CN102369210A

CN102369210A - 抗菌肽

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Publication number: CN102369210A
Application number: CN2010800158123A
Authority: CN
Inventors: R·霍夫曼; D·克纳珀; A·K·B·汉森
Original assignee: AMP Therapeutics GmbH and Co KG
Current assignee: AMP Therapeutics GmbH and Co KG
Priority date: 2009-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2012-03-07
Also published as: US8686113B2; CA2751010A1; WO2010086401A1; US20150299256A1; AU2010209695A1; EP2391636A1; IL214365A0; DE102009007381A1; JP2012516142A; US20170114096A1; BRPI1007295A; ZA201105852B; BRPI1007295A8; RU2011135755A; KR20110120917A; EP2391636B1; US20120021975A1; MX2011008030A

Abstract

本发明涉及具有以下通式的肽或肽衍生物：Sub₁-X₁-D₂-K₃-P₄-P₅-Y₆-L₇-P₈-R₉-P₁₀-X₂-P₁₂-P₁₃-R₁₄-X₃-I₁₆-P₁₇/Y₁₇-N₁₈-N₁₉-X₄-Sub₂，其中X₁为非极性、疏水基团或带正电基团，D₂为天冬酰胺或谷氨酰胺，K₃、X₂以及X₄为带正电基团，X₃为带正电基团、脯氨酸或脯氨酸衍生物；L₇和I₁₆为非极性、疏水基团，Y₆和Y₁₇为酪氨酸，R₉和R₁₄为精氨酸，N₁₈和N₁₉为天冬酰胺或谷氨酰胺，P₄，P₅，P₈，P₁₀，P₁₂，P₁₃，和P₁₇为脯氨酸、羟基脯氨酸或其衍生物，其中可能有1个或2个选自D₂，P₄，P₅，P₈，P₁₀，P₁₂P₁₃，P₁₇和Y₁₇的基团被任意基团取代和/或P₁₃以及R₁₄被置换，Sub₁为游离或经修饰N末端，以及Sub₂为游离或经修饰C末端。本发明进一步涉及所述肽和肽衍生物在医药中作为抗生素、在消毒或清洁剂作为防腐剂或在包装材料、药学研究或者在筛选方法中的应用。

Description

抗菌肽

技术领域

本发明涉及抗菌肽和肽衍生物，特别是用作药物。

本发明进一步涉及破坏微生物如细菌或真菌的组合物和方法，以及治疗微生物感染的方法。本发明还包括筛选活性物质的方法。

背景技术

尽管抗菌治疗的进展显著，但发生严重细菌和真菌感染的问题仍日益增加。在美国，每年有超过四千万例住院，这些患者中有超过200万在医院中被感染。这些病例中有50-60％涉及抗生素耐药性细菌(Tomasz A.Multiple-Antibiotic-Resistant Pathogenic Bacteria-A Report on theRockefeller-University Workshop.(多重抗生素耐药性病原细菌-在洛克菲勒大学研讨会上的报告)，New England Journal of Medicine，330：1247-51，1994)。据估计，这些医院获得性疾病引起的死亡在美国为60000-70000例，而在德国近10000例(Wenzel R P.，The Mortality of Hospital-Acquired Blood-StreamInfections-Need for A New Vital Statistic.(医院获得性血流感染的致死率-需要新的生命统计)，International Journal of Epidemiology，17：225-7，1988)。尽管耐药的革兰氏阴性菌在1970年代是主要问题，多种抗生素耐药的革兰氏阳性菌起到作用的病例数在在过去十年间有增长(Moellering R C，Emergingresistance with gram-positive aerobic infections：Where do we go from here？Introduction：Problems with antimicrobial resistance in gram-positive cocci(革兰氏阳性好氧感染耐药性的显现：此后去向何方？革兰氏阳性球菌抗菌剂耐药性问题简介)Clinical Infectious Diseases 26：1177-8，1998)。目前耐药菌株的快速发展包括革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体(Hand W L.，Current challenges inantibiotic resistance(目前抗生素耐药性的挑战)，Adolescent Medicine 11：427-38，2000)。耐药性首先在单个突变就足以达到临床重要水平的种属中发展，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，接着是必需多个突变的种属，例如大肠杆菌(E.coli)和淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)。这主要是由于氟喹诺酮抗生素的频繁使用(Hooper D C.，Emerging mechanisms of fluoroquinolone resistance.(氟喹诺酮耐药性的形成机理)，Emerging Infectious Diseases 7：337-41，2001)。革兰氏阴性菌中产生耐药性的另一个重要原因是大肠杆菌(Escherichia coli)和肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)中广泛的内酰胺酶(Jones R N.，Resistance patternsamong nosocomial pathogens-Trends over the past few years.(医院病原体的耐药模式-过去几年的趋势)，Chest，397S-404S，2001)。杜氏嗜血菌(Haemophilusducreyi)是软性梅毒的主要病因，其临床相关菌株中近一半携带使该细菌耐受阿莫西林、氨苄青霉素和几种其它β-内酰胺的基因(Prachayasittikul V，LawungR和Bulow L，Episome profiles and mobilizable beta-lactamase plasmid inHaemophilus ducreyi.(杜氏嗜血菌中的附加体概况和可动员β-内酰胺酶质粒)，Southeast Asian J Trop Med Public Health 31：80-4，2000)。相似地，鼠伤寒血清型肠道沙门菌(Salmonella enterica serovar typhimurium)对四环素的耐药从1948年的0％增至1998年的98％(Teuber M.，Spread of antibiotic resistance withfood-borne pathogens.(食源性病原体抗生素耐药性的扩散)，Cellular andMolecular Life Sciences 56：755-63，1999)。

这解释了对进一步寻找新抗生素的需求。诱导性抗菌肽代表了现代生物化学、免疫学和活性物质研究相结合的研究领域。已从植物、动物和微生物中分离出肽抗生素，大小范围从13到超过100个氨基酸(Boman H G.，PeptideAntibiotics and Their Role in Innate Immunity.(肽抗生素及其在先天免疫中的作用)，Annual Review of Immunology 13：61-92，1995)。单个动物具有约6-10种肽抗生素，每种肽往往显示截然不同的活性谱(Barra D，Simmaco M和BomanH G.，Gene-encoded peptide antibiotics and innate immunity.Do′animalcules′havedefense budgets？(基因编码的肽抗生素和先天免疫。“动物分子”有防御预算吗？)Febs Letters 430：130-4，1998)。已知大量的抗菌肽包括广泛研究的防御素、天蚕素和爪蟾抗菌肽，通过“分解性/离子性”机制发挥作用。经研讨，对细菌细胞质膜的透化效应是这些“裂解”肽作用的共同机制(Ludtke S，He K和Huang H.，Membrane thinning caused by magainin 2(爪蟾抗菌肽2引起膜变薄)，Biochemistry 34：16764-9，1995；Wimley W C，Selsted M E和White S H.，Interactions Between Human Defensins and Lipid Bilayers-Evidence forFormation of Multimeric Pores(人防御素和脂质双层间的相互作用-多聚体孔形成的证据)，Protein Science 3：1362-73，1994；Shai Y，Molecular RecognitionBetween Membrane-Spanning Polypeptides.(跨膜多肽间的分子识别)，Trends inBiochemical Sciences 20：460-4，1995)。这一活性的基础是在脂质双层中形成亲水性离子(质子)通道的阳离子、两性结构。由于质子的流出，扰乱了多数基础生命过程必需的膜电位，细胞因此被杀死。由于这些肽对膜的干扰取决于手性分子的识别，不消除一般两性结构或基础净电荷的氨基酸改变在功能上是可接受的(Wade D等，All-D Amino Acid-Containing Channel-Forming AntibioticPeptides(形成含全D型氨基酸通道的抗菌肽)，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 87：4761-5，1990；Steiner H，Andreu D和Merrifield R B，Binding and Action of Cecropin and Cecropin Analogs-Antibacterial Peptides from Insects(天蚕素和天蚕素类似物的结合与作用-来自昆虫的抗菌肽)Biochimica et Biophysica Acta 939：260-6，1988)。在较高浓度下，这些裂解肽通常对哺乳动物膜具有毒性作用，这限制了它们作为可能的药物产品的适用性。若在α-螺旋抗菌肽序列中插入脯氨酸，所述肽透化大肠杆菌细胞质膜的能力随脯氨酸残基的数量而降低。在检查这一关系时，惊讶地发现至少就一些革兰氏阴性病原体而言最活跃的一些天然抗菌肽属于富脯氨酸肽族(Otvos L等，Insect peptides with improved protease-resistance protect miceagainst bacterial infection(蛋白酶耐受性改善的昆虫肽保护小鼠免受细菌感染)Protein Science 9：742-9，2000)。

特异性识别细菌蛋白或其它胞内或胞外组分而不对哺乳动物类似物显示交叉反应性的抗菌肽克服了上述副作用。这看来适用于富含脯氨酸的抗菌肽，包括最初分离自昆虫的蜜蜂抗菌肽、果蝇抗菌肽、红蝽抗菌肽。因为大小和生化性质上有大量变化，结构-活性和构象-活性关系不出意料地成为抗菌肽研究的焦点。对天然抗菌肽库进行生物强度的完全研究不但对一般生化问题很重要，对制药工业的持续利益也很重要。尽管肽基抗生素的体外测试存在问题，一些天然的阳离子抗菌肽已经进入临床试验阶段(Boman H G，PeptideAntibiotics and Their Role in Innate Immunity(肽抗生素及其在先天免疫中的作用)，Annual Review of Immunology 13：61-92，1995)。这些肽中有一些在早期临床试验阶段显示了局部药剂活性，而其它在全身治疗中为活性。例如，用于脑膜炎球菌血症胃肠外治疗的阳离子蛋白rBPI 21已完成三期临床测试(BomanH G.，Peptide Antibiotics and Their Role in Innate Immunity(肽抗生素及其在先天免疫中的作用)Annual Review of Immunology 13：61-92，1995)。

富脯氨酸肽族(例如蜜蜂抗菌肽、果蝇抗菌肽和红蝽抗菌肽)通过膜透化和空间特异性结合一个或多个靶蛋白而杀死细菌。这些可能的相互作用伴侣被富脯氨酸肽抑制，推测正确的蛋白折叠受到阻碍，最终导致细胞死亡，目前已深入研究了热激蛋白DnaK(Kragol G.等，Identification of crucial residues for theantibacterial activity of the proline-rich peptide，pyrrhocoricin(富脯氨酸肽红蝽抗菌肽的抗菌活性关键残基的鉴别)，European Journal of Biochemistry 269：4226-37，2002；Kragol G.等，The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits theATPase actions of DnaK and prevents chaperone-assisted protein folding(抗菌肽红蝽抗菌肽抑制ATP酶对DnaK的作用并防止伴侣蛋白辅助的蛋白折叠)，Biochemistry 40：3016-26，2001)。此外，与具有确定二级结构的AMP如蜂毒肽或短杆菌肽截然相反，富脯氨酸肽在体外看来对真核细胞既没有溶血作用也没有毒性效果。除抗菌活性外，在哺乳动物血清(25％)中的稳定性对开发新的肽基抗生素有主要的决定性影响。例如，果蝇抗菌肽在1小时内被蛋白酶分解，而红蝽抗菌肽稳定许多，其半衰期为120分钟。

在Schneider和Dorn(2001)(Schneider M & Dorn A.Differential infectivity oftwo pseudomonas species and the immune response in the milkweed bug，Oncopeltus fasciatus(两种假单胞菌的差异感染性和乳草蝽(昆虫纲：半翅目)中的免疫应答)Journal of Invertebrate Pathology 78：135-40，2001)的生物实验中，用两种不同的革兰氏阴性假单胞菌感染长蝽科(Lygaeidae)家族的乳草蝽(Oncopeltus fasciatus)的若虫和蛹并分析它们的免疫应答。用人病原性绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染乳草蝽若虫时造成所有个体在48小时后死亡，用病原性较低的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)感染的个体中71％存活至少96小时。若乳草蝽的若虫先用恶臭假单胞菌感染，24小时后再用绿脓假单胞菌感染，在最初24小时内双重感染个体的存活率显著提高到73％。然后研究了可能的抗菌肽合成诱导，昆虫通过抗菌肽在先天免疫系统范围内抵御入侵的微生物。鉴定出四种肽(蝽抗菌肽1-4)，分子量为15、8、5、或2kDa，它们负责抗菌作用。在肽1的34个氨基酸长的部分序列(15kDa)以外，根据Edman的测序分析还发现富含脯氨酸的2kDa肽4的不完全序列。不能确切鉴定第11位和从第19位开始的C末端序列的氨基酸。确切的分子量未知。

表1列出了一些目前已知的抗菌肽序列选择：

表1：

[1]Casteels P，Ampe C，Jacobs F，Vaeck M和Tempst P.，Apidaecins-Antibacterial Peptides from Honeybees.(蜜蜂抗菌肽—源自蜜蜂的抗菌肽)Embo Journal 8：2387-91，1989

[2]Bulet P等，A Novel Inducible Antibacterial Peptide of Drosophila Carriesan O-Glycosylated Substitution.(新的诱导型果蝇抗菌肽携带O-糖基化取代)Journal of Biological Chemistry 268：14893-7，1993

[3]Mackintosh J A等，Isolation from an ant Myrmecia gulosa of two inducibleO-glycosylated proline-rich antibacterial peptides.(从蚂蚁公牛蚁中分离出两种诱导型O-糖基化富脯氨酸抗菌肽)Journal of Biological Chemistry 273：6139-41，1998

[4]Cociancich S等，Novel Inducible Antibacterial Peptides from A HemipteranInsect，the Sap-Sucking Bug Pyrrhocoris-Apterus.(来自半翅昆虫吸树汁虫无翅红蝽的新型诱导型抗菌肽)Biochemical Journal 300：567-75，1994

[5]Chernysh S，Cociancich S，Briand J P，Hetru C和Bulet P，The inducibleantibacterial peptides of the hemipteran insect Palomena prasina：Identification of aunique family of proline-rich peptides and of a novel insect defensin.(半翅昆虫红尾碧蝽的诱导型抗菌肽：鉴定独特的富脯氨酸家族和新型昆虫防御素)Journalof Insect Physiology 42：81-9，1996

[6]Schneider M和Dorn A，Differential infectivity of two pseudomonas speciesand the immune response in the milkweed bug，Oncopeltus fasciatus(Insecta：Hemiptera)(两种假单胞菌的差异感染性和乳草蝽(昆虫纲：半翅目)中的免疫应答).Journal of Invertebrate Pathology 78：135-40，2001

仍然需要新的抗菌和抗真菌化合物、新的抗菌和抗真菌药物组合物、以及使用它们的方法，和能用于筛选活性物质的化合物以检测新的药物抗生素。

本发明解决的问题是，提供了新的稳定性提高的抗生素肽，扩展AMP对革兰氏阳性菌的作用谱，从而可以得到现代的光谱抗生素，并将肽引入真核细胞以抗击隐藏的细菌。

发明内容

所述问题通过具有以下通式的本发明所述肽和肽衍生物解决：

Sub₁-X₁-D₂-K₃-P₄-P₅-Y₆-L₇-P₈-R₉-P₁₀-X₂-P₁₂-P₁₃-R₁₄-X₃-I₁₆-P₁₇/Y₁₇-N₁₈-N₁₉-X₄-Sub₂

(式1)

X₁为具有非极性、疏水侧链或具有正净电荷或在生理条件下侧链带正电的残基；

D₂为天冬氨酸或谷氨酸残基，

K₃为带正净电荷或在生理条件下侧链带正电的残基，优选赖氨酸或精氨酸，

X₂和X₄彼此独立地选自带正净电荷或在生理条件下侧链带正电的残基；

X₃为带正净电荷或在生理条件下侧链带正电的残基或脯氨酸或脯氨酸衍生物；

L₇和I₁₆彼此独立地选自具有非极性、疏水侧链的残基，优选亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，

