KR20110120917A - 항생 펩티드 - Google Patents

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KR20110120917A
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랄프 호프만
다니엘 크나페
안나 클라라 브리기테 한센
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에이엠피-테라퓨틱스 게엠베하 운트 코. 카게
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Abstract

본 발명은 하기 식을 갖는 펩티드 또는 펩티드 유도체에 관한 것이다.
Figure pct00032

여기서, X1은 비극성 소수성 기 또는 양으로 하전된 기이고, D2는 아스파라긴 또는 글루타민이고, K3, X2 및 X4는 양으로 하전된 기이고, X3은 양으로 하전된 기, 프롤린 또는 프롤린 유도체이고, L7 및 I16은 비극성 소수성 기이고, Y6 및 Y17은 티로신이고, R9 및 R14는 아르기닌이고, N18 및 N19는 아스파라긴 또는 글루타민이고, P4, P5, P8, P10, P12, P13 및 P17은 프롤린, 히드록시프롤린 또는 이들의 유도체이고, 여기서 가능하게는 D2, P4, P5, P8, P10, P12, P13, P17 및 Y17로부터 선택된 기 중 1개 또는 2개는 임의의 기로 대체되고/거나 P13 및 R14는 교환되고, Sub1은 유리 또는 변형된 N-말단이고, Sub2는 유리 또는 변형된 C-말단이다. 본 발명은 또한 의약에서, 항생제로서, 살균제 또는 세정제에서, 보존제로서 또는 포장 재료에서, 제약 연구에서, 또는 스크리닝 방법에서의 펩티드 및 펩티드 유도체의 용도에 관한 것이다.

Description

항생 펩티드{ANTIBIOTIC PEPTIDES}
본 발명은 특히 의약에 사용하기 위한, 항생 펩티드 및 펩티드 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 미생물, 예컨대 박테리아 또는 진균의 파괴를 위한 조성물 및 방법, 및 미생물 감염의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 활성 물질의 스크리닝을 위한 방법을 포함한다.
심각한 박테리아 및 진균 감염의 발생은 항생제 요법의 주목할 만한 진전에도 불구하고 증가하고 있는 문제이다. 매해 미국에서 4천만명이 넘게 입원하고, 이들 환자 중 2백만명이 넘게 병원에서 감염된다. 항생제-내성 박테리아는 이러한 경우의 50 내지 60％와 관련된다 (문헌 [Tomasz A. Multiple-Antibiotic-Resistant Pathogenic Bacteria - A Report on the Rockefeller-University Workshop. New England Journal of Medicine 330:1247-51, 1994]). 이러한 병원-획득 질환은 미국에서 60,000 내지 70,000명의 사망 및 독일에서 최대 10,000명의 사망을 초래하는 것으로 추정된다 (문헌 [Wenzel R P. The Mortality of Hospital-Acquired Blood-Stream Infections - Need for A New Vital Statistic. International Journal of Epidemiology 17:225-7, 1988]). 1970년대에는 내성 그람-음성 박테리아가 주요 문제점이었던 반면, 지난 십년 동안에는 여러 항생제에 내성을 갖는 그람-양성 박테리아가 소정의 역할을 하는 경우가 증가하였다 (문헌 [Moellering R C. Emerging resistance with gram-positive aerobic infections: Where do we go from here? Introduction: Problems with antimicrobial resistance in gram-positive cocci. Clinical Infectious Diseases 26:1177-8, 1998]). 최근 내성 균주의 급속한 발생은 그람-양성 및 그람-음성 병원체 모두와 관련된다 (문헌 [Hand W L. Current challenges in antibiotic resistance. Adolescent Medicine 11:427-38, 2000]). 내성은 단일 돌연변이가 임상적으로 중요한 수준에 이르기에 충분한 종, 예를 들어 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에서 처음 발생하였고, 다음에는 다중 돌연변이가 필수적이었던 박테리아, 예를 들면 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 네이세리아 고노레아에(Neisseria gonorrhoeae)였다. 이는 우선적으로 플로로퀴놀론 항생제의 빈번한 사용 때문이다 (문헌 [Hooper D C. Emerging mechanisms of fluoroquinolone resistance. Emerging Infectious Diseases 7:337-41, 2001]). 그람-음성 박테리아에서 내성 발생의 또 다른 중요한 원인은 에스케리키아 콜라이 및 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)에서의 락타마제의 넓은 범위이다 (문헌 [Jones R N. Resistance patterns among nosocomial pathogens - Trends over the past few years. Chest 119:397S-404S, 2001]). 연성 하감의 원인이 되는 물질인 헤모필루스 듀크레이(Hae mophilus ducreyi)의 임상적으로 관련된 균주의 거의 절반이 이 박테리아를 아목시실린, 암피실린 및 여러 다른 β-락탐에 내성을 갖도록 하는 유전자를 보유한다 (문헌 [Prachayasittikul V, Lawung R, ＆ Bulow L. Episome profiles and mobilizable beta-lactamase plasmid in Haemophilus ducreyi. Southeast Asian J Trop Med Public Health 31:80-4, 2000]). 이와 유사하게, 테트라시클린에 대한 살모넬라 엔테리카(S almonella enterica) 혈청형 변이주 티피뮤리움(typhimurium)의 내성은 1948년에 0％에서 1998년에 98％까지 상승하였다 (문헌 [Teuber M. Spread of antibiotic resistance with food-borne pathogens. Cellular and Molecular Life Sciences 56:755-63, 1999]).
이는 새로운 항생제를 위한 추가의 조사에 대한 필요를 설명한다. 유도가능한 항박테리아 펩티드는 현대 생화학, 면역학 및 활성 물질로의 연구가 함께 모이는 연구의 분야를 나타낸다. 13개 내지 100개 초과의 아미노산 크기 범위의 항생 펩티드가 식물, 동물 및 미생물로부터 단리되었다 (문헌 [Boman H G. Peptide Antibiotics and Their Role in Innate Immunity. Annual Review of Immunology 13:61-92, 1995]). 단일 동물은 각각의 펩티드가 완전히 상이한 활성 스펙트럼을 나타내기도 하는, 대략 6개 내지 10개 펩티드 항생제를 갖는다 (문헌 [Barra D, Simmaco M, ＆ Boman H G. Gene-encoded peptide antibiotics and innate immunity. Do 'animalcules' have defense budgets? Febs Letters 430:130-4, 1998]). 많이 연구된 디펜신스, 세크로핀 및 마가이닌을 포함하는 압도적인 수의 항박테리아 펩티드는 "용해/이온" 메카니즘에 의해 작용한다고 알려져 있다. 박테리아 세포질 막에 대한 투과 효과는 이러한 "용해" 펩티드의 작용의 공통적인 메카니즘으로 논의되었다 (문헌 [Ludtke S, He K, ＆ Huang H. Membrane thinning caused by magainin 2. Biochemistry 34:16764-9, 1995]; [Wimley W C, Selsted M E, ＆ White S H. Interactions Between Human Defensins and Lipid Bilayers - Evidence for Formation of Multimeric Pores. Protein Science 3:1362-73, 1994]; [Shai Y. Molecular Recognition Between Membrane-Spanning Polypeptides. Trends in Biochemical Sciences 20:460-4, 1995]). 지질 이중층에서 친수성 이온 (양성자) 채널을 형성하는 양이온성 양친매성 구조가 이러한 활성의 근거이다. 양성자의 유출 때문에, 다수의 근본적인 생명 과정을 위해 필요한 막 전위가 교란되어, 그 결과 세포가 사멸된다. 이러한 펩티드에 의한 막의 교란이 키랄 분자의 인식에 의존하므로, 일반적인 양친매성 구조 또는 기본적인 순전하를 제거하지 않은 교환이 기능적으로 허용된다 (문헌 [Wade D et al. All-D Amino Acid-Containing Channel-Forming Antibiotic Peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87:4761-5, 1990]; [Steiner H, Andreu D, ＆ Merrifield R B. Binding and Action of Cecropin and Cecropin Analogs - Antibacterial Peptides from Insects. Biochimica et Biophysica Acta 939:260-6, 1988]). 보다 높은 농도에서 이러한 용해 펩티드는 종종 가능한 의약품으로서 그의 적합성을 제한하는 포유동물 막에 대한 독성 작용을 갖는다. 프롤린이 α-나선형 항미생물 펩티드의 서열에 삽입되면, 에스케리키아 콜라이의 세포질 막을 투과하는 펩티드의 용량이 프롤린 잔기의 수의 함수로서 감소한다. 이를 조사하였을 때, 적어도 일부 그람-음성 병원체에 대해, 가장 활성인 천연 항박테리아 펩티드 중 일부가 프롤린-풍부 펩티드 부류에 속한다는 것이 놀라웠다 (문헌 [Otvos L et al. Insect peptides with improved protease-resistance protect mice against bacterial infection. Protein Science 9:742-9, 2000]).
상기 기재된 부작용은 특히 포유동물 유사체와 교차-반응성을 나타내지 않으면서 박테리아 단백질 또는 다른 세포내 또는 세포외 성분을 인식하는 항미생물 펩티드 (AMP)에 의해 극복된다. 이것은 본래 곤충으로부터 단리된 아피다에신, 드로소신 및 피로코리신을 비롯하여 프롤린-풍부 항미생물 펩티드에 적용되는 것으로 보인다. 크기 및 생화학적 성질의 큰 변화와 함께, 구조-활성 및 형태-활성 관계가 항박테리아 펩티드 연구의 초점이라는 것은 놀랍지 않다. 생물학적 힘에 대한 천연 항박테리아 펩티드 레퍼토리의 완전한 조사는 일반적인 생화학적 질문에 중요할 뿐만 아니라 제약 산업에 있어 꾸준한 관심사이다. 펩티드-기재 항생제를 사용하는 시험관내 시험의 문제점에도 불구하고, 일부 천연 양이온성 항박테리아 펩티드는 이미 임상 시험 상에 도달하였다 (문헌 [Boman H G. Peptide Antibiotics and Their Role in Innate Immunity. Annual Review of Immunology 13:61-92, 1995]). 이러한 펩티드 중 일부는 초기 임상 시험 상에서 국소 (국부) 작용제로서의 활성을 나타낸 반면, 다른 것은 전신 요법에서 활성이었다. 예를 들어, 수막구균혈증의 부모 치료에 사용된 양이온성 단백질 rBPI 21은 임상 검사의 제3상을 완료하였다 (문헌 [Boman H G. Peptide Antibiotics and Their Role in Innate Immunity. Annual Review of Immunology 13:61-92, 1995]).
프롤린-풍부 펩티드 부류 (예를 들어, 아피다에신, 드로소신 및 피로코리신)는 그의 막의 투과에 의해서 뿐만 아니라 하나 이상의 표적 단백질에 입체특이적으로 결합하여 박테리아를 사멸시킨다. 이러한 가능한 상호작용 파트너 (지금까지는 열-충격 단백질 DnaK가 철저하게 연구됨) (문헌 [Kragol G et al. Identification of crucial residues for the antibacterial activity of the proline-rich peptide, pyrrhocoricin. European Journal of Biochemistry 269:4226-37, 2002]; [Kragol G et al. The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK and prevents chaperone-assisted protein folding. Biochemistry 40:3016-26, 2001])는 프롤린-풍부 펩티드에 의해 억제되며, 아마도 정확한 단백질 폴딩이 방해되어 결국 세포 사멸을 초래할 것이다. 또한, 프롤린-풍부 펩티드는, 한정된 2차 구조를 갖는 AMP, 예컨대 멜리틴 또는 그라미시딘에 대한 극명한 대조에서, 시험관내에서 진핵 세포에 대해 용혈 효과 또는 독성 효과를 나타내지 않는 것으로 보인다. 항미생물 활성과 함께, 주로 포유동물 혈청에서의 안정성 (25％)은 신규 펩티드-기재의 항생제의 개발에 결정적인 영향을 미친다. 예를 들어, 드로소신은 1시간 내에 분해된 반면, 피로코리신은 120분의 반감기를 가졌으며, 프로테아제에 대해 훨씬 더 안정하였다.
슈나이더(Schneider) 및 도른(Dorn)에 의한 생물학적 실험 (2001년)에서 (문헌 [Schneider M ＆ Dorn A. Differential infectivity of two pseudomonas species and the immune response in the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus (Insecta: Hemiptera). Journal of Invertebrate Pathology 78:135-40, 2001]), 긴노린재과(L ygaeidae family)로부터의 유액 분비 곤충 온코펠투스 파스시아투스(Oncopeltus fasciatus)의 애벌레 및 번데기를 두 가지 상이한 그람-음성 슈도모나스 종으로 감염시키고, 그의 면역 반응을 분석하였다. 온코펠투스 파스시아투스의 애벌레를 인간 병원체 슈도모나스 아에루기노사로 감염시키면 48시간 후에 모든 개체가 사멸하는 반면, 덜 병원성인 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로 감염된 개체 중 71％가 적어도 96시간 동안 생존하였다. 이어서, 유즙 분비 곤충의 애벌레를 우선 슈도모나스 푸티다로 감염시키고, 24시간 후에 슈도모나스 아에루기노사로 감염시키면, 처음 24시간 이내에 이중 감염된 개체의 생존률이 73％로 현저하게 상승하였다. 이어서, 곤충이 침입 미생물에 대해 그의 선천성 면역계의 범위 내에서 스스로를 방어하게 하는 항박테리아 펩티드의 합성의 가능한 유도를 연구하였다. 4개의 펩티드 (온코펠투스 항박테리아 펩티드 1-4)는 15, 8, 5 또는 2 kDa의 분자량을 갖는 것으로 확인되었고, 항박테리아 작용을 담당하도록 유지하였다. 에드만에 따른 서열 분석은, 펩티드 1 (15 kDa)에 대한 34개 아미노산의 긴 부분적인 서열 뿐만 아니라, 또한 프롤린-풍부 2 kDa 펩티드 4의 불완전 서열을 발견하였다. 위치 19로부터 시작하여 C-말단 서열 및 위치 11의 아미노산은 명확하게 확인할 수 없었다. 정확한 분자량은 알려져 있지 않다.
최근에 공지된 항생 펩티드 서열의 선택은 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
신규 항박테리아 및 항진균 화합물, 신규 항박테리아 및 항진균 제약 조성물 뿐만 아니라, 신규 제약 항생제를 검출하기 위해, 이들을 사용하는 방법, 및 활성 물질을 스크리닝하는데 사용될 수 있는 화합물이 여전히 요망되고 있다.
본 발명에 의해 해결될 문제는 증가된 안정성을 갖는 신규 항생 펩티드를 제공하는 것, 그람-양성 박테리아에 대한 AMP의 작용 스펙트럼을 확장하여 최신의 넓은-스펙트럼 항생제를 이용가능하도록 하는 것 및 펩티드를 진핵 세포에 도입하여 숨은 박테리아를 박멸하는 것이다.
상기 문제는 하기 식 1을 갖는 본 발명에 따른 펩티드 및 펩티드 유도체에 의해 해결된다.
[식 1]
Figure pct00003
여기서,
X1은 비극성 소수성 측쇄, 또는 순 양전하 또는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는 잔기이고,
D2는 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기이고,
K3은 순 양전하 또는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는 잔기, 바람직하게는 리신 또는 아르기닌이고,
X2 및 X4는 순 양전하 또는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는 잔기로부터 서로 독립적으로 선택되고,
X3은 순 양전하 또는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는 잔기, 또는 프롤린 또는 프롤린 유도체이고,
L7 및 I16은 비극성 소수성 측쇄를 갖는 잔기, 바람직하게는 류신, 이소류신 및 발린으로부터 서로 독립적으로 선택되고,
Y6 및 Y17은 각각의 경우에 티로신이고, R9 및 R14는 각각의 경우에 아르기닌이고, N18은 아스파라긴 또는 글루타민이고, N19는 아스파라긴 또는 글루타민이거나 또는 존재하지 않고, P4, P5, P8, P10, P12, P13 및 P17은 프롤린 및 프롤린 유도체 또는 히드록시프롤린 및 히드록시프롤린 유도체로부터 서로 독립적으로 선택되고,
여기서 임의로 P13 및 R14는 교환되고/거나,
임의로 D2, P4, P5, P8, P10, P12, P13, P17 및 Y17로부터 선택된 잔기 중 1개 또는 2개는 임의의 잔기로 대체되고,
Sub1은 아미노산 X1의 유리 N-말단 또는 변형된 N-말단 아미노 기이고,
Sub2는 C-말단 아미노산의 유리 C-말단 카르복실 기 (-COOH) 또는 변형된 C-말단 카르복실 기이다.
특히 바람직한 실시양태에서, I16은 류신, 이소류신, tert-부틸글리신 및 발린을 포함하는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, P17이 존재하는 경우에 N19는 존재하지 않는다.
하기 식 1 내지 3 중 하나를 갖는 펩티드 및 펩티드 유도체가 바람직하다.
[식 2]
Figure pct00004
[식 3]
Figure pct00005
[식 4]
Figure pct00006
여기서,
X1은 비극성 소수성 측쇄, 또는 순 양전하 또는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는 잔기이고,
D2는 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기이고,
K3은 순 양전하 또는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는 잔기, 바람직하게는 리신 또는 아르기닌이고,
X2 및 X4는 순 양전하 또는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는 잔기로부터 서로 독립적으로 선택되고,
X3은 순 양전하 또는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는 잔기, 또는 프롤린 또는 프롤린 유도체이고,
L7 및 I16은 비극성 소수성 측쇄를 갖는 잔기, 바람직하게는 류신, 이소류신 및 발린으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
특히 바람직한 실시양태에서, I16은 류신, 이소류신, tert-부틸글리신 및 발린을 포함하는 군으로부터 선택된다.
Y6 및 Y17은 각각의 경우에 티로신이고, R9 및 R14는 각각의 경우에 아르기닌이고, N18 및 N19는 각각의 경우에 아스파라긴 또는 글루타민이고, P4, P5, P8, P10, P12, P13 및 P17은 프롤린 및 프롤린 유도체 또는 히드록시프롤린 및 히드록시프롤린 유도체로부터 서로 독립적으로 선택된다.
임의로 D2, P4, P5, P8, P10, P12, P13, P17 및 Y17로부터 선택된 잔기 중 1개 또는 2개가 임의의 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 잔기, 특히 바람직하게는 중성 극성 잔기로 대체된다.
