，但是可以利用对翻译装置(例如氨基酰tRNA分子)的操作以允许导入D-氨基酸(或导入其它非天然氨基酸，如碘酪氨酸或甲基苯丙氨酸、叠氮高丙氨酸等)[15]。然而，在包括D-氨基酸时，优选使用化学合成法。本发明的多肽可以在羧基末端和/或氨基末端具有共价性修饰。

本发明的多肽可以采取多种形式(例如天然的、融合、糖基化、非糖基化、脂化、非脂化、磷酸化、非磷酸化、豆蔻酰化、非豆蔻酰化、单体的、多体的、微粒化(particulate)、变性的等)。

本发明的多肽优选地以纯化或基本上纯化即基本上无其它多肽(例如没有天然存在的多肽)的形式提供，并且通常具有至少约50％纯度(以重量计)及通常至少约90％纯度，即少于约50％并且更优选少于约10％(例如5％或更少)的成分由所表达的其它多肽组成。

本发明的多肽可以与固相支持物连接。本发明的多肽可以包含可检测的标记(例如放射性或荧光性标记或生物素标记)。

术语“多肽”指任意长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线形的、分支的或环状的，它可以包含修饰的氨基酸并且它可以由非氨基酸打断。该术语还包括已经天然地或通过介入(例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化)或任何其它操作或修饰作用(如与标记成分缀合)而加以修饰的氨基酸聚合物；本定义内还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本技术领域已知的其它修饰的多肽。多肽可以作为单链或结合的链存在。

本发明提供包含一个或多个序列-X-Y-或-Y-X-或-X-X-的多肽，其中：-X-是如上定义的氨基酸序列并且-Y-不是如上定义的氨基酸序列，即本发明提供融合蛋白。例如，本发明提供-X₁-Y₁-X₂-Y₂-或X₁-X₂-Y₁或-X₁-X₂-等。在本发明的一个实施方案中，Y是如SEQ ID No 14或15内所示的氨基末端前导序列。在又一个实施方案中，Y是如SEQ ID No 16或17内所示的羧基末端T-辅助序列。

本发明提供用于产生本发明多肽的方法，包括在诱导多肽表达条件下培养本发明的宿主主细胞的步骤。

本发明提供用于产生本发明多肽的方法，其中该多肽部分地或完全地使用化学方法合成。

羧基末端多肽与TFPI的组合

TFPI具有抗凝血效应并且它还破坏极为有害的内毒素信号作用。此外，如本文中所述，TFPI具有由其羧基末端结构域介导的抗微生物效应，例如抗菌效应。为增强TFPI和TFPI类似物的抗菌效应，TFPI(或TFPI类似物)可以与如上所定义的来自TFPI羧基末端的多肽一起施用。备选地或额外地，为增强如上所定义的来自TFPI羧基末端的多肽的抗微生物效应，它们可以与TFPI和/或TFPI类似物一起施用。

因此本发明提供：(1)包含TFPI或TFPI类似物以及本发明的抗微生物性多肽的药物组合物；(2)用于同时分别地或依次施用的TFPI或TFPI类似物以及本发明的抗微生物性多肽；(3)用于治疗患者的方法，包括同时分别地或依次施用TFPI或TFPI类似物以及本发明的抗微生物性多肽；(4)用于治疗患者的方法，包括施用TFPI或TFPI类似物至已经接受本发明的抗微生物性多肽的患者内；(4)用于治疗患者的方法，包括施用本发明的抗微生物性多肽至已经接受TFPI或TFPI类似物的患者内。抗微生物药优选地是抗菌剂。

因此本发明提供：(1)包含本发明的抗微生物性多肽以及TFPI或TFPI类似物的药物组合物；(2)用于同时分别地或依次施用的本发明的抗微生物性化合物以及TFPI或TFPI类似物；(3)用于治疗患者的方法，包括同时分别地或依次施用本发明的抗微生物性化合物以及TFPI或TFPI类似物；(4)用于治疗患者的方法，包括施用TFPI或TFPI类似物至已经接受本发明的抗微生物性化合物的患者内；(4)用于治疗患者的方法，包括施用本发明的抗微生物性化合物至已经接受TFPI或TFPI类似物的患者内。

在这些组合中使用的TFPI类似物可以包括或备选地可以缺少羧基末端衍生性的抗微生物性多肽或抗菌多肽。因此如上所述的，TFPI可以缺少至多到q个羧基末端氨基酸。

药物设计和拟肽

本发明的多肽本身是有用的抗微生物药。然而，它们可以进行改进以改善(一般的或特异的)抗微生物活性或改善重要的药理学性质，如生物利用率、毒理学、代谢、药物代谢动力学等。多肽因此可以用作用于进一步研究和改进的前导化合物。

本发明的多肽可以用于设计拟肽分子[16-21]。拟肽技术已经成功地用来设计凝血酶抑制物[22，23]。这些凝血酶抑制物一般与本发明多肽是同构的，但是缺少本发明多肽的一个或多个肽键。例如，肽主链可以是由非肽主链替换而同时保留重要的氨基酸侧链。拟肽分子可以包含糖氨基酸[24]。可以使用类肽。

为辅助拟肽分子的设计，可以对肽定义药效团(即表述导致活性的具体特征的化学性质及3D约束的总称)。药效团优选地包括表面可获得性，更优选地包括氢键供体及受体、带电荷/可离子化基团和/或疏水区域。这些可以根据它们在赋予活性中的相对重要性进行加权。

药效团可以使用软件如CATALYST(包括HypoGen或HipHop)、CERIUS²确定，或手工从本发明多肽的已知构象中构建。使用程序如CATALYST，可以使用药效团来筛选结构文库。还可以使用CLIX程序，该程序搜索结构库内候选分子的取向，其中所述的取向产生与受体相互作用的化学基团的最大空间一致性。