在各情况中Y₆和Y₁₇为酪氨酸，在各情况中R₉和R₁₄为精氨酸，N₁₈为天冬酰胺或谷氨酰胺，N₁₉为天冬酰胺或谷氨酰胺或没有，P₄、P₅、P₈、P₁₀、P₁₂、P₁₃和P₁₇彼此独立地选自脯氨酸和脯氨酸衍生物或羟基脯氨酸和羟基脯氨酸衍生物，

其中可选地，P₁₃和R₁₄可互换，和/或

可选地，选自D₂、P₄、P₅、P₈、P₁₀、P₁₂、P₁₃、P₁₇和Y₁₇的一个或两个残基用任何残基取代，

Sub₁为氨基酸X₁的游离N末端或经修饰的N末端氨基基团；

Sub₂为C末端氨基酸的游离C末端羧基(-COOH)或经修饰的C末端羧基基团。

在一个特别优选的实施方式中，I₁₆选自亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基甘氨酸和缬氨酸。

在一种实施方式中，当P₁₇存在时没有N₁₉。

优选通式1-3之一的肽或肽衍生物：

Sub₁-X₁-D₂-K₃-P₄-P₅-Y₆-L₇-P₈-R₉-P₁₀-X₂-P₁₂-P₁₃-R₁₄-X₃-I₁₆-Y₁₇-N₁₈-X₄-Sub₂

(式2)

Sub₁-X₁-D₂-K₃-P₄-P₅-Y₆-L₇-P₈-R₉-P₁₀-X₂-P₁₂-P₁₃-R₁₄-X₃-I₁₆-Y₁₇-N₁₈-N₁₉-X₄-Sub₂

(式3)

Sub₁-X₁-D₂-K₃-P₄-P₅-Y₆-L₇-P₈-R₉-P₁₀-X₂-P₁₂-P₁₃-R₁₄-X₃-I₁₆-P₁₇-N₁₈-X₄-Sub₂

(式4)

D₂为天冬氨酸或谷氨酸残基，

L₇和I₁₆彼此独立地选自具有非极性、疏水侧链的残基，优选亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。

在各情况中Y₆和Y₁₇为酪氨酸，在各情况中R₉和R₁₄为精氨酸，在各情况中N₁₈和N₁₉为天冬酰胺或谷氨酰胺，P₄、P₅、P₈、P₁₀、P₁₂、P₁₃和P₁₇彼此独立地选自脯氨酸和脯氨酸衍生物或羟基脯氨酸和羟基脯氨酸衍生物。

可选地，选自D₂、P₄、P₅、P₈、P₁₀、P₁₂、P₁₃、P₁₇和Y₁₇的一个或两个残基用任何氨基酸残基取代，优选中性残基，特别优选中性极性残基。

此外，P₁₃和R₁₄可任选互换。

带正净电荷或在生理条件下侧链带正电的残基优选选自下组：精氨酸、赖氨酸、δ-羟基赖氨酸、高精氨酸、2，4-二氨基丁酸、β-高精氨酸、D-精氨酸、精氨醛(精氨酸中的-COOH被-CHO取代)、2-氨基-3-胍基丙酸、硝基精氨酸(优选N(G)-硝基精氨酸)、亚硝基精氨酸(优选N(G)-亚硝基精氨酸)、甲基精氨酸(优选N-甲基-精氨酸)、ε-N-甲基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，2′-二氨基庚二酸、鸟氨酸、对称二甲基精氨酸、不对称二甲基精氨酸、2，6-二氨基己炔酸、对氨基苯甲酸和3-氨基酪氨酸和较不优选的组氨酸、1-甲基组氨酸和3-甲基组氨酸。X₁、X₂和X₃优选彼此独立地选自该列表。

术语脯氨酸衍生物表示衍生自脯氨酸的氨基酸残基，优选通过功能团结构修饰从脯氨酸获得。优选的脯氨酸衍生物选自β-环己基丙氨酸、3，4-顺-甲醇基脯氨酸、3，4-脱氢脯氨酸、高脯氨酸或伪脯氨酸。术语羟基脯氨酸包括顺-4-羟基脯氨酸、反-4-羟基脯氨酸、顺-3-羟基脯氨酸和反-3-羟基脯氨酸等。术语羟基脯氨酸衍生物相应表示衍生自羟基脯氨酸的氨基酸残基，优选通过功能团结构修饰从羟基脯氨酸获得。优选的羟基脯氨酸衍生物选自羟基-β-环己基丙氨酸和用羟基取代的上述脯氨酸衍生物。

中性残基是在生理条件下侧链不带电的残基。

极性残基优选在侧链中有至少一个极性基团。它们优选选自羟基、巯基、胺基、酰胺或酯基或能形成氢桥的其它基团。

优选的中性极性残基选自天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-甲基丝氨酸、高丝氨酸、别-苏氨酸和3，5-二硝基酪氨酸和β-高丝氨酸。

在优选的实施方式中，P₅选自β-环己基丙氨酸、3，4-顺-甲醇基脯氨酸、3，4-脱氢脯氨酸、高脯氨酸或伪脯氨酸、顺-4-羟基脯氨酸、顺-3-羟基脯氨酸、反-3-羟基脯氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-甲基丝氨酸、高丝氨酸、别-苏氨酸和3，5-二硝基酪氨酸和β-高丝氨酸。

所述具有非极性、疏水侧链的残基在生理条件下为不带电残基，亲水系数优选大于0，特别优选大于3。优选的非极性、疏水侧链选自有1-10个、优选2-6个碳原子的烷基、亚烷基、烷氧基、亚烷氧基、烷基硫基和亚烷基硫基残基，或者具有5-12个碳原子的芳基残基。优选的具有非极性、疏水侧链的残基选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、N-甲基亮氨酸、叔丁基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、1-氨基环己基羧酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸和N-甲基缬氨酸。

“生理条件”是指pH在6-8，温度在30℃-40℃，优选温度为37℃、pH为7.4以及渗透压为300mosmol/kg。

本发明所述的肽或肽衍生物优选含有至少19个氨基酸残基，优选多至50个氨基酸残基。

Sub₁为氨基酸X₁的游离N末端或经修饰的N末端氨基基团。Sub₂为C末端氨基酸的游离C末端羧基(-COOH)或经修饰的C末端羧基基团。“经修饰的N末端氨基”和“经修饰的C末端羧基”是指氨基或羧基被改变(例如，还原或取代)。

因此，Sub₁表示氨基酸X₁的游离N末端或具有通式NR₁R₂的N末端氨基修饰(用Sub₁置换氨基酸X₁的N末端氨基)。Sub₁＝NR₁R₂，其中R₁和R₂彼此独立并优选选自氢或下列基团：

(i)线性、分支、环状或杂环烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或环己基；

(ii)线性、分支、环状或杂环烷酰基，例如乙酰基或甲酰基、丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、戊酰基、己酰基或环己酰基；

(iii)报告基团，优选荧光染料(例如荧光素、Alexa488)或生物素；

(iv)N和C末端之间有接头与COR₃(见下文)以获得环形肽，例如基于胍、乙二醇寡聚体、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸、2，2′-二氨基庚二酸、锁链素或异锁链素。

(v)用于通过特异性化学或酶反应与另一种肽或肽衍生物(Y1)偶联的接头，例如基于碘代、溴代或氯代烷酸(如碘代乙酸)，或用于偶联含巯基肽的马来酰亚胺或用于偶联第二种肽或肽衍生物(例如活性酯、醛或硫酯)作为载体蛋白的另一反应基团(例如氨基、巯基)。

(vi)如(v)所述的接头，其上偶联另一种肽或肽衍生物Y1。

N末端修饰的例子有乙酰化、甲酰化或鸟苷酸化N末端。

优选另一种肽或肽衍生物Y₁通过Sub₁偶联。Y₁优选为生物聚合物(如肽)，其将如式1-4中任一所述的抗菌肽引入细菌并因此提高抗菌肽针对该细菌的活性和/或将其引入哺乳动物细胞并因此能处理隐藏在哺乳动物细胞内的细菌。Y₁通过Sub₁与肽的X₁永久偶联(例如Sub₁＝NH₂时的肽或脒键或Sub₁＝SH、碘代乙酸或马来酰亚胺时的硫醚键)或通过在某些条件下可切割的化合物偶联(例如二硫桥或酸不稳定性接头)。优选的Y₁序列是细胞穿透肽(CPP)，例如穿透素、Tat肽、模拟两性肽和传送素(Langel，U.，Handbook of Cell-PenetratingPeptides(细胞穿透肽手册)5-28(CRC-TF集团(Taylor & Francis Group)，2006)。

接头是指用来偶联两个物质的分子或分子基团；优选的接头包含通过优选具有10-20个碳原子的桥接分子(例如聚乙二醇)连接的两个反应基团(例如碘代乙酸、马来酰亚胺、亚氨或NHs-酯或酰肼)。

Sub₂是C末端氨基酸的游离C末端羧基(-COOH)或经修饰的C末端羧基，优选为通式COR₃(R₃置换最后氨基酸的羟基)、X₅-COR₃或X₆-COR或X₅X₆-COR₃。

COR₃优选选自下组：

(i)羧基(R₃为游离羧基)、酯基(R₃为烷氧基)、酰胺基(R₃为胺基)或亚胺；

(ii)接头，该接头与Sub₁一起桥接N和C末端成环状肽；

(iii)COR₃，其中R₃是另外的氨基酸残基，所述氨基酸残基选自Pro、Ile、Leu、Arg和Gln，或其中R₃是肽，所述肽优选具有2-6个氨基酸，其中至少一个氨基酸选自Pro、Ile、Leu、Arg或Gln，其中后者用下组之一取代：羧基(R₃为游离羧基)、酯基(R₃为醇，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇)、酰胺基(R₃为酰胺)或亚胺(R₃为烷基胺或二烷基胺，例如甲基胺、乙基胺、二甲基胺、或环己基胺)。

(iv)COR₃，其中R₃为另外的分支氨基酸，以形成二聚体或寡聚体结构，例如赖氨酸、羟基赖氨酸、鸟氨酸、2，4-二胺基丁酸、2，3-二胺基丙酸、2，2′-二胺基庚二酸、锁链素、异锁链素或这些分支氨基酸的组合。

(v)用于通过特异性化学或酶反应与另一种肽或肽衍生物(Y₁)偶联的接头，例如基于碘代、溴代或氯代烷酸(如碘代乙酸)或用于偶联含巯基肽的马来酰亚胺或用于偶联第二种肽或肽衍生物(例如活性酯、醛或硫酯)作为载体蛋白的另一反应基团(例如氨基、巯基)。

(vi)如(v)所述的接头，其上偶联了另一种肽或肽衍生物Y₁。

如此可获得C末端肽衍生物，例如酯(R₃＝烷氧基)、酰胺(R₃＝胺基，如-NH₂)或亚胺(R₂＝烷基亚胺，如-NHC₃H₇)或肽，其用其它氨基酸加以延伸，所述氨基酸选自Pro、Ile、Arg和Val，或再次在C末端修饰为酯、酰胺或亚胺。可以通过肽N末端或C末端修饰形成进一步的肽衍生物。例如，这些改变可以是永久偶联或通过在某些条件下可切割的化合物(如二硫桥或酸不稳定接头)偶联的另外烷基或烷酰基基团(具有直链或分支、环化或杂环)或额外的胍基或其它大分子或报道残基。

C末端修饰优选通过硫酯合成和后续伯胺取代进行。

形成本发明所述肽或肽衍生物的所有天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸衍生物(例如亚氨基酸)可以是L-或D-构象。但是，除非另有说明，序列中的结构单元优选为L-构象。

X₅和X₆可选为额外的残基。当没有X₅和X₆时，上述序列中的末位精氨酸(Arg)具有游离C末端羧基或与Sub₂连接。

当至少有一个X₅和X₆残基时，所述肽具有例如以下通式之一：

Y₁-Sub₁-X₁-D-K-P-P-Y-L-P-R-P-X₂-P-P-R-X₃-I-Y-N-X₄-X₅-X₆-COR₃

(式5)

Y₁-Sub₁-X₁-D-K-P-P-Y-L-P-R-P-X₂-P-P-R-X₃-I-Y-N-X₄-X₅-COR₃

(式6)

Y₁-Sub₁-X₁-D-K-P-P-Y-L-P-R-P-X₂-P-P-R-X₃-I-Y-N-X₄-X₆-COR₃

(式7)

X₅选自脯氨酸、脯氨酸衍生物或具有极性侧链的中性残基(例如天冬酰胺、谷氨酰胺)。优选的X₅残基选自脯氨酸、顺-4-羟基脯氨酸、反-4-羟基脯氨酸、顺-3-羟基脯氨酸、反-3-羟基脯氨酸、β-环己基丙氨酸、3，4-顺-甲醇基脯氨酸、3，4-脱氢脯氨酸、高脯氨酸、伪脯氨酸和天冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基甘氨酸、二羟基苯丙氨酸、N-乙基天冬酰胺、N-乙基甘氨酸、高丝氨酸、青霉胺、四氢吡喃基甘氨酸、别苏氨酸和3，5-二硝基酪氨酸。

X₆选自脯氨酸、脯氨酸衍生物、极性残基(如丝氨酸)或疏水残基。优选的X₆残基选自脯氨酸、顺-4-羟基脯氨酸、反-4-羟基脯氨酸、顺-3-羟基脯氨酸、反-3-羟基脯氨酸、β-环己基甘氨酸、3，4-顺-甲醇基脯氨酸、3，4-脱氢脯氨酸、高脯氨酸或伪脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、δ-羟基赖氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸或别苏氨酸以及苯丙氨酸、N-甲基亮氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、叔丁基甘氨酸、环己基丙氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、1-胺基环己基羧酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、N-甲基缬氨酸，或者是短肽序列，优选具有1-3个残基，所述残基优选选自脯氨酸、异亮氨酸或上述残基之一。

或者，X₆是含有多个肽单元的分支接头。这通过含有多个氨基的氨基酸残基形成，例如赖氨酸、羟基赖氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸、2，2′-二氨基庚二酸、锁链素、异锁链素。

例如，C末端氨基酸为式1-4中的X₄、式6中的X₅或式5和7中的X₆。

相对于此前富脯氨酸抗菌肽“长蝽抗菌肽4”的不完整确定序列，本发明所述肽和肽衍生物显示改善的抗菌活性、更广的作用谱且蛋白酶耐受性更高。

本发明所述肽和肽衍生物的优选实施例选自以下序列：SEQ ID NO.5-9、14-26、29、30、32、33、36、38、40、41、44-46、49、50、53-59、61-85、93、94、101、102、107-112；参见实施例1中表2。

特别优选的肽具有序列VDKPPYLPRPRPPRRIYNR-NH₂(SEQ ID NO.18)，在下文中称为长蝽素。本发明所述的其它肽或肽衍生物在下文中称为长蝽素衍生物。

本发明所述肽或多聚体肽结构经修饰以提高抗菌或抗真菌活性以及扩展对其它细菌或真菌的活性谱并改善稳定性，其特征为高抗菌和/或抗真菌效力以及在哺乳动物血清中良好的代谢稳定性。

如下文讨论和实施例中所示，在第11(X₂)、15(X₃)和19(X₄)位的适当修饰改进天然长蝽肽序列4抗不同细菌的抗菌活性。

此外，残基Sub₁-X₁、X₃和X₄可以额外针对蛋白水解降解稳定N和C末端肽序列，从而提高在血清中的半衰期。

本发明所述序列具有带正电残基X₂(第11位)。

本发明优选的实施例为具有带正电残基X₃(第15位)的序列，例如选自SEQID NO.18、29、32、33、46、50、54-59、62、65-74、78、79、82、107、109、111和112的序列，或者在残基X₃(第15位)具有羟基脯氨酸的序列，例如选自SEQ ID NO.25和63的序列。