또한, P13 및 R14는 임의로 교환된다.
순 양전하 또는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는 잔기는 바람직하게는 아르기닌, 리신, δ-히드록시리신, 호모아르기닌, 2,4-디아미노부티르산, β-호모아르기닌, D-아르기닌, 아르기날 (아르기닌에서 -COOH가 -CHO로 대체됨), 2-아미노-3-구아니디노프로피온산, 니트로아르기닌 (바람직하게는, N(G)-니트로아르기닌), 니트로소아르기닌 (바람직하게는, N(G)-니트로소아르기닌), 메틸아르기닌 (바람직하게는, N-메틸-아르기닌), ε-N-메틸리신, 알로-히드록시리신, 2,3-디아미노프로피온산, 2,2'-디아미노피멜산, 오르니틴, sym-디메틸아르기닌, asym-디메틸아르기닌, 2,6-디아미노헥신산, p-아미노벤조산 및 3-아미노티로신 및 덜 바람직하게는 히스티딘, 1-메틸히스티딘 및 3-메틸히스티딘을 포함하는 군으로부터 선택된다. X1, X2 및 X3은 바람직하게는 이 목록으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
용어 프롤린 유도체는 바람직하게는 관능기의 구조적인 변형에 의해 프롤린으로부터 수득된, 프롤린으로부터 유래된 아미노산 잔기를 나타낸다. 바람직한 프롤린 유도체는 β-시클로헥실알라닌, 3,4-시스-메타노프롤린, 3,4-데히드로프롤린, 호모프롤린 또는 슈도프롤린을 포함하는 군으로부터 선택된다. 용어 히드록시프롤린은 특히 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시프롤린, 시스-3-히드록시프롤린 및 트랜스-3-히드록시프롤린을 포함한다. 이에 상응하여, 용어 히드록시프롤린 유도체는 바람직하게는 관능기의 구조적인 변형에 의해 히드록시프롤린으로부터 수득된, 히드록시프롤린으로부터 유래된 아미노산 잔기를 나타낸다. 바람직한 히드록시프롤린 유도체는 히드록시-β-시클로헥실알라닌 및 상기 언급된 프롤린 유도체로부터 선택되며, 이들은 히드록실 기로 치환된다.
중성 잔기는 생리적 조건하에 비하전된 측쇄를 갖는 잔기이다.
극성 잔기는 바람직하게는 측쇄에서 적어도 하나의 극성 기를 갖는다. 이들은 바람직하게는 히드록실, 술프히드릴, 아민, 아미드 또는 에스테르 기, 또는 수소 브릿지의 형성을 허용하는 다른 기를 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직한 중성 극성 잔기는 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시트룰린, N-메틸세린, 호모세린, 알로-트레오닌 및 3,5-디니트로티로신 및 β-호모세린을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, P5는 β-시클로헥실알라닌, 3,4-시스-메타노프롤린, 3,4-데히드로프롤린, 호모프롤린 또는 슈도프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 시스-3-히드록시프롤린, 트랜스-3-히드록시프롤린, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시트룰린, N-메틸세린, 호모세린, 알로-트레오닌 및 3,5-디니트로티로신 및 β-호모세린을 포함하는 군으로부터 선택된다.
비극성 소수성 측쇄를 갖는 잔기는 바람직하게는 0 초과, 특히 바람직하게는 3 초과의 친수도 인덱스를 갖는, 생리적 조건하에 비하전된 잔기이다. 바람직한 비극성 소수성 측쇄는 1개 내지 10개, 바람직하게는 2개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 알킬렌, 알콕시, 알켄옥시, 알킬술파닐 및 알케닐술파닐 잔기, 또는 5개 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 아릴 잔기를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직한 비극성 소수성 측쇄를 갖는 잔기는 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 알라닌, 페닐알라닌, N-메틸류신, tert-부틸글리신, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, 1-아미노시클로헥실카르복실산, N-메틸이소류신, 노르류신, 노르발린 및 N-메틸발린으로부터 선택된다.
"생리적 조건"은 pH 6 내지 8의 pH 및 30℃ 내지 40℃의 온도, 바람직하게는 37℃의 온도, 7.4의 pH 및 300 mosmol/kg의 삼투압을 의미한다.
본 발명에 따른 펩티드 또는 펩티드 유도체는 바람직하게는 적어도 19개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 50개까지의 아미노산 잔기를 함유한다.
Sub1은 아미노산 X1의 유리 N-말단 또는 변형된 N-말단 아미노 기이다. Sub2는 C-말단 아미노산의 유리 C-말단 카르복실 기 (-COOH) 또는 변형된 C-말단 카르복실 기이다. "변형된 N-말단 아미노 기" 및 "변형된 C-말단 카르복실 기"는 아미노 기 또는 카르복실 기가 변경 (예를 들어, 환원 또는 치환)되는 것을 의미한다.
따라서, Sub1은 식 NR1R2를 갖는 아미노산 X1의 유리 N-말단 또는 N-말단 아미노 기의 변형 (아미노산 X1의 N-말단 아미노 기가 Sub1로 대체됨)을 나타낸다. Sub1 = NR1R2, 여기서 R1 및 R2는 서로 독립적으로, 바람직하게는 수소 또는 하기 기로부터 선택된다:
(i) 선형, 분지형, 시클릭 또는 헤테로시클릭 알킬 기, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 시클로헥실,
(ii) 선형, 분지형, 시클릭 또는 헤테로시클릭 알카노일 기, 예를 들어 아세틸 또는 메타노일 (포르밀), 프로피오닐, n-부티릴, 이소부티릴, 펜타노일, 헥사노일 또는 시클로헥사노일,
(iii) 리포터 기, 바람직하게는 형광 염료 (예를 들어, 플루오레세인, 알렉사488) 또는 비오틴,
(iv) COR3 (하기 참조)과 함께, 시클릭 펩티드를 수득하기 위한 N- 및 C-말단 사이의 링커 (예를 들어, 구아니딘, 에틸렌 글리콜 올리고머, 2,4-디아미노부티르산, 2,3-디아미노프로피온산, 2,2'-디아미노피멜산, 데스모신 또는 이소데스모신을 기재로 함),
(v) 특정한 화학물질 또는 효소 반응에 의해 추가의 펩티드 또는 펩티드 유도체 (Y1)를 커플링하기 위한 링커 (예를 들어, 요오도-, 브로모- 또는 클로로알칸산 (예를 들어, 요오도아세트산)을 기재로 함) 또는 티올-함유 펩티드에 커플링시키기 위한 말레이미드 또는 또한 제2 펩티드 또는 펩티드 유도체를 (예를 들어, 활성 에스테르, 알데히드 또는 티오에스테르로서) 담체 단백질로서 커플링시키기 위한 또 다른 반응성 기 (예를 들어, 아미노 기, 티올 기),
(vi) 또 다른 펩티드 또는 펩티드 유도체 Y1이 커플링되는, (v)에 언급된 링커.
N-말단 변형의 예는 아세틸화된, 포르밀화된 또는 구아닐화된 N-말단이다.
바람직하게는 또 다른 펩티드 또는 펩티드 유도체 Y1은 Sub1을 통해 커플링된다. Y1은 바람직하게는 바이오폴리머 (예를 들어, 펩티드)로, 이는 식 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 항미생물 펩티드를 박테리아에 도입하여 이 박테리아에 대한 항미생물 펩티드의 활성을 증가시키고/거나 이를 포유동물 세포에 도입하여 포유동물 세포에 숨겨진 박테리아를 처치하는 것을 가능하게 한다. Y1은 펩티드의 X1에 Sub1을 통해 영구적으로 (예를 들어, Sub1 = NH2의 경우 펩티드 또는 아미딘 결합 또는 Sub1 = SH, 요오도아세테이트 또는 말레이미드의 경우 티오에테르) 또는 특정 조건하에 절단가능한 화합물 (예를 들어, 디술피드 브릿지 또는 산-불안정 링커)에 의해 커플링된다. Y1에 바람직한 서열은 세포-침투 펩티드 (CPP), 예를 들어 페네트라틴, Tat 펩티드, 모델 양친매성 펩티드 및 트랜스포르탄이다 (문헌 [Langel, U. in Handbook of Cell-Penetrating Peptides 5-28 (CRC - Taylor ＆ Francis Group, 2006)]).
링커는 두 물질을 커플링하는데 사용되는 분자 또는 분자의 기에 대한 명칭이고, 바람직한 링커는 2개의 반응성 기를 함유하는 링커 (예를 들어, 요오도아세테이트, 말레이미드, 이미도- 또는 NHS-에스테르 또는 히드라지드)를 함유하고, 이는 바람직하게는 10개 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 가교 분자 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)에 의해 연결된다.
Sub2는 C-말단 아미노산의 유리 C-말단 카르복실 기 (-COOH) 또는 변형된 C-말단 카르복실 기이고, 바람직하게는 식 COR3 (R3은 마지막 아미노산의 히드록실 기를 대체함), X5-COR3 또는 X6-COR3 또는 X5X6-COR3을 갖는다.
COR3은 바람직하게는 하기 기로부터 선택된다:
(i) 카르복실 (R3은 유리 히드록실 기임), 에스테르 (R3은 알콕시 기임), 아미드 (R3은 아민임) 또는 이미드,
(ii) Sub1과 함께 N- 및 C-말단을 시클릭 펩티드에 연결하는 링커,
(iii) R3이 Pro, Ile, Leu, Arg 및 Gln을 포함하는 군으로부터 선택되는 추가의 아미노산 잔기이거나 또는 R3이 바람직하게는 적어도 하나의 아미노산이 Pro, Ile, Leu, Arg 또는 Gln을 포함하는 군으로부터 선택되는 2개 내지 6개의 아미노산을 갖는 펩티드 (여기서, 후자는 카르복실 (R3은 유리 히드록실 기임), 에스테르 (R3은 알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소-프로판올 또는 부탄올임), 아미드 (R3은 아미드임) 또는 이미드 (R3은 알킬아민 또는 디알킬아민, 예컨대 메틸아민, 에틸아민, 디메틸아민 또는 시클로헥실아민임)를 갖는 군으로부터의 구성원으로 치환됨)인 COR3,
(iv) R3이 이량체 또는 올리고머 구조를 형성하는 추가의 분지형 아미노산, 예를 들어 리신, 히드록시리신, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 2,3-디아미노프로피온산, 2,2'-디아미노피멜산, 데스모신, 이소데스모신 또는 이러한 분지형 아미노산의 조합인 COR3,
(v) 특정한 화학물질 또는 효소 반응에 의해 또 다른 펩티드 또는 펩티드 유도체 (Y1)를 커플링하기 위한 링커 (예를 들어, 요오도-, 브로모- 또는 클로로알칸산 (예를 들어, 요오도아세트산)을 기재로 함) 또는 티올-함유 펩티드에 커플링시키기 위한 말레이미드 또는 또한 제2 펩티드 또는 펩티드 유도체를 (예를 들어, 활성 에스테르, 알데히드 또는 티오에스테르로서) 담체 단백질로서 커플링시키기 위한 또 다른 반응성 기 (예를 들어, 아미노 기, 티올 기),
(vi) 또 다른 펩티드 또는 펩티드 유도체 Y1이 커플링되는, (v)에 언급된 링커.
이러한 방식으로, C-말단 펩티드 유도체, 예컨대 에스테르 (R3 = 알콕시), 아미드 (R3 = 아민, 예를 들어 -NH2) 또는 이미드 (R2 = 알킬아민, 예를 들어 -NHC3H7), 또는 Pro, Ile, Arg 및 Val을 포함하는 군으로부터 선택되거나 또는 다시 한번 에스테르, 아미드 또는 이미드로서 C-말단 상에서 변형된 추가의 아미노산으로 확장되는 펩티드를 수득할 수 있다. 추가의 펩티드 유도체는 펩티드의 N-말단 또는 C-말단 끝의 변형에 의해 형성될 수 있다. 이러한 변화는 예를 들어 추가의 알킬 또는 알카노일 기 (직쇄 또는 분지형, 시클릭 또는 헤테로시클릭을 가짐) 또는 추가의 구아니디노 기 또는 추가의 거대분자 또는 리포터 잔기 (영구적으로 또는 특정 조건하에 절단가능한 화합물 (예컨대, 디술피드 브릿지 또는 산 불안정 링커)을 통해 커플링됨)일 수 있다.
C-말단의 변형은 바람직하게는 티오에스테르 합성 및 이후의 1급 아민으로의 치환에 의해 일어난다.
본 발명에 따른 펩티드 또는 펩티드 유도체를 형성하는 모든 천연 아미노산, 비천연 아미노산 또는 아미노산 유도체 (예를 들어, 이미노 산)는 L- 또는 D-형태일 수 있다. 그러나, 달리 명시되지 않는 한, 서열에서의 빌딩 블록은 바람직하게는 L-형태이다.
X5 및 X6은 임의로 추가의 잔기이다. X5 및 X6이 존재하지 않는 경우에, 상기 언급된 서열에서 마지막 아르기닌 (Arg)은 유리 C-말단 카르복실 기를 갖거나 또는 Sub2에 연결된다.
적어도 하나의 잔기 X5 및 X6이 존재하는 경우에, 펩티드는 예를 들어 하기 식 중 하나를 갖는다.
[식 5]
Figure pct00007
[식 6]
Figure pct00008
[식 7]
Figure pct00009
여기서,
X5는 프롤린, 프롤린 유도체, 또는 극성 측쇄를 갖는 중성 잔기 (예컨대, 아스파라긴, 글루타민)로부터 선택된다. 바람직한 잔기 X5는 프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시프롤린, 시스-3-히드록시프롤린, 트랜스-3-히드록시프롤린, β-시클로헥실알라닌, 3,4-시스-메타노프롤린, 3,4-데히드로프롤린, 호모프롤린, 슈도프롤린 뿐만 아니라 아스파라긴, 글루타민, 시트룰린, N-메틸세린, N-메틸글리신, 디히드록시페닐알라닌, N-에틸 아스파라긴, N-에틸글리신, 호모세린, 페니실라민, 테트라히드로피라닐글리신, 알로-트레오닌 및 3,5-디니트로티로신을 포함하는 군으로부터 선택된다.
X6은 프롤린, 프롤린 유도체, 극성 잔기 (예컨대 세린) 또는 소수성 잔기로부터 선택된다. 바람직한 잔기 X6은 프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시프롤린, 시스-3-히드록시프롤린, 트랜스-3-히드록시프롤린, β-시클로헥실알라닌, 3,4-시스-메타노프롤린, 3,4-데히드로프롤린, 호모프롤린 또는 슈도프롤린, 세린, 트레오닌, δ-히드록시리신, 시트룰린, 호모세린 또는 알로-트레오닌 뿐만 아니라 페닐알라닌, N-메틸류신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, tert-부틸글리신, 시클로헥실알라닌, 알라닌, β-알라닌, 1-아미노시클로헥실카르복실산, N-메틸이소류신, 노르류신, 노르발린, N-메틸발린을 포함하는 군으로부터 선택되거나, 또는 바람직하게는 프롤린, 이소류신 또는 상기 언급된 잔기 중 하나로부터 선택되는, 바람직하게는 1개 내지 3개의 잔기를 갖는 짧은 펩티드 서열이다.
다르게는, X6은 여러 펩티드 단위를 함유하는 분지형 링커이다. 이는 여러 아미노 기, 예를 들어 리신, 히드록시리신, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 2,3-디아미노프로피온산, 2,2'-디아미노피멜산, 데스모신, 이소데스모신을 함유하는 아미노산의 잔기에 의해 형성된다.
C-말단 아미노산은 예를 들어 식 1 내지 4에서 X4, 식 6에서 X5 또는 식 5 및 7에서 X6이다.
본 발명에 따른 펩티드 및 펩티드 유도체는 이전에 불완전하게 결정된 프롤린-풍부 항미생물 펩티드 "온코펠투스 항박테리아 펩티드 4"의 서열에 비해, 개선된 항박테리아 활성, 보다 넓은 작용 스펙트럼 및 증가된 프로테아제 내성을 나타낸다.
본 발명에 따른 펩티드 및 펩티드 유도체의 바람직한 예는 서열 5 내지 9, 14 내지 26, 29, 30, 32, 33, 36, 38, 40, 41, 44 내지 46, 49, 50, 53 내지 59, 61 내지 85, 93, 94, 101, 102, 107 내지 112에 따른 서열로부터 선택된다 (실시예 1의 표 2 참조).
서열 VDKPPYLPRPRPPRRIYNR-NH2 (서열 18)를 갖는 특히 바람직한 펩티드는 이하에서 온코신으로 지칭한다. 본 발명에 따른 다른 펩티드 및 펩티드 유도체는 이하에서 온코신 유도체로 지칭한다.
항미생물 또는 항진균 활성을 증가시키고 활성의 스펙트럼을 다른 박테리아 또는 진균으로 확장하고 안정성을 개선하기 위해 변형된 본 발명에 따른 펩티드 및/또는 다량체 펩티드 구축물은 높은 항박테리아 및/또는 항진균 효능 및 포유동물 혈청에서의 우수한 대사 안정성을 특징으로 한다.
아래 논의되고 실시예에 나타낸 바와 같이, 위치 11 (X2), 15 (X3) 및 19 (X4)에서의 적합한 변형은 다양한 박테리아에 대한 천연 온코펠투스 4-서열의 항박테리아 활성을 개선시킨다.
또한, 잔기 Sub1-X1, X3 및 X4는 추가로 N- 및 C-말단 펩티드 서열을 단백질가수분해에 의한 분해에 대해 안정화시켜 혈청에서의 반감기를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 서열은 양으로 하전된 잔기 X2 (위치 11)를 갖는다.
본 발명에 따른 바람직한 예는 양으로 하전된 잔기 X3 (위치 15)을 갖는 서열, 예를 들어 서열 18, 29, 32, 33, 46, 50, 54 내지 59, 62, 65 내지 74, 78, 79, 82, 107, 109, 111 및 112에 따른 서열로부터 선택된 서열, 또는 잔기 X3 (위치 15)으로 히드록시프롤린을 갖는 서열, 예를 들어 서열 25 및 63에 따른 서열로부터 선택된 서열이다.
본 발명에 따른 서열은 양으로 하전된 잔기 X4 (위치 19)를 갖는다.