结合性表面或药效团可以是用来定位对官能团(例如质子、羟基、胺基、疏水基)或小分子片段有利的相互作用位置。随后可以从头设计其中相关官能团与本发明多肽处于基本上相同的空间关系的化合物。

官能团可以使用具有合适大小及几何形状的桥接片段或能够在有利方向上支持官能团的框架连接于单个化合物中，因此提供本发明的拟肽化合物。在可以以如此方式手工完成官能团连接的同时，借助软件如QUANTA或SYBYL，可能还可以获得自动化或半自动化的从头设计方法：

-MCSS/HOOK[26，27]，其将多个官能团与取自数据库的分子模板连接。

-LUDI[28]，其计算理想地由配体填充的相互作用点，将片段基于它们与受体相互作用的能力在结合位点内安放，以及随后连接所述片段以产生配体。

-MCDLNG[29]，其填充具有类属原子的紧密压缩阵列的受体结合位点并使用Monte Carlo方法以便随机变动原子类型、位置、键合排列和其它特性。

-GROW[30]，其以(手工或自动化安放的)初始‘种子’片段开始并向外生长配体。

-SPROUT[31]，该套软件包括如下模块：鉴定结合袋内有利的成氢键区域和疏水区域(HIPPO模块)；选择官能团并将它们在靶位点上安置以便形成用于产生结构的起始片段(EleFAnT)；通过将间隔片段生长到起始片段上并随后连接所得到的部分主链，产生满足结合袋的空间约束条件的主链(SPIDeR)；置换主链内的杂原子以产生具有与受体位点静电特性互补的静电特性的分子(MARABOU)。解决方案可以使用ALLigaTOR模块加以集成并计分。

-CAVEAT[32]，其设计连接单元以约束非环状分子。

-LEAPFROG[33]，其通过产生细微的逐步结构性变化并快速评估新化合物的结合能而评价配体。变化基于改变的结合能加以保留或抛弃，并且结构发生演化以增加与受体的相互作用能。

-GROUPBUILD[34]，其使用常见有机物模板文库和对配体与受体之间非键合相互作用的完整试验性力场描述(complete empirical force fielddescription)以构建具有化学合理的结构和具有与受体结合位点互补的空间及静电特性的配体。

-RASSE[35]

这些方法鉴定了相关化合物。这些化合物可以被从头设计，可以是已知化合物或基于已知化合物。化合物本身可以是有用的，或它们可以是能够用于进一步改进药物的原型(即前导化合物)，以便改善结合亲和力或其它重要的药理学性质(例如生物利用率、毒理学、代谢、药物代谢动力学等)。

在单独作为有用化合物的同时，由基于结构的设计技术在计算机法(insilica)上鉴定的拟肽还可以用来提出用于“常规”体外或体内筛选方法的化合物文库。配体内重要的药物基序可以鉴定并在用于筛选抗微生物活性的化合物文库(例如组合文库)内模拟。

本发明提供：(i)使用这些药物设计方法所确定的化合物；(ii)使用这些药物设计方法所确定用作药物的化合物；(iii)使用这些药物设计方法所确定的化合物在制造抗微生物药如抗菌药中的用途；和(iv)治疗具有微生物感染如细菌性感染的患者的方法，包括施用有效量的使用这些药物设计方法所确定的化合物。

治疗方法和组合物

本发明提供组合物，包含：(a)本发明的化合物、多肽和/或拟肽和(b)可药用载体。本发明的组合物用于治疗具有发生微生物感染风险或诊断为具有微生物感染的患者或用于降低一位或一群患者中的感染发展成严重感染的风险。

成分(a)是组合物内的活性成分，并且该成分以治疗有效量即足够抑制患者内微生物生长和/或存活的量存在，并且优选地是足够消除微生物感染的量。对给定患者的精确有效量取决于他们的体格大小和健康、感染的性质和程度以及为施用所选择的组合物的组成或组合。有效量可以通过常规实验确定并处于临床医生的判断能力范围内。为本发明的目的，有效剂量通常将是从约0.01mg/kg至约5mg/kg，或约0.01mg/kg至约50mg/kg或约0.05mg/kg至约10mg/kg。基于多肽的药物组合物是本技术领域众所周知的。多肽可以以盐和/或酯形式包含在组合物内。

‘可药用载体’包括本身不诱导有害于接受组合物的个体的抗体产生的任何载体。合适的载体一般是巨大的、代谢缓慢的大分子如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂类聚集物(如油滴或脂质体)。本领域技术人员众所周知此类载体。

药物组合物可以通过本技术领域已知的方法施用。这可以包括，但不限于局部应用和静脉内、气雾、皮下和皮内途径。药物组合物可以作为单剂量或以多剂量给予。

微生物感染可以涉及单个微生物物种或涉及数种微生物。它可以是因任意两种或更多种细菌、病毒或真菌所致的感染组合。当微生物感染因细菌所致时，它可以涉及革兰氏阳性细菌和/或革兰氏阴性细菌。严重感染中所涉及的常见革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、克雷伯氏菌(Klebsiella species)、肠杆菌(Enterobacter species)和变形杆菌(Proteusspecies)。严重感染中所涉及的常见革兰氏阳性细菌包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、肠球菌(Enterococcus species)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。严重真菌性感染可以包括白假丝酵母(Candida albicans)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)和镰孢菌(Fusariumspecie)。病毒性感染可以是与人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、肝炎病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、流感病毒和人T细胞白血病病毒有关。寄生性原虫感染可以与克鲁兹锥虫(Trypanosoma cruzi)以及利什曼虫(Leishmania)、贾第虫(Giardia)、内变形虫(Entamoeba)和疟原虫(Plasmodium species)有关。