本发明所述序列具有带正电残基X₄(第19位)。

此外，所述C末端羧基优选经修饰。这意外地导致了所述肽在血清中半衰期的提高。

在N和C末端的修饰允许肽偶联其它基团，例如其它氨基酸序列(可能产生多聚体肽或蛋白质)或具有载体或标记功能的其它生物分子，例如通过Sub₁偶联Y₁。在具体实施方式中，载体分子起穿梭作用以抗击哺乳动物细胞中的细菌感染或将抗菌肽和肽衍生物转运到抗菌肽本身不能穿透的细菌内(例如革兰氏阳性菌)。例如，所述细胞穿透肽(CPP)的例子为穿透素、Tat肽、模拟两性肽和转运素。此外，可以通过偶联的结构(靶分子)识别感染位点，从而将抗生素物质带到(细菌)细胞附近以抗击细菌。例如，这些靶分子是已知与脂多糖(LPS)分子结合的分子，脂多糖形成革兰氏阴性菌的外侧。用于这一应用的已知化合物有例如锚定肽，如来自乳酸杆菌的AcmA基序或针对脂多糖的抗体。优选该最后提及的变体，因为它还具有固有的抗生素效果，因此能用于提高本发明所述肽的活性。

若N末端氨基酸，即Sub₁-X₁具有在生理条件即人体内情况下带正电的残基，则是有利的。

获得N端稳定的一个实施例是酰基化(Sub₁＝酰基-NH-)，例如带正电氨基酸如鸟氨酸或赖氨酸(Sub₁-X₁＝酰基-Orn或酰基-Lys)的α-氨基的乙酰化(Sub₁＝乙酰-NH-)。该酰基化(优选乙酰化)使得氨基酸侧链的正电荷完整。

本发明中进一步优选的实施例是在X₂、X₃和X₄(第11、15和19位)具有带正电残基的序列，例如选自SEQ ID NO.18、22、58、62、63、65-74、78、79、82和83的序列。

本发明进一步优选的实施例是具有羟基脯氨酸而不是脯氨酸的序列，例如选自SEQ ID NO.21、22和24的序列。

特别优选的实施例是在第11、15和19位(X₂、X₃和X₄)具有带正电氨基酸(例如鸟氨酸、精氨酸或赖氨酸)且具有经修饰C末端的肽，特定是SEQ ID NO.18、63、71、72、74所述的肽。

一个特别优选的肽包含在第15位(残基X₃)的鸟氨酸、第11和19位(残基X₂和X₄)的精氨酸以及C末端为聚丙基酰胺(残基Sub₂)，如SEQ ID NO.71所述。

另一特别优选的肽包含在第15和19位(残基X₃和X₄)的鸟氨酸和第11位(X₂残基)的精氨酸，C末端为酰胺(残基Sub₂)。该类中一个优选的肽具有SEQ IDNO.72所述的序列。

另一特别优选的肽包含在第11位(残基X₂)的精氨酸、第15位(残基X₃)的反-4-羟基脯氨酸和第19位(残基X₄)的鸟氨酸，C末端为酰胺(残基Sub₂)。该类中一个优选的肽具有SEQ ID NO.63所述的序列。

另一特别优选的肽包含在第15和19位(残基X₃和X₄)的鸟氨酸、第11位(残基X₂)的精氨酸、第18位的谷氨酰胺而不是天冬酰胺以及C端为酰胺(残基Sub₂)。该类中一个优选的肽具有SEQ ID NO.74所述的序列。

从实施例可见，本发明所述C末端修饰成酰胺(Sub＝-NH₂)意外地显著提高了针对大肠杆菌和藤黄微球菌(M.luteus)的抗菌作用。在C末端具有酰胺的优选序列为SEQ ID NO.18、22、50、54-57、61-63、65-70、72-79和82。

也优选减少C末端降解的修饰，例如在C末端(Sub₂)如SEQ ID NO.58和71所述为异丙酰胺，和在第8和/或13位为反-4-羟基脯氨酸。实验结果显示在第6和7位的氨基酸对抗菌作用显然也很重要。因此，与长蝽素的抗生素活性相比，用丙氨酸交换第6和/或7位的单独氨基酸破坏了功效。

本发明最优选的实施例是肽，其提供了以下优点：

(i)在哺乳动物血清中的半衰期提高和

(ii)针对一种或多种细菌菌株，特别是人病原体，或真菌或其它微生物感染的抗菌活性提高以及

(iii)所述肽对人细胞，包括红细胞无毒性。

抗菌肽的作用非常复杂，为了抑制特定的胞内细菌靶分子，它们必须通过细胞膜并穿透进入细胞质，但对哺乳动物细胞和血液细胞没有毒性效果。另一重点是所述肽或肽衍生物对抗肽酶或蛋白酶降解的稳定性。因此，理想的肽具有高抗菌活性(低MIC值)，没有细胞毒性，没有溶血活性，以及在血液中的半衰期达数小时。与天然长蝽肽序列4相比，本发明所述肽衍生物显示超过20倍的抗菌活性。C末端优选经修饰(酰胺、烷基酰胺、酯)，且第14位后的C末端区域通过例如在第15和/或19位(X₃和X₄)用非蛋白原性氨基酸取代来改变。在N末端，优选正电荷以实现良好的活性。在天然长蝽肽序列4的第1位(X₁)的缬氨酸优选游离或用乙酰化碱性残基如精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸置换。特别优选鸟氨酸，意外地，它引起了蛋白质稳定性的改善。出于相同理由，长蝽肽序列4的第15和19位优选被取代，该取代意外地引起肽稳定性的改善。将第15和19位(X₃和X₄)交换为反-4-羟基脯氨酸(X₃)和鸟氨酸(X₄)或都是鸟氨酸的实施例出乎意料地使25％血清中的半衰期提高了10倍以上，即从低于30分钟提至高于6小时。C末端从游离酸到丙基酰胺的转变也引起血清稳定性的改善。

优选细胞穿透肽序列与本发明所述肽和肽衍生物偶联。这一偶联优选通过接头如乙酰基或烷基发生。所述偶联优选发生在本发明所述肽或肽衍生物的N末端。优选地，该富脯氨酸肽或肽衍生物在N末端用碘化乙酸衍生，细胞穿透肽序列在C末端通过半胱氨酸残基延伸。随后，该半胱氨酸的巯基与乙酰基团形成硫醚桥。

细胞穿透肽(CPP)是相对较短的多阳离子或疏水肽，其结合使得能穿透原核与真核细胞的细胞膜。CPP可具有不同的序列和长度。但是，在多数情况下，它们包含约10-40个氨基酸的序列并且富含带正电氨基酸(例如，Arg、Lys)。这些短序列负责通过细胞膜，并称为“蛋白转导结构域(PTD)”。

优选的细胞穿透肽选自穿透素、Tat肽、模拟两性肽、转运素(源自甘丙肽)、SynB(源自仔猪抗菌肽)、和含顺-γ-氨基-1-脯氨酸的肽。

根据本发明所述使用的细胞穿透肽优选为8-20个氨基酸残基长，其中30％-90％的残基具有在生理条件下带正电的侧链。其余残基优选为中性。优选的细胞穿透肽序列选自：

RQIKIWFQNRRMKWKK-OH SEQ ID NO.105(穿透素)，

KLALKLALKALKAALKLA-NH₂SEQ ID NO.124(模拟两性肽)

RKKRRQRRR SEQ ID NO.125(Tat肽)。

文献中给出了进一步优选的细胞穿透肽(Langel，U.Handbook ofCell-Penetrating Peptides(细胞穿透肽手册)中5-28(CRC-TF集团，2006)、(Pujals S，Giralt E.Proline-rich，amphipathic cell-penetrating peptides(富脯氨酸两性细胞穿透肽)Adv Drug Deliv Rev.60(4-5)：473-84，2008)和(Farrera-Sinfreu J，Giralt E，Royo M，Albericio F.Cell-penetrating proline-rich peptidomimetics.(细胞穿透的富脯氨酸肽模拟物)Methods Mol Biol.386：241-67，2007)，其内容通过引用纳入本文。

在所述肽衍生物的优选实施例中，AMP在第1位(X₁)之前用穿透素-半胱氨酸(Y₁)通过碘代乙酰基(Sub₁)形成硫醚键进行N末端延长。该类优选实施例优选选自SEQ ID NO.101和102所述序列。

通过连接细胞穿透肽序列如穿透素，意外地提高了针对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的活性，且作用谱扩展到其它革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，另外所述抗菌肽将无细胞毒性地引入哺乳动物细胞，因此也能到达这些细胞内隐藏的细菌、真菌或病毒。

穿透素对应于黑腹果蝇的触角足(Antennapedia)同源域(转录因子的DNA结合区域)的R43-K58部分序列。穿透素的序列(优选R Q I K I W F Q N R RM K W K K-OH；SEQ ID NO.105)富含阳离子氨基酸并与很多AMP序列类似。

本发明中，所述细胞穿透肽序列用于将AMP引入细菌和哺乳动物细胞。偶联了穿透素的AMP转运入真核细胞，也用于处理其中的感染。此外，可以通过AMP与胞内靶分子的相互作用研究毒性效果。

穿透素和本发明所述抗菌肽通过硫醚桥偶联构成本发明的部分。

为此，通过半胱氨酸延长穿透素的C末端并与抗菌肽偶联，用碘代乙酸标记N末端。

本发明所述的长蝽素及其衍生物以及其它抗菌肽优选富脯氨酸肽或肽衍生物，例如蜜蜂抗菌肽、果蝇抗菌肽、蚁抗菌肽1、红蝽抗菌肽和碧蝽抗菌肽1也可用细胞穿透肽序列如穿透素相应修饰。

在PCT/EP2008/059512(2008年7月21日提交)中提及优选的蜜蜂抗菌肽衍生物，其内容通过引用纳入本文。

所述肽衍生物的优选实施例选自SEQ ID NO.95-100和106所述序列。

本文所用表达“肽”是指通过肽键连接的氨基酸序列，其中所述氨基酸优选选自20个自然产生的形成肽的氨基酸，其中所述氨基酸可以是L-构象或D-构象，或者在异亮氨酸和苏氨酸情况中也可以是D-别-构象(仅反转两个手性中性之一)。

本发明描述中所用肽衍生物(或肽模拟物)表达不仅仅包括上述用Y₁、Sub₁和Sub₂在N或C末端修饰的肽。此外，它还包括通过用化学基团取代和/或修饰一个或多个氨基酸残基来改变的肽，其中所述化学基团与天然的形成蛋白的氨基酸残基不同，例如非蛋白原性α-氨基酸、β-氨基酸或主链改变的肽。术语“改变的主链”是指至少一个肽键被化学修饰，即用在生理条件下不被切割的键置换，且不被内切蛋白酶切割。

所述不可切割的键优选为经修饰的肽键，例如，还原的肽键、烷基化酰胺键或硫代酰胺键。还原的酰胺键是肽键，其中羰基(C＝O)还原成羟基(HCOH)或亚甲基(CH₂)。烷基化酰胺键是在氮(N-α)或碳(C-α)原子上烷基化的肽键。所述烷基残基优选具有1-3个碳原子。一个示例为N-甲基化。

此外，术语“改变的主链”包括适合与在前氨基酸残基的COOH基团以及下一氨基酸残基的NH₂基团形成共价键的其它基团，因此，它不必要保持肽主链结构，例如糖氨基酸-二肽等构物、氮杂肽、6-共聚物、γ-肽、Y-内酰胺类似物、寡(亚苯基亚乙基)、插烯砜肽、聚-N-取代甘氨酸或寡氨基甲酸酯。

主链的修饰在第14-19位，R-X₃-I₁₆-Y₁₇-N₁₈-X₄。因此，优选X₃-I₁₆(例如Arg-Ile)、N₁₈-X₄(例如Asn-Arg)、X₄-NH₂(例如Arg-NH₂)、X₆-X₇(例如Arg-Leu或Arg-Ile)之间至少一个键被修饰。这些键优选选自还原酰胺键、烷基化酰胺键或硫代酰胺键。

本发明所述肽和肽衍生物可以是线性，即序列中第一和最后的氨基酸具有一个游离NH₂和COOH基团，或是用Sub₁和Sub₂修饰的序列。或者，所述肽为环状，即第一和最后的氨基酸通过肽键或接头相连。

生产上述新型抗菌活性化合物的方法也构成本发明的部分。

本发明所述肽或肽衍生物可以通过常规方法合成或在适当情况下重组生成。下文在实验部分详细公开了实施本发明的特定实施例。优选地，本发明所述肽或肽衍生物通过已知的合成技术常规生成，例如Merrifield所述(MerrifieldR B.Solid-phase peptide synthesis.1.Synthesis of a Tetrapeptide.(固相肽合成1：四肽的合成)Journal of the American Chemical Society 85：2149-&，1963)。

或者，通过重组技术生成本发明所述肽，其中含有编码上述肽之一的核酸序列的DNA片段被克隆并在例如微生物或宿主细胞中表达。编码核酸序列可以合成产生(Stemmer W P C，Crameri A，Ha K D，Brennan T M和Heyneker H L.，Single-Step Assembly of a Gene and Entire Plasmid from Large Numbers ofOligodeoxyribonucleotides(从大量寡脱氧核苷酸一步组装基因和整个质粒)Gene 164，49-53，1995)或可通过已有核酸序列(例如编码野生型长蝽肽4的序列)的定点突变获得。如此生成的编码序列可以通过RNA(或DNA)用已知技术在聚合酶链反应(PCR)中由相应生成的引物扩增。纯化如通过琼脂糖凝胶电泳后，所述PCR产物接入载体并最终用相应的重组质粒转化宿主细胞。已知用于多种宿主细胞的重组技术，例如大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(Bacillus)、乳杆菌(Lactobacillus)、链霉菌(Streptomyces)、哺乳动物细胞(例如CHO(中华仓鼠卵巢)或COS-1细胞)、酵母细胞(例如酵母(Saccharomyces)、裂褶菌(Schizophyllum))、昆虫细胞或病毒表达系统(例如杆状病毒系统)。本领域技术人员可以从文献中选择其它适用的宿主细胞和转化、培养、扩增、筛选、产物生产和纯化的方法(Gething M J和Sambrook J.Cell-SurfaceExpression of Influenza Hemagglutinin from a Cloned Dna Copy of the RnaGene.(从Rna基因的克隆Dna拷贝进行流感血凝素的细胞表面表达)Nature 293：620-5，1981)。在常规重组生成后，本发明所述肽可以从宿主细胞分离，可通过经典的细胞裂解技术或通过常规方法如液相色谱特别是亲和层析从细胞培养基中分离。所述抗菌肽可以表达为单体肽或者寡聚体。所述寡聚体可含有数个肽序列，它们通过N或C末端连接，或甚至含有N或C末端标记使重组肽或蛋白构建体的纯化更容易。可以采用常规分子生物学技术和定点突变进一步修饰序列并从而获得所需的非天然肽序列。所有这些重组技术是本领域技术人员已知的，并已用于许多抗菌肽，包括蜜蜂抗菌肽(Maeno M，Taguchi S和MomoseH.Production of Antibacterial Peptide Apidaecin Using the Secretory ExpressionSystem of Streptomyces.(采用链霉菌分泌表达系统生产蜜蜂抗菌肽)BioscienceBiotechnology and Biochemistry 57：1206-7，1993)、海蚕抗菌肽(Zhou Q F，LuoX G，Ye L和Xi T.High-level production of a novel antimicrobial peptide perinerinin Escherichia coli by fusion expression.(通过融合表达在大肠杆菌中高水平生产新型抗菌肽perinerin)Current Microbiology 54：366-70，2007)和防御素(Si LG，Liu X C，Lu Y Y，Wang G Y和Li W M.Soluble expression of active humanbeta-defensin-3in Escherichia coli and its effects on the growth of host cells.(活性人β-防御素-3在大肠杆菌中的可溶性表达及其对宿主细胞生长的影响)Chinese Medical Journal 120：708-13，2007)。

也可能通过基因技术将非天然产生的氨基酸引入肽。Noren等和Ellman等对此有详细描述(Noren C J，Anthonycahill S J，Griffith M C和Schultz P G.AGeneral Method for Site-Specific Incorporation of Unnatural Amino-Acids IntoProteins.(在蛋白质中位点特异性掺入非天然氨基酸的通用方法)Science 244：182-8，1989；Ellman J，Mendel D，Anthonycahill S，Noren C J和Schultz P G.Biosynthetic Method for Introducing Unnatural Amino-Acids Site-Specifically IntoProteins.(向蛋白质内位点特异性引入非天然氨基酸的生物合成方法)Methodsin Enzymology 202：301-36，1991)。