또한, C-말단 카르복실 기는 바람직하게는 변형된다. 놀랍게도, 이는 혈청에서 펩티드의 증가된 반감기로 이어진다.
N- 및 C-말단의 변형은 다른 기, 예를 들어 다른 아미노산 서열 (아마도 다량체 펩티드 또는 단백질을 생성함) 또는 다른 생체분자 (담체 또는 표지의 기능을 가짐)로의 펩티드의 커플링, 예를 들어 Sub1을 통한 Y1의 커플링을 허용한다. 특정 실시양태에서, 담체 분자는 포유동물 세포에서 박테리아 감염을 박멸하거나 또는 항박테리아 펩티드가 그 자신 상으로는 침투할 수 없는 박테리아 (예를 들어, 그람-양성 박테리아)에 항박테리아 펩티드 및 펩티드 유도체를 수송하기 위한 셔틀(shuttle)로 기능한다. 상기 세포-침투 펩티드 (CPP)의 예는 예를 들어 페네트라틴, Tat 펩티드, 모델 양친매성 펩티드 및 트랜스포르탄이다. 또한, 감염의 부위는 커플링된 구조 (표적 분자)에 의해 인식될 수 있고, 그 결과 항생제 물질은 이를 박멸하기 위해 (박테리아) 세포 근처로 온다. 이들 표적 분자는 예를 들어 그람-음성 박테리아의 외부를 형성하는 리포폴리사카라이드 (LPS) 분자에 결합하는 것으로 알려져 있는 분자이다. 본 출원을 위한 공지된 화합물은 예를 들어 앵커 펩티드, 예컨대 락토바실루스(Lactobacillus)로부터의 AcmA 모티프 또는 리포폴리사카라이드에 대해 지시된 항체이다. 이 마지막으로 언급된 변이체는 또한 내인성 항생제 효과를 가지며, 이에 따라 본 발명에 따른 펩티드의 활성을 증가시키는데 사용될 수 있으므로 바람직하다
N-말단 아미노산, 즉 Sub1-X1이 생리적 조건, 즉 인체에서 양으로 하전된 잔기를 갖는다면 유리하다.
N-말단 안정화를 달성하기 위한 예는 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 오르니틴 또는 리신 (Sub1-X1 = 아실-Orn 또는 아실-Lys)의 α-아미노 기의 아실화 (Sub1 = 아실-NH-), 예를 들어 아세틸화 (Sub1 = 아세틸-NH-)이다. 이 아실화 (바람직하게는, 아세틸화)는 양전하를 무손상 아미노산 측쇄에 남긴다.
본 발명의 추가의 바람직한 예는 X2, X3 및 X4 (위치 11, 15 및 19) 상에 양으로 하전된 잔기를 갖는 서열, 예를 들어 서열 18, 22, 58, 62, 63, 65 내지 74, 78, 79, 82 및 83에 따른 서열로부터 선택된 서열이다.
본 발명의 추가의 바람직한 예는 프롤린 대신에 히드록시프롤린을 갖는 서열, 예를 들어 서열 21, 22 및 24에 따른 서열로부터 선택된 서열이다.
특히 바람직한 예는 위치 11, 15 및 19 (X2, X3 및 X4)에서 양으로 하전된 아미노산 (예컨대, 오르니틴, 아르기닌 또는 리신)을 보유하고, 변형된 C-말단을 갖는 펩티드, 특히 서열 18, 63, 71, 72, 74에 따른 펩티드이다.
특히 바람직한 펩티드는 서열 71에 따른 위치 15 (잔기 X3)에 오르니틴, 위치 11 및 19 (잔기 X2 및 X4)에 아르기닌 및 프로필아미드로서의 C-말단 (잔기 Sub2)을 함유한다.
또 다른 특히 바람직한 펩티드는 위치 15 및 19 (잔기 X3 및 X4)에 오르니틴, 위치 11 (잔기 X2)에 아르기닌, 아미드로서의 C-말단 (잔기 Sub2)을 함유한다. 이러한 종류의 바람직한 펩티드는 서열 72에 따른 서열을 갖는다.
또 다른 특히 바람직한 펩티드는 위치 11 (잔기 X2)에 아르기닌, 위치 15 (잔기 X3)에 트랜스-4-히드록시프롤린 및 위치 19 (잔기 X4)에 오르니틴 및 아미드로서의 C-말단 (잔기 Sub2)을 함유한다. 이러한 종류의 바람직한 펩티드는 서열 63에 따른 서열을 갖는다.
또 다른 특히 바람직한 펩티드는 위치 15 및 19 (잔기 X3 및 X4)에 오르니틴, 위치 11 (잔기 X2)에 아르기닌, 위치 18에 아스파라긴 대신 글루타민 및 아미드로서의 C-말단 (잔기 Sub2)을 함유한다. 이러한 종류의 바람직한 펩티드는 서열 74에 따른 서열을 갖는다.
이들 예로부터 본 발명에 따른 C-말단의 아미드로의 변형 (Sub = -NH2)이 놀랍게도 에스케리키아 콜라이 및 미크로코쿠스 루테우스에 대한 항생제 작용을 유의하게 증가시킨다는 것을 볼 수 있다. C-말단 상에 아미드를 갖는 바람직한 서열은 서열 18, 22, 50, 54 내지 57, 61 내지 63, 65 내지 70, 72 내지 79 및 82이다.
C-말단 분해를 감소시키는 변형, 예를 들어 서열 58 및 71에 따른 C-말단 (Sub2) 상의 이소프로필아미드 및 위치(들) 8 및/또는 13에서의 트랜스-4-히드록시프롤린이 또한 바람직하다. 실험 결과는 명백하게 위치 6 및 7에서의 아미노산이 또한 항생제 작용에 매우 중요하다는 것을 보여준다. 따라서, 알라닌을 갖는 이들 위치 6 및/또는 7에서의 개별 아미노산의 교환은 온코신의 항생제 활성과 비교하여 효능을 파괴한다.
본 발명의 가장 바람직한 예는 하기 장점을 제공하는 펩티드이다:
(i) 포유동물 혈청에서의 증가된 반감기, 및
(ii) 하나 이상의 박테리아 균주, 특히 인간 병원체, 또는 진균 또는 다른 미생물 감염에 대해 증가한 항미생물 활성, 및
(iii) 적혈구를 비롯한 인간 세포에 독성이 아닌 펩티드.
항미생물 펩티드는 포유동물 세포 및 혈액 세포에 대해 독성 효과를 나타내지 않으면서 특정 세포내 박테리아 표적 분자를 억제하게 위해 세포막을 통과하여 세포질에 침투해야 하기 때문에 그의 작용은 매우 복잡하다.
또 다른 중요한 점은 펩티다제 또는 프로테아제에 의한 분해에 대한 펩티드 또는 펩티드 유도체의 안정성이다. 따라서, 이상적인 펩티드는 높은 항박테리아 활성 (낮은 MIC 값)을 갖고, 세포 독성, 용혈 활성을 갖지 않으며, 혈중 몇 시간의 반감기를 갖는다. 천연 온코펠투스 4-서열과 비교하여, 본 발명에 따른 펩티드 유도체는 20배 넘게 더 높은 항미생물 활성을 나타낸다. C-말단은 바람직하게는 변형되고 (아미드, 알킬아미드, 에스테르), 위치 14 뒤의 C-말단 영역은 예를 들어 위치 15 및/또는 19 (X3 및 X4)의 비단백질생성 아미노산으로의 치환에 의해 변경된다. N-말단에서, 양전하는 우수한 활성을 달성하기에 바람직하다. 천연 온코펠투스 4-서열의 위치 1 (X1)에서의 발린은 바람직하게는 유리되거나 또는 아세틸화된 염기성 잔기, 예컨대 아르기닌, 리신 또는 오르니틴으로 대체된다. 오르니틴이 특히 바람직하며, 이는 놀랍게도 증가한 단백질 안정성으로 이어진다. 동일한 이유로 온코펠투스 4-서열의 위치 15 및 19는 바람직하게는 치환되고, 이는 놀랍게도 펩티드 안정성의 증가로 이어진다. 예는 위치 15 및 19 (X3 및 X4)의 트랜스-4-히드록시프롤린 (X3) 및 오르니틴 (X4)으로의 교환 또는 둘 모두의 오르니틴으로의 교환이고, 이는 놀랍게도 25％ 혈청에서의 반감기를 10배 넘게 증가시키는데, 즉 30분 미만으로부터 6시간 넘게 증가시킨다. 유리 산으로부터 C-말단의 프로필아미드로의 수송은 또한 혈청 안정성의 증가로 이어진다.
바람직하게는, 세포-침투 펩티드 서열은 본 발명에 따른 펩티드 및 펩티드 유도체에 커플링된다. 이 커플링은 바람직하게는 링커, 예를 들어 아세틸 기 또는 알킬 기를 통해 일어난다. 커플링은 바람직하게는 본 발명에 따른 펩티드 및 펩티드 유도체의 N-말단 상에서 일어난다. 바람직하게는, 이를 위해 프롤린-풍부 펩티드 또는 펩티드 유도체가 N-말단에서 요오도아세테이트로 유도체화되고, 세포-침투 펩티드 서열은 C-말단에서 시스테인 잔기에 의해 연장된다. 이어서, 이 시스테인의 티올 기는 아세틸 기와 티오에테르 브릿지를 형성한다.
세포-침투 펩티드 (CPP)는 상대적으로 짧은 다가양이온 또는 소수성 펩티드이며, 그의 부착이 원핵 및 진핵 세포가 세포 막을 통과하는 것을 가능하게 한다. CPP는 상이한 서열 및 길이를 가질 수 있다. 그러나, 대부분의 경우에, 이들은 대략 10개 내지 40개 아미노산의 서열을 함유하고, 양으로 하전된 아미노산 (예를 들어, Arg, Lys)이 풍부하다. 이들 짧은 서열은 세포막을 통한 통과를 담당하고, "단백질 형질도입 도메인 (PTD)"으로 지칭된다.
바람직한 세포-침투 펩티드는 페네트라틴, Tat 펩티드, 모델 양친매성 펩티드, 트랜스포르탄 (갈라닌에서 유래됨), SynB (프로테그린에서 유래됨) 및 시스-γ-아미노-1-프롤린-함유 펩티드로부터 선택된다.
본 발명에 따라 사용된 세포-침투 펩티드 서열은 바람직하게는 8개 내지 20개의 아미노산 잔기 길이이고, 여기서 이들 잔기 중 30％ 내지 90％는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는다. 나머지 잔기는 바람직하게는 중성이다. 바람직한 세포-침투 펩티드 서열은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00010
서열 105 (페네트라틴)
Figure pct00011
서열 124 (모델 양친매성 펩티드)
Figure pct00012
서열 125 (Tat 펩티드)
추가의 바람직한 세포-침투 펩티드 서열은 문헌에서 주어진다 (문헌 [Langel, U. in Handbook of Cell-Penetrating Peptides 5-28 (CRC - Taylor ＆ Francis Group, 2006], [Pujals S, Giralt E. Proline-rich, amphipathic cell-penetrating peptides Adv Drug Deliv Rev. 60(4-5):473-84, 2008] 및 [Farrera-Sinfreu J, Giralt E, Royo M, Albericio F. Cell-penetrating proline-rich peptidomimetics. Methods Mol Biol. 386:241-67, 2007], 이와 관련하여 참고로 도입됨).
상기 펩티드 유도체의 바람직한 예에서, AMP는 요오도아세틸 (Sub1)을 통해 페네트라틴-시스테인 (Y1)에 의해 위치 1 (X1) 앞에서 N-말단 연장되고 티오에테르 결합을 형성한다. 이러한 종류의 바람직한 예는 바람직하게는 서열 101 및 102에 따른 서열로부터 선택된다.
세포-침투 펩티드 서열, 예컨대 페네트라틴의 부착을 통해, 놀랍게도 그람-음성 및 그람-양성 박테리아에 대한 활성이 증가하고, 작용 스펙트럼이 다른 그람-양성 및 그람-음성 박테리아로 확장되고, 추가로 항미생물 펩티드가 숨겨진 박테리아, 진균 또는 바이러스가 또한 이들 세포에 도달할 수 있도록 세포독성 없이 포유동물 세포에 도입될 것이다.
페네트라틴은 과실파리 드로소필라 멜라노가스터의, 안테나페디아 호메오도메인(Antennapedia homeodomain) (전사 인자의 DNA-결합 영역)의 부분 서열 R43 내지 K58에 상응한다. 페네트라틴의 서열 (바람직하게는, R Q I K I W F Q N R R M K W K K-OH; 서열 105)은 양이온성 아미노산 및 다수의 AMP의 서열을 닮은 것이 풍부하다.
본 발명에서 세포-침투 펩티드 서열은 박테리아 및 포유동물 세포 둘 모두로 AMP를 도입시키는데 사용된다. AMP는 페네트라틴에 커플링되어, 또한 그곳에서 감염을 치료하기 위해, 진핵 세포로 수송된다. 또한, 독성 효과는 세포내 표적 분자와 AMP의 상호작용에 의해 조사할 수 있다.
페네트라틴을 티오에테르 브릿지를 통해 본 발명에 따른 항미생물 펩티드에 커플링시키는 것이 본 발명의 부분을 형성한다.
이를 위해, 페네트라틴의 C-말단은 시스테인에 의해 연장되고, 요오도아세트산으로 N-말단 표지된 항미생물 펩티드에 커플링된다 .
온코신 및 그의 유도체 뿐만 아니라, 본 발명에 따라 다른 항미생물 펩티드, 바람직하게는 프롤린-풍부 펩티드 또는 펩티드 유도체, 예를 들어 아피다에신, 드로소신, 포르마에신 1, 피로코리신 및 메탈니코윈 1이 또한 이와 상응하게 세포-침투 펩티드 서열, 예를 들어 페네트라틴으로 변형될 수 있다.
바람직한 아피다에신 유도체는 PCT/EP2008/059512 (2008년 7월 21일 출원, 이와 관련하여 참고로 도입됨)에 언급되어 있다.
상기 펩티드 유도체의 바람직한 예는 서열 95 내지 100 및 106에 따른 서열로부터 선택된다.
본원에 사용된 표현 "펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산의 서열을 나타내고, 여기서 아미노산은 바람직하게는 20개의 자연 발생 펩티드-형성 아미노산으로부터 선택되고, 이 때 아미노산은 L-형태 또는 D-형태일 수 있거나, 또는 이소류신 및 트레오닌의 경우에 또한 D-알로-형태 (오직 2개의 키랄 중심 중 하나가 전도됨)일 수 있다.
본 발명의 설명에 사용된 표현 펩티드 유도체 (또는 펩티드모방체)는 상기 기재된 바와 같이 N- 또는 C-말단 상에서 Y1, Sub1 및 Sub2로 변형된 펩티드만을 포함하지는 않는다. 또한, 이는 화학적 기에 의한 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 및/또는 변형에 의해 변경된 펩티드를 포함하며, 여기서 상기 화학적 기는 천연 단백질-형성 아미노산 잔기, 예를 들어 비단백질생성 α-아미노산, β-아미노산 또는 변경된 주쇄를 갖는 펩티드와 상이하다. 용어 "변경된 주쇄"는 적어도 하나의 펩티드 결합이 화학적으로 변형된 것, 즉 생리적 조건하에 절단가능하지 않고, 엔도프로테아제에 의해 절단될 수 없는 결합으로 대체된 것을 의미한다.
바람직하게는 절단가능하지 않은 결합은 변형된 펩티드 결합, 예를 들어 환원된 펩티드 결합, 알킬화된 아미드 결합 또는 티오아미드 결합이다. 환원된 아미드 결합은 카르보닐 기 (C=O)가 히드록실 기 (HCOH) 또는 메틸렌 기 (CH2)로 환원된 펩티드 결합이다. 알킬화된 아미드 결합은 질소 (N-알파) 또는 탄소 원자 (C-알파) 상에서 알킬화된 펩티드 결합이다. 알킬 잔기는 바람직하게는 1개 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다. 예는 N-메틸화이다.
또한, 용어 "변경된 주쇄"는 둘 모두 앞선 아미노산 잔기의 COOH 기 및 다음 아미노산 잔기의 NH2 기와 공유 결합을 형성하는데 적합하고, 따라서 반드시 펩티드 주쇄 구조, 예를 들어 당 아미노산-디펩티드 동배체, 아자펩티드, 6-단독중합체, 감마-펩티드, Y-락탐-유사체, 올리고(페닐렌 에틸렌), 비닐족체 술폰 펩티드, 폴리-N-치환된 글리신 또는 올리고카르바메이트를 유지하지 않는 다른 기를 포함한다.
주쇄의 변형은 위치 14 내지 19에서 R-X3-I16-Y17-N18-X4이다. 따라서 바람직하게는 X3-I16 (예를 들어, Arg-Ile), N18-X4 (예를 들어, Asn-Arg), X4-NH2 (예를 들어, Arg-NH2), X6-X7 (예를 들어, Arg-Leu 또는 Arg-Ile) 사이의 결합 중 적어도 하나가 변형된다. 이들 결합은 바람직하게는 환원된 아미드 결합, 알킬화된 아미드 결합 또는 티오아미드 결합의 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 펩티드 및 펩티드 유도체는 선형일 수 있고, 즉 서열의 제1 및 마지막 아미노산이 유리 NH2 및 COOH 기를 보유하거나 또는 Sub1 및 Sub2로 변형된 서열일 수 있다. 다르게는, 펩티드는 시클릭이고, 즉 제1 및 마지막 아미노산이 펩티드 결합 또는 링커를 통해 연결된다.
상기 언급된 신규 항생제 활성 화합물의 생성 방법이 본 발명의 부분을 형성한다.
본 발명의 펩티드 또는 펩티드 유도체는 합성에 의해, 또는 적용가능한 경우, 재조합에 의해 통상적인 방법으로 생성될 수 있다. 본 발명을 수행하는 특정 예는 아래 실험 부분에서 상세히 기술된다. 바람직하게는, 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 유도체는 예를 들어 메리필드(Merrifield)에 의해 기재된 바와 같이, 공지된 합성 기술에 의해 통상적으로 생성된다 (문헌 [Merrifield R B. Solid-phase peptide synthesis. 1. Synthesis of a Tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society 85:2149-＆, 1963]).