微生物感染包括例如肺炎、耳感染、腹泻、尿道感染、皮肤病、局部性和粘膜性及弥散侵入性真菌感染。

本发明的组合物可以包括另外的抗微生物药，尤其当以多重剂量形式进行包装时。

本发明还提供本发明的化合物和多肽在制造用于治疗患者的药物中的用途，其中所述患者具有发生微生物感染的风险或诊断为患有微生物感染。

用于治疗的优选患者是人，包括儿童(例如幼儿或婴儿)、少年和成人。

一般术语

术语“包含”包括“包括”以及“由......组成”例如“包含”X的组合物可以排他性地由X组成或可以包括另外的某物，例如X+Y。

与数字值x有关的术语“约”意指例如x±10％。根据需要，术语“约”可以省略。

词语“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上没有”Y的组合物可以完全没有Y。根据需要，词语“基本上”可以从本发明定义中省略。

序列同一性百分数可以利用Smith-Waterman同源性搜索算法，使用具有空位开口罚分＝12和空位延伸罚分＝1的affine空位搜索，BLOSUM矩阵线62加以确定。Smith-Waterman同源性搜索算法在参考文献36内教授。

如以上文本内所示，本发明的核酸和多肽可以包括这样的序列：

(a)其与序列表内所公开的序列完全相同(即100％相同)；

(b)其与序列表内所公开的序列具有序列同一性；

(c)其与(a)或(b)的序列相比时，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个单核苷酸或氨基酸改变(缺失、插入、置换)，其中所述的改变可以在分开的位置上或可以是连续的；和

(d)当使用配对比对算法与来自序列表的特定序列比对时，具有x个单体(氨基酸或核苷酸)的移动窗口从起始(氨基末端或5′)移动至结尾(羧基末端或3′)，以至于对于延伸至p个单体(其中p＞x)的比对，存在p-x+1个此类窗口，每个窗口具有至少x·y个相同的比对单体，其中：x选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、y选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99；并且若x·y不是整数，则将它四舍五入至多到最近的整数。优选的配对比对算法是Needleman-Wunsch全面比对算法[37]、使用默认参数(例如空位开口罚分＝10.0及空位延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62计分矩阵)。该算法方便地在EMBOSS软件包[38]的needle工具内执行。

本发明的核酸和多肽可以额外地具有在序列(a)至(d)的氨基末端/5′和/或羧基末端/3′的其它序列。

术语“微生物的”和“微生物”包括全部微生物，包括细菌、病毒和真菌。

术语“动物”指动物界的任何成员，包括人。本发明的化合物在具有补体系统的动物内有用。

除非另外说明，本发明的实施将采用处于本领域技术人员技能范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法。此类技术在文献内得到充分解释，例如见参考文献39-46等。

补体系统是免疫系统的生物化学级联，其通过破坏靶细胞的细胞膜或通过增加调理作用而从生物中辅助清除微生物病原体。补体经典途径由活化C1-复合体(由C1q、C1r和C1s组成)而触发。活化可能涉及C1q分子内的构象变化，这导致C1r丝氨酸蛋白酶分子活化和随后C1s切割。产生的C1-复合体可以与C2和C4结合，通过切割产生C2b和C4b。补体旁路途径由在病原体表面上的C3水解直接触发。补体的凝集素途径与经典途径同源，但是具有替代C1q的调理素、甘露糖结合性凝集素(MBL)和纤维胶凝蛋白。补体的细胞裂解终产物是由C5b、C6、C7、C8和C9组成的膜攻击复合物(MAC)。MAC形成引起靶细胞渗透性裂解的跨膜通道。本发明的化合物可以与补体或其成分如C1q相互作用。

附图简述

图1显示蛋白水解消化的TFPI在全血内的杀菌活性。TFPI用纤溶酶、凝血酶(1A)、弹性蛋白酶(1B)或组织蛋白酶G(1C)进行蛋白水解。与单独的组织蛋白酶G或完整的TFPI相比，用组织蛋白酶G作蛋白水解的TFPI显示最高的抗菌活性。

图2显示增加蛋白水解的温育时间导致增加的抗菌活性。2A显示蛋白水解消化物随时间的SDS-PAGE描述，而2B显示消化物的抗菌活性增加。2C显示杀伤不是因组织蛋白酶G所致。

图3显示通过消化所产生的主要蛋白水解片段。用组织蛋白酶G消化TFPI并收集凝胶过滤级分。

图4显示在TFPI的蛋白水解后的凝胶过滤级分的抗菌活性。

图5描述在1M NaCl存在下开展凝胶过滤时的凝胶过滤级分。

图6描述脱盐后的1M NaCl凝胶过滤级分(6A)并显示来自柱的抗菌活性的恢复(6B)。6C显示6A内所示的纯化TFPI片段的抗菌活性。

图7显示为来自具有抗菌活性的凝胶过滤级分内的条带的选择用于氨基末端测序和质谱分析的肽。

图8显示抗菌活性依赖活性补体。8A和8B显示杀伤活性在血浆(A)或血清(B)热灭活时下降。8C显示杀伤活性还可以通过眼镜蛇毒因子处理而减弱。8D显示肽在血清内的杀伤活性与在全血内相似。