接着，可以从宿主细胞培养物或体外翻译系统中分离肽。这可以用现有技术已知的蛋白质纯化和分离常规技术来实现。例如，这些技术可以包括免疫吸附或亲和层析。还可以在合成过程中提供带标记(如组氨酸标签)的肽，以允许快速结合与纯化。之后，可以酶法分解所述标记以获得活性肽序列。

肽本身若不能编码或表达，但与可编码或可表达的肽非常相似，可以首先将所述方法应用于所述的相似肽，随后再经一步或多步化学或酶学步骤转化成所需肽或模拟肽。本文所述生产肽的这些方法在文献中有更全面的说明(Anderson W F.Human gene therapy.(人基因治疗)Nature 392：25-30，1998；Pharmaceutical Biotechnology(药物生物技术)(Crommelin D J A和Sindelar R D编著)8-20，53-70，123-152，167-180页)哈沃德学术出版公司(HarwoodAcademic Publishers)，1997；Protein Synthesis：Methods and Protocols(蛋白质合成：方法和方案)(Martin R编)1-144，休玛纳出版公司(Humana Press)，1998；Amino Acid and Peptide Synthesis(氨基酸与肽合成)(Jones J编)1-89，牛津大学出版社，1997；Solid-Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)(Fields G B编)1-780，学术出版社(Academic Press)，1997)。

本发明所述肽和肽衍生物可单独、联合、作为多聚体或作为分支多聚体使用。本发明所述肽的合理联用包括串联体，其中本发明所述肽依序或通过间隔连接在一起，例如以肽二聚体或肽三聚体等(多聚体)形式与单独肽串接在一起。这种多聚体可以由式1-4中任一所述具有相同序列或不同序列的肽或肽衍生物构成。

单独肽或肽衍生物可以与生物相容蛋白偶联，例如人血清白蛋白、人源化抗体、脂质体、胶束、合成聚合物、纳米颗粒和噬菌体。或者，本发明所述肽或肽衍生物各自结合的多聚体可以枝状聚合物或群集的形式生成，3个或更多肽结合在一个中心上。

在一个实施方式中，可将上述式1-4中任一所述的肽或肽衍生物生成为多聚体构建物或排列。例如，因而可任选将基于氨基酸或其它化学化合物的氨基酸(例如Gly-Ser-)或其它间隔连接到N或C末端，以将2个或更多肽连接在一起或与载体偶联。这一排列可以采取一个或多个上述合成肽与载体蛋白偶联的形式。或者，可任选将含多种肽，各自表达为多重抗原性肽的排列与载体蛋白偶联。在另一种变体中，所选肽依序连接并表达成重组蛋白或多肽。在一个实施方式中，多个肽依序连接，之间有或没有氨基酸作为间隔，以得到较大的重组蛋白。或者，所述重组蛋白可以与载体蛋白融合。

在另一实施方式中，所述多聚体构建物含有至少两个上文定义的肽(可以是与式1-4中任一个的肽相同或不同)，其中一个肽经任意氨基酸与其它肽偶联。任意数量的其它肽可以与这些肽的任意其它氨基酸结合。在多聚体排列的另一实施方式中，包含至少两个肽，第二个或更多的肽与基础结构中其它肽的分支结构偶联。或者，各更多的肽通过Sub₁或Sub₂基团与排列中的另一肽共价结合。

在具有至少两个肽的多聚体构建物或排列的另外实施方式中，至少一个或多个肽与载体结合。在另一实施方式中，一种或多种所述肽是融合载体蛋白的合成肽。此外，将多个上述有或没有侧翼序列的肽依序与线性多肽结合。与相同载体或不同肽偶联的所述肽或多肽可作为肽单独与一个或不同的免疫惰性载体蛋白偶联。

合适的载体改善稳定性、施用或者生产，或者改变或改进所述肽的活性谱。载体的实施例为人白蛋白、聚乙二醇或其它生物聚合物或其它天然或非天然产生的聚合物。在一个实施方式中，所述载体的主要组成优选是蛋白质或增强所述肽稳定性的其它分子。本领域技术人员能容易地选择载体与肽的适当偶联单元。

在另一个实施方式中，所述肽以多抗原肽(MAP)的形式排列，例如，可以用Tam等描述的″MAP″概念构建(Tam J P，Mora A L和Rao C.Lipidation as anovel approach to mucosal immunization.(脂质化作为粘膜免疫的新方法)Modulation of the Immune Response to Vaccine Antigens 92：109-16，1998)。这一系统采用赖氨酸残基的中心单元，其上合成多个拷贝的本发明所述相同肽(参见如，Posnett D N，Mcgrath H和Tam J P.A Novel Method for ProducingAnti-Peptide Antibodies-Production of Site-Specific Antibodies to the T-CellAntigen Receptor Beta-Chain.(生成抗肽抗体的新方法-T细胞抗原受体β链位点特异性抗体的生产)Journal of Biological Chemistry 263：1719-25，1988)。每个MAP含本发明所述一个或多个肽的多个拷贝。MAP的一个实施方式包含至少3个，但优选4个或更多肽。本领域技术人员能根据以上通式鉴别的肽容易地生成任意数量的多聚体化合物。所有这些多聚体排列和构建物构成本发明的部分。

可以在颗粒表面生成多聚体形式的进一步组合，其中在颗粒表面呈递所述肽或模拟肽。然后，该颗粒作为肽或模拟肽的载体发挥作用并可同时用作可检测标记。例如，可通过所述肽或模拟肽链N末端的N末端生物素化和后续与链霉亲和素的络合获得多聚体。由于链霉亲和素能结合4个生物素分子或以高亲和力缀合，用此方法可以获得非常稳定的四聚体肽。可以从本发明所述相同或不同的肽或模拟肽生成多聚体。优选地，本发明所述多聚体包含2种或更多肽或模拟肽，其中各组成有助于所述杀生物活性(靶识别、抗菌活性、纯化)。

本发明的另一目的是本发明所述肽或肽衍生物在医学或药学中的应用，例如用于抗生素疗法或在具有抗微生物(特别是杀菌)活性的组合物中的应用。

本发明还包括本发明所述的肽、肽衍生物和/或多聚体用于治疗微生物、细菌或真菌感染。

本发明进一步涉及包含一种或多种本发明所述肽或肽衍生物或多聚体构建物的药物组合物，其独立于其它活性药物成分的存在。

本发明所述肽作为药物的应用和/或用于生产可用作抗生素的活性物质也是本发明的部分。

所述肽还可单独用于药物产品。或者，上述一种或多种肽可以与另一化合物融合或缀合以提高药代动力学或生物利用度，而不引起免疫应答。可将任意数量的单独肽或多聚体构建物混合在一起产生单个组合物。

本发明所述药物组合物含有治疗有效量的一种或多种本发明的肽或肽衍生物。本发明所述药物组合物一旦组成，就能直接给予对象以治疗微生物(特别是细菌)感染。为此，将治疗有效量的本发明组合物给予需治疗对象。

本发明所述组合物旨在治疗哺乳动物的感染，包括感染细菌或真菌的人。

本发明所述至少一种或多种肽或多聚体构建物可与药学上可接受的载剂或其它组分混合形成有抗微生物(特别是抗菌或抗真菌)作用的组合物。为了使用这种组合物，所选肽优选如上所述合成或重组产生。

该组合物的直接给予可局部(在皮肤表面)或通过一些其它给药途径进行，如经口、胃肠外、皮下、舌下、病损内、腹膜内、静脉内、肌肉内、肺或组织间隙。

所述药物组合物可进一步包括适当的药学上可接受载剂、填料或溶剂，并可具有胶囊、片剂、锭剂、包衣片、丸剂、滴剂、栓剂、粉末、喷雾、疫苗、软膏、糊剂、乳膏、吸入剂、贴片、气雾剂等等。药学上可接受的赋形剂可包括溶剂、稀释剂、或其它液体粘合剂如分散或悬浮助剂、表面活性剂、等张活性物质、增稠剂或乳化剂、防腐剂、包封剂、固体粘合剂或助流剂，取决于哪种最适合特定剂量并同时与所述肽、肽模拟物(肽衍生物)、肽缀合物或肽模拟物缀合物相容。

因此，优选所述药物组合物含药学可接受的载剂。术语“药学上可接受载剂”还包括用于给予所述治疗组合物的载剂，例如抗体或多肽、基因或其它治疗剂。该术语涉及本身不引发对给予所述处方个体有危害的抗体，且不具有任何不合理毒性的任何药物载剂。合适的“药学上可接受载剂”可以是大的、缓慢降解的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和灭活病毒组分。所述载剂是本领域技术人员熟知的。

可以用已知方法生成所述肽或功能等效复合物的盐，通常指所述肽、肽模拟物、肽缀合物、或肽模拟物缀合物与药学上可接受的酸混合以形成酸盐或与药学上可接受的碱混合以形成碱盐。了解所述应用和所述配方的本领域技术人员可容易地确定酸或碱是否为药学上可接受。例如，并非所有离体应用可接受的酸和碱都能转用于治疗配方。取决于具体的应用，药学上可接受的酸可以是有机或无机性质的，例如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、乙醇酸、草酸、丙酮酸、琥珀酸、马来酸、丙二酸、肉桂酸、硫磺酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、高氯酸、磷酸和硫氰酸，其与肽或功能等效复合物的游离氨基形成铵盐。与肽或功能等效复合物的游离羧酸基团形成羧酸盐的药学上可接受碱基包括，乙胺、甲胺、二甲胺、三乙胺、异丙胺、二异丙胺、和其它单-、双-和三烷基胺和芳基胺。此外，包括药学上可接受的溶剂。

可使用药学上可接受的盐，例如无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学，新泽西麦克出版公司(Mack Pub.Co.)，1991年)给出了药学上可接受成分的具体讨论。

治疗组合物中的药学上可接受载剂能包含液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。还可加入其它赋形剂，例如润湿剂或乳化剂；pH缓冲物质和相似化合物可存在于所述试剂。通常，所述治疗组合物制成用于注射的液体形式或悬浮液，也能制成用于在注射前溶解或悬浮于载体液体的固体形式。在“药学上可接受载剂”的定义中也包括脂质体。

对于治疗处理，可生成上述肽、肽衍生物、肽缀合物或肽衍生物缀合物并给予需要的对象。所述肽、肽衍生物、肽缀合物或肽衍生物缀合物可以任何适当形式给予对象/患者，优选调整为剂量形式并以所需治疗适当的剂量存在的药物组合物。

本发明所述药物组合物可包含其它活性化合物，例如常规抗生素(如万古霉素、链霉素、四环素、青霉素)或其它抗微生物活性化合物，例如杀真菌剂如伊曲康唑或咪康唑。还可添加其它化合物缓解感染伴随症状，例如发烧(水杨酸)或红疹。

除了用于处理感染的治疗用途，或者用于生物战争外，还可在消毒剂和/或清洁剂(例如，杀菌组合物)中使用本发明所述肽或肽衍生物，它们可用于消毒和/或清洁表面和/或物件。另一应用领域是包装，肽可与包装材料结合或掺入其中，或作为易被微生物降解的其它材料的保存剂。本发明所述肽或肽衍生物特别适合包装食物，因为它们在接触或被摄入时无毒性作用。

本发明的另一目的是治疗感染微生物(特别是细菌或真菌)的哺乳动物的方法，包括给予有效治疗活性剂量的本发明所述药物活性组合物。

与本发明相关，细菌或真菌感染可选自但不限于：泌尿生殖道感染、血液感染(“血流感染”)、脓毒症、呼吸道感染、腹膜炎、伤口感染、消化道感染和脑膜炎。

本文所用术语“治疗有效量”指治疗剂，即本发明所述肽、肽模拟物、肽缀合物或肽模拟物缀合物的量能降低或完全预防细菌的繁殖和菌落形成或能实现可测量的治疗或预防成效。例如，所述效应可以通过测试细菌活性用培养活检确定，或用评估细菌感染范围和程度的其它适当方法确定。用于对象的确切有效量取决于其重量和健康状况、疾病的类型和程度以及为治疗选用的治疗剂或多种治疗剂的组合。具体地，本发明所述组合物可用于降低或预防细菌感染和/或生物或物理附随效果(如发烧)。医师确定初始剂量的方法在现有技术中已知。所述剂量确定必须是安全和成功的。

抗菌有效剂量必需的本发明所述蛋白质、肽或核酸的量可以考虑引起感染的病原体、感染的严重程度、以及患者的年龄、体重、性别、总体身体状况等确定。抗菌和抗真菌有效而没有显著副作用的活性成分必需量取决于所用药物配方和其它成分如抗生素、抗真菌素等的可选存在。对于本发明所述的应用区域，所述肽、肽模拟物、肽缀合物或肽模拟物缀合物在治疗个体内的有效剂量可以在0.01μg/kg-50mg/kg之间，优选在0.5μg/kg-10mg/kg之间。

可选地，可以通过重复给药监控本发明所述肽、肽模拟物、多聚体、肽缀合物或肽模拟物缀合物的初始剂量。剂量频率取决于上文鉴定的因素，并优选在3天到最多1周的治疗期间每天1-6剂。

在另一替代组合物中，本发明所述肽、肽模拟物、肽缀合物或肽模拟物缀合物或其混合物通过从引入对象身体的基质中受控或连续释放给予。

在一种实施方式中，本发明所述复合物透过皮肤给予。这一给药方法是非侵入性和患者友好型，且同时明显引起所述复合物的生物利用度比口服给药提高，尤其当所述复合物在消化系统的环境中不稳定或是其太大而难以从肠道有效吸收时。例如，可能在鼻中、颊、舌下、齿龈上或阴道内透过皮肤吸收。可通过已知技术获得相应剂型；它们可以加工成鼻滴剂、鼻喷剂、植入剂、膜剂、贴片、凝胶、软膏或片剂。优选地，为了透过皮肤吸收，药物载剂应含有一种或多种粘附于皮肤的成分从而延长剂型与吸附表面的接触时间，因而提高经吸收的摄入。

在另一种实施方式中，所述复合物经肺部途径以确定量给予，例如，通过吸入剂、雾化剂、气溶胶喷剂或干粉吸入剂。可通过已知方法和技术制备适当制剂。在一些情况下，透皮或直肠递送，以及眼内应用可以是适当的。

通过先进的药物递送或靶向方法更有效地给予本发明所述物质可能具有优势。因此，若需避免消化道，所述剂型可含有能提高生物利用度的任何物质或混合物。例如，这可以通过如酶抑制剂或抗氧化剂的方法减少降解来实现。若通过提高吸收阻挡层的通透性实现所述复合物的生物利用度则更佳，该阻挡层通常为粘膜。促进渗透的物质可以多种方式起作用；一些提高粘膜的流动性，而其它则扩大粘膜细胞间的间隙。

还可降低粘膜上粘液的粘度。优选的吸收加速剂包括两性物质，例如胆酸衍生物、磷脂、乙醇、脂肪酸、油酸、脂肪酸衍生物、EDTA、卡波姆、聚卡波非和壳聚糖。

可使用本发明所述肽、肽衍生物、缀合物或多聚体的适应症为革兰氏阳性和革兰氏阴性菌感染，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、胞氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、野兔热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium meliloti)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)或奇异变形杆菌(Proteus mirabili)。

本发明还涉及本发明所述肽、肽衍生物或多聚体在生化、生物技术、医学或药物研究或者筛选中的应用，特别是用于鉴定可能有抗菌或抗真菌作用的物质。

因此，本发明还涉及鉴定具有抗菌或抗真菌作用化合物的方法，包括下列步骤：

(i)用下列物质：

(a)对本发明所述肽、肽衍生物或多聚体敏感的微生物，

(b)本发明所述肽、肽衍生物或多聚体，

(c)至少一种待测化合物，

通过使(a)与(b)和(c)接触进行竞争性试验；以及

(ii)选择从所述微生物中竞争性置换所述肽、肽衍生物或多聚体的测试化合物。

该筛选过程鉴定能与本发明所述肽或多聚体构建物竞争结合病原体未知受体的测试化合物。这样，可在高通量筛选中有效鉴定能特异性结合与所述肽相同位点的小分子。该测试化合物可能具有与初始肽序列相同的作用机理，并因此对由本发明所述肽或肽衍生物消除的多重耐药性微生物也有活性。