다르게는, 본 발명에서 기재된 펩티드는 재조합 기술에 의해 생성되며, 여기서는 상기 기재된 펩티드 중 하나를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA 단편을 클로닝하고, 예를 들어 미생물 또는 숙주 세포에서 발현시킨다. 코딩 핵산 서열은 합성에 의해 생성될 수 있거나 (문헌 [Stemmer W P C, Crameri A, Ha K D, Brennan T M, ＆ Heyneker H L. Single-Step Assembly of a Gene and Entire Plasmid from Large Numbers of Oligodeoxyribonucleotides. Gene 164:49-53, 1995]) 또는 기존 핵산 서열 (예를 들어, 야생형 온코펠투스 4를 코딩하는 서열)의 측면-특이적 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다. 이와 같이 생성된 코딩 서열은 공지된 기술에 의해 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에서 상응하게 생성되는 프라이머로 RNA (또는 DNA)에 의해 증폭시킬 수 있다. 예를 들어 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제한 후에, PCR 생성물은 벡터에 라이게이션시키고, 최종적으로 숙주 세포는 상응하는 재조합 플라스미드로 형질전환시킨다. 재조합 기술은 다양한 숙주 세포, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 바실루스(Bacillus), 락토바실루스, 스트렙토미세스(Streptomyces), 포유동물 세포 (예를 들어, CHO (차이니즈 햄스터 난소) 또는 COS-1 세포), 효모 세포 (예를 들어, 사카로미세스(S accharomyces), 스키조필럼(Schizophyllum)), 곤충 세포 또는 바이러스 발현 시스템 (예를 들어, 바큘로바이러스 시스템)에 대해 공지되어 있다. 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝, 생성물 생성 및 정제에 적합한 추가의 숙주 세포 및 방법은 임의의 당업자에 의해 문헌으로부터 선택될 수 있다 (문헌 [Gething M J ＆ Sambrook J. Cell-Surface Expression of Influenza Hemagglutinin from a Cloned Dna Copy of the Rna Gene. Nature 293:620-5, 1981]). 통상적인 재조합 생성 후에, 본 발명의 펩티드는 고전적인 세포 용해 기술에 의해 또는 통상적인 방법, 예를 들어 액체 크로마토그래피, 특히 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배지로부터, 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 항미생물 펩티드는 개별 펩티드로서 또는 올리고머로서 나타낼 수 있다. 올리고머는 N- 또는 C-말단을 통해 연결된 여러 펩티드 서열을 함유할 수 있거나, 또는 심지어는 N- 또는 C-말단 태그를 함유할 수 있고, 이는 재조합 펩티드 또는 단백질 구축물의 보다 용이한 정제를 허용한다. 분자 생물학 및 부위-지정 돌연변이유발의 통상적인 기술은 추가로 서열을 변형시켜 바람직한 비-천연 펩티드 서열을 수득하기 위해 이용될 수 있다. 이들 모든 재조합 기술은 당업자에 의해 공지되어 있고, 아피다에신 (문헌 [Maeno M, Taguchi S, ＆ Momose H. Production of Antibacterial Peptide Apidaecin Using the Secretory Expression System of Streptomyces. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 57:1206-7, 1993]), 페리네린 (문헌 [Zhou Q F, Luo X G, Ye L, ＆ Xi T. High-level production of a novel antimicrobial peptide perinerin in Escherichia coli by fusion expression. Current Microbiology 54:366-70, 2007]) 및 디펜신 (문헌 [Si L G, Liu X C, Lu Y Y, Wang G Y, ＆ Li W M. Soluble expression of active human beta-defensin-3 in Escherichia coli and its effects on the growth of host cells. Chinese Medical Journal 120:708-13, 2007])을 비롯한 다수의 항미생물 펩티드에 이미 적용되고 있다.
또한 자연적으로 발생하지 않는 아미노산을 유전자 기술에 의해 펩티드에 도입시키는 것이 가능하다. 이는 노렌(Noren) 등 및 엘만(Ellman) 등의 문헌에 상세히 기재되어 있다 (문헌 [Noren C J, Anthonycahill S J, Griffith M C, ＆ Schultz P G. A General Method for Site-Specific Incorporation of Unnatural Amino-Acids Into Proteins. Science 244:182-8, 1989]; [Ellman J, Mendel D, Anthonycahill S, Noren C J, ＆ Schultz P G. Biosynthetic Method for Introducing Unnatural Amino-Acids Site-Specifically Into Proteins. Methods in Enzymology 202:301-36, 1991]).
다음에, 펩티드는 숙주 세포 배양물 또는 시험관내 번역 시스템으로부터 단리될 수 있다. 이는 선행 기술로부터 공지된 단백질 정제 및 단리를 위한 일반적인 기술로 달성할 수 있다. 이러한 기술은 예를 들어 면역-흡착 또는 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 고속 결합 및 정제를 허용하는, 태그 (예를 들어, 히스티딘 태그)를 사용하는, 합성 동안 펩티드를 제공하는 것이 또한 가능하다. 태그는 이후에 활성 펩티드 서열을 수득하기 위해, 효소에 의해 분리될 수 있다.
펩티드 자체는 코딩되거나 발현될 수 없지만, 코딩가능하거나 또는 발현가능한 펩티드와 매우 유사하다면, 방법은 우선 유사한 펩티드에 적용되고, 이후에 하나 이상의 단계에서 화학적으로 또는 효소에 의해 바람직한 펩티드 또는 펩티드모방체로 전환된다. 여기서 기재된 펩티드를 생성하는 이들 방법의 일부 보다 포괄적인 설명이 문헌에 기재되어 있다 (문헌 [Anderson W F. Human gene therapy. Nature 392:25-30, 1998]; [Pharmaceutical Biotechnology (eds. Crommelin D J A ＆ Sindelar R D) pp. 8-20, 53-70, 123-152, 167-180) Harwood Academic Publishers, 1997]; [Protein Synthesis: Methods and Protocols (ed. Martin R) 1-144, Humana Press, 1998]; [Amino Acid and Peptide Synthesis (ed. Jones J) 1-89, Oxford University Press, 1997]; [Solid-Phase Peptide Synthesis (ed. Fields G B) 1-780, Academic Press, 1997]).
본 발명에 따른 펩티드 및 펩티드 유도체는 개별적으로, 조합하여, 다량체로서 또는 분지형 다량체로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드의 합리적인 조합은 콘카타머(concatamer)를 포함하는데, 여기서 본 발명에 따른 펩티드는 개별 펩티드가 함께 결합된 상태로, 예를 들어 펩티드 이량체 또는 펩티드 삼량체 등 (다량체)의 형태로, 순차적으로 또는 스페이서를 통해 함께 연결된다. 이 다량체는 식 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 동일한 서열 또는 상이한 서열을 갖는 펩티드 또는 펩티드 유도체로부터 만들어질 수 있다.
개별 펩티드 또는 펩티드 유도체는 생체적합성 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 인간화 항체, 리포좀, 미셀, 합성 중합체, 나노입자 및 파지에 커플링될 수 있다. 다르게는, 본 발명에 따른 펩티드 또는 펩티드 유도체가 개별적으로 조합된 다량체는 3개 이상의 펩티드가 하나의 중심에 결합된 상태로, 덴드리머 또는 클러스터의 형태로 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 식 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 여러 펩티드 또는 펩티드 유도체는 다량체 구축물 또는 정렬로 생성될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 임의로 아미노산 또는 다른 화합물을 기재로 하는 아미노산 (예를 들어, Gly-Ser-) 또는 다른 스페이서는 2개 이상의 펩티드를 함께 연결하거나 이들을 담체에 커플링시키기 위해 N- 또는 C-말단에 부착될 수 있다. 이 정렬은 담체 단백질에 커플링된 상기 기재된 합성 펩티드 중 하나 이상의 형태를 가정할 수 있다. 다르게는, 정렬은 각각 임의로는 담체 단백질에 커플링된 다중 항원 펩티드로 발현되는 여러 펩티드를 함유한다. 또 다른 변이체에서, 선택된 펩티드는 순차적으로 연결되고, 재조합 단백질 또는 폴리펩티드로 발현된다. 한 실시양태에서, 여러 펩티드는 사이에 스페이서로서의 아미노산과 함께 또는 이러한 아미노산 없이 순차적으로 연결되어 보다 큰 재조합 단백질을 수득한다. 다르게는, 재조합 단백질은 담체 단백질에 융합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 다량체 구축물은 (식 1 내지 4 중 어느 하나의 동일하거나 상이한 펩티드일 수 있는) 상기 규정된 펩티드 중 적어도 2개를 함유하며, 여기서 하나의 펩티드는 다른 펩티드에 임의의 아미노산을 통해 커플링된다. 임의의 수의 추가의 펩티드는 이들 펩티드의 임의의 추가의 아미노산에 부착될 수 있다. 적어도 2개의 펩티드를 함유하는 다량체 정렬의 또 다른 실시양태에서, 제2 또는 추가의 펩티드는 기본 구조의 다른 펩티드의 분지형 구조에 커플링된다. 다르게는, 각각의 추가의 펩티드가 정렬의 또 다른 펩티드에 기 Sub1 또는 Sub2를 통해 공유 결합에 의해 연결된다.
적어도 2개의 펩티드를 갖는 다량체 구축물 또는 정렬의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나 이상의 펩티드가 담체에 결합된다. 또 다른 실시양태에서, 언급된 펩티드 중 하나 이상이 합성 펩티드이고, 이는 담체 단백질에 융합된다. 또한, 말단절단 서열과 함께 또는 말단절단 서열 없이 상기 기재된 펩티드 중 몇몇을 순차적으로 선형 폴리펩티드에 결합시키는 대안이 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 동일한 담체에 커플링되거나 또는 상이한 펩티드가 개별적으로 펩티드로서 하나의 또는 상이한 면역학상 불활성 담체 단백질에 커플링될 수 있다.
적합한 담체는 안정성, 투여 또는 생성을 개선시키거나, 또는 펩티드의 활성 스펙트럼을 변경 또는 개선시킨다. 담체의 예는 인간 알부민, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 바이오폴리머 또는 다른 자연적으로 또는 비-자연적으로 발생하는 중합체이다. 한 실시양태에서, 담체의 주요 성분은 바람직하게는 펩티드의 안정성을 증가시키는 단백질 또는 다른 분자이다. 당업자는 담체 및 펩티드의 적합한 커플링 유닛을 용이하게 선택할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 펩티드는 다중 항원 펩티드 (MAP)의 형태로 정렬되고, 이는 예를 들어 탐(Tam) 등의 문헌에 기재된 "MAP" 개념에 의해 구축될 수 있다 (문헌 [Tam J P, Mora A L, ＆ Rao C. Lipidation as a novel approach to mucosal immunization. Modulation of the Immune Response to Vaccine Antigens 92:109-16, 1998]). 이 시스템은 리신 잔기의 중앙 유닛을 사용하고, 이 위에서 본 발명에 따른 동일한 펩티드의 여러 카피가 합성된다 (예를 들어, 문헌 [Posnett D N, Mcgrath H, ＆ Tam J P. A Novel Method for Producing Anti-Peptide Antibodies - Production of Site-Specific Antibodies to the T-Cell Antigen Receptor Beta-Chain. Journal of Biological Chemistry 263:1719-25, 1988] 참조). 각각의 MAP은 본 발명에 따른 펩티드 중 하나 이상의 여러 카피를 함유한다. MAP의 한 실시양태는 적어도 3개, 그러나 바람직하게는 4개 이상의 펩티드를 함유한다. 당업자는 상기 식에서 확인된 펩티드에 따른 임의의 수의 다량체 화합물을 용이하게 생성할 수 있다. 이러한 모든 다량체 정렬 및 구축물이 본 발명의 부분을 형성한다.
다량체 형태의 추가의 조합이 입자의 표면 상에서 생성될 수 있으며, 여기서 펩티드 또는 펩티드모방체가 그의 표면 상에 제시된다. 이어서, 입자는 펩티드 또는 펩티드모방체의 담체로 기능할 수 있고, 동시에 검출가능한 마커로서 작용할 수 있다. 다량체는 예를 들어 펩티드 또는 펩티드모방체 쇄의 N-말단 끝의 N-말단 비오티닐화 및 이후의 스트렙타비딘과의 복합체화에 의해 수득할 수 있다. 스트렙타비딘은 4개의 비오틴 분자 또는 접합체에 높은 친화도로 결합할 수 있으므로, 이 방법으로 매우 안정한 사량체 펩티드 복합체를 수득할 수 있다. 다량체는 동일하거나 또는 상이한 본 발명에 따른 펩티드 또는 펩티드모방체로부터 생성될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 다량체는 2개 이상의 펩티드 또는 펩티드모방체를 함유하고, 여기서 각각의 성분은 살생물 활성 (표적 인식, 항미생물 활성, 정제)에 기여한다.
본 발명의 또 다른 목적은, 의약 또는 약학에서, 예를 들어 항생제를 사용하는 요법을 위한 또는 항미생물 (특히, 살세균) 활성을 갖는 조성물에서의, 본 발명에 따른 펩티드 또는 펩티드 유도체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 미생물, 박테리아 또는 진균 감염의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드, 펩티드 유도체 및/또는 다량체를 포함한다.
본 발명은 또한 다른 활성 제약 성분의 존재와 무관하게 하나 이상의 본 발명에 따른 펩티드 또는 펩티드 유도체 또는 다량체 구축물을 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다.
제약으로서 및/또는 항생제로서 사용될 수 있는 활성 물질의 생성을 위한 본 발명에 따른 펩티드의 용도가 또한 본 발명의 부분이다.
펩티드는 또한 제약 생성물에서 개별적으로 사용될 수 있다. 다르게는, 상기 기재된 하나 이상의 펩티드가 면역 반응을 유도하지 않으면서 약동학 또는 생체이용률을 증가시키기 위해 다른 화합물에 융합 또는 접합될 수 있다. 임의의 수의 개별 펩티드 또는 다량체 구축물은 단일 조성물을 생성하기 위해 함께 혼합될 수 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 치료상 유효량의 본 발명의 하나 이상의 펩티드 또는 펩티드 유도체를 함유한다. 구성되면, 본 발명에 따른 제약 조성물은 미생물 (특히 박테리아) 감염을 치료하기 위해, 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있다. 이를 위해, 본 발명에 따른 조성물의 치료상 유효량은 치료할 대상체에게 투여된다.
본 발명에 따른 조성물은 박테리아 또는 진균에 감염된, 인간을 비롯한 포유동물의 감염을 치료하기 위한 것이다.
적어도 하나 또는 다르게는 또한 여러 개의 본 발명에 따른 펩티드 또는 다량체 구축물은 약리학상 허용되는 비히클 또는 다른 성분과 혼합되어 항미생물 (특히 항박테리아 또는 살진균) 작용을 하는 조성물을 형성할 수 있다. 이러한 조성물의 사용을 위해, 선택된 펩티드는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같이 합성에 의해 또는 또한 재조합적으로 생성된다.
이 조성물의 직접적인 투여는 국소적으로 (피부의 표면에) 또는 일부 다른 투여 경로, 예를 들어 경구, 비경구, 피하, 설하, 병변내, 복강내, 정맥내, 근육내, 폐 또는 조직으로의 간질 경로에 의해 수행한다.
제약 조성물은 추가의 적합하고 제약상 허용되는 비히클, 충전제 또는 용매를 함유할 수 있고, 캡슐, 정제, 파스틸, 코팅된 정제, 환제, 점적제, 좌제, 분말, 스프레이, 백신, 연고, 페이스트, 크림, 흡입제, 패치, 에어로졸 등의 형태를 가질 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 어느 것이 특정 투여량에 가장 적합하고 동시에 펩티드, 펩티드모방체 (펩티드 유도체), 펩티드 접합체 또는 펩티드모방체 접합체와 상용가능한지에 따라, 용매, 희석제 또는 다른 액체 결합제, 예컨대 분산액 또는 현탁액 보조물, 계면활성제, 등장성 활성 물질, 증점제 또는 유화제, 보존제, 캡슐화제, 고체 결합제 또는 활택제를 포함할 수 있다.
따라서 제약 조성물은 바람직하게는 제약상 허용되는 비히클을 함유한다. 용어 "제약상 허용되는 비히클"은 또한 치료 조성물, 예를 들어 항체 또는 폴리펩티드, 유전자 또는 다른 치료제의 투여를 위한 비히클을 포함한다. 용어는 레시피가 투여된 개체에 위험할 수 있는 항체의 생성 그 자체를 촉발하지 않고, 임의의 불합리한 독성을 보유하지 않는 임의의 제약 비히클을 나타낸다. 적합한 "제약상 허용되는 비히클"은 크고, 서서히 붕해가능한 거대분자, 예를 들어 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락톤산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성화된 바이러스 성분일 수 있다. 상기 비히클은 당업자에게 잘 알려진 것이다.
동등한 화합물의 염은 공지된 방법에 의해 생성될 수 있고, 전형적으로 펩티드, 펩티드모방체, 펩티드 접합체 또는 펩티드모방체 접합체가 제약상 허용되는 산과 혼합되어 산 염을 형성하거나 또는 제약상 허용되는 염기와 혼합되어 염기성 염을 형성한다는 것을 의미한다. 산 또는 염기가 제약상 허용되는지 여부는 당업자에 의해 용이하게 확립될 수 있으며, 적용 및 레시피는 공지되어 있다. 예를 들어, 생체외 적용에 허용되는 모든 산 및 염기가 또한 치료 레시피에게 전달될 수는 없다. 특정 적용에 따라, 제약상 허용되는 산은 유기 및 무기 성질 둘 모두의 것, 예를 들어 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 글리콜산, 옥살산, 피루브산, 숙신산, 말레산, 말론산, 신남산, 황산, 염산, 브롬화수소산, 질산, 과염소산, 인산 및 티오시안산일 수 있으며, 이는 펩티드 및 기능상 동등한 화합물의 유리 아미노 기와 암모늄 염을 형성한다. 펩티드 및 기능상 동등한 화합물의 유리 카르복실산 기와 카르복실레이트를 형성하는 제약상 허용되는 염기는 에틸아민, 메틸아민, 디메틸아민, 트리에틸아민, 이소프로필아민, 디이소프로필아민 및 다른 모노-, 디- 및 트리알킬아민 뿐만 아니라 아릴아민을 포함한다. 또한, 제약상 허용되는 용매가 포함된다.