图9显示经典补体途径对TFPI肽的抗菌活性是必需的。

图10描述荧光标记的肽对细菌的结合作用，并显示该结合作用可以因肝素存在受抑制。图10A-10D是1000x，荧光；图10E-10H是1000x，白色光。

图11显示TFPI的羧基末端区对TFPI抗菌活性的重要性。

实施例

本发明现在将参考如下描述特别有利的实施方案的实施例加以说明。然而，应当指出这些实施方案是说明性的，并且无论如何不被解释为限制本发明。

在后续实施例中，全部外源性TFPI是TFPI类似物，即ala-TFPI。

实施例1.经蛋白水解的TFPI的抗菌效应

实验I

TFPI在10％血液内与α-凝血酶、纤溶酶、弹性蛋白酶和组织蛋白酶G温育并如下测试对大肠杆菌O18:K1:H7的杀菌活性。5μM(除非另外说明)的重组TFPI用纤溶酶(100nM，道3)和α-凝血酶(100nM，道7；1μM，道8)(A)、弹性蛋白酶(100nM，道3和4)(B)和组织蛋白酶G(100nM，道4；1μM，道5，6和7)(C)在180μl总体积内处理。该反应含有在无酚红的、25mM Hepes、pH7.5的RPMI 1640(RPMI)内稀释的TFPI、在40μlPBS内的3000CFU大肠杆菌O18:K1:H7和在20μl RPMI内稀释的酶。体积用RPMI调整。将样品预温育15-30分钟，之后添加无抗凝血剂的新鲜血液至终体积200μl。对照是在RPMI内的10％血液、1μM、2μM和5μM的TFPI和各自浓度的单独的酶。样品在具有5％CO₂的加湿温箱内于37℃温育4小时并将连续稀释物涂布在胰胨豆胨琼脂平板上。细菌菌落数在37℃过夜温育后测定。全部实验条件一式两份。数据代表平均菌落数。

实验II

TFPI使用组织蛋白酶G进行蛋白水解性消化并如下文在10％血液存在下测试对大肠杆菌O18:K1:H7的杀菌活性。制剂缓冲液(300mM L-精氨酸、5mM甲硫氨酸、20mM柠檬酸钠，pH 5.5)内10mg/ml的TFPI(1.2mg)用(在150mM NaCl、50mM乙酸钠，pH 5.5内)10μM的组织蛋白酶G消化并且在5日后取出1μl和18μl等分试样。1μl等分试样通过SDS-PAGE凝胶电泳在10-20％甘氨酸凝胶上分析。

如图2A所示，TFPI与组织蛋白酶G经过5日的温育产生部分消化(M，预染标准物；S，消化开始)。

将18μl等分试样用445μl的无酚红的、25mM Hepes、pH 7.5的RPMI 1640(RPMI)稀释成10μM TFPI并在含有40μl PBS内的3000CFU大肠杆菌和非凝血液的200μl反应内以终浓度5μM进行分析，并用RPMI调节至终体积。阴性对照是RPMI内的10％血液、5μM TFPI和400nM组织蛋白酶G。新鲜采集无抗凝血剂的血液并作为最后成分添加至反应内。样品如上所述操作。

如图1和2所示，消化的TFPI干扰细菌生长，活性随时间增加。组织蛋白酶G和未消化的TFPI未显示相似的活性。因此，TFPI的片段化导致新活性的释放。

实验III

为了定义TFPI蛋白水解片段的活性区域，TFPI在制备级别上进行消化并接受如下在RPMI内的凝胶过滤处理。TFPI(12mg或23mg)如前用组织蛋白酶G消化2日并且对照样品通过凝胶过滤经过Hiload Superdex30 16/60柱在RPMI内或备选地在NaCl作为固体添加至终浓度1M的RPMI内进行分级分离，收集1ml的级分并通过SDS-PAGE凝胶电泳在16％三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶上分析。

图3和图5分别显示在RPMI和在具有1M NaCl的RPMI内实现的分离。如通过比较图3和图5可以见到，在1M NaCl内改善了片段1与片段3的分离并且片段2仅在1M NaCl内洗脱于确定数目的级分中。

如下对级分测试杀菌活性：将来自在RPMI内凝胶过滤的级分的100μl等分试样直接添加至如上所述的200μl反应内并且检定对细菌菌落生长晕的影响。使用具有界限值1000道尔顿的Centrifugal Devices对含有1MNaCl的级分在RPMI内脱盐至约155mM NaCl和级分体积600μl。来自在1M NaCl内凝胶过滤的级分在图6A内显示。将该级分的25μl或100μl等分试样添加至如上所述的200μl反应内并检定对细菌存活的影响。

如图4所示，在RPMI内凝胶过滤后，检定的全部级分仅在细菌杀伤鉴定法内表现细微活性。相反，如图6B内所示，来自在1M NaCl内凝胶过滤中的数个级分表现强烈杀菌活性。最高活性存在于级分21和22内。级分27和28当以较高浓度(级分体积增加4倍)添加时显示微弱活性。该数据显示消化的TFPI含有抗菌活性。

实验IV

在图6A内鉴定的片段1、2和3进一步纯化。简而言之，使用Mono-S柱以在50mM Hepes、pH 7内进行0.5M-1M NaCl梯度的阳离子交换以便纯化片段1和2。使用Mono-Q柱以进行50mM-1M NaCl梯度的阴离子交换，以便纯化片段3。收集1ml的级分并如前通过SDS-PAGE凝胶电泳加以分析。随后，将已纯化片段的缓冲液如前交换成RPMI并检定杀菌活性。

如图6C内所示，纯化的来自TFPI羧基末端的片段具有杀菌活性。减少片段1(鉴定为氨基酸161/165-276；道1、2、3)的浓度(1∶2稀释)显示减少的活性水平。浓度与片段1(道2，通过比较性SDS-PAGE凝胶电泳确定)相似的片段2(鉴定为183-269/276，道4)表现相似的活性。片段3(鉴定为氨基酸1-90)无活性。