用已知方法进行该筛选过程，但使用至少一种本发明所述的肽、肽衍生物或多聚体。为此，本发明所述的肽、肽衍生物或多聚体优选带有荧光、放射性或其它可检测标记。比较有和没有测试物质时带标记肽、肽衍生物或多聚体与所述微生物的结合行为。

优选地，鉴别与本发明所述肽或多聚体构建物竞争结合的所述测试化合物，并测试其抗菌或抗真菌作用。

在一种实施方式中，竞争性试验中在二聚体(BIFC；生物分子荧光互补)形成后测定荧光。所述方法允许直接呈现胞内蛋白相互作用，这可用于证明例如大肠杆菌内c-Abl酪氨酸激酶的SH3结构域与天然和人工靶分子的相互作用(Morell M，Espargaro A，Aviles F X和Ventura S.Detection of transientprotein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation：TheAbl-SH3 case.(通过生物分子荧光互补检测瞬时蛋白质-蛋白质相互作用：Abl-SH3案例)Proteomics 7：1023-36，2007)。这一测试系统充分敏感，甚至能在大肠杆菌内检测低表达水平蛋白质之间的相互作用。它基于SH3结构域与其伴侣结合后两个黄色荧光蛋白(YFP)片段的加合。一旦这两个蛋白质彼此结合，YFP的两个片段形成复合物，其结构与天然蛋白质非常相似。这由所观察到的YFP复合物荧光可见，因为单独的片段不发出荧光。还可设计相似的构建物用于搜索与本发明所述肽和肽衍生物竞争结合位点的化合物。本领域技术人员可容易地将高通量筛选转化到386孔形式的微孔板。

在另一种实施方式中，所述肽用于适当的竞争性试验以确定测试化合物从病原体未知受体上竞争性置换所述肽的能力。需要时，已知结合所选肽的微生物(例如细菌、病毒或真菌)，例如大肠杆菌或肺炎杆菌的菌株，可以(取决于所选试验)直接或间接固定在适当表面，例如在ELISA模式中。已知用于固定的相应表面。例如，可使用惰性颗粒(“珠”)。然而，所述配体还可以与96孔微孔板结合。然后，选定量的所述测试化合物和本发明所述肽与固定的微生物接触，所述化合物与肽竞争结合所选微生物。若鉴定出这些与肽竞争结合细菌或真菌上受体的测试化合物，可进一步研究它们的抗菌或抗真菌作用。下文实施例中描述了为此的适当方法。

本发明的另一方面提供了分离的核酸分子，其序列编码本发明所述肽或多聚体。本发明所述抗菌或抗真菌肽或多聚体构建物的编码核酸与控制其在宿主细胞内表达的调节序列操作性连接。本发明的另一目的是用上述核酸分子转染或转化的宿主细胞。

用下列实施例解释本发明，但本发明不限于此。

实施例

实施例1：肽合成

除非另有说明，用于肽合成的所有化学品都来自复鲁卡化学公司(FlukaChemie GmbH，瑞士布克斯(Buchs))，纯度尽可能最高。

通过常规固相肽合成法，采用Fmoc/tBu方案(Fields G B和Noble R L.Solid-Phase Peptide Synthesis Utilizing 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Acids.(利用9-芴基甲氧基羰基氨基酸的固相肽合成)International Journal of Peptideand Protein Research Protein Research 35：161-214，1990)在Syro 2000多重肽合成机器人(MST公司(MultiSynTech GmbH，德国维腾(Witten))上合成所有肽和肽衍生物。从MST公司(德国维腾)或沃佩进药物公司(Orpegen PharmaGmbH，德国海德堡)获得所有标准Fmoc氨基酸。2-氨基-3-胍基丙酸(Agp；虹生物技术公司(Iris Biotech GmbH，德国马克切德维茨(Marktredwitz))，β-高精氨酸(βHar，复鲁卡化学公司，瑞士布克斯)、高精氨酸(Har)、N-甲基精氨酸(N-Me-Arg)和硝基精氨酸(Arg(NO₂)，巴凯姆公司(Bachem AG)，瑞士布本多夫(Bubendorf))用作特殊的精氨酸同系物。反-4-羟基脯氨酸(t-4-Hyp)和2，3-二氨基丙酸(Dap)从诺瓦生化(Novabiochem)(默克生物科学公司(Merck Biosciences GmbH)，德国达姆施塔特)获得。

所述肽或者在王氏树脂(1.23mmol/g)上合成为酸，或者在Rink-酰胺4-甲苯氢胺(MBHA)树脂(0.67mmol/g)上合成为酸性酰胺，来自MST公司(德国维腾)。对于稍后具有伯胺的官能化，肽衍生成肽硫酯，为此第一氨基酸与4-磺氨基-丁酰基-氨基甲基树脂(SAB AM，1.1mmol/g；诺瓦生化默克生物科学公司，德国达姆施塔特)偶联。

在王氏树脂上，将第一个C末端氨基酸(5当量)与5当量2，6-二氯苯甲酰氯(Merck KGaA，德国达姆施塔特)和8.25当量吡啶在二氯甲烷(DCM；生物解决公司(Biosolve BV)，荷兰瓦肯斯沃德)中偶联(Sieber P.An Improved Methodfor Anchoring of 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Amino Acids to 4-AlkoxybenzylAlcohol Resins.(9-将芴基甲氧基羰基氨基酸锚定于4-烷氧基苄基醇树脂的改进方法)Tetrahedron Letters 28：6147-50，1987)。-20℃下在DCM中通过用5当量(苯并三唑-1-氧基)-三吡咯烷基鏻六氟磷酸(PyBOP，诺瓦生化默克生物科学公司，德国达姆施塔特)和10当量N-乙基二异丙胺(DIPEA)激活完成SAB AM树脂与C末端氨基酸(5当量)的官能化(Backes B J和Ellman J A.AnAlkanesulfonamide Safety-Catch Linker for Solid-Phase Synthesis.(用于固相合成的烷烃磺酰胺安全性捕获接头)The Journal of Organic Chemistry 64：2322-30，1999)。

在各情况中，通过用二甲基甲酰胺(DMF；生物解决公司(Biosolve BV)，荷兰瓦肯斯沃德(Valkenswaard))中的8当量N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)激活溶解于0.5mol/L 1-羟基苯并三唑(HOBt)的8当量氨基酸使该第一氨基酸与Rink-酰胺树脂偶联，如前文装载在王氏和SAB AM树脂的自动合成中所述。

所用侧链保护基团为：三苯基甲基(三苯甲基)用于Cys、Asn、His和Gln，叔丁基醚(^tBu)用于Tyr、Ser和Thr，叔丁基酯(O^tBu)用于Asp和Glu，ω-N-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰(Pbf)用于Arg，ω-N-2，2，5，7，8-五甲基色原烷-6-磺酰(Pmc)用于βHar和Har，叔丁氧基-碳酰(Boc)用于Lys、Orn和Agp或者ω-N-4-甲氧基-2，3-6-三甲基苯基-磺酰(Mtr)用于N-Me-Arg。临时性Fmoc保护基团用DMF中的40％哌啶(v/v)(生物解决公司(Biosolve BV)，荷兰瓦肯斯沃德)切割5分钟，再用新鲜的DMF中20％哌啶(v/v)切割10分钟。

通过将8当量乙酸、甲酸或碘乙酸溶解于0.5mol/L HOBT/DMF并在DMF中用8当量DIC激活而将肽或肽衍生物的N末端乙酰化、甲酰化或碘乙酰化。按Gausepohl等所述进行肽或肽衍生物的N末端胍基化(Gausepohl，H.，Pieles，H.和Frank，R.W.，见Peptides：chemistry，structure and biology(肽：化学、结构及生物学)(Smith，J.A.和Rivier，J.E.编著)523(ESCOM，Leiden，1992))，各用DMF中的10当量2-(¹H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基铵六氟磷酸(HBTU，MultiSynTech公司，德国Witten)和DIPEA进行。在DMF中用5当量HBTU和10当量DIPEA将N末端用荧光染料5，6-羧基荧光素(5当量)修饰。

通过Kaiser测试验证N末端修饰的完整性。为此，用乙醇(CR公司(Carl RothGmbH+Co.KG)，德国卡士如赫(Karlsruhe))中的0.28mol/L茚三酮(RdH公司(Riedel de Haen)，德国席尔泽(Seelze))、吡啶中的0.2mmol/L氰化钾和乙醇中的76％苯酚按比例(1∶1∶2)在95℃孵育少量树脂。若出现指示游离伯胺基团的蓝色，则重复偶联。

肽或肽衍生物合成完成后，树脂用DMF和DCM仔细清洗并在真空下干燥。结合于树脂的肽用87.5％三氟乙酸(TFA)中的水、间甲酚、茴香硫醚和乙二硫醇(5∶5∶5∶2.5)混合物在室温下切割4小时且同时将侧链脱保护。肽和肽衍生物用冷二乙醚沉淀并以3000*g离心。沉淀用冷乙醚洗涤两次，干燥并溶于0.1％的TFA水溶液(UV色谱级)。所述样品在-20℃下保存。

切割SAB AM树脂上的肽之前，Fmoc基团切割后，在DMF中用20当量二叔丁基二碳酸(Boc₂O，复鲁卡化学公司，瑞士布克斯)和10当量DIPEA保护N末端。将DMF中的100当量碘乙腈和20当量DIPEA加入清洗过的树脂中通过烷基化激活氨磺酰接头(Teruya K，Murphy A C，Burlin T，Appella E和Mazur S J.Fmoc-based chemical synthesis and selective binding to supercoiled DNA of thep53C-terminal segment and its phosphorylated and acetylated derivatives.(基于Fmoc的化学合成和与超螺旋p53C末端区段DNA及其磷酸化和乙酰化衍生物的选择性结合)Journal of Peptide Science 10：479-93，2004)。为切割肽，向树脂中加入DMF中的50当量丙基胺(10％v/v)。除去DMF后，新生肽溶入含水、间甲酚、茴香硫醚和乙基二硫醇(5∶5∶5∶2.5)的87.5％TFA溶液中，所有侧链保护基团和N末端Boc保护基团被裂解。肽用冷二乙醚沉淀并以3000x g离心。沉淀用冷乙醚洗涤两次，干燥并溶入0.1％的TFA水溶液(UV色谱级)。所述样品在-20℃下保存。

已切割的肽和肽衍生物在

HPLC系统(安玛西亚生物科学公司，德国弗雷堡(Freiburg))上采用Jupiter C18 5μm

250x 10mm或JupiterC18 15μm，

250x 21mm柱(菲诺米耐克斯公司(Phenomenex Inc.)，美国托伦斯(Torrance))通过RP-HPLC纯化。

各情况中所用溶剂为0.1％的TFA水溶液(洗脱剂A)和含0.1％TFA的60％乙腈水溶液(生物解决公司(Biosolve BV)，荷兰瓦肯斯沃德)(洗脱剂B)。典型的线性梯度以5％洗脱剂B开始，并以每分钟提高1％B进行洗脱，流速为10mL/min(250x 21mm柱)或5mL/min(250x 10mm柱)。在220、230和240μm进行检测。由相同HPLC系统使用Jupiter C18 5μm，150x 4.6mm柱(菲诺米耐克斯公司，美国托伦斯)分析纯化的肽。以1mL/min流速用5-95％B的线性梯度在30分钟内洗脱并在220nm检测。此外，用基体辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS；4700蛋白质组分析仪，应用生物系统公司，德国达姆施塔特)测定纯度。为此，将0.5μL肽溶液与0.5μL α-氰基羟基肉桂酸(布鲁克道尔顿公司(Bruker Daltonik GmbH)，德国布雷曼(Bremen))共结晶作为基体(在含50％乙腈的0.1％TFA水溶液中为5.3mg/mL)。

通过将纯化的穿透素-Cys单体与4当量纯化的碘乙酰化AMP在脱气磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中在氮气下于4℃孵育进行穿透素衍生物的硫醚连接。用RP-HPLC监测反应，并在穿透素-Cys单体反应完成后纯化穿透素构建物。平行获得所述(穿透素-Cys)₂二聚体。

从富脯氨酸抗菌肽“长蝽抗菌肽4”的不完全确定序列开始，首先合成具有C末端氨基酸N₁₈N₁₉R₂₀的肽4第一衍生物(表2)且羧基功能未改变。在第11位的修饰中，阳离子氨基酸Lys和Arg显示惊人地良好性质。所述衍生物在较低微摩尔范围内显示对大肠杆菌和藤黄微球菌的抗菌活性。为进一步衍生C末端，选择Arg11衍生的序列并合成具有不同Asn和Arg排列的衍生物。在C末端缩短至Asn的衍生物(SEQ ID NO.18)显示惊人的高活性。此外，作为C末端酸酰胺，它保留了惊人的高度血清稳定性。具有序列VDKPPYLPRPRPPRRIYNR-NH₂(SEQ ID NO.18)的肽在下文中称为长蝽素，并主要就血清稳定性和抗菌活性作进一步改善。

表2：

^*比较实施例

表3：合成肽序列综述

单字母编码用于氨基酸残基，氨基酸链中的O代表鸟氨酸；

Propyl代表C末端的丙酰胺(Sub₂＝OR₃＝NHC₃H₇)；Ac＝乙酰基团，for＝甲酰基团，guan＝胍基团以及CF＝5，6-羧基荧光素是经修饰的N末端实施例(N末端氨基酸的α氨基被修饰，Sub₁＝乙酰-NH，甲酰-NH，胍基或5，6-羧基荧光素)，

βHar：β-高精氨酸，精氨酸的β氨基酸同系物，

Agp：2-氨基-3-胍基丙酸，Har：高精氨酸和Arg(NO₂)：硝基精氨酸是精氨酸的同系物，

N-Me-Arg：N-甲基-精氨酸-在肽键上甲基化的精氨酸，

4tHyp：反-4-羟基脯氨酸，

Tle：叔丁基甘氨酸

Dap(Ac)：侧链中具有乙酰化氨基功能的2，3-二氨基丙酸，

(CH₂CO)：半胱氨酸SH基团的乙酰基接头，

f：α-氨基己酸，

小写字母代表相应的D-氨基酸，

比较实施例用*标注。

实施例2：稳定性

在25％小鼠血清中的血清稳定性

在小鼠血清和含25％小鼠血清(PAA公司(PAA Laboratories GmbH)，奥地利Pasching)的水溶液中按Hoffmann等的双重测定(Hoffmann R，Vasko M和Otvos L.Serum stability of phosphopeptides.(磷酸肽的血清稳定性)AnalyticaChimica Acta 352：319-25，1997)进行血清稳定性研究。为此，将肽和肽模拟物溶入水，加入小鼠血清，肽浓度调整至75μg/mL。混合物在37℃孵育，同时连续振荡。0、30、60、120、240和360分钟后，取各情况中的等份样品并与15％三氯乙酸水溶液(CR公司，德国卡士如赫)混合。冰上再孵育10分钟后，离心(5分钟，13400rpm，迷你离心(MiniSpin)，艾本德公司(EppendorfAG，德国汉堡)除去血清蛋白沉淀。取上清，用1mol/L氢氧化钠(复鲁卡化学公司，瑞士布克斯)水溶液中和，-20℃保存至分析。

用线性乙腈梯度(生物解决公司(Biosolve BV)，荷兰瓦肯斯沃德)在作为离子对试剂的0.1％三氟乙酸(TFA，UV级，复鲁卡化学公司，瑞士布克斯)存在下通过RP-HPLC分析上清液。将组分与α-氰基羟基肉桂酸(布鲁克道尔顿公司；德国布雷曼)共结晶作为基体(在含50％乙腈的0.1％TFA水溶液中为5.3mg/mL)，并在正离子反射器模式下用串联质谱仪(MALDI-TOF/TOF-MS，4700蛋白质组分析仪；应用生物系统公司，德国维特斯塔特(Weiterstadt))分析。从而可以鉴定并定量完整肽及其降解产物或代谢物在各时间点的比例。所用对照为25％小鼠血清的水溶液，在相同时间间隔对其作平行分析。