제약상 허용되는 염, 예를 들어 무기산의 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등이 사용될 수 있으나, 또한 유기 산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 사용될 수 있다. 제약상 허용되는 성분의 상세한 논의는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J., 1991)]에 기재되어 있다.
치료 조성물에서 제약상 허용되는 비히클은 액체, 예를 들어 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 함유할 수 있다. 다른 부형제, 예컨대 습윤제 또는 유화제가 또한 첨가될 수 있고, pH 완충 물질 및 유사한 화합물이 상기 작용제에 존재할 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액체 형태로 또는 주사용 현탁액으로서, 및 또한 주사가 가능하기 전에 담체 액체에 용해 또는 현탁시키는 고체 형태로 제조될 수 있다. 리포좀은 또한 "제약상 허용되는 비히클"의 정의에 포함된다.
치유적 치료를 위해, 상기 기재된 바와 같이 펩티드, 펩티드 유도체, 펩티드 접합체 또는 펩티드 유도체 접합체가 생성될 있고, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 펩티드, 펩티드 유도체, 펩티드 접합체 또는 펩티드 유도체 접합체는 투여 형태에 적합하고 원하는 치료에 적절한 투여랑으로 존재하는 임의의 적합한 형태, 바람직하게는 제약 조성물로 대상체/환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 다른 활성 화합물, 예를 들어 통상적인 항생제 (예를 들어, 반코마이신, 스트렙토마이신, 테트라시클린, 페니실린) 또는 다른 항미생물 활성 화합물, 예컨대 살진균제, 예를 들어 이트라코나졸 또는 미코나졸을 함유할 수 있다. 감염에 수반되는 증상, 예컨대 열 (살리실산) 또는 발진을 완화시키는 다른 화합물이 또한 첨가될 수 있다.
감염 치료를 위한 또는 또한 세균전에서 치료 용도 이외에, 표면 및/또는 물체를 소독 및/또는 세정하는데 사용될 수 있는, 살균제 및/또는 세정제 (예를 들어, 살세균 조성물)에 본 발명에 따른 펩티드 또는 펩티드 유도체를 사용하는 것이 또한 가능하다. 또 다른 적용 분야는 포장이며, 여기서 펩티드는 포장 재료에 결합되거나 그 안에 혼입되거나, 또는 미생물에 의해 쉽게 분해될 수 있는 다른 재료를 위한 보존제로 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드 또는 펩티드 유도체는 접촉시 또는 섭취한 경우 독성 작용을 나타내지 않으므로, 식품 포장에 특히 적합한다.
본 발명의 또 다른 목적은 유효한 치료상 활성량의 본 발명에 따른 제약상 활성 조성물의 투여를 포함하는, 미생물 (특히, 박테리아 또는 진균)에 감염된 포유동물을 치료하기 위한 방법이다.
본 발명과 관련하여, 박테리아 또는 진균 감염은 특히 비뇨생식기관의 감염, 혈액의 감염 ("혈류 감염"), 패혈증, 기도 감염, 복막염, 상처 감염, 소화관의 감염 및 수막염을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료상 유효량"은 박테리아의 증식 및 콜로니 형성을 감소시키거나 완전히 방지할 수 있거나, 또는 측정가능한 치료 또는 예방적 성공을 달성할 수 있는, 치료제, 즉 본 발명에 따른 펩티드, 펩티드모방체, 펩티드 접합체 또는 펩티드모방체 접합체의 양을 나타낸다. 효과는 예를 들어 배양물에서의 생검체에 대해, 박테리아 활성을 시험하거나 또는 박테리아 감염의 범위 및 정도를 평가하는 몇몇 다른 적합한 방법으로 결정할 수 있다. 대상체에 대해 정확한 유효량은 이들의 체중 및 건강 상태, 질환의 유형 및 범위, 및 치료를 위해 선택된 치료제 또는 여러 치료제의 조합에 따라 달라진다. 특히, 본 발명에 따른 조성물은 박테리아 감염 및/또는 생물학적 또는 물리적 수반 영향 (예를 들어, 열)을 감소시키거나 방지하기 위해 사용될 수 있다. 의사에 의해 초기 투여량을 확립하는 방법은 선행 기술로부터 공지되어 있다. 확립된 용량은 안전하고 성공적이어야 한다.
항박테리아적으로 효과적인 투여량에 필요한 본 발명에 따른 단백질, 펩티드 또는 핵산의 양은 감염의 원인이 되는 병원체, 및 환자의 연령, 체중, 성별, 일반적인 물리적 상태 등을 고려하여 확립될 수 있다. 주목할 만한 부작용 없이 항박테리아 및 항진균적으로 효과적인 활성 성분의 필요량은 사용되는 제약 레시피 및 다른 성분, 예컨대 항생제, 항진균제 등의 임의의 존재에 따라 달라진다. 본 발명에 따른 적용 분야에서, 유효 투여량은 치료되는 개체에서 펩티드, 펩티드모방체, 펩티드 접합체 또는 펩티드모방체 접합체의 0.01 ㎍/kg 내지 50 mg/kg, 바람직하게는 0.5 ㎍/kg 내지 10 mg/kg일 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드, 펩티드모방체, 다량체, 펩티드 접합체 또는 펩티드모방체 접합체의 초기 투여량은 임의로 반복 투여에 의해 모니터링될 수 있다. 투여 횟수는 상기 확인된 요인에 따라 달라지고, 바람직하게는 약 3일 내지 최대 1주일의 치료 기간에 걸쳐 하루에 1회 내지 6회 투여이다.
또 다른 대안적인 조성물에서, 본 발명에 따른 펩티드, 펩티드모방체, 펩티드 접합체 또는 펩티드모방체 접합체 또는 혼합물은 대상체의 신체에 도입된 매트릭스로부터 제어되거나 연속적인 방출에 의해 투여된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 피부를 통해 투여된다. 특히 화합물이 소화계의 환경에서 안정하지 않거나 또는 장으로부터 효율적으로 흡수되기에 너무 크다면, 이 투여 방법은 비침습적이고 환자에게 친숙하며, 동시에 경구 투여에 비해 화합물의 생체이용률 증가로 명백하게 이어진다. 피부을 통한 흡수는 예를 들어 코, 뺨, 설하, 잇몸 또는 질에서 가능하다. 상응하는 투여 형태는 공지된 기술에 의해 수득될 수 있고, 이들은 점비액, 비강 스프레이, 임플란트, 필름, 패치, 겔, 연고 또는 정제로 처리될 수 있다. 바람직하게는, 피부을 통한 흡수를 위해, 제약 비히클은 피부에 부착되어 흡수에 의한 섭취가 증가하도록 투여 형태와 흡수 표면의 접촉 시간을 연장시키는 하나 이상의 성분을 함유할 것이다.
또 다른 실시양태에서, 화합물은 폐 경로에 의해, 예를 들어 흡입기, 분무기, 에어로졸 스프레이 또는 건조-분말 흡입기에 의해, 규정된 양으로 투여된다. 적합한 제제는 공지된 방법 및 기술에 의해 제조될 수 있다. 경피 또는 직장 전달 뿐만 아니라, 눈의 적용이 일부 경우에 적절할 수 있다.
본 발명에 따른 물질을 진보된 약물 전달 또는 표적화 방법에 의해 보다 효과적으로 투여하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 소화관을 피해야 한다면, 투여 형태는 생체이용률을 증가시키는 임의의 물질 또는 혼합물을 함유할 수 있다. 이는 예를 들어 효소 억제제 또는 항산화제에 의해, 분해를 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 화합물의 생체이용률이 흡수에 대한 장벽의 투과성의 증가에 의해 달성된다면 일반적으로 점막이 보다 우수하다. 침투를 용이하게 하는 물질은 다양한 방식으로 작용할 수 있는데, 일부는 점막의 유동성을 증가시키는 반면, 다른 것은 점막 세포 사이에 간극을 확대한다.
또 다른 것은 점막 상에서 점액의 점도를 감소시킨다. 바람직한 흡수 가속화제는 양친매성 물질, 예컨대 콜산 유도체, 인지질, 에탄올, 지방산, 올레산, 지방산 유도체, EDTA, 카르보머, 폴리카르보필 및 키토산을 포함한다.
본 발명에 따른 펩티드, 펩티드 유도체, 접합체 또는 다량체가 사용될 수 있는 징후는 그람-양성 및 그람-음성 박테리아 둘 모두, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 클레브시엘라 뉴모니아에, 모르가넬라 모르가니이(Morganella morganii), 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 시겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae), 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 슈도모나스 아에루기노사, 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 또는 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)로의 박테리아 감염이다.
본 발명은 또한 생화학적, 생물공학적, 의학적 또는 약제학적 연구, 또는 스크리닝, 특히 잠재적인 항박테리아 또는 항진균 작용을 하는 물질을 확인하기 위한 스크리닝에 있어 본 발명에 따른 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한
(i) (a) 본 발명에 따른 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체에 민감성인 미생물,
(b) 본 발명에 따른 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체, 및
(c) (a)를 (b) 및 (c)와 접촉시킴으로써 시험되는 적어도 하나의 화합물
을 사용하여 경쟁적 검정을 수행하는 단계; 및
(ii) 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체를 미생물로부터 경쟁적으로 대체하는 시험 화합물을 선별하는 단계
를 포함하는, 항박테리아 또는 항진균 작용을 하는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다.
이 스크리닝 방법은 병원체의 알려지지 않은 수용체에 대한 결합에 대해 본 발명에 따른 펩티드 또는 다량체 구축물과 경쟁할 수 있는 시험 화합물을 확인한다. 이러한 방식으로, 펩티드로서 동일한 부위에 특이적으로 결합하는 소분자는 고처리량 스크리닝에서 효과적으로 확인될 수 있다. 시험 화합물은 아마도 본래 펩티드 서열과 동일한 작용 메커니즘을 가질 것이며, 따라서 또한 본 발명에 따른 펩티드 또는 펩티드 유도체에 의해 근절되는 다중내성 미생물에 대해 활성이다.
스크리닝 방법은 공지된 방법에 의해 수행되지만, 적어도 하나의 본 발명에 따른 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체를 사용한다. 바람직하게는, 이를 위해 본 발명에 따른 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체가 형광, 방사성 또는 다른 검출가능한 마커와 함께 제공된다. 미생물에 대한 표지된 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체의 결합 거동은 시험 물질(들)의 존재 및 부재하에 비교된다.
바람직하게는, 이어서 본 발명에 따른 펩티드 또는 다량체 구축물과의 결합에 대해 경쟁하는 시험 화합물을 확인하고, 그의 항박테리아 또는 항진균 작용에 대해 시험한다.
한 실시양태에서, 이량체의 형성 후에 경쟁적 검정에서 형광을 측정한다 (BIFC; 2분자 형광 상보성). 방법은 세포내 단백질 상호작용의 직접적인 시각화를 허용하고, 이는 에스케리키아 콜라이에서 천연 및 인공 표적 분자를 갖는 c-Abl 티로신 키나제로부터의 SH3 도메인에 대해 입증된다 (문헌 [Morell M, Espargaro A, Aviles F X, ＆ Ventura S. Detection of transient protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation: The Abl-SH3 case. Proteomics 7:1023-36, 2007]). 이 시험 시스템은 심지어는 에스케리키아 콜라이에서 낮은 발현 수준을 갖는 단백질 사이의 상호작용을 검출할 수 있을 정도로 충분히 민감하다. 이는 SH3 도메인이 그의 파트너에 결합한 후에 황색 형광 단백질 (YFP)의 2개의 단편의 부가물 형성을 기초로 한다. 이들 두 단백질이 서로 결합되자마자, YFP의 2개의 단편은 복합체를 형성하고, 그의 구조는 천연 단백질과 매우 유사하다. 개별 단편은 형광을 내지 않으므로, 이는 YFP 복합체의 관찰된 형광으로부터 볼 수 있다. 또한, 유사한 구축물이 본 발명에 기재된 펩티드 및 펩티드 유도체와 결합 부위에 대해 경쟁하는 화합물을 조사하기 위해 설계될 수 있다. 고처리량 스크리닝은 마이크로타이터 플레이트에 386-웰 포맷으로 당업자에 의해 용이하게 전달될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 펩티드를 병원체의 알려지지 않은 수용체로부터 경쟁적으로 대체하는 시험 화합물의 용량을 결정하기 위해, 적절한 경쟁적 검정에 펩티드를 사용한다. 바람직한 경우, 선별된 펩티드(들)에 결합하는 것으로 알려진 미생물 (예를 들어, 박테리아, 바이러스 또는 진균), 예를 들어 에스케리키아 콜라이 또는 클레브시엘라 뉴모니아에의 균주는 (선택된 검정에 따라) 적합한 표면에 직접적으로 또는 간접적으로, 예를 들어 ELISA 포맷으로 고정된다. 고정화를 위해 상응하는 표면은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 불활성 입자 ("비드")가 사용될 수 있다. 그러나, 리간드는 또한 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 결합될 수 있다. 이어서, 시험 화합물의 및 본 발명에 따른 펩티드의 선택된 양은 고정된 미생물과 접촉시켜 가져오고, 미생물에 대한 결합에 대해 펩티드와 경쟁하는 화합물이 선별된다. 박테리아 또는 진균 상의 수용체 결합에 대해 펩티드와 경쟁하는 이들 시험 화합물이 확인되면, 이들을 추가로 그의 항박테리아 또는 항진균 작용에 대해 연구할 수 있다. 이에 적합한 방법은 아래 실시예에 기재된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 핵산 분자를 제공하고, 그의 서열은 본 발명에 따른 펩티드 또는 다량체를 코딩한다. 본 발명에 따른 항박테리아 또는 항진균 펩티드 또는 다량체 구축물을 코딩하는 핵산은 조절 서열과 작동가능하게 연결되고, 이는 숙주 세포에서의 그의 발현을 제어한다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 기재된 핵산 분자로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포이다.
본 발명은 하기 실시예로 아래 설명될 것이나, 본 발명이 이에 제한되지는 않는다.
실시예
실시예 1: 펩티드 합성
펩티드 합성을 위한 모든 화학 물질은, 달리 언급되지 않는 한, 가능한 가장 높은 순도에서 플루카 케미 게엠베하 (Fluka Chemie GmbH; 스위스 부치스)로부터 수득하였다.
모든 펩티드 및 펩티드 유도체는 Syro 2000 다중 펩티드 합성 로봇 (멀티신테크 게엠베하(MultiSynTech GmbH), 독일 비텐) 상에서 Fmoc/tBu 전략을 이용하는 통상적인 고체-상 펩티드 합성에 의해 합성하였다 (문헌 [Fields G B ＆ Noble R L. Solid-Phase Peptide Synthesis Utilizing 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Acids. International Journal of Peptide and Protein Research 35:161-214, 1990]). 모든 표준-Fmoc 아미노산은 멀티신테크 게엠베하 (독일 비텐) 또는 오르페겐 파마 게엠베하 (Orpegen Pharma GmbH; 독일 하이델베르그)로부터 수득하였다. 2-아미노-3-구아니디노프로피온산 (Agp; 아이리스 바이오텍 게엠베하(Iris Biotech GmbH),, 독일 마르크트레드위츠), β-호모아르기닌 (βHar, 플루카 케미 게엠베하, 스위스 부치스), 호모아르기닌 (Har), N-메틸아르기닌 (N-Me-Arg) 및 니트로아르기닌 (Arg(NO2), 바켐 아게(Bachem AG), 스위스 부벤도르프)을 특정한 아르기닌 상동체로 사용하였다. 트랜스-4-히드록시프롤린 (t-4-Hyp) 및 2,3-디아미노프로피온산 (Dap)을 노파바이오켐(Novabiochem) (머크 바이오사이언시스 게엠베하(Merck Biosciences GmbH), 독일 다름슈타트)으로부터 수득하였다.
펩티드는 멀티신테크 게엠베하 (독일 비텐) 사로부터, Wang 수지 (1.23 mmol/g) 상의 산으로서 또는 Rink-아미드 4-메틸벤질히드릴아민 (MBHA) 수지 (0.67 mmol/g) 상의 산 아미드로서 합성하였다. 나중의 1급 아민으로의 관능화를 위해, 펩티드를 펩티드 티오에스테르로 유도체화하고, 이를 위해 제1 아미노산을 4-술파미노-부티릴-아미노메틸 수지 (SAB AM, 1.1 mmol/g; 노파바이오켐, 머크 바이오사이언시스 게엠베하, 독일 다름슈타트)에 커플링시켰다.
Wang 수지 상에서, 제1 C-말단 아미노산 (5 당량(eq))을 5 eq 2,6-디클로로벤조일 클로라이드 (머크(Merck) KGaA, 독일 다름슈타트) 및 8.25 eq 피리딘과 디클로로메탄 (DCM; 바이오솔브(Biosolve) BV, 네덜란드 발켄스바르트) 중에서 커플링시켰다 (문헌 [Sieber P. An Improved Method for Anchoring of 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Amino Acids to 4-Alkoxybenzyl Alcohol Resins. Tetrahedron Letters 28:6147-50, 1987]). C-말단 아미노산 (5 eq)을 사용한 SAB AM 수지의 관능화는 DCM 중에서 5 eq (벤조트리아졸-1-일옥시)-트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP, 노파바이오켐, 머크 바이오사이언시스 게엠베하, 독일 다름슈타트) 및 10 eq N-에틸디이소프로필아민 (DIPEA)으로 활성화시킴으로써 -20℃에서 수행하였다 (문헌 [Backes B J ＆ Ellman J A. An Alkanesulfonamide Safety-Catch Linker for Solid-Phase Synthesis. The Journal of Organic Chemistry 64:2322-30, 1999]).
제1 아미노산은 이전에 로딩된 Wang 및 SAB AM 수지 상에서의 자동 합성에서 기재된 바와 같이, 각각의 경우에 0.5 mol/L의 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)에 용해된 8 eq 아미노산을 디메틸포름아미드 (DMF; 바이오솔브 BV, 네덜란드 발켄스바르트) 중에서 8 eq N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC)로 활성화시킴으로써 Rink-아미드 수지에 커플링시켰다.