实施例2.TFPI蛋白水酶片段的氨基末端测序

为鉴定生物活性片段的分子身份，分离来自凝胶过滤级分21、23和25的特定蛋白水解条带并进行如下的氨基末端测序。级分的等分试样通过SDS-PAGE电泳在16％三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶上分离并在10mMCAPS、10％甲醇(pH11)内印迹在PVDF膜上。该膜用40％甲醇内的0.025％考马斯亮蓝G染色1分钟，更换数次50％甲醇，脱色30分钟并且剪下如图7内的框内所示的目的条带。使用LC-ESI-MS对这些级分开展质谱分析。

氨基末端序列测定的结果显示具有抗菌活性的级分含有衍生自TFPI羧基末端区内的片段。结果如下：通过氨基末端测序在级分21内鉴定的主要种类以氨基酸161和165为起点，在级分23内以氨基酸1为起点并且在级分25内以氨基酸183为起点。这些结果以及通过质谱法鉴定的种类总结于如下。

综合这些结果表明在活性级分内的主要蛋白质种类衍生自TFPI的羧基末端结构域并包括氨基酸161-269、氨基酸165-269、氨基酸183-276及氨基酸183-269。还在相同级分中发现从TFPI氨基末端衍生的片段(氨基酸1-90)但它无活性。

实施例3：TFPI羧基末端区的重要性

使用TFPI和TFPI类似物测试TFPI在LPS存在下诱导IL-6分泌的能力，其中所述的TFPI类似物包括：(i)TFPI_1-161，仅具有TFPI的残基1-161；(ii)具有突变体K1的TFPI；(iii)具有突变体K2的TFPI；(iv)具有突变体K1和K2的TFPI。

当稀释时，新鲜抽取的全血与衍生自革兰氏阴性细菌细胞壁的LPS温育，细胞因子级联在数小时内受到诱导。如图11a内所示，K2结构域或氨基酸162-276(包括羧基末端结构域的区域)的丢失导致丧失诱导IL-6分泌的能力，因而得出结论：K2结构域和在TFPI羧基末端1/3内的某些氨基酸对这种活性是必需的。

图11b显示相似实验的结果。ala-TFPI诱导IL-6的能力由仅缺少K3结构域的Des-K3-TFPI模拟。相反，截短羧基末端以留下161个氨基酸或252个氨基酸则产生具有与阴性对照即绿色荧光蛋白相似的IL-6诱导谱的分子。因此诱导IL-6的能力可能涉及位于TFPI羧基末端的残基252下游的氨基酸。

由TFPI的22个羧基末端氨基酸组成的肽(即SEQ ID NO：3)在IL-6鉴定法内在LPS存在下被测试。如图11c内所示，包含该肽则以肽和LPS剂量依赖性方式完全逆转LPS对细胞因子产生的影响。因此，该肽似乎能够中和LPS的内毒素活性。

图11d显示22聚体与大肠杆菌O18ac:K1:H7(ATCC)温育的结果。在IL-6诱导鉴定法中，将活细菌的接种物添加至稀释的全血内。22聚体以剂量依赖方式降低细菌存活，如抑制细菌菌落的生长晕所示。300nM肽杀死全部细菌。

因此，该22聚体可以中和LPS并且还具有对活细菌的直接杀菌效应。这些活性可能是抗细菌感染的防御内的天然免疫应答的部分。该鉴定法说明TFPI分子作用机制的一个方面并显示TFPI及其类似物可作为能够通过中和内毒素并防止与血清及细胞受体的相互作用而调节细菌性感染进程的分子。这种活性可能在败血症早期或在抗微生物剂处理后的内毒素释放后发挥重要作用。LPS的高血清水平与败血性休克患者内的致命后果相关[47]。

实施例4.TFPI羧基末端肽的抗菌效应

实验I

设计肽以测试位于TFPI羧基末端结构域内的杀菌活性。活性如上所述在10％血液存在下对革兰氏阴性(大肠杆菌O18:K1:H7.ATCC 700973)细菌进行测量。对照是具有10％血液和100nM Tifacogin的RPMI。生物学活性如上文从细菌菌落的减少中得到测定。

22聚体(SEQ ID NO：3；‘肽#1’)的抗菌效应与混杂对照肽(SEQ ID NO：8；‘肽#2’)及与如此的TFPI片段进行比较，其中所述的片段具有进一步往上游移动13个氨基酸的氨基末端和往上游移动8个氨基酸的羧基末端(即SEQ ID NO：7；‘肽#3’)。肽#3包括天然TFPI内的位于SEQ ID NO：3上游的凝血酶切割位点。肽#1和#3的14聚体重叠是SEQ ID NO：5。肽#5(SEQ ID NO.10)包括肽#3的氨基酸并额外地包括肽#1的羧基末端8个氨基酸。下文显示序列及其相应的肽编号。

肽	序列	TFPI序列	SEQ ID NO
肽	序列	TFPI序列	SEQ ID NO	#1	TKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM	氨基酸255-276	3
#2	NFQRKEKREVIYKVKTKIKAMR	混杂的氨基酸255-276	8	#1	TKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM	氨基酸255-276	3
#2	NFQRKEKREVIYKVKTKIKAMR	混杂的氨基酸255-276	8	#3	GFIQRISKGGLIKTKRKRKKQRVKIAY	氨基酸242-268	7
#4	LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLR	LL-37，cap18	9	#3	GFIQRISKGGLIKTKRKRKKQRVKIAY	氨基酸242-268	7

	NLVPRTES
	NLVPRTES			#5	GFIQRISKGGLIKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM	氨基酸242-276	10

三种肽#1、#2和#3在H₂O中稀释至10倍最终检定浓度并在终浓度3μM、300nM、100nM和10nM与细菌温育4小时。使用3000CFU/200μl的大肠杆菌。如实施例1内所述测定存活的菌落数。如表1内显示，肽#1和#3均对O18ac:K1:H7大肠杆菌菌株有活性。肽#3比肽#1显示更好的活性，当在3000nM上与血液温育时产生完全的细菌杀伤，提示在凝血酶切割位点处的切割是失活性的。全长TFPI在这些鉴定法内在所测试的浓度上对革兰氏阴性细菌无活性。表2显示在连续稀释至300nM、100nM和10nM后的肽#3和肽#5的生物学活性。肽#5的活性与肽#3相比是相似的，但是略微降低。