表4显示长蝽素(SEQ ID NO.18)和所选长蝽素衍生物在25％小鼠血清中的半衰期。所列具有SEQ ID NO.14和19的长蝽肽4衍生物稳定性最低，半衰期小于30分钟。在此，第19位的精氨酸(X₄残基)首先断裂。然后降解产物VDKPPYLPRPRPPRRIYN-OH(SEQ ID NO.28)的稳定性增至120分钟，但该片段仅有极低的抗菌活性(对大肠杆菌为64μg/mL)。在长蝽素C末端(Sub₂)酰胺化，除了针对大肠杆菌和藤黄微球菌的活性外(分别为4和8μg/mL)，稳定性也增至60分钟，这对于肽衍生物是惊人的高数值。通过与丙酰胺的酰胺化(SEQ ID NO.58)，长蝽素的半衰期甚至延长至120分钟。

表4：血清稳定性：长蝽素和所选长蝽素衍生物在25％小鼠血清中的半衰期

^*比较实施例

用非蛋白原性氨基酸鸟氨酸取代第19位(X₄残基)(SEQ ID NO.61)将稳定性提高到半衰期为120分钟。用鸟氨酸取代Arg15使该长蝽素衍生物(SEQID NO.50)的稳定性提高到半衰期为90分钟。在第15位(X₃残基)的脯氨酸(SEQID NO.60)或β-高精氨酸(SEQ ID NO.62)衍生物降解不足一半，直到120或150分钟后。在第13位用4-反-羟基脯氨酸取代脯氨酸(SEQ ID NO.24)对长蝽素的稳定性没有负效应。

通过组合第15和19位(X₃和X₄残基)的修饰，可合成非常稳定的肽衍生物，测得其半衰期超过360分钟。具有Orn19和Hyp15或Orn15的优选实施例SEQ IDNO.63和72针对大肠杆菌活性的MIC值为4或8mg/mL，与长蝽素相当。Orn15与丙酰胺化C末端的组合(SEQ ID NO.71)代表了本发明另一非常优选的实施例。

在100％小鼠血清中的血清稳定性

表5：血清稳定性：长蝽素和所选长蝽素衍生物在100％小鼠血清中的半衰期

通过用鸟氨酸或反-4-羟基脯氨酸交换第15和19位的精氨酸残基(SEQ IDNO.63和72)，在25％小鼠血清水溶液中的半衰期可提高至超过6小时(见上文)。在100％小鼠血清中孵育后，测得这些序列R₁₅O和R₁₉O交换的半衰期为175分钟。通过R₁₅Hyp和R₁₉O交换(SEQ ID NO.63)，480分钟后仍测得60％的肽量。具有P₁₃Hyp、R₁₅Hyp、R₁₉O和I₁₆Tle的另一长蝽素衍生物(SEQ ID NO.110)在480分钟后甚至仍含有初始肽量的60％或70％。这两种衍生物针对大肠杆菌的活性都非常好，为4和2μg/mL。

抗细菌蛋白酶的稳定性

制备细菌裂解液

对于细菌裂解液，用大肠杆菌BL21 A1接种500mL营养肉汤(CR公司，德国卡士如赫)并37℃孵育过夜。将2x 250mL细菌悬液在带JLA-10.500转子的Beckman Avanti^TM J-20-XP离心机(美国富勒敦的贝克曼库尔特公司)中以5000rpm在4℃离心25分钟。菌团各自悬浮于30mL PBS(pH 7.4)并在BeckmanAllegra^TM 2IR离心机(美国富勒敦的贝克曼库尔特公司)中再次离心。菌团各自悬浮于10mL PBS并在冰上用超声破碎(Vibra-cell^TM微头(microtip)，费氏生物模块科学公司(Fisher Bioblock Scientific)，法国伊尔克弛(Illkirch))2x 5分钟(750W；40％幅度，开2秒/停3秒)。组合细菌裂解液，将1mL等份样品在4℃下以15400rpm离心20分钟(Beckman Allegra^TM)。取上清液，-20℃保存。按Bradford蛋白质测定法确定细菌裂解液的蛋白质含量。

按Bradford法测定蛋白质[M.M.Bradford；(1976)：AnalytischeBiochemie，72，248-254]

制备含2mg/mL BSA的PBS溶液作为标准系列的原液。用PBS稀释给出10-100μg/mL BSA的6个标准溶液。用待分析样品制备PBS中的系列稀释。在各情况中，取50μL样品或标准溶液加入聚苯乙烯微孔板。对于Bradford试剂，将0.01％考马斯亮蓝G250溶于5％乙醇，添加8.5％正磷酸，用双蒸水定容。然后混合物在60℃孵育1小时再室温放置12小时，然后过滤。各孔中加入200μLBradford试剂，避光孵育15分钟。检测595nm相对空白值(50μL PBS+200μLBradford试剂)的吸收。

测定在细菌裂解液中的稳定性

在37℃孵育蛋白含量为1.5mg/mL或0.5mg/mL的细菌裂解液中的0.15μg/mL肽溶液。0、30、60、120、240或360分钟后，各取200μL并用50μL15％三氯乙酸沉淀蛋白质。接着4℃孵育10分钟然后在Minispin台式离心机中以13000rpm离心5分钟。取210μL上清用1mol/L氢氧化钠溶液中和。HPLC分析完整的肽和降解产物。溶液中添加60μL含0.1％三氟乙酸(TFA)的3％乙腈水溶液，取250μL混合物注射进样。层析分离后，用MALDI-TOF-MS鉴定组分。

表6：抗细菌蛋白酶的稳定性：长蝽素和所选长蝽素衍生物在0.5mg/mL蛋白浓度的大肠杆菌裂解液中孵育后的半衰期

为研究抗细菌蛋白酶的稳定性，从培养过夜的大肠杆菌BL21 A1制得裂解液并将肽在其中孵育。采用Bradford蛋白测定法，调整蛋白浓度到0.5或1.5mg/mL。

对于天然长蝽素(SEQ ID NO.18)，测得在总蛋白浓度0.5mg/mL的裂解液中半衰期为60分钟。通过交换R₁₅O和R₁₉O(SEQ ID NO.72)，半衰期翻倍至115分钟。下一步，用反-4-羟基脯氨酸交换脯氨酸内切蛋白酶切割位点的第13位脯氨酸(SEQ ID NO.107)，稳定性进一步提高至215分钟。通过联用P₁₃Hyp、R₁₅Hyp和R₁₉O，获得超过240分钟的半衰期。

在具有R₁₅O和R₁₉O的另一衍生物中，用叔丁基甘氨酸交换第16位的异亮氨酸(SEQ ID NO.109)使稳定性提高至超过240分钟。具有P₁₃Hyp、R₁₅Hyp、R₁₉O和I₁₆Tle组合的衍生物(SEQ ID NO.110)也在蛋白浓度0.5mg/mL的裂解液中有超过240分钟的半衰期。意外地，长蝽素衍生物对于抗大肠杆菌的抗菌活性有正效应，SEQ ID NO.108和110的MIC值降至2μg/mL。

实施例3：抗菌测试

抑制区测试(琼脂扩散试验)

将纯化的肽和肽衍生物在水中稀释至终浓度为500μg/mL。从浓度约3x 10⁵细胞/mL的对数生长期的培养物中将测试微生物接种到1％胰蛋白酶大豆肉汤和1.2％琼脂糖平板(复鲁卡化学公司，瑞士布克斯)。各情况中，间隔3cm滴加10μL肽的水溶液(500μg/mL)或10μL水和抗生素溶液作为对照。在37℃孵育20小时后，测定抑制区直径(IZD)。在需氧条件下进行所有测试。

采用长蝽素序列的丙氨酸扫描，鉴定了多个残基，其与丙氨酸的交换导致针对大肠杆菌BL21 A1(图1)和藤黄微球菌10240(图2)的抗菌活性显著降低。

在图1和图2中，长蝽素序列VDKPPYLPRPRPPRRIYNR(SEQ ID NO.18)绘于X轴。各氨基酸代表在该位置用丙氨酸置换的相应肽。例如，Val1列代表肽ADKPPYLPRPRPPRRIYNR-NH₂(SEQ ID NO.29)，Y轴表示其IZD值。抑制区直径越大，则肽的活性越高。

在抗大肠杆菌BL21 A1的琼脂扩散试验(图1)中，发现与长蝽素相比(IZD1.7cm)，在Lys3、Tyr6-Arg9和Arg11位置的丙氨酸交换都显著降低活性。这些衍生物(SEQ ID NO.31，34-37和39)仅部分抑制琼脂板上大肠杆菌的生长，有时会长过直径1.0-1.2cm的抑制区。肽Ala15具有最小的无生长抑制区(1.3cm；SEQ ID NO.43)。所有其它位置可以被改变而不降低活性，但其中可以获得活性提高、抗菌谱扩展、稳定化和更好的体内分布。当掺入蛋白酶稳定的氨基酸且血清稳定性因此提高而不损失抗菌活性时，正效应主要在N末端Val1和C末端Arg19实现。

抗革兰氏阳性菌藤黄微球菌的琼脂扩散试验(图2)显示丙氨酸交换的结果，对抗菌活性有正效应和负效应。对活性重要的位置散布于整个序列；在此，肽完全抑制生长，最低较小抑制区相当于长蝽素(1.8cm)。主要是Lys或Arg的置换和因此肽中正电荷的损失降低抗菌活性。通过Ile16和Asn18的置换(SEQID NO.44，46)获得了0.7cm的最大活性提高。实施例中发现这些位置各用Orn15和Orn19以及第16位用Leu(SEQ ID NO.73)或第18位用Gln(SEQ ID NO.74)取代的变化。通过这三个取代，SEQ ID NO.74获得与长蝽素相应的活性，其中Gln18可补偿鸟氨酸取代的轻微负效应。

生长抑制试验

在微量稀释试验中测定所述抗菌肽和肽衍生物的最低抑制浓度(MIC)。试验采用无菌平底96孔微孔板(聚苯乙烯，Greiner Bio-One公司，德国Frickenhausen)的连续肽稀释，每孔总体积为100μL。用1％TSB水稀释肽或肽模拟物的水溶液以获得256μg/mL的终浓度。吸取50μL肽或肽模拟物溶液移入各系列的第一个孔并搅拌。从该溶液中，移出50μL至第二个孔，搅拌并再移出50μL到下个孔，如此继续。得到双倍稀释系列，从第一个孔的256μg/mL到第12孔的125ng/mL。所述细菌如大肠杆菌BL21A1在营养肉汤(NB，CR公司，德国卡士如赫)中37℃培养过夜。取50μL 5x 10⁶细菌/毫升的1％TSB悬液加入微孔板的各孔，因此确立各系列中肽或肽模拟物的终浓度从128μg/mL(孔1)到62.5ng/mL(孔12)。平板在37℃孵育20小时，然后用TECAN微孔板分光光度计(泰坎贸易公司(Tecan Trading AG)，瑞士曼多夫(Mannedorf))测定595nm的吸收。所有肽和肽模拟物的MIC值都一式三份测定。用无菌水作为阴性对照。MIC值代表37℃孵育20小时后观察到无细菌生长的最低肽浓度。

表7给出肽和肽衍生物抗大肠杆菌BL21 A1和藤黄微球菌ATCC 10240的MIC值。

表7：抗大肠杆菌BL21 A1和藤黄微球菌10240的抗菌活性。1％TSB中测定的最低抑制浓度(MIC)。

Propyl代表C末端的丙酰胺(Sub₂＝OR₃＝NHC₃H₇)；Ac＝乙酰基团，for＝甲酰基团，guan＝胍基团以及CF＝5，6-羧基荧光素是经修饰N末端的实施例(N末端氨基酸的α氨基被修饰，Sub₁＝乙酰-NH，甲酰-NH，胍基或5，6-羧基荧光素)，

βHar：β-高精氨酸，精氨酸的β氨基酸同系物，

N-Me-Arg：N-甲基-精氨酸-在肽键上甲基化的精氨酸，

4tHyp：反-4-羟基脯氨酸，

Tle：叔丁基甘氨酸。

Dap(Ac)：侧链中具有乙酰化氨基功能的2，3-二氨基丙酸，

(CH₂CO)：半胱氨酸SH基团上的乙酰基接头，

f：α-氨基己酸，

小写字母代表相应的D-氨基酸。

SEQ ID NO.2对应天然长蝽肽序列4。SEQ ID NO.1是天然长蝽肽序列4的N末端截短衍生物。SEQ ID NO.1、2、3、4、10-13、17、28、31、34，、35、39和48的序列为比较实施例，它们和其它序列在表7中标以*。SEQ ID NO.8-9、80、81和85的序列是本发明较不优选的实施例。表7所示其它序列是本发明优选的肽或肽衍生物。最优选的实施例是SEQ ID NO.18、22、24、26、29、58、62、63、65-71、74、79、82和107-112。

通过将初始序列(SEQ ID NO.2)中的Pro11(X₂残基)用阳离子氨基酸Lys和Arg(SEQ ID NO.8与14)取代，惊人地获得抗大肠杆菌BL21 A1和抗藤黄微球菌10240的更高活性。用His置换(SEQ ID NO.5)和富脯氨酸AMP中该位置常发生的Thr置换(SEQ ID NO.4)没有正效应。第11位的Arg衍生物具有8μg/mL(抗大肠杆菌)的目前最低MIC，并在C末端相应改变。C末端酰胺化仅使抗藤黄微球菌的活性负向改变了一个稀释步骤。没有Arg并因此在最后和次末位置缺乏正电的肽衍生物(SEQ ID NO.27，28，47，51)的活性损失8-16倍，主要是抗藤黄微球菌的活性，它们不包括在优选实施例中。

在第19位(X₄残基)是Arg和第20位是Asn的SEQ ID NO.16与SEQ IDNO.14同样活跃。出乎意料地，C末端(Sub₂)酰胺化对活性没有负面影响(SEQID NO.15)。C末端(Sub₂)酰胺化甚至引起活性提高(参见SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19)。C末端酰胺化还对稳定性有显著的正效应。因此，与相应具有游离酸官能的肽(实施例2)相比，酰胺化肽衍生物的半衰期最多延长30分钟。肽衍生物SEQ ID NO.18分别具有4或8μg/mL的抗大肠杆菌或藤黄微球菌的最低MIC值，在25％小鼠血清水溶液中的半衰期为60分钟，被定名为长蝽素(表4)。

在血清稳定性测试中，长蝽素在第15位(X₃残基)和第19位(X₄残基)被C末端切割，肽VDKPPYLPRPRPPR-OH(对应SEQ ID NO.126)和VDPPYLPRPRPPRRIYN-OH(对应SEQ ID NO.28)被鉴定为主要降解产物。截短至Arg19的衍生物的MIC为64μg/mL，仍有很低的抗大肠杆菌的抗菌活性。在第19位(X₄残基)为精氨酸或其它阳离子氨基酸的衍生物惊人地显示改善的稳定性。但是，在第19位(X₄残基；SEQ ID NO.53)的His衍生物的抗大肠杆菌MIC为16μg/mL，活性比长蝽素低4倍。优选实施例为在第19位(X₄残基)用Agp、Arg(NO₂)、N-Me-Arg和Har(SEQ ID NO.54-57)取代的肽衍生物，其MIC值与长蝽素的相当，因此出乎意料地对肽的活性没有负面影响。优选的最低成本实施例为SEQ ID NO.50中Arg19用鸟氨酸取代。该衍生物比长蝽素稳定得多(60分钟)，而活性大致相同。另一C末端稳定化的优选实施例是羧基官能(Sub₂)酰胺化为丙酰胺(SEQ ID NO.58)。保持抗菌活性，且半衰期也高于120分钟。