이용된 측쇄 보호기는 Cys, Asn, His 및 Gln의 경우 트리페닐메틸 (트리틸), Tyr, Ser 및 Thr의 경우 tert-부틸 에테르 (tBu), Asp 및 Glu의 경우 tert-부틸 에스테르 (OtBu), Arg의 경우 ω-N-2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐 (Pbf), βHar 및 Har의 경우 ω-N-2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐 (Pmc), Lys, Orn 및 Agp의 경우 tert-부틸옥시-카르보닐 (Boc) 또는 N-Me-Arg의 경우 ω-N-4-메톡시-2,3-6-트리메틸페닐-술포닐 (Mtr)이었다. 일시적 Fmoc 보호기는 5분 동안 DMF (v/v) 중에서 40％ 피페리딘 (바이오솔브 BV, 네덜란드 발켄스바르트)로 절단하고, 다시 10분 동안 DMF (v/v) 중에서 새로운 20％ 피페리딘으로 절단하였다.
8 eq 아세트산, 포름산 또는 요오도아세트산을 0.5 mol/L HOBT/DMF에 용해시키고, 이들을 8 eq DIC로 DMF 중에서 활성화시킴으로써 펩티드 또는 펩티드 유도체의 N-말단을 아세틸화, 포르밀화 또는 요오도아세틸화시켰다. 펩티드 또는 펩티드 유도체의 N-말단을 가우스폴(Gausepohl) 등의 문헌 [Gausepohl, H., Pieles, H., ＆ Frank, R.W. in Peptides: chemistry, structure and biology (eds. Smith, J.A. ＆ Rivier, J.E.) 523 (ESCOM, Leiden, 1992)]에 따라 각각 10 eq 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU, 멀티신테크 게엠베하, 독일 비텐) 및 DIPEA로 DMF 중에서 구아닌화시켰다. N-말단을 5 eq HBTU 및 10 eq DIPEA가 포함된 형광 염료 5,6-카르복시플루오레세인 (5 eq)으로 DMF 중에서 변형시켰다.
N-말단 변형의 완성은 카이저(Kaiser) 시험에 의해 검증하였다. 이를 위해, 약간의 수지를 95℃에서 에탄올 (칼 로트 게엠베하(Carl Roth GmbH) + Co. KG, 독일 칼스루에) 중 0.28 mol/L 닌히드린 (리델 드 하엔(Riedel de Haen), 독일 실즈), 피리딘 중 0.2 mmol/L 시안화칼륨 및 에탄올 중 76％ 페놀 (비율 (1:1:2))과 인큐베이션하였다. 유리 1급 아미노 기를 나타내는 청색 착색이 나타나면, 커플링을 반복하였다.
펩티드 또는 펩티드 유도체의 합성이 완료되면, 수지를 DMF 및 DCM으로 조심스럽게 세척하고, 진공하에 건조시켰다. 수지-결합 펩티드를 4시간 동안 실온에서 87.5％ 트리플루오로아세트산 (TFA) 중 물, m-크레졸, 티오아니솔 및 에탄디티올 (5:5:5:2.5)의 혼합물로 절단하고, 동시에 측쇄를 탈보호시켰다. 펩티드 및 펩티드 유도체를 냉각 디에틸 에테르로 침전시키고, 3000xg에서 원심분리하였다. 펠릿을 냉각 에테르로 2회 세척하고, 건조시키고, 0.1％ 수성 TFA에 용해시켰다 (UV 분광분석법). 샘플을 -20℃에 보관하였다.
SAB AM 수지 상에서 펩티드를 절단하기 전에, Fmoc 기를 절단한 후에 N-말단을 20 eq 디-tert-부틸디카르보네이트 (Boc2O, 플루카 케미 게엠베하, 부치스, 스위스) 및 10 eq DIPEA로 DMF 중에서 보호하였다. 알킬화에 의해 술파밀 링커를 활성화시키기 위해 DMF 중 100 eq 요오도아세토니트릴 및 20 eq DIPEA를 세척된 수지에 첨가하였다 (문헌 [Teruya K, Murphy A C, Burlin T, Appella E, ＆ Mazur S J. Fmoc-based chemical synthesis and selective binding to supercoiled DNA of the p53 C-terminus segment and its phosphorylated and acetylated derivatives. Journal of Peptide Science 10:479-93, 2004]). 펩티드의 절단을 위해, DMF (10％ v/v) 중 50 eq 프로필아민을 수지에 첨가하였다. DMF를 제거한 후에, 비처리 펩티드를 87.5％ TFA 중 물, m-크레졸, 티오아니솔 및 에탄디티올 (5:5:5:2.5)의 용액에 용해시키고, 모든 측면-보호기 및 N-말단 Boc 보호기를 분리시켰다. 펩티드를 냉각 디에틸 에테르로 침전시키고, 3000xg에서 원심분리하였다. 침전물을 냉각 에테르로 2회 세척하고, 건조시키고, 0.1％ 수성 TFA에 용해시켰다 (UV 분광분석법). 샘플을 -20℃에 보관하였다.
절단된 펩티드 및 펩티드 유도체를 쥬피터(Jupiter) C18 5 ㎛ 300Å, 250 x 10 mm 또는 쥬피터 C18 15 ㎛, 300Å, 250 x 21 mm 칼럼 (페노메넥스 인크.(Phenomenex Inc.), 미국 토랜스)을 사용하는 Akta HPLC 시스템 (아머샴 바이오사이언스 게엠베하(Amersham Bioscience GmbH), 독일 프라이부르크) 상에서 RP-HPLC에 의해 정제하였다.
각각의 경우에 사용된 용매는 0.1％ 수성 TFA (용리액 A) 및 0.1％ TFA를 포함하는 60％ 수성 아세토니트릴 (바이오솔브 BV, 네덜란드 발켄스바르트) (용리액 B)이었다. 전형적인 선형 구배를 5％ 용리액 B에서 시작하고, 용출은 1분당 1％ B를 증가시키면서 10 mL/분 (250 x 21 mm 칼럼) 또는 5 mL/분 (250 x 10 mm 칼럼)의 유속으로 수행하였다. 검출은 220, 230 및 240 ㎛에서 수행하였다. 정제된 펩티드를 쥬피터 C18 5 ㎛, 300Å, 150 x 4.6 mm 칼럼 (페노메넥스 인크., 미국 토랜스)을 사용하는 동일한 HPLC 시스템으로 분석하였다. 이를 5-95％ B의 선형 구배를 사용하여 1 mL/분의 유속에서 용출하고 (30분), 220 nm에서 검출하였다. 또한, 순도는 비행시간(time-of-flight) 질량 분광측정법 (MALDI-TOF-MS; 4700 프로테오믹(Proteomic) 분석기, 어플라이드 바이오시스템즈 게엠베하(Applied Biosystems GmbH), 독일 다름슈타트)을 사용하는 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화에 의해 결정하였다. 이를 위해, 펩티드 용액 0.5 ㎕를 매트릭스 (0.1％ 수성 TFA 중 50％ 아세토니트릴에서 5.3 mg/mL)로서 α-시아노히드록시신남산 (브루커 달토닉 게엠베하(Bruker Daltonik GmbH); 독일 브레맨) 0.5 ㎕와 공동-결정화시켰다.
페네트라틴 유도체의 티오에테르 연결은 질소하에 4℃에서 탈기된 포스페이트-완충 염수 (PBS, pH 7.4) 중 4 eq 정제된 요오도아세틸화된 AMP와 정제된 페네트라틴-Cys 단량체를 인큐베이션하여 수행하였다. 반응을 RP-HPLC에 의해 모니터링하고, 페네트라틴 구축물을 페네트라틴-Cys 단량체의 완전한 반응 후에 정제하였다. (페네트라틴-Cys)2 이량체를 동시에 수득하였다.
프롤린-풍부 항미생물 펩티드의 불완전하게 결정된 서열에서 시작하여 펩티드 4의 "온코펠투스 항박테리아 펩티드 4" 제1 유도체 (표 2)를 우선 C-말단 아미노산 N18N19R20으로 합성하고, 카르복실 관능기는 변경하지 않았다. 위치 11에서의 변형 중에, 양이온성 아미노산 Lys 및 Arg는 놀랍게도 우수한 특성을 나타내었다. 유도체는 보다 낮은 마이크로몰 농도 범위에서 에스케리키아 콜라이 및 미크로코쿠스 루테우스에 대한 항박테리아 활성을 나타내었다. C-말단의 추가의 유도체화를 위해, Arg11로 유도체화된 서열을 선별하고, Asn 및 Arg의 상이한 정렬을 갖는 유도체를 합성하였다. Asn에 의해 C-말단 상에서 단축된 유도체 (서열 18)가 놀랄만큼 높은 활성을 나타내었다. 또한, C-말단 산 아미드로서, 이는 놀랍게도 높은 혈청 안정성을 달성하였다. 서열 VDKPPYLPRPRPPRRIYNR-NH2 (서열 18)를 갖는 펩티드는 이하 온코신으로 지칭하고, 추가로 혈청 안정성 뿐만 아니라 또한 항미생물 활성에 대해 주로 개선되었다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
아미노산 잔기에 대해 1-문자 코드를 사용하였으며, 아미노산 쇄 중의 O는 오르니틴을 나타내고,
프로필은 C-말단 상의 프로필아미드 (Sub2 = OR3 = NHC3H7)를 나타내고, Ac = 아세틸 기, for = 포르밀 기, guan = 구아니디노 기 및 CF = 5,6-카르복시플루오레세인은 변형된 N-말단 (N-말단 아미노산, Sub1의 변형된 알파-아미노 기 = 아세틸-NH, 포르밀-NH, 구아니디노 또는 5,6-카르복시플루오레세인)의 예이고,
βHar: β-호모아르기닌, 아르기닌에 대한 베타-아미노산 상동체,
Agp: 2-아미노-3-구아니디노프로피온산, Har: 호모아르기닌 및 Arg(NO2): 니트로아르기닌은 아르기닌의 상동체이고,
N-Me-Arg: N-메틸-아르기닌 - 펩티드 결합 상에서 메틸화된 아르기닌,
4tHyp: 트랜스-4-히드록시프롤린,
Tle: tert-부틸 글리신,
Dap(Ac): 측쇄에 아세틸화된 아미노 관능기를 갖는 2,3-디아미노프로피온산,
(CH2CO): 시스테인의 SH 기에 대한 아세틸 링커,
f: α-아미노카프론산,
소문자는 상응하는 D-아미노산을 나타내고,
비교 실시예는 *로 표시된다.
실시예 2: 안정성
25％ 마우스 혈청에서 혈청 안정성
혈청 안정성 연구를 마우스 혈청 및 25％ 수성 마우스 혈청 (PAA 레보러토리즈 게엠베하(PAA Laboratories GmbH); 오스트리아 파슁)에서 호프만(Hoffmann) 등의 문헌 [Hoffmann R, Vasko M, ＆ Otvos L. Serum stability of phosphopeptides. Analytica Chimica Acta 352:319-25, 1997]에 따라 이중 결정으로 수행하였다. 이를 위해, 펩티드 및 펩티드모방체를 물에 용해시키고, 마우스 혈청을 첨가하고, 펩티드 농도를 75 ㎍/mL로 조정하였다. 계속 진탕하면서, 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하였다. 0, 30, 60, 120, 240 및 360분 후에, 각각의 경우에 분취액을 취하고, 15％ 수성 트리클로로아세트산 (칼 로트 게엠베하 ＆ Co. KG; 독일 칼스루에)과 혼합하였다. 추가의 10분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한 후에, 침전된 혈청 단백질을 원심분리하였다 (5분, 13400 rpm, 미니스핀(MiniSpin), 에펜도르프 아게(Eppendorf AG), 독일 함부르크). 상청액을 제거하고, 1 mol/L 수성 수산화나트륨 용액 (플루카 케미 게엠베하, 스위스 부치스)으로 중화시키고, 분석까지 -20℃에서 보관하였다.
상청액을 이온-페어링 시약으로서 0.1％ 트리플루오로아세트산 (TFA, UV-등급, 플루카 케미 게엠베하, 스위스 부치스)의 존재하에 선형 아세토니트릴 구배 (바이오솔브 BV, 네덜란드 발켄스바르트)를 사용하는 RP-HPLC에 의해 분석하였다. 분획을 매트릭스 (0.1％ 수성 TFA 중 50％ 아세토니트릴에서 5.3 mg/mL)로서 α-시아노히드록시신남산 (브루커 달토닉 게엠베하; 독일 브레맨)과 공동 결정화시키고, 양성-이온 반사 장치 모드에서 직렬 질량 분광측정계 (MALDI-TOF/TOF-MS, 4700 프로테오믹스 분석기; 어플라이드 바이오시스템즈 게엠베하, 독일 바이테르스타트)로 분석하였다. 이에 따라, 무손상 펩티드 및 그의 분해 생성물 또는 대사물의 비율을 개별적 시점에 확인하고 정량하였다. 사용된 대조군은 25％ 수성 마우스 혈청이고, 이를 동일한 시간 간격 동안 동시에 분석하였다.
표 4는 25％ 마우스 혈청에서 온코신 (서열 18) 및 선택된 온코신 유도체의 반감기를 보여준다. 서열 14 및 19를 갖는 나열된 온코펠투스 4 유도체는 30분 미만의 반감기로 가장 낮은 안정성을 갖는다. 여기서, 위치 19 (잔기 X4)에서의 아르기닌을 우선 절단하였다. 이어서, 분해 생성물 VDKPPYLPRPRPPRRIYN-OH (서열 28)의 안정성을 120분까지 증가시켰으나, 이 단편은 여전히 단지 매우 낮은 항미생물 활성 (64 ㎍/mL 에스케리키아 콜라이)을 갖는다. 온코신에서 C-말단 (Sub2)의 아미드화시, 에스케리키아 콜라이 및 미크로코쿠스 루테우스 (각각 4 및 8 ㎍/mL)에 대한 활성 이외에, 안정성은 또한 60분까지, 펩티드 유도체에 대해 놀랍게도 높은 값으로 증가하였다. 프로필아미드 (서열 58)로의 아미드화를 통해, 온코신의 반감기는 심지어는 120분까지 늘어났다.
Figure pct00018
비단백질생성 아미노산 오르니틴 (서열 61)에 대한 위치 19 (잔기 X4)의 치환은 안정성을 120분 반감기까지 증가시켰다. 오르니틴에 대한 Arg15의 치환은 이 온코신 유도체 (서열 50)의 안정성을 90분 반감기까지 증가시켰다. 위치 15 (잔기 X3)에서 프롤린 (서열 60) 또는 β-호모아르기닌 (서열 62)을 갖는 유도체는 120분 또는 150분 후까지 반으로 분해되지 않았다. 4-트랜스-히드록시프롤린 (서열 24)에서 위치 13에서의 프롤린의 치환은 온코신의 안정성에 대해 어떠한 부정적 효과도 나타내지 않았다.
위치 15 및 19 (잔기 X3 및 X4)에서 이러한 변형을 합함으로써, 360분이 넘는 반감기가 결정된 매우 안정한 펩티드 유도체를 합성할 수 있었다. 에스케리키아 콜라이에 대해 4 또는 8 mg/mL의 MIC 값을 갖는 Orn19 및 Hyp15 또는 Orn15를 갖는 바람직한 예시 서열 63 및 72의 활성은 온코신과 대등하였다. 프로필아미드화된 C-말단 (서열 71)과 Orn15의 조합은 본 발명의 또 다른 매우 바람직한 예를 나타내었다.
100％ 마우스 혈청에서 혈청 안정성
Figure pct00019
위치 15 및 19에서 아르기닌 잔기를 오르니틴 또는 트랜스-4-히드록시프롤린 (서열 63 및 72)으로 교환함으로써, 25％ 수성 마우스 혈청에서 반감기를 6시간 초과까지 증가시킬 수 있었다 (상기 참조). 100％ 마우스 혈청에서 인큐베이션한 후에, R15O 및 R19O를 교환하였을 때 이들 서열에 대해 175분의 반감기가 결정되었다. R15Hyp 및 R19O (서열 63)를 교환함으로써, 사용된 펩티드 양의 60％가 480분 후에 여전히 검출되었다. P13Hyp, R15Hyp, R19O 및 I16Tle를 갖는 온코신의 다른 유도체 (서열 110)는 480분 후에 심지어는 본래 펩티드 양의 60％ 또는 70％를 여전히 함유하였다. 에스케리키아 콜라이에 대한 두 유도체의 활성은 4 및 2 ㎍/mL에서 매우 우수하였다.
박테리아 프로테아제에 대한 안정성
박테리아 용해물의 제조
박테리아 용해물의 경우, 영양 배지 (칼 로트 게엠베하 + Co. KG, 칼스루에) 500 mL를 에스케리키아 콜라이 BL21 AI로 접종하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 2 x 250 mL 박테리아 현탁액을 JLA-10.500 로터 (베크만 코울터(Beckman Coulter), 미국 풀러톤)를 갖는 베크만 아반티(Avanti)TM J-20-XP 원심분리기에서 5000 rpm 및 4℃에서 25분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 각각 30 mL PBS (pH 7.4)에 현탁시키고, 베크만 알레그라(Allegra)TM 2IR 원심분리기 (베크만 코울터, 미국 풀러톤)에서 다시 원심분리하였다. 펠릿을 각각 10 mL PBS에 현탁시키고, 얼음 상에서 초음파 (비브라-셀(Vibra-cell)TM 마이크로팁, 피셔 바이오블록 사이언티픽(Fisher Bioblock Scientific), 프랑스 일키르히) 2 x 5분 (750 W; 진폭 40％; 2초 온/3초 오프)으로 파괴하였다. 박테리아 용해물을 합하고, 1 mL 분취액을 4℃에서 20분 동안 15400 rpm에서 원심분리 (베크만 알레그라TM)하였다. 상청액을 제거하고, -20℃에서 보관하였다. 박테리아 용해물의 단백질 함량은 브래드포드(Bradford)에 따른 단백질 결정에 의해 결정하였다.