表1

N.D.＝未检测到

表2

N.D.＝未检测到

实验II

使用正常人血清作为对照，在另外的大肠杆菌菌株上对3μM的肽#3测试活性。如表3内显示，大肠杆菌O2a，2b:K5(L):H4(ATCC 23500)和O7:K1(L):NM(ATCC 23503)以与大肠杆菌O18:K1:H7相似的方式受到肽#3影响。

表3

N.D.＝未检测到

实验III

对肽#1、#3和#4在无血液下在大肠杆菌O18:K1:H7上测试它们的活性。在3μM上检定肽。包括如实验1内那样的相同血液对照和TFPI对照。

表4

N.D.＝未检测到

在血液缺乏时，肽在大肠杆菌O18:K1:H7上显示很少的抗菌活性。

如表4内所示，肽对大肠杆菌存活的影响与单独的生长培养基对大肠杆菌存活的影响相似，甚至在3000nM上也是如此。相反，已知的抗菌肽LL37(肽#4；SEQ ID NO：9)在该浓度上显示完全地抑制细菌。因此TFPI衍生肽可以与血液内存在的因子发生协同作用以实现它们的抗菌效应。

实验IV

肽#1(SEQ ID NO：3)、肽#2(SEQ ID NO：8)、肽#3(SEQ ID NO：7)和肽#4(SEQ ID NO：9)的抗菌效应进一步在如下鉴定法内评定。

时间-依赖性：如上所述，肽在所示终浓度上在10％血液存在下，在三个平行的200μl反应内与3000CFU大肠杆菌O18:K1:H7温育。使用含10％血液的RPM作为阴性对照。在温育1、3或5小时后，样品对细菌存活的影响通过在琼脂平板上涂布连续稀释物分析。表5显示细菌清除率的时间依赖性，在1小时上未观察到清除，而在3小时和5小时后肽#1、#3和#4显示出清除。肽对细菌存活的影响随所研究的时间范围而增加。在3小时和5小时温育时，肽#3又比肽#1显示更高的活性。

表5

N.D.＝未检测到

肽#1(SEQ ID NO：3)、肽#2(SEQ ID NO：8)、肽#3(SEQ ID NO：7)和肽#4(SEQ ID NO：9)的抗菌效应进一步在如下鉴定法内分析。

能力：表6通过细菌滴定法显示细菌清除的能力。在这些实验中，可变浓度的大肠杆菌O18:K1:H7(3×10³、3×10⁴或3×10⁵ CFU/200μl)用在RPMI/10％血液内的3μM或100nM肽#3攻击，温育3小时或5小时后稀释并涂布。简而言之，细菌在40μl PBS内稀释成所示的CFU，反应在如上所述的200μl终体积内制备，并在37℃温育。涂布连续稀释的反应物并在过夜温育后测定菌落数。肽#3在3小时对所用的全部CFU显示有影响。在5小时上，在高CFU培养物上观察不到效应，显示杀伤活性的滴度并表明高CFU培养物超出细菌清除能力。

表6

N.D.＝未检测到

实施例5.杀菌活性依赖于活性的补体

实验I

如图8A内所示，当与血液的非细胞级分(血浆或血清)组合时，TFPI羧基末端肽具有抗革兰氏阴性细菌(大肠杆菌O17:K1:H7)的生物学活性。图8A、8B和8C描述该活性可以通过在56℃对血浆或血清热处理30分钟或通过用眼镜蛇毒因子(CVF)处理而消除。已经证实CVF通过耗尽所有的终末补体成分而破坏血清的补体介导性裂解活性[48]。在图8C中显示实验结果，其中血清用10U或1U CVF处理如下：通过在PBS内稀释而制备100U/ml和10U/ml的CVF贮存液。血清在室温与任一的CVF贮存液以10∶1处理30分钟。对于对照反应，平行地用10U/ml CVF处理RPMI，并且血清平行地在CVF不存在下进行室温温育。如前，处理的血清以反应总体积的10％使用。含未处理血清的反应用经10％CVF处理的RPMI补充。对照显示肽#3在未处理的血清内或已经在无CVF下室温温育30分钟的血清内有活性。肽#3的活性在用10U/ml CVF处理并因此破坏补体介导性裂解活性的血清内丧失。在1U/ml CVF上，与肽#3组合的杀伤活性仍得以保留，提示该低浓度不足以破坏补体活性。

大肠杆菌O18:K1:H7具有被认为提供抗补体介导性杀伤作用的聚唾液酸K1荚膜[49]。数据显示衍生自TFPI羧基末端的阳离子肽可能调节该抗性。

实验II

为了评价在血清内的杀菌活性是否代表血液内的杀菌活性，肽#1、#2、#3和#5连续稀释至3μM、300nM和30nM。作为对照，包括血清和具有300nM TFPI的血清。如图8D内所示，与血清组合的肽#3具有最强烈的效应，其次是肽#5，并且随后是活性大幅度降低的肽#1。肽#2无活性。血清内的肽活性与先前在血液内观察到的那些肽活性(见实施例4，实验I，表2)具有相同的强度等级。

实验III

为评价组织蛋白酶G消化的rTFPI是否与血清成分组合共同发挥作用，在具有20μl血液或40μl血清的细菌杀伤鉴定法内包含终浓度5μM的消化的rTFPI。肽#3用于平行样品内。对照泳道显示未添加肽或消化的rTFPI的血液或血清样品。如表7内显示，蛋白酶消化的TFPI与血清成分一起发挥作用，这与TFPI羧基末端肽相似。