在第19位(X₄残基)稳定化的衍生物中，进一步的实施例在第15位(X₃残基)取代为精氨酸衍生物或其它阳离子氨基酸。优选实施例为SEQ ID NO.65-70，具有Agp，Arg(NO₂)，N-Me-Arg，Har和Orn的不同组合。最节约成本的优选实施例为SEQ ID NO.72，在第15和第19位(X₃和X₄残基)为鸟氨酸，半衰期超过360分钟，活性与长蝽素相当(抗大肠杆菌的MIC为8μg/mL)。除Orn15和Orn16外，SEQ ID NO.74还在第18位将谷氨酰胺取代为天冬酰胺，这导致活性稍高(抗大肠杆菌的MIC为4μg/mL)。SEQ ID NO.71中第15位(X₃残基)的Orn和C末端(Sub₂)用丙酰胺酰胺化的组合是另一非常优选的实施例，具有惊人地高活性(4μg/mL抗大肠杆菌)和极高的血清稳定性(＞360分钟)。与第19位(X₄残基)的Orn联合，在优选的SEQ ID NO.63中进行第15位(X₃残基)的羟基脯氨酸非阳离子型取代。该衍生物也具有高活性(4μg/mL抗大肠杆菌，8μg/mL抗藤黄微球菌)和出色的稳定性(＞360分钟)。在长蝽素第4、8或13位用羟基脯氨酸取代脯氨酸(SEQ ID NO.21-24)对MIC值没有影响，也不降低在第15位(X₃残基)的第二不稳定切割位点的蛋白酶抗性。尽管这种用羟基脯氨酸的置换对MIC值和血清稳定性都没有影响，出乎意料地，这种置换降低了细胞毒性和溶血作用。

长蝽素N末端修饰的优选实施例是在第1位(X₁残基)有Orn取代的SEQ IDNO.82，其抗菌活性与长蝽素相同。N末端氨基官能的乙酰化、甲酰化或胍基化(Sub₁；SEQ ID NO.80，81，83，84，85)降低活性至例如128μg/mL或32。(抗大肠杆菌或藤黄微球菌；SEQ ID NO.81)。

通过硫酯桥将穿透素与所述抗菌肽N末端的氨基官能偶联。这一修饰能将目前对藤黄微球菌几乎没有活性的所述肽的活性谱扩展至包括该细菌。红蝽抗菌肽(SEQ ID NO.91)的MIC值以最大程度从128μg/mL降低到穿透素-红蝽抗菌肽(SEQ ID NO.98)的4μg/mL，这相当于活性提高32倍。穿透素-蜜蜂抗菌肽(8μg/mL，SEQ ID NO.94)也比未修饰的蜜蜂抗菌肽1b(64μg/mL SEQ IDNO.87)活跃8倍。对于MIC值为8μg/mL的长蝽素(SEQ ID NO.18)，活性仍增高2倍至穿透素-长蝽素(SEQ ID NO.100)观察到的4μg/mL。在穿透素-果蝇抗菌肽构建物(1μg/mL，SEQ ID NO.96)中，保持果蝇抗菌肽的高活性(0.5μg/mL，SEQ ID NO.89)。

将第13和第15位脯氨酸用反-4-羟基脯氨酸置换，以及Arg19用鸟氨酸置换(SEQ ID NO.108)意外产生2μg/mL的抗大肠杆菌活性，比天然长蝽素序列(4μg/mL，SEQ ID NO.18)提高，而仍保持高稳定性。若第16位的异亮氨酸用叔丁基甘氨酸(SEQ ID NO.110)置换，则抗大肠杆菌的MIC值保持在2μg/mL。在此，感兴趣的主要是稳定性的提高。

肽SEQ ID NO.107的活性显示与长蝽素(SEQ ID NO.18)相同的抗藤黄微球菌抗生素作用。序列SEQ ID NO.113-118为比较实施例。用D-氨基酸合成的衍生物(SEQ ID NO.115和116)显示没有抗大肠杆菌的活性，仅有微弱的抗藤黄微球菌活性(64或128μg/mL)。

所有D氨基酸以自然顺序排列的D-肽(SEQ ID NO.115和116)以及逆反向合成的肽(SEQ ID NO.117和118)都仅显示微弱的抗大肠杆菌活性(64-256μg/mL)。然而，所有用D-氨基酸合成的肽(SEQ ID NO.115-118)仍显示相对良好的抗藤黄微球菌活性，MIC值在16-32μg/mL之间，其在L-肽的区域内具有5个正的净电荷。D-肽抗藤黄微球菌的所述电荷依赖型活性和MIC值可能表明该革兰氏阳性菌中靶蛋白非特异性作用机制。

表8：抗病原体大肠杆菌DSM 10233、肺炎杆菌DSM 681和绿脓假单胞菌DSM 3227的抗菌活性。1％TSB中测定的最低抑制浓度(MIC)。

研究了表8所示肽抗病原细菌如大肠杆菌DSM 10233、肺炎杆菌DSM 681和绿脓假单胞菌DSM3227的MIC。所有在第15位具有4-反-羟基脯氨酸的衍生物(SEQ ID NO.63，108，113和114)惊人地具有比长蝽素(SEQ ID NO.18)高多至16倍的抗大肠杆菌DSM10233活性，MIC值在1-4μg/mL之间。

表10给出了一些肽和肽衍生物抗多重耐药性细菌菌株的MIC值。该情况中，在与1％TSB相当的Mueller-Hinton培养基(1/4浓缩)中进行测试。表9显示一些测试的耐药性细菌菌株，表11显示所测肽。

表9：测试的多重耐药性革兰氏阴性菌

表10：抗多重耐药性细菌的抗菌活性。在1/4 Muller-Hinton培养基中的MIC。

n.d.未测定

^*蜜蜂抗菌肽(SEQ ID NO.87)和果蝇抗菌肽(SEQ ID NO.89)用作比较

表11：所测序列

SEQ ID NO.	序列
		87	GNNRPVYIPQPRPPHPRL-OH
89	GKPRPYSPRPTSHPRPIRV-OH
		18	VDKPPYLPRPRPPRRIYNR-NH₂
24	VDKPPYLPRPRP-4tHyp-RRIYNR-NH₂
		15	VDKPPYLPRPRPPRRIYNNR-NH₂
22	VDKPPYL-4tHyp-RPRPPRRIYNR-NH₂
		14	VDKPPYLPRPRPPRRIYNNR-OH
20	VDKPPYLPRPRPPRPIYNR-OH
		23	VDK-4tHyp-PYLPRPRPPRRIYNR-OH
21	VDKPPYL-4tHyp-RPRPPRRIYNR-OH
		16	VDKPPYLPRPRPPRRIYNRN-OH
5	VDKPPYLPRPKPPRRIYNNR-OH

优选实施例SEQ ID NO.18，22和24意外地显示抗三种不同革兰氏阴性多重耐药细菌大肠杆菌、肺炎杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的至少相同或更高活性。长蝽素(SEQ ID NO.18)抗过量生成β-内酰胺酶的大肠杆菌D31的MIC值为2μg/mL，抗氟喹诺酮耐药性肺炎杆菌012-3132的MIC值为4μg/mL，抗多重耐药性鼠伤寒沙门氏菌ATCC 700408细菌的MIC为0.25μg/mL。除了一个例外(SEQ ID NO.15)，测试的所有酰胺化肽显示抗大肠杆菌和肺炎杆菌菌株的良好MIC值。从SEQ ID NO.2删除Asn19使得长蝽素(SEQ ID NO.18)意外地进一步提高肽的活性。C末端酰胺化不但提高抗大肠杆菌和肺炎杆菌的活性，此外还提高长蝽肽4或长蝽素衍生物的稳定性。

用绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)和普通变形杆菌(Proteus vulgaris)测试了其它革兰氏阴性菌并测定优选实施例SEQ ID NO.18和24的活性。长蝽素(SEQ ID NO.18)针对绿脓假单胞菌39324(MIC 4μg/mL)和对奇异变形杆菌以及普通变形杆菌(128μg/mL)都有活性。长蝽素还对革兰氏阳性腐生性葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)15305有活性，MIC为16μg/mL。因此，本发明所述肽显示了惊人的广谱作用。

表11：抗病原性大肠杆菌DSM 10233、肺炎杆菌DSM 681和绿脓假单胞菌DSM3227的抗菌活性。1％TSB中测定的最低抑制浓度(MIC)。

长蝽素的衍生物显示抗病原细菌如大肠杆菌DSM 10233、肺炎杆菌DSM681和绿脓假单胞菌DSM3227的非常良好活性。在第15位用4-反-羟基脯氨酸取代(SEQ ID NO.63和108)引起抗大肠杆菌DSM10233的1-4μg/mL的惊人高MIC值，这些比长蝽素(SEQ ID NO.18)高16倍。这些衍生物还显示抗肺炎杆菌DSM 681和绿脓假单胞菌DSM 3227的高活性，证明本发明所述肽的广谱作用。

实施例4：荧光显微分析

将HeLa和SH-SY5Y接种到96孔微孔板(GBO公司(Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯霍森)中并孵育过夜。次日，将5，6-羧基荧光素标记的肽或穿透素构建物溶解于新鲜培养基(40μmol/L)并将细胞在其中孵育2小时。细胞用PBS清洗2次并在PBS中用荧光显微镜进行研究。

荧光显微镜的参数

显微镜：Leica DMI6000B(莱卡微系统公司，德国维茨拉尔(Wetzlar))

光源：带金属-卤素灯的Leica EL6000

物镜：N PLAN L 20x 0.40corr

软件：Leica应用套装2.1.8.；Adobe Photoshop CS

图3的荧光显微图显示在40μmol/L 5，6-羧基荧光素标记长蝽素(SEQ IDNO.94)孵育后，在HeLa或SH-SY5Y细胞中荧光不可测得(图3，B和F)。此外，对5，6-羧基荧光素标记的蜜蜂抗菌肽1b、红蝽抗菌肽和果蝇抗菌肽(SEQ IDNO.88、90和92)，不能测得荧光，因此这些抗菌性富脯氨酸肽没有内化。相反，两种细胞系在5，6-羧基荧光素标记的穿透素-长蝽素(SEQ ID NO.102)孵育后，显微图像观察到细胞内的强烈荧光(图3，D和E)，提供了完整构建物内化的证据。

在两种细胞系中，蜜蜂抗菌肽1b、红蝽抗菌肽和果蝇抗菌肽的穿透素构建物(SEQ ID NO.96、98和100)也内化并显示明确的荧光。

实施例5：共聚焦激光扫描显微分析

细菌

将培养过夜的细菌悬液稀释到150x 10⁶细胞/mL并加入5，6-羧基荧光素标记的肽和穿透素构建物(终浓度为30μmol/L)。为淬灭细菌外分子的荧光，加入60当量的5，6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA，默克，德国达姆施塔特)。立即用Leica微系统公司(德国维茨拉尔)的TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜研究细菌内由带标记肽内化产生的荧光。

用5，6-羧基荧光素标记的长蝽素孵育20分钟后，所述肽在细菌膜中积累(图4B)。通过5，6-羧基荧光素和TAMRA之间的荧光共振能量转移(FRET)产生的淬灭效应保持在细胞外部，从而可检测损失以及荧光信号。再过30分钟后，肽在细胞内积累(图4D)。在大肠杆菌中，5，6-羧基荧光素标记的蜜蜂抗菌肽1b、红蝽抗菌肽和果蝇抗菌肽序列(SEQ ID NO.96、98和100)也内化并产生明确的荧光。相反，标记的穿透素构建物较慢到达细胞内部，并在相应孵育时间后引起的荧光微弱许多(图4F)。这一观察与所测得最低抑制浓度相关。因此长蝽素的穿透素构建物(SEQ ID NO.100)的MIC值为32μg/mL，比长蝽素(4μg/mL；SEQ ID NO.18)高8倍，并因而具有显著较低的抗大肠杆菌活性(表7)。即使在90分钟后，仍不能通过荧光显微镜测得穿透素同源二聚体的进入(图4H)。这显示在穿透素构建物中，相对富脯氨酸的肽序列将穿透素作为装载运入细菌细胞内。

相反，在孵育1小时后，5，6-羧基荧光素标记的穿透素同源二聚体进入革兰氏阳性藤黄微球菌细胞并产生明确的荧光信号(图5J)。相同孵育时间后，不能在藤黄微球菌中测得标记的红蝽抗菌肽(图5B)。有穿透素作为带标记穿透素-红蝽抗菌肽中的转运子，所述衍生物在藤黄微球菌中积累并产生强烈荧光信号(图D)。MIC值从红蝽抗菌肽的128μg/mL降至穿透素-红蝽抗菌肽的4μg/mL，这相当于活性提高32倍(表7)。平行地，在穿透素-蜜蜂抗菌肽衍生物(8μg/mL)中测得的活性比蜜蜂抗菌肽1b(64μg/mL)提高8倍。

HeLa和SH-SY5Y细胞

所述细胞在MatTek公司(美国马萨诸塞州艾什兰)的玻璃底培养皿中培养，并与5，6-羧基荧光素标记的穿透素构建物(SH-SY5Y用10μmol/L或HeLa用7μmol/L)孵育2小时或24小时。除去培养基，用PBS清洗两遍并加入新鲜培养基。为了染色细胞核，加入染料Hoechst 33342(复鲁卡化学公司，瑞士布克斯)并再孵育15分钟。立即用TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜分析荧光。以顺序扫描模式记录所有图像，用Leica应用套装高级荧光1.7.1软件(Leica微系统公司)和Adobe Photoshop CS(Adobe系统公司，德国慕尼黑)分析成批图像。

结果显示，通过5，6-羧基荧光素-穿透素作N末端延伸的抗菌肽在2小时内穿透进入细胞。相反，仅用5，6-羧基荧光素标记而没有穿透素序列的抗菌肽不能在细胞内测得，即，这些肽不能穿透外部细胞膜进入测试细胞系中。仅通过穿透素序列才能转运到细胞内部。用Hoechst 33342染料进行的细胞核染色以及用MitoTracker Red CMXRos染料进行的线粒体染色排除了肽在这些细胞器中的定位。相当长的孵育时间(24小时)后，5，6-羧基荧光素所用的荧光集中在细胞核附近。通过高尔基体染色，可测得部分共定位。

实施例6：细胞毒性

HeLa和SH-SY5Y细胞的MTT试验

采用罗氏诊断公司(德国曼海姆)的“细胞增殖试剂盒I”测定肽、肽模拟物和穿透素构建物的细胞毒性。该方法基于通过代谢活性细胞的细胞氧化还原酶还原黄色甲基噻唑二苯基溴化四唑(MTT)(Vistica D T等，Tetrazolium-Based Assays for Cellular Viability-A Critical Examination ofSelected Parameters Affecting Formazan Production.(基于四唑的细胞活力实验-影响甲

生成的选定参数的重要检查)Cancer Research 51：2515-20，1991；Slater T F，Sawyer B和Strauli U.Studies on Succinate-Tetrazolium ReductaseSystems.3.Points of Coupling of 4 Different Tetrazolium Salts.(琥珀酸-四唑还原酶系统的研究3：偶联4种不同四唑盐的位点)Biochimica et Biophysica Acta 11：383-&，1963；Berridge M V和Tan A S.Characterization of the Cellular Reductionof 3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(Mtt)-Subcellular Localization，Substrate Dependence，and Involvement of MitochondrialElectron Transport in Mtt Reduction.(细胞还原3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(Mtt)的特征-Mtt还原的亚细胞定位、底物依赖性以及线粒体电子转运的作用)Archives of Biochemistry and Biophysics 303：474-82，1993)。水不溶性紫色甲的形成与活细胞数量成比例，并能在细胞裂解后光度法检测。

在带过滤盖细胞培养瓶(25cm²)或96孔微孔板(GBO公司(Greiner Bio-OneGmbH，德国弗里肯霍森(Frickenhausen))中，以37℃在5％CO₂和95％空气湿度下进行细胞培养。所有培养基和添加剂从PAA实验品公司(PAALaboratories，奥地利帕斯青(Pasching))获得。在各情况中，添加1％非必需氨基酸和1％青霉素/链霉素到含5％胎牛血清的MEM/谷氨酰胺培养基(HeLa)或含15％胎牛血清的DMEM/HAM′s F-12培养基中(SH-SY5Y)。

将HeLa和SH-SY5Y以2x 10⁴细胞/孔的浓度接种到无菌96孔微孔板中并孵育过夜。细胞用无菌PBS清洗一次，添加溶于100μL新鲜培养基的肽。含12％PBS或12％DMSO的培养基分别用作阴性或阳性对照。孵育(24小时)后，添加10μL MTT试剂至终浓度0.5mg，37℃下再孵育4小时。用含10％十二烷基硫酸钠的0.01mol/L盐酸溶液溶解细胞及结晶的甲