브래드포드에 따른 단백질 결정 [M.M. Bradford; (1976): Analytische Biochemie, 72, 248-254]
PBS 중 2 mg/mL BSA 용액을 표준 시리즈를 위한 원액으로 제조하였다. 이를 PBS로 희석하여 10 내지 100 ㎍/mL BSA까지 6가지 표준 용액을 수득하였다. PBS 중 희석 시리즈를 분석될 샘플로부터 제조하였다. 각각의 경우에 50 ㎕의 샘플 또는 표준 용액을 폴리스티렌 마이크로플레이트에 피펫팅하였다. 브래드포드 시약의 경우, 0.01％ 쿠마씨 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) G250을 5％ 에탄올에 용해시키고, 8.5％ o-인산을 첨가하고, 이를 이중-증류된 물로 채웠다. 이어서, 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 실온에서 추가 12시간 동안 정치시킨 후에 여과하였다. 브래드포드 시약 200 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 15분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 블랭크(blank) 값 (50 ㎕ PBS + 200 ㎕ 브래드포드 시약)에 대해 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
박테리아 용해물의 안정성의 결정
1.5 mg/mL 또는 0.5 mg/mL의 단백질 함량을 갖는 박테리아 용해물 중 0.15 ㎍/mL 펩티드의 용액을 37℃에서 배양하였다. 0, 30, 60, 120, 240 또는 360분 후에, 각각으로부터 200 ㎕를 취하고, 단백질을 15％ 트리클로로아세트산 50 ㎕로 침전시켰다. 이어서, 이를 4℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후에, 미니스핀 데스크탑 원심분리기에서 13000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액으로부터 210 ㎕를 취하고, 1 mol/L 수산화나트륨 용액으로 중화시켰다. 무손상 펩티드 및 분해 생성물을 HPLC에 의해 분석하였다. 0.1％ 트리플루오로아세트산 (TFA)을 갖는 3％ 수성 아세토니트릴 60 ㎕를 용액에 첨가하고, 혼합물 250 ㎕를 주입하였다. 크로마토그래피 분리 후에, 성분을 MALDI-TOF-MS에 의해 확인하였다.
Figure pct00020
박테리아 프로테아제에 대한 안정성을 조사하기 위해, 용해물을 에스케리키아 콜라이 BL21 AI의 밤샘 배양물로부터 제조하고, 여기에서 펩티드를 인큐베이션하였다. 브래드포드 단백질 결정을 이용하여, 단백질 농도를 0.5 또는 1.5 mg/mL로 조정하였다.
천연 온코신 (서열 18)의 경우, 0.5 mg/mL의 총 단백질 농도를 갖는 용해물에서 60분의 반감기가 결정되었다. R15O 및 R19O (서열 72)를 교환함으로써 반감기가 115분까지 2배가 되었다. 다음 단계에서, 프롤린 엔도펩티다제의 절단 부위의 위치 13에서의 프롤린과 트랜스-4-히드록시프롤린 (서열 107)을 교환하여 215분까지 안정성이 추가로 증가하였다. P13Hyp, R15Hyp 및 R19O를 합하여, 240분 초과의 반감기를 달성하였다.
R15O 및 R19O를 갖는 또 다른 유도체에서, 위치 16에서의 이소류신과 tert-부틸글리신 (서열 109)을 교환하여 240분 초과까지 안정성을 증가시켰다. P13Hyp, R15Hyp, R19O 및 I16Tle 조합 (서열 110)을 갖는 유도체는 또한 0.5 mg/mL의 단백질 농도를 갖는 용해물에서 240분 초과의 반감기를 달성하였다. 놀랍게도, 온코신 유도체는 에스케리키아 콜라이에 대해 항박테리아 활성에 대한 긍정적인 효과를 나타내었으며, 서열 108 및 110의 MIC 값을 2 ㎍/mL로 감소시켰다.
실시예 3: 항박테리아 시험
억제 구역 시험 (아가 확산 검정)
정제된 펩티드 및 펩티드 유도체를 500 ㎍/mL의 최종 농도로 물에 희석하였다. 시험 미생물을 1％ 트립틱 소이(tryptic soy) 배지 및 1.2％ 아가로스 (플루카 케미 게엠베하, 스위스 부치스) 중 대략 3 x 105개 세포/mL의 농도에서 대수 성장 단계의 배양물로부터 플레이팅하였다. 3 cm의 간격으로, 각각의 경우에 10 ㎕의 수성 펩티드 용액 (500 ㎍/mL) 또는 10 ㎕의 물 및 항생제 용액을 대조군으로 적가하였다. 37℃에서 20 시간 동안 인큐베이션 후에, 억제 구역 직경 (IZD)을 결정하였다. 모든 시험을 호기성 조건에서 수행하였다.
온코신 서열의 알라닌 스캔을 이용하여, 다양한 잔기를 확인하고, 그의 알라닌과의 교환으로 에스케리키아 콜라이 BL21 AI (도 1) 및 미크로코쿠스 루테우스 10240 (도 2)에 대한 항미생물 활성이 현저하게 감소하였다.
도 1 및 도 2에서, 온코신의 서열 VDKPPYLPRPRPPRRIYNR (서열 18)을 X-축 상에 플롯팅하였다. 각각의 아미노산은 이 위치에서 교환된 알라닌을 갖는 상응하는 펩티드를 나타낸다. 예를 들어, 칼럼 Val1은 펩티드 ADKPPYLPRPRPPRRIYNR-NH2 (서열 29)를 나타내고, 이에 대한 IZD의 값을 Y-축에 배정하였다. 억제 구역의 직경이 커질수록, 펩티드 활성이 더 높아졌다.
에스케리키아 콜라이 BL21 AI에 대한 아가 확산 검정에서 (도 1), 위치 Lys3, Tyr6-Arg9 및 Arg11에서의 알라닌 교환 모두가 온코신 (IZD 1.7 cm)에 비해 활성을 현저하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이들 유도체 (서열 31, 34 내지 37 및 39)는 단지 부분적으로 아가 플레이트 상에서 에스케리키아 콜라이의 성장을 억제하고, 때때로 1.0 내지 1.2 cm 직경을 갖는 성장-초과 억제 구역을 갖는다. 펩티드 Ala15는 성장 없이 가장 작은 억제 구역 (1.3 cm; 서열 43)을 가졌다. 다른 모든 위치를 활성을 감소시키지 않고 변경할 수 있으나, 여기서 활성의 증가, 스펙트럼의 확장, 안정화 및 보다 우수한 생체내 분포가 달성될 수 있다. 여기서 프로테아제-안정한 아미노산이 도입되어 항미생물 활성의 손실없이 혈청 안정성이 증가한 경우에 N-말단 Val1 및 C-말단 Arg19에서 주로 긍정적인 효과가 달성되었다.
그람-양성 박테리아 미크로코쿠스 루테우스에 대한 아가 확산 검정 (도 2)은 알라닌 교환의 결과로서, 항미생물 활성에 대해 긍정적인 효과 및 부정적인 효과가 모두 있다는 것을 보여주었다. 활성에 중요한 위치는 전체 서열에 걸쳐 분포되어 있고, 여기서 펩티드는 온코신 (1.8 cm)에 비해 최소한으로 보다 작은 억제 구역으로 성장을 완전히 억제하였다. 주로 Lys 또는 Arg의 교환 및 이에 따른 펩티드의 양전하의 손실은 항미생물 활성을 감소시켰다. 0.7 cm에서의 활성의 가장 큰 증가는 Ile16 및 Asn18 (서열 44, 46)을 교환함으로써 달성되었다. 이들 위치에서의 변화는 각각의 경우에 Orn15 및 Orn19 및 위치 16에서 Leu (서열 73) 또는 위치 18에서 Gln (서열 74)에 대한 치환을 갖는 예에서 발견되었다. 서열 74는, 이러한 3가지 치환에 의해, 온코신의 활성에 상응하는 활성을 달성하였으며, 여기서 Gln18은 오르니틴 치환의 작은 부정적인 효과를 보상할 수 있다.
성장 억제 검정
항미생물 펩티드 및 펩티드 유도체의 최소 억제 농도 (MIC)를 미세희석 검정에서 결정하였다. 이들은 멸균 편평-바닥 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (폴리스티렌, 그라이너 바이오-원 게엠베하(Greiner Bio-One GmbH), 독일 프리켄하우젠)에서 웰 당 100 ㎕의 전체 부피로 연속 펩티드 희석을 이용하였다. 수성 펩티드 또는 펩티드모방체 용액을 1％ TSB 물로 희석하여 256 ㎍/mL의 최종 농도를 수득하였다. 펩티드 또는 펩티드모방체 용액 50 ㎕를 각각의 시리즈의 제1 웰로 피펫팅하고, 교반하였다. 이 용액으로부터, 50 ㎕를 제2 웰로 옮기고, 교반하고, 다시 50 ㎕를 다음 웰 등으로 옮겼다. 제1 웰에서 256 ㎍/mL에서 시작하여 제12 웰에서 125 ng/mL까지 이중 희석 시리즈를 수득하였다. 박테리아, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 BL21 AI를 영양 배지 (NB, 칼 로트 게엠베하 + Co. KG, 독일 칼스루에)에서 밤새 37℃에서 배양하였다. 1％ TSB 중 5 x 106개 박테리아/mL 현탁액 50 ㎕를 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 이에 따라 각각의 시리즈에서 128 ㎍/mL (웰 1) 내지 62.5 ng/mL (웰 12)의 펩티드 또는 펩티드모방체의 최종 농도를 확립하였다. 플레이트를 20시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후에 흡광도를 TECAN 마이크로타이터 플레이트 분광광도계 (테칸 트레이딩 아게(Tecan Trading AG), 스위스 맨느도르프)로 595 nm에서 측정하였다. 모든 펩티드 및 펩티드모방체의 MIC 값은 3회 반복하여 결정하였다. 멸균수를 음성 대조군으로 사용하였다. MIC 값은 37℃에서 20시간의 인큐베이션 시간 후에 어떠한 박테리아 성장도 관찰되지 않는 가장 낮은 펩티드 농도를 나타낸다.
에스케리키아 콜라이 BL21 AI 및 미크로코쿠스 루테우스 ATCC 10240에 대한 펩티드 및 펩티드 유도체의 MIC 값을 표 7에 기재하였다.
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
프로필은 C-말단 상의 프로필아미드 (Sub2 = OR3 = NHC3H7)를 나타내고, Ac = 아세틸 기, for = 포르밀 기, guan = 구아니디노 기 및 CF = 5,6-카르복시플루오레세인은 변형된 N-말단 (N-말단 아미노산, Sub1의 변형된 알파-아미노 기 = 아세틸-NH, 포르밀-NH, 구아니디노 또는 5,6-카르복시플루오레세인)의 예이고,
βHar: β-호모아르기닌, 아르기닌에 대한 베타-아미노산 상동체,
Agp: 2-아미노-3-구아니디노프로피온산, Har: 호모아르기닌 및 Arg(NO2): 니트로아르기닌은 아르기닌의 상동체이고,
N-Me-Arg: N-메틸-아르기닌 - 펩티드 결합에서 메틸화된 아르기닌,
4tHyp: 트랜스-4-히드록시프롤린,
Tle: tert-부틸글리신,
Dap(Ac): 측쇄에서 아세틸화된 아미노 관능기를 갖는 2,3-디아미노프로피온산,
(CH2CO): 시스테인의 SH 기 상의 아세틸 링커,
f: α-아미노카프론산,
소문자는 상응하는 D-아미노산을 나타낸다.
서열 2는 천연 온코펠투스 4 서열에 상응한다. 서열 1은 천연 온코펠투스 4 서열의 N-말단 단축된 유도체이다. 서열 1, 2, 3, 4, 10 내지 13, 17, 28, 31, 34, 35, 39 및 48을 갖는 서열은 비교 실시예이고, 이들 및 다른 것을 표 7에서 *로 표시하였다. 서열 8 내지 9, 80, 81 및 85를 갖는 서열은 보다 덜 바람직한 본 발명의 예이다. 표 7에 나타낸 다른 서열은 본 발명에 따라 바람직한 펩티드 또는 펩티드 유도체이다. 가장 바람직한 예는 서열 18, 22, 24, 26, 29, 58, 62, 63, 65 내지 71, 74, 79, 82 및 107 내지 112이다.
초기 서열 (서열 2)에서 Pro11 (잔기 X2)과 양이온성 아미노산 Lys 및 Arg (서열 8 및 14)를 교환함으로써, 놀랍게도 에스케리키아 콜라이 BL21 AI 및 미크로코쿠스 루테우스 10240에 대해 보다 높은 활성이 달성되었다. 프롤린-풍부 AMP (서열 4)에서 이 위치에서 빈번히 발생하는 His (서열 5) 및 Thr에 대한 교환은 긍정적인 효과를 나타내지 않았다. 위치 11에 Arg를 갖는 유도체는 8 ㎍/mL (에스케리키아 콜라이)에서 지금까지 가장 낮은 MIC를 가졌고, 이에 따라 C-말단 변경되었다. C-말단의 아미드화는 단지 하나의 희석 단계에 의해 부정적으로 미크로코쿠스 루테우스에 대한 활성을 변경시켰다. Arg가 없고, 이에 따라 마지막 또는 끝에서 두번째 위치에서 양전하가 부족한 펩티드 유도체 (서열 27, 28, 47, 51)는 주로 미크로코쿠스 루테우스에 대해 활성이 8 내지 16배 손실되었고, 바람직한 예 중에 포함되지 않았다.
위치 19 (잔기 X4)에 Arg 및 위치 20에 Asn을 갖는 서열 16은 서열 14 만큼의 활성이 있었다. 놀랍게도, C-말단 (Sub2)의 아미드화는 활성에 대해 부정적인 영향을 나타내지 않았다 (서열 15). C-말단 (Sub2)의 아미드화는 심지어는 상승된 활성 (서열 18 및 서열 19 참조)으로 이어졌다. C-말단 아미드화는 또한 안정성에 대해 유의하게 긍정적인 효과를 나타내었다. 따라서, 아미드화된 펩티드 유도체는 유리 산 관능기를 갖는 상응하는 펩티드 (실시예 2)보다 30분까지 보다 긴 반감기를 갖는다. 펩티드 유도체 서열 18은 4 또는 8 ㎍/mL에서 각각 에스케리키아 콜라이 또는 미크로코쿠스 루테우스에 대해 25％ 수성 마우스 혈청에서 60분의 반감기에서 가장 낮은 MIC 값을 가졌으며, 이는 온코신으로 명명되었다 (표 4).
혈청 안정성 시험에서, 온코신을 위치 15 (잔기 X3) 및 19 (잔기 X4)에서 C-말단 절단하고, 펩티드 VDKPPYLPRPRPPR-OH (서열 126에 상응함) 및 VDPPYLPRPRPPRRIYN-OH (서열 28에 상응함)를 주요 분해 생성물로 확인하였다. 64 ㎍/mL의 MIC를 갖는, Arg19에 의해 단축된 유도체는 여전히 단지 에스케리키아 콜라이에 대해 매우 낮은 항미생물 활성을 나타내었다. 위치 19 (잔기 X4)에서 아르기닌 또는 다른 양이온성 아미노산을 갖는 유도체는 놀랍게도 증가된 안정성을 보여주었다. 그러나, 에스케리키아 콜라이에 대해 16 ㎍/mL의 MIC를 갖는, 위치 19 (잔기 X4; 서열 53)에 His를 갖는 유도체는 온코신보다 4배 더 낮은 활성을 가졌다. 바람직한 예는 그의 MIC 값이 온코신의 값에 상응하는 위치 19 (잔기 X4) 치환된 펩티드 유도체에서의 Agp, Arg(NO2), N-Me-Arg 및 Har (서열 54 내지 57)로의 치환이고, 이에 따라 놀랍게도 펩티드의 활성에 대해 부정적인 영향을 나타내지 않았다. 바람직한, 최소 비용의 예는 서열 50에서 Arg19와 오르니틴의 치환이었다. 이 유도체는 거의 동일한 활성에서 온코신 (60분)보다 훨씬 더 안정하였다. C-말단의 안정화를 위한 또 다른 바람직한 예는 프로필아미드 (서열 58)로서 카르복실 관능기 (Sub2)의 아미드화이다. 항미생물 활성이 유지되었고, 반감기가 또한 120분을 초과하였다.
위치 19 (잔기 X4)에서 안정화된 유도체에서, 추가의 예로 위치 15 (잔기 X3)를 아르기닌 유도체 또는 다른 양이온성 아미노산으로 치환하였다. 바람직한 예는 Agp, Arg(NO2), N-Me-Arg, Har 및 Orn의 다양한 조합을 갖는, 서열 65 내지 70이다. 가장 비용-효과적인 바람직한 예는 위치 15 및 19 (잔기 X3 및 X4)에 오르니틴을 갖고 반감기가 360분을 초과하며 온코신 (MIC 8 ㎍/mL 에스케리키아 콜라이)과 대등한 활성을 갖는 서열 72이다. 서열 74는 Orn15 및 Orn16에 더하여 위치 18에서 글루타민과 아스파라긴의 치환을 갖고, 그 결과 활성이 약간 더 높아졌다 (MIC 4 ㎍/mL 에스케리키아 콜라이). 서열 71에서 위치 15 (잔기 X3)의 Orn의 조합 및 프로필아민으로의 C-말단 (Sub2)의 아미드화는 놀랍게도 높은 활성 (4 ㎍/mL 에스케리키아 콜라이) 및 매우 높은 혈청 안정성 (>360분)을 갖는 또 다른 매우 바람직한 예이다. 위치 15 (잔기 X3)에서 히드록시프롤린으로의 비양이온성 치환을 바람직한 서열 63에서 위치 19 (잔기 X4)의 Orn과 함께 수행하였다. 이 유도체는 또한 높은 활성 (4 ㎍/mL 에스케리키아 콜라이, 8 ㎍/mL 미크로코쿠스 루테우스) 및 우수한 안정성 (>360분)을 갖는다. 온코신의 위치 4, 8 또는 13 (서열 21 내지 24)에서의 프롤린의 히드록시프롤린으로의 치환은 MIC 값에 대해 효과를 나타내지 않았으며, 위치 15 (잔기 X3)에서 제2 불안정 절단 부위의 프로테아제 내성을 감소시키지 않았다. 이러한 히드록시프롤린으로의 교환은 MIC 값 또는 혈청 안정성에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않았으나, 놀랍게도 이 교환은 세포 독성 및 용혈을 감소시켰다.
온코신에서 N-말단의 변형을 위한 바람직한 예는 온코신에 대해 동일한 활성을 가지면서, Orn에서 위치 1 (잔기 X1)의 치환을 갖는 서열 82이다. N-말단 아미노 관능기 (Sub1; 서열 80, 81, 83, 84, 85)의 아세틸화, 메타노일화 (포르밀화) 또는 구아니드화는 활성을 예를 들어 128 ㎍/mL 또는 32로 감소시켰다. (에스케리키아 콜라이 또는 미크로코쿠스 루테우스; 서열 81).