表7

实施例6.鉴定参与杀菌活性的补体因子

实验I

为鉴定与肽#3协同作用的特定靶，使用单种补体因子耗尽或缺损的血清实施细菌杀伤实验。购买耗尽C3、C1q-、C2-、C6-和C9的人血清、C4缺陷的豚鼠血清(源于遗传缺陷动物)和正常人血清。实验如上所述实施。图9A-D描述来自如此实验的结果，其中耗尽补体因子C1q、C3、C6、C2、C9的血清或C4缺陷的血清分别测试。这些实验揭示以上补体因子的去除或缺少导致肽#3杀菌活性丧失。值得注意的是，大部分耗尽的血清具有一些残余的杀伤活性，而C4缺陷的血清则完全没有杀菌活性，这提示补体因子的不完全去除可能是残余活性的原因。此外，当以接近生理浓度将纯化的C1蛋白复合体或因子C4再添加至各自反应内时，杀伤活性得以恢复(图9C和D)。C1q的推定血清浓度是117μg/ml并且C4的推定血清浓度是310μg/ml，反应分别以2.34μg C1复合体和6μg因子C4进行补充。因子C1q是补体经典途径的起始物[50]。因子C6(C6b，在酶切割C6成为C6a和C6b后)和C9是膜攻击复合物的结构成分，其中所述的膜攻击复合物形成造成裂解孔，起负责通过补体的吞噬依赖性杀伤作用。因此，肽#3似乎以某种方式与补体经典途径相互作用并且肽#3相关性补体杀伤作用依赖膜攻击复合物的形成。

实验II

C1复合体的活化取决于C1r和C1s的Ca^2+-依赖性结合，而凝集素途径和旁路途径是非Ca²⁺依赖性的，并且全部补体途径是Mg²⁺依赖性的。为了进一步支持所确定的经典补体途径作为所观察到的杀菌活性的中介，在补充5mM MgCl₂的10mM EGTA内开展螯合实验。如表8内显示，肽#3在含有10mM EGTA和5mM MgCl₂的血清内没有杀菌活性，而在空白血清内的对照反应是有活性的。

表8

N.D.＝未检测到

实施例7.鉴定肽结合位点

实验I

两个肝素结合位点位于TFPI的羧基末端并且已经在临床研究中注意到肝素相互作用[51]。因此，设计实验以评价肝素与杀菌活性的相互作用。3μM的肽#1和#3用于含有或不含3U/ml及0.3U/ml的肝素或低分子量肝素的如上所述实验内。其它对照是在平行反应内在相同条件下处理的血液。在0.3U/ml上的未分级的肝素引起两种肽的杀菌活性部分丧失(数据未显示)并且3U/ml上的未分级的肝素消除这种活性(见表9)。表9内数据表明0.3U/mL低分子量肝素的存在强烈干扰杀伤活性并且3U/mL低分子量肝素的存在消除杀伤活性。这表明在TFPI羧基末端处的肝素结合位点的相互作用对肽的生物学活性是需要的。

表9

N.D.＝未检测到

实验II

TFPI羧基末端与LPS的相互作用已经得到描述[52]。为显示肽#3与细菌细胞表面的直接相互作用，增加浓度的荧光标记的肽与具有和不具有肝素的生长细菌贮藏液温育。实验细节如下：冰冻的大肠杆菌O18:K1:H7(1×10⁹CFU/ml)贮存液1∶5稀释于LB生长培养基内并在37℃温育40分钟。0.7ml等分试样(3×10⁸CFU)用10mM Tris(pH 7.5)洗涤两次并重悬于具有10％热失活的血清的100μl 10mM Tris(pH 7.5)内。未分级的肝素以10倍浓度添加以产生30、3和0.3U/ml或不添加肝素，并且将样品在室温温育30分钟。Hilyte Fluor^TM 555Dye-标记的肽#3以100倍(1μl)浓度添加以产生300nM并在黑暗中温育5分钟。样品用10mM Tris(pH 7.5)洗涤两次，重悬于200μl的4％多聚甲醛内并在黑暗中温育15分钟。在10mM Tris(pH 7.5)内洗涤后，将样品重悬于100-300μl中并将10μl滴到盖玻片上并空气干燥。盖玻片在载玻片上用封片介质封片。显微镜分析使用具有AxioCam照相机的Zeiss Axiovert 200倒置荧光显微镜开展。

如图10内所示，与荧光标记的肽#3在无肝素下温育的细菌显示结合作用(A)。在0.3U/ml肝素上，荧光信号减少(B)，并且30U/ml和3U/ml的肝素消除结合作用(C和D)。图10E至10H显示相应的图像。

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序列表

<110>诺瓦提斯公司(NOVARTIS AG)

<120>与补体系统相互作用的抗微生物剂

<130>PP028246.0001

<140>PCT/US2006/028804

<141>2006-07-24

<150>USSN 60/702,049

<151>2005-07-22

<150>USSN 60/722,512

<151>2005-09-29

<160>18

<170>SeqWin99，版本1.02

<210>1

<211>276

<212>PRT

<213>人

<400>1

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35 40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys

165 170 175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro

180 185 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

195 200 205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

210 215 220

Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys

225 230 235 240

Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys

245 250 255

Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe

260 265 270

Val Lys Asn Met

275

<210>2

<211>277

<212>PRT

<213>人

<400>2

Ala Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu

1 5 10 15

Leu Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp

20 25 30

Asp Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe

35 40 45

Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln

50 55 60

Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp

65 70 75 80

Asn Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp

85 90 95

Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr

100 105 110

Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr

115 120 125

Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys

130 135 140

Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr

145 150 155 160

Gly Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr

165 170 175

Lys Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr

180 185 190

Pro Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr

195 200 205

Asn Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly

210 215 220

Gly Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys

225 230 235 240

Lys Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr

245 250 255

Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile

260 265 270

Phe Val Lys Asn Met

275

<210>3

<211>22

<212>PRT

<213>人

<400>3

Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu

1 5 10 15

Ile Phe Val Lys Asn Met

20

<210>4

<211>23

<212>PRT

<213>人

<400>4

Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu

1 5 10 15

Glu Ile Phe Val Lys Asn Met

20

<210>5

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>5

Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr

1 5 10

<210>6

<211>187

<212>PRT

<213>人

<400>6

Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile

1 5 10 15

Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln

20 25 30

Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe

35 40 45

Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly

50 55 60

Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser

65 70 75 80

Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly

85 90 95

Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn

100 105 110

Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe

115 120 125

Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln

130 135 140

Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys

145 150 155 160

Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys

165 170 175

Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met

180 185

<210>7

<211>27

<212>PRT

<213>人

<400>7

Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg

1 5 10 15

Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr

20 25

<210>8

<211>22

<212>PRT

<213>人

<400>8

Asn Phe Gln Arg Lys Glu Lys Arg Glu Val Ile Tyr Lys Val Lys Thr

1 5 10 15

Lys Ile Lys Ala Met Arg

20

<210>9

<211>37

<212>PRT

<213>人

<400>9

Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu

1 5 10 15

Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val

20 25 30

Pro Arg Thr Glu Ser

35

<210>10

<211>35

<212>PRT

<213>人

<400>10

Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg

1 5 10 15

Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val

20 25 30

Lys Asn Met

35

<210>11

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>11

Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys

1 5 10

<210>12

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>N-末端测序结果

<400>12

Gly Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser

1 5 10 15

<210>13

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>N-末端测序结果

<400>13

Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Xaa

1 5 10 15

<210>14

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>N-末端测序结果

<400>14

Ala Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr

1 5 10 15

<210>15

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>N-末端测序结果

<400>15

Gly Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

<210>16

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>N-末端测序结果

<400>16

Asn Xaa Val Asn Xaa Xaa Leu Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

<210>17

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>N-末端测序结果

<400>17

Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Xaa Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly

1 5 10 15

<210>18

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>N-末端测序结果

<400>18

Ala Asp Ser Glu Glu Asp Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Claims

1.一种用于治疗具有补体系统的动物内的微生物感染的化合物，其中化合物与微生物表面结合并与动物内存在的补体系统成分相互作用以杀死微生物。

2.如权利要求1内所述的化合物，其中化合物协同性地与补体系统的成分起作用。

3.如权利要求2内所述的化合物，其中化合物协同性地与动物内存在的补体系统的成分起作用以调理微生物。

4.如权利要求2内所述的化合物，其中化合物协同性地与动物内存在的补体系统的成分起作用以引起微生物裂解。

5.如任意前述权利要求内所述的化合物，其中微生物选自细菌、真菌和病毒中的任一种。

6.如权利要求5内所述的化合物，其中微生物是革兰氏阴性细菌。

7.如任意前述权利要求内所述的化合物，其中化合物协同性地与补体系统的C1q成分起作用。

8.如任意前述权利要求内所述的化合物，包含具有选自SEQ ID NO：3、5、7和10的氨基酸序列的肽，或与SEQ ID NO：3、5、7和10中的任一序列具有至少80％同一性的肽，前提是该多肽不是TFPI。

9.多肽，包含选自SEQ ID NO：3、5、7和10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3、5、7和10中的任一序列具有至少80％同一性的肽，前提是该多肽不是TFPI或TFPI类似物以及与SEQ ID NO：3、5、7和10的氨基末端相连的氨基酸不是Lys。

10.如权利要求9内所述的多肽，其可以与LPS和/或与细菌结合。

11.如权利要求9内所述的多肽，具有不多于50个氨基酸。

12.一种药物组合物，包含与可药用载体混合的如权利要求1-8任一项内所述的化合物或如权利要求9-11内所述的多肽。

13.如权利要求12内所述的药物组合物，还包含抗生素。

14.如任意前述权利要求内所述的药物组合物，还包含与可药用载体混合的TFPI或TFPI类似物。

15.药物组合物，包含TFPI或TFPI类似物和如权利要求9-11任一项内所述的多肽。

16.如权利要求1-8任一项内所述的化合物或如权利要求9-11任一项内所述的多肽用于药物内的用途。

17.有效量的如权利要求9-11内所述多肽在制造用于治疗哺乳动物受试者内微生物感染的药物中的用途。

18.权利要求17的用途，其中微生物感染是细菌性感染。

19.筛选细菌清除活性的方法，其中血液与权利要求9-11任一项的多肽及细菌性微生物一起培养。

20.一种TFPI类似物，其中类似物缺少存在于天然TFPI羧基末端附近的凝血酶切割位点。

21.一种TFPI类似物，其中类似物缺少存在于天然TFPI的氨基酸Lys-254与Thr-255之间的凝血酶切割位点。

22.一种TFPI类似物，其中类似物包含(i)至少一个Kunitz结构域和(ii)羧基末端区，但是其中该类似物在其羧基最末端Kunitz结构域与羧基末端区之间不具有凝血酶切割位点。

23.一种TFPI类似物，其中类似物不能由凝血酶切割以产生包括Kunitz结构域的氨基末端多肽和不包括Kunitz结构域的羧基末端多肽。

24.一种TFPI类似物，其中类似物含有少于2个的Lys-Thr二肽。

25.一种TFPI类似物，其中类似物包括TFPI的Kunitz结构域3，但是缺少TFPI的羧基末端结构域。

26.一种TFPI类似物，其中类似物是已经从羧基末端截短至多到23个氨基酸的TFPI。