，16小时后用Paradigm^TM微板读数仪(贝克曼库尔特公司，奥地利沃尔斯(Wals))测定590和650nm的吸收。

意外的结果显示，在600μg/mL所测抗菌富脯氨酸肽无一对SH-SY5Y或HeLa细胞有毒性效应(图6)。以三次测定独立进行三次实验，将代谢活性细胞的比例根据含12％PBS培养基的阴性对照进行标准化。结果证实，在1小时孵育时间后，在这些细胞内部不能测得这些肽的荧光标记衍生物(见实施例5)。因此，也可排除与SH-SY5Y和HeLa细胞的胞外靶分子或外部细胞膜中受体的相互作用。

50-400μg/mL稀释系列的三次独立实验作为三次测定来进行穿透素构建物的细胞毒性测试。穿透素单体(SEQ ID NO.105)和穿透素-tau序列作为对照，显示在高达400μg/mL最高浓度时对HeLa细胞无毒性作用(图6)。对于带有抗菌肽的穿透素构建物，在100和400μg/mL间观察到可忽略的微弱毒性效果。穿透素同源二聚体(SEQ ID NO.103)在400μg/mL下几乎为100％毒性，而穿透素-果蝇抗菌肽和穿透素-长蝽素(SEQ ID NO.97和101)显示轻微毒性。在SH-SY5Y细胞的研究中，400μg/mL的穿透素单体和穿透素-tau构建物使生长细胞的比例降至70％。所有穿透素-AMP构建物意外地在优选浓度下显示无毒性作用。

溶血测试

研究肽和肽衍生物细胞毒性的另一可能是溶血测试。研究对人红细胞的溶血活性(Ryge T S和Hansen P R.Potent antibacterial lysine-peptoid hybridsidentified from a positional scanning combinatorial library.(从定位扫描组合库中鉴定的潜在抗菌赖氨酸拟肽杂交物)Bioorganic & Medicinal Chemistry 14：4444-51，2006)，红细胞由莱比锡大学医院(德国)以氯化钠-腺嘌呤-葡萄糖-甘露醇缓冲液中人红细胞浓缩液形式提供(4℃保存)。1000g离心出红细胞，用10倍体积的冷磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.4)清洗3遍。红细胞在PBS中稀释至1％的终浓度。吸取100微升红细胞悬液移入96孔聚苯乙烯微孔板(GBO公司)的V形孔内。然后在各位置中加入溶于PBS的100μL肽，在7个稀释步骤中得到600μg/mL至4.7μg/mL的稀释系列。微孔板在37℃孵育1小时，然后1000*g离心。取100μL上清液移入96孔平底聚苯乙烯微孔板(GBO公司)，在Sunrise微孔板读数仪(泰坎贸易公司，瑞士曼多夫(Mannedorf))测定405nm的吸收以评估血红素基团的释放。PBS或0.1％曲通X-100

((对-叔辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇；复鲁卡化学公司，瑞士布克斯)和蜂毒肽(西格马-阿德瑞奇公司实验化学品公司(SIGMA-Aldrich-Laborchemikalien)，德国托福克琛(Taufkirchen))用作阴性或阳性对照。所有溶血测试独立进行两次作为双重测定，用下式确定溶血程度(Park Y等，A Leu-Lys-rich antimicrobialpeptide：activity and mechanism.(富含Leu-Lys的抗菌肽：活性和机理)Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics 1645：172-82，2003)：

(E_肽-E_PBS)/(ETriton-EPBS)x 100％ E＝405nm的消光

浓度高至600μg/mL的所分析抗菌富脯氨酸肽无一显示溶血活性(表12)。这意味着即便浓度比测得的MIC值高100倍，仍观察不到人红细胞的裂解。相对于曲通X-100

，所有肽的溶血率仅约1％，这在该测试的误差限制内。用非离子型表面活性剂曲通X-100

作为阳性对照，因为在本实验设定中，它在1小时内完全破坏血红细胞。蜜蜂毒素蜂毒肽是具有α-螺旋的肽，即使浓度为5μg/mL，对生物膜有强裂解作用并破坏原核及真核细胞膜。本细胞测试显示所述肽和肽衍生物可以高血液浓度使用，而对人红细胞没有副作用。

表12：所选抗菌肽的溶血程度

图例：

图1显示长蝽素类似物(Ala-扫描)在琼脂扩散试验中抗大肠杆菌BL21 AI的抗菌活性。斜纹柱表明部分抑制。

图2显示长蝽素类似物(丙氨酸扫描)在琼脂扩散试验中抗藤黄微球菌ATCC 10240的抗菌活性。

图3显示HeLa与SH-SY5Y细胞在用5，6-羧基荧光素标记的长蝽素(CF-长蝽素SEQ ID NO.94)和穿透素-长蝽素(CF-穿透素-长蝽素SEQ ID NO.102)孵育后的荧光显微图。顶行：相差；底行：荧光(517nm发射)。A，B：CF-长蝽素孵育的SH-SY5Y；C，D：CF-穿透素-长蝽素孵育的SH-SY5Y；E，F：CF-长蝽素孵育的HeLa；G，H：CF-穿透素-长蝽素孵育的HeLa。标尺相当于20μm。

图4显示大肠杆菌BL21 A1的共聚焦激光扫描显微图。肽浓度30μmol/L；TAMRA浓度180μmol/L。顶行：相差；底行：荧光。A，B：CF-长蝽素孵育20分钟；C，D：CF-长蝽素孵育50分钟；E，F：CF-穿透素-长蝽素孵育50分钟；G，H：CF-穿透素同源二聚体孵育90分钟。标尺相当于5μm。

图5显示藤黄微球菌10240的共聚焦激光扫描显微图。肽浓度30μmol/L；TAMRA浓度180μmol/L。顶行：相差；底行：荧光。A，B：CF-红蝽抗菌肽；C，D：CF-穿透素-红蝽抗菌肽；E，F：CF-果蝇抗菌肽；G，H：CF-穿透素-果蝇抗菌肽；I，J：CF-穿透素同源二聚体。标尺相当于5μm。

图6显示用“细胞增殖试剂盒I”测定的抗菌肽对SH-SY5Y(斜纹柱)和HeLa细胞(黑色柱)的细胞毒性测试结果。在含600μg/mL长蝽素、长蝽素R15O R19O、果蝇抗菌肽和蜜蜂抗菌肽1b(SEQ ID NO.18，72，89和87)的培养基中孵育24小时后测试。阳性对照为12％DMSO和100μg/mL蜂毒肽。根据阴性对照12％PBS进行标准化。

图7显示用“细胞增殖试剂盒I”测定的穿透素构建物对HeLa细胞的细胞毒性测试结果。在含50-400μg/mL穿透素-果蝇抗菌肽(SEQ ID NO.96)、穿透素-蜜蜂抗菌肽1b(SEQ ID NO.94)、穿透素-红蝽抗菌肽(SEQ ID NO.98)、穿透素-长蝽素(SEQ ID NO.100)、穿透素同源二聚体(SEQ ID NO.102)、穿透素(SEQ ID NO.105)的培养基中孵育24小时后测试。阴性对照为12％PBS，阳性对照为12％DMSO。

图8显示用“细胞增殖试剂盒I”测定的穿透素构建物对SH-SY5Y细胞的细胞毒性测试结果。在含50-400μg/mL穿透素-果蝇抗菌肽(SEQ ID NO.96)、穿透素-蜜蜂抗菌肽1b(SEQ ID NO.94)、穿透素-红蝽抗菌肽(SEQ ID NO.98)、穿透素-长蝽素(SEQ ID NO.100)、穿透素同源二聚体(SEQ ID NO.102)、穿透素(SEQ ID NO.105)、穿透素-tau(SEQ ID NO.106)的培养基中孵育24小时后测试。12％PBS用作阴性对照，12％DMSO作为阳性对照。

图9显示长蝽素、果蝇抗菌肽和蜜蜂抗菌肽1b(SEQ ID NO.18，89和87)的肽溶血测试结果。肽稀释系列为4.7-600μg/mL。阳性对照：蜂毒肽和曲通X-100

，阴性对照为PBS。

图10显示用“细胞增殖试剂盒I”测定的抗菌肽对HeLa细胞的细胞毒性测试结果。在含600μg/mL长蝽素和长蝽素衍生物(SEQ ID NO.18，63，72，107-110)和比较实施例蜜蜂抗菌肽1b和果蝇抗菌肽(SEQ ID NO.87和89)的培养基中孵育24小时后测试。阳性对照为12％DMSO和100μg/mL蜂毒肽。根据阴性对照12％PBS进行标准化。图中显示一式三份的两次独立测试的均值。

Claims

1.一种肽或肽衍生物，其含有以下序列之一：

D₂为天冬氨酸或谷氨酸残基，

K₃为带正净电荷或生理条件下侧链带正电的残基，优选赖氨酸或精氨酸，

X₃为带正净电荷或生理条件下侧链带正电的残基或脯氨酸或脯氨酸衍生物；

L₇选自具有非极性、疏水侧链的残基，优选亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，

I₁₆选自具有非极性、疏水侧链的残基，优选亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基甘氨酸和缬氨酸，

Y₆和Y₁₇在各种情况下为酪氨酸，R₉和R₁₄在各种情况下为精氨酸，N₁₈为天冬酰胺或谷氨酰胺，N₁₉为天冬酰胺或谷氨酰胺或没有，P₄、P₅、P₈、P₁₀、P₁₂、P₁₃和P₁₇彼此独立地选自脯氨酸和脯氨酸衍生物或羟基脯氨酸和羟基脯氨酸衍生物，

Sub₁为氨基酸X₁的游离N末端或经修饰的N末端氨基；

Sub₂为C末端氨基酸的游离C末端羧基(-COOH)或经修饰的C末端羧基。

2.如权利要求1所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述P₁₃和R₁₄被取代和/或选自D₂、P₄、P₅、P₈、P₁₀、P₁₂、P₁₃、P₁₇和Y₁₇的一个或两个残基被任意残基取代。

3.如权利要求1或2所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述N末端与另一肽直接或通过接头连接。

4.如权利要求1-3中任一项所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述肽或肽衍生物在Sub₂中至少含有1个额外残基X₅和/或X₆，其中X₅选自脯氨酸、脯氨酸衍生物和带正净电荷或具有生理条件下带正电侧链的结构单元，其中X₆选自脯氨酸、脯氨酸衍生物、极性结构单元或疏水结构单元。

5.如权利要求1-4中任一项所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述残基X₁选自精氨酸、赖氨酸、δ-羟基赖氨酸、高精氨酸、2，4-二氨基丁酸、β-高精氨酸、D-精氨酸、精氨醛、2-氨基-3-胍基丙酸、硝基精氨酸、N-甲基精氨酸、ε-N-甲基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，2′-二氨基庚二酸、鸟氨酸、对称二甲基精氨酸、不对称二甲基精氨酸、2，6-二氨基己炔酸、对氨基苯甲酸、3-氨基酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、N-甲基亮氨酸、叔丁基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、1-氨基环己基羧酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸和N-甲基缬氨酸。

6.如权利要求1-5中任一项所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述残基X₂和/或X₄彼此独立地选自精氨酸、赖氨酸、δ-羟基赖氨酸、高精氨酸、β-高精氨酸、D-精氨酸、精氨醛、2，4-二氨基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、硝基精氨酸、亚硝基精氨酸、N-甲基精氨酸、ε-N-甲基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，2′-二氨基庚二酸、鸟氨酸、对称二甲基精氨酸、不对称二甲基精氨酸、2，6-二氨基己炔酸、对氨基苯甲酸和3-氨基酪氨酸。

7.如权利要求1-6中任一项所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述残基X₃选自精氨酸、赖氨酸、δ-羟基赖氨酸、高精氨酸、β-高精氨酸、D-精氨酸、精氨醛、2，4-二氨基丁酸、β-高精氨酸、2-氨基-3-胍基丙酸、硝基精氨酸、亚硝基精氨酸、N-甲基精氨酸、ε-N-甲基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，2′-二氨基庚二酸、鸟氨酸、对称二甲基精氨酸、不对称二甲基精氨酸、2，6-二氨基己炔酸、对氨基苯甲酸、3-氨基酪氨酸、脯氨酸、顺-4-羟基脯氨酸、反-4-羟基脯氨酸、顺-3-羟基脯氨酸、反-3-羟基脯氨酸、β-环己基丙氨酸、3，4-顺-甲醇基脯氨酸、3，4-脱氢脯氨酸、高脯氨酸和伪脯氨酸。

8.如权利要求1-7中任一项所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述肽或肽衍生物选自包括SEQ ID NO.5-9、14-26、29、30、32、33、36、38、40、41、44-46、49、50、53-59、61-85、93、94、101、102和107-112的序列组。

9.一种含有抗菌肽和细胞穿透肽的肽或肽衍生物。

10.如权利要求9所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述抗菌肽选自蜜蜂抗菌肽、果蝇抗菌肽、蚁抗菌肽1、红蝽抗菌肽和碧蝽抗菌肽1。

11.如权利要求9所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述抗菌肽包含权利要求1-8中任一项所述的肽或肽衍生物。

12.如权利要求9-11中任一项所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述细胞穿透肽选自穿透素、Tat肽、模拟两性肽、转运素、SynB和含顺-γ-氨基-1-脯氨酸的肽。

13.如权利要求1-12中任一项所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述肽或肽衍生物选自SEQ ID NO.95-102和106。

14.如权利要求1-13中任一项所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述肽主链的至少一个肽键被化学修饰。

15.如权利要求14所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述X₆-X₇之间的键是在生理条件下不能切割的化学键。

16.如权利要求14或15所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述经化学修饰的键选自还原酰胺键、烷基化酰胺键或硫酰胺键。

17.如权利要求1-16中任一项所述的肽或肽衍生物，其特征在于，所述肽或肽衍生物与蛋白质连接或与聚合物偶联或与载体结合。

18.一种其中至少两个肽或肽衍生物彼此相连的多聚体，其特征在于，所述至少1个肽或肽衍生物是如权利要求1-17中任一项所述的肽或肽衍生物。

19.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含至少一种如权利要求1-18中任一项所述的肽、肽衍生物或多聚体。

20.一种生成如权利要求1-18中任一项所述肽或肽衍生物或多聚体的方法，其特征在于，所述肽或肽衍生物或多聚体通过化学合成或通过重组方法生成。

21.如权利要求1-18中任一项所述的肽、肽衍生物或多聚体在生产医药产品中的用途。

22.如权利要求1-18中任一项所述的肽、肽衍生物或多聚体用作消毒剂和/或清洁剂、防腐剂和/或在包装材料中的用途。

23.如权利要求1-18中任一项所述的肽、肽衍生物和/或多聚体在治疗微生物、细菌或真菌感染中的用途。

24.如权利要求1-18中任一项所述的肽、肽衍生物和/或多聚体在消除微生物、细菌或真菌污染中的用途。

25.如权利要求1-18中任一项所述的肽、肽衍生物或多聚体在药学研究或在筛选过程中的用途。

26.一种鉴定具有抗菌或抗真菌作用物质的方法，包括下列步骤：

(i)用下列物质进行竞争性试验：

(a)对如权利要求1-18中任一项所述的肽、肽衍生物或多聚体敏感的微生物；

(b)如权利要求1-18中任一项所述的肽、肽衍生物或多聚体和

(c)至少一种待测化合物，使(a)与(b)和(c)接触；以及

(ii)选择从所述微生物竞争性取代所述肽、肽衍生物或多聚体结合的测试化合物。

27.如权利要求26所述方法，其特征在于，所述微生物选自大肠杆菌(Escherichia coli)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、胞氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、野兔热弗朗西丝菌(Francisellatularensis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium meliloti)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、奇异变形杆菌(Proteus mirabili)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。

28.一种编码如权利要求1-18中任一项所述肽、肽衍生物或多聚体的核酸。

29.一种包含一种或多种如权利要求28所述核酸的宿主细胞。