페네트라틴을 티오에테르 브릿지를 통해 항미생물 펩티드의 N-말단의 아미노 관능기에 커플링시켰다. 이 변형은 지금까지 미크로코쿠스 루테우스에 대한 활성이 거의 없는 펩티드의 활성 스펙트럼을 이 박테리아를 포함하도록 확장시킬 수 있었다. 피로코리신 (서열 91)의 MIC 값은 페네트라틴-피로코리신 (서열 98)의 경우 128 ㎍/mL에서 4 ㎍/mL로 가장 큰 정도로 감소하였으며, 이는 활성의 32배 증가에 상응한다. 페네트라틴-아피다에신 (8 ㎍/mL, 서열 94)은 변경되지 않은 아피다에신 1b (64 ㎍/mL 서열 87)보다 또한 8배 더 활성이었다. 8 ㎍/mL의 MIC 값을 갖는 온코신 (서열 18)의 경우, 여전히 4 ㎍/mL까지의 활성의 2배 증가가 페네트라틴-온코신 (서열 100)에서 관찰되었다. 드로소신 (0.5 ㎍/mL, 서열 89)의 높은 활성은 페네트라틴-드로소신 구축물 (1 ㎍/mL, 서열 96)에서 유지되었다.
위치 13 및 15에서 프롤린과 트랜스-4-히드록시프롤린의 교환 및 Arg19와 오르니틴의 교환 (서열 108)은 2 ㎍/mL에서 놀랍게도 안정성을 높게 유지하면서 천연 온코신 서열 (4 ㎍/mL, 서열 18)에 비해 에스케리키아 콜라이에 대한 활성을 증가시켰다. 위치 16에서의 이소류신이 tert-부틸글리신 (서열 110)으로 대체되면, 에스케리키아 콜라이에 대한 2 ㎍/mL의 MIC 값이 유지된다. 이것이 주로 여기서 관심을 갖는 증가된 안정성이다.
서열 107을 갖는 펩티드의 활성은 온코신 (서열 18)과 동일한 미크로코쿠스 루테우스에 대한 항생제 작용을 보여준다. 서열 113 내지 118의 서열은 비교 실시예이다. D-아미노산 (서열 115 및 116)으로 합성된 유도체는 에스케리키아 콜라이에 대해 활성을 나타내지 않았으며, 미크로코쿠스 루테우스에 대해서는 단지 약간의 활성을 나타내었다 (64 또는 128 ㎍/mL).
본래 순서로 D-아미노산을 갖는 모든 D-펩티드 (서열 115 및 116) 및 레트로-인버스(retro-inverse) 합성된 펩티드 (서열 117 및 118) 모두는 에스케리키아 콜라이에 대해 단지 약간의 활성을 보여주었다 (64-256 ㎍/mL). 그러나, D-아미노산으로 합성된 모든 펩티드 (서열 115 내지 118)는 여전히 16 내지 32 ㎍/mL의 MIC 값을 가지면서 미크로코쿠스 루테우스에 대해 상대적으로 우수한 활성을 나타내었으며, 이는 5 순 양전하를 갖는 L-펩티드의 영역에 위치하였다. 미크로코쿠스 루테우스에 대한 D-펩티드 MIC 값 및 순 전하-의존성 활성은 이 그람-양성 박테리아에서 작용의 표적 단백질-비특이적 메카니즘을 나타낼 수 있을 것이다.
Figure pct00025
표 8에 나타낸 펩티드는 병원성 박테리아, 예컨대 에스케리키아 콜라이 DSM 10233, 클레브시엘라 뉴모니아에 DSM 681 및 슈도모나스 아에루기노사 DSM 3227에 대한 그의 MIC에 대해 조사하였다. 위치 15에서 4-트랜스-히드록시프롤린을 갖는 모든 유도체 (서열 63, 108, 113 및 114)는 1 내지 4 ㎍/mL의 MIC 값을 가지면서 놀랍게도 온코신 (서열 18)보다 에스케리키아 콜라이 DSM 10233에 대해 16배까지 더 높은 활성을 나타내었다.
표 10은 다중내성 박테리아 균주에 대한 일부 펩티드 및 펩티드 유도체의 MIC 값을 제공한다. 시험은 이 경우에 뮐러-힌톤(Mueller-Hinton) 배지 (1/4 농축) (1％ TSB에 해당됨)에서 수행하였다. 시험된 내성 박테리아 균주 중 일부를 표 9에 나타내고, 시험된 펩티드를 표 11에 나타내었다.
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
바람직한 예시 서열 18, 22 및 24는 놀랍게도 3가지 상이한 그람-음성 다중내성 박테리아 종 에스케리키아 콜라이, 클레브시엘라 뉴모니아에 및 살모넬라 티피뮤리움에 대해 적어도 높은 또는 보다 높은 활성을 나타내었다. 온코신 (서열 18)은 β-락타마제-과다생산 에스케리키아 콜라이 D31에 대해 2 ㎍/mL, 플로로퀴놀론-내성 클레브시엘라 뉴모니아에 012-3132에 대해 4 ㎍/mL 및 다중내성 살모넬라 티피뮤리움 ATCC 700408 박테리아에 대해 0.25 ㎍/mL의 MIC 값을 나타내었다. 한 가지 (서열 15)를 제외하고, 시험된 모든 아미드화된 펩티드는 에스케리키아 콜라이 및 클레브시엘라 뉴모니아에 균주에 대해 우수한 MIC 값을 나타내었다. 온코신 (서열 18)을 유도하는 서열 2로부터 Asn19의 결실은 놀랍게도 펩티드의 활성을 추가로 증가시켰다. C-말단의 아미드화는 에스케리키아 콜라이 및 클레브시엘라 뉴모니아에에 대한 활성을 증가시켰을 뿐만 아니라, 또한 온코펠투스 4 또는 온코신 유도체의 안정성을 증가시켰다.
슈도모나스 아에루기노사, 프로테우스 미라빌리스 및 프로테우스 불가리스로, 추가로 그람-음성 박테리아를 시험하고, 바람직한 예시 서열 18 및 24의 활성을 결정하였다. 온코신 (서열 18)은 슈도모나스 아에루기노사 39324에 대해 (MIC 4 ㎍/mL) 및 프로테우스 미라빌리스 및 프로테우스 불가리스에 대해 (128 ㎍/mL) 모두 활성이었다. 온코신은 또한 16 ㎍/mL에서 그람-양성 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스 15305 박테리아에 대해 활성이었다. 따라서, 본 발명에 따른 펩티드는 놀랍게도 광범위한 작용 스펙트럼을 나타내었다.
[표 11]
Figure pct00029
온코신의 유도체는 병원성 박테리아, 예컨대 에스케리키아 콜라이 DSM 10233, 클레브시엘라 뉴모니아에 DSM 681 및 슈도모나스 아에루기노사 DSM 3227에 대해 매우 우수한 활성을 나타내었다. 위치 15에서 4-트랜스-히드록시프롤린으로의 치환 (서열 63 및 108)은 놀랍게도 1 내지 4 ㎍/mL의 에스케리키아 콜라이 DSM 10233에 대해 높은 MIC 값을 나타내었으며, 이들은 온코신 (서열 18)보다 16배 더 높았다. 이들 유도체는 또한 클레브시엘라 뉴모니아에 DSM 681 및 슈도모나스 아에루기노사 DSM 3227에 대해 높은 활성을 나타내었으며, 이는 본 발명에 따른 펩티드의 광범위한 작용 스펙트럼을 설명한다.
실시예 4: 형광 현미경검사
HeLa 및 SH-SY5Y 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (그라이너 바이오-원 게엠베하, 독일 프리켄하우젠)에서 플레이팅하고, 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 5,6-카르복시플루오레세인-표지된 펩티드 또는 페네트라틴 구축물을 새로운 배지 (40 μmol/L)에 용해시키고, 세포를 그 안에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, PBS 중에서 형광 현미경검사에 의해 조사하였다.
형광 현미경검사를 위한 파라미터
현미경: 라이카(Leica) DMI6000B (라이카 미크로시스템즈 게엠베하(Leica Mikrosystems GmbH), 독일 웨즐러)
광원: 금속-할로겐 램프가 있는 라이카 EL6000
대물렌즈: N PLAN L 20 x 0.40 corr
소프트웨어: 라이카 애플리케이션 슈트(Leica Application Suite) 2.1.8.; 어도비 포토샵(Adobe Photoshop) CS
도 3의 형광 현미경사진은 40 μmol/L의 5,6-카르복시플루오레세인-표지된 온코신 (서열 94)과 인큐베이션한 후에, HeLa 또는 SH-SY5Y 세포에서 형광이 검출가능하지 않았다는 것을 보여준다 (도 3B 및 F). 또한, 5,6-카르복시플루오레세인-표지된 아피다에신 1b, 피로코리신 및 드로소신 (서열 88, 90 및 92)에 대해 형광이 검출될 수 없었으며, 이에 따라 이들 항미생물 프롤린-풍부 펩티드의 내재화도 검출될 수 없었다. 반면, 5,6-카르복시플루오레세인-표지된 페네트라틴-온코신 (서열 102)을 갖는 세포주를 모두 인큐베이션한 후에, 현미경 사진에서 세포 내부에 강한 형광이 관찰되었으며 (도 3D 및 E), 이는 전체 구축물의 내재화의 증거를 제공한다.
아피다에신 1b, 피로코리신 및 드로소신 (서열 96, 98 및 100)을 갖는 페네트라틴 구축물은 또한 세포주 둘 모두에서 내재화되고, 명확한 형광을 보여주었다.
실시예 5: 공초점 레이저 주사 현미경검사
박테리아
밤새 배양된 박테리아 현탁액을 150 x 106개 세포/mL로 희석하고, 5,6-카르복시플루오레세인-표지된 펩티드 및 페네트라틴 구축물을 첨가하였다 (30 μmol/L의 최종 농도). 박테리아 외부 분자의 형광을 켄칭하기 위해, 60 eq 5,6-카르복시테트라메틸로다민 (TAMRA; 머크, 독일 다름슈타트)을 첨가하였다. 박테리아에서 표지된 펩티드의 내재화로부터 발생하는 형광은 라이카 미크로시스템즈 게엠베하 (독일 웨즐러) 사로부터의 TCS SP5 공초점 레이저 주사 현미경으로 즉시 조사하였다.
5,6-카르복시플루오레세인-표지된 온코신과 20분 동안 인큐베이션한 후에, 펩티드는 박테리아 막에 축적되었다 (도 4B). 이에 따라, 세포 외부에 잔류하는 5,6-카르복시플루오레세인과 TAMRA 사이의 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 통한 켄칭 효과가 소실되고, 형광 신호를 검출할 수 있었다. 추가의 30분 후에, 펩티드는 세포 내부에서 축적되었다 (도 4D). 5,6-카르복시플루오레세인-표지된 아피다에신 1b, 피로코리신 및 드로소신 서열 (서열 96, 98 및 100)은 또한 에스케리키아 콜라이에서 내재화되고, 명확한 형광을 생성하였다. 반면, 표지된 페네트라틴 구축물은 비슷한 인큐베이션 시간 후에 보다 천천히 세포의 내부에 도달하고, 훨씬 더 약한 형광을 발생시켰다 (도 4F). 이 관찰은 결정된 최소 억제 농도와 관련된다. 따라서, 온코신의 페네트라틴 구축물 (서열 100)은 32 ㎍/mL에서 온코신 (4 ㎍/mL; 서열 18)보다 8배 더 높은 MIC 값을 나타냈으며, 이에 따라 에스케리키아 콜라이에 대해 상당히 더 낮은 활성을 나타내었다 (표 7). 페네트라틴 동종이량체의 진입은 심지어는 90분 후에 형광 현미경검사에 의해 검출될 수 없었다 (도 4H). 이는 페네트라틴 구축물에서 각각의 프롤린-풍부 펩티드 서열이 박테리아 세포 내로 운반물로서 페네트라틴을 수송한다는 것을 보여준다.
반면, 5,6-카르복시플루오레세인-표지된 페네트라틴 동종이량체는 그람-양성 미크로코쿠스 루테우스 세포에 진입하고, 1시간 동안 인큐베이션한 후에 거기서 명확한 형광 신호를 생성하였다 (도 5J). 표지된 피로코리신은 동일한 인큐베이션 시간 후에 미크로코쿠스 루테우스에서 검출될 수 없었다 (도 5B). 표지된 페네트라틴-피로코리신에서 페네트라틴을 트랜스포터로 사용하면, 유도체가 미크로코쿠스 루테우스 내에 축적되어, 강한 형광 신호를 생성하였다 (도 D). MIC 값은 피로코리신의 경우 128 ㎍/mL에서 페네트라틴-피로코리신의 경우 4 ㎍/mL로 떨어졌으며, 이는 활성의 32배 증가에 상응한다 (표 7). 동시에, 아피다에신 1b (64 ㎍/mL)의 경우 페네트라틴-아피다에신 유도체 (8 ㎍/mL)에서 활성의 8배 증가가 결정되었다.
HeLa 및 SH-SY5Y 세포
세포를 매트텍 코포레이션 (MatTek Corporation, 미국 매사추세츠주 애쉬랜드)으로부터의 유리-바닥 배양 접시 상에서 배양하고, 2시간 또는 24시간 동안 5,6-카르복시플루오레세인-표지된 페네트라틴 구축물 (SH-SY5Y의 경우 10 μmol/L 또는 HeLa의 경우 7 μmol/L)과 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, PBS로 2회 세척하고, 새로운 배지를 첨가하였다. 세포 핵을 염색하기 위해, 염료 훽스트(Hoechst) 33342 (플루카 케미 게엠베하, 스위스 부치스)를 첨가하고, 이를 추가의 15분 동안 인큐베이션하였다. 형광을 TCS SP5 공초점 레이저 주사 현미경으로 즉시 분석하였다. 모든 이미지는 순차적 스캔 모드로 기록하고, 이미지의 배치를 라이카 애플리케이션 슈트 어드밴스드 플루오레센스 1.7.1 소프트웨어(Leica Application Suite Advanced Fluorescence 1.7.1 software) (라이카 미크로시스템즈) 및 어도비 포토샵 CS (어도비 시스템즈 게엠베하(Adobe Systems GmbH), 독일 뮌헨)로 분석하였다.
결과는 5,6-카르복시플루오레세인-페네트라틴에 의해 N-말단 연장된 항미생물 펩티드가 2시간 이내에 세포에 침투한다는 것을 보여준다. 반대로, 페네트라틴 서열 없이 오직 5,6-카르복시플루오레세인으로 표지된 항미생물 펩티드는 세포에서 검출할 수 없었으며, 즉 이들 펩티드는 외부 세포막을 통해 시험된 세포주로 침투할 수 없었다. 세포의 내부로의 수송은 오직 페네트라틴 서열을 통해 일어난다. 세포 핵을 염료 훽스트 33342로 염색하고, 미토콘드리아를 염료 미토트래커 레드(MitoTracker Red) CMXRos로 염색하여 이들 구획에서 펩티드의 국한을 배제하였다. 상당히 긴 인큐베이션 시간 (24시간) 후에, 5,6-카르복시플루오레세인에 의해 사용된 형광은 세포 핵 근처에 집중하였다. 골지체를 염색하여, 부분적인 공동-편재화를 검출할 수 있었다.
실시예 6: 세포독성
HeLa 및 SH-SY5Y 세포를 사용한 MTT 검정
펩티드, 펩티드모방체 및 페네트라틴 구축물의 세포독성을 로슈 디아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH) (독일 만하임) 사로부터의 "세포 증식 키트 I"을 사용하여 결정하였다. 방법은 대사 활성 세포의 세포 옥시도리덕타제에 의한 황색 메틸티아졸릴디페닐 테트라졸륨 브로마이드 (MTT)의 감소를 기반으로 한다 (문헌 [Vistica D T et al. Tetrazolium-Based Assays for Cellular Viability - A Critical Examination of Selected Parameters Affecting Formazan Production. Cancer Research 51:2515-20, 1991]; [Slater T F, Sawyer B, ＆ Strauli U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. 3. Points of Coupling of 4 Different Tetrazolium Salts. Biochimica et Biophysica Acta 11:383-＆, 1963]; [Berridge M V ＆ Tan A S. Characterization of the Cellular Reduction of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (Mtt) - Subcellular Localization, Substrate Dependence, and Involvement of Mitochondrial Electron Transport in Mtt Reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics 303:474-82, 1993]). 수불용성 자주색 포르마잔 생성물의 형성은 살아있는 세포의 수에 비례하고, 세포 용해 후에 광도계에 의해 검출될 수 있다.
세포 배양은 5％ CO2 및 95％ 공기 습도하에 37℃에서 필터 캡이 있는 세포 배양 용기 (25 cm2) 또는 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (그라이너 바이오-원 게엠베하, 독일 프리켄하우젠)에서 수행하였다. 모든 배지 및 첨가제는 PAA 래보러토리즈 (오스트리아 파슁)로부터 얻었다. 각각의 경우에 1％의 비필수 아미노산 및 1％의 페니실린/스트렙토마이신을 5％ 소 태아 혈청 (HeLa)이 포함된 MEM/글루타민 배지 또는 15％ 소 태아 혈청 (SH-SY5Y)이 포함된 DMEM/HAM의 F-12 배지에 첨가하였다.
HeLa 또는 SH-SY5Y 세포를 2 x 104개 세포/웰의 농도로 멸균 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅하고, 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 멸균 PBS로 1회 세척하고, 100 ㎕의 새로운 배지에 용해된 펩티드를 첨가하였다. 배지 중 12％ PBS 또는 12％ DMSO를 각각 음성 또는 양성 대조군으로 제공하였다. 인큐베이션 (24시간) 후에, MTT 시약 10 ㎕를 첨가하여 0.5 mg의 최종 농도를 제공하고, 이를 37℃에서 추가의 4시간 동안 인큐베이션하였다. 0.01 mol/L 염산 중 10％ 나트륨 도데실술페이트 용액으로, 세포 및 결정질 포르마잔을 용해시키고, 흡광도는 16시간 후에 590 및 650 nm에서 패러다임(Paradigm)TM 마이크로플레이트 판독기 (베크만 코울터 게엠베하(Beckman Coulter GmbH), 오스트리아 왈스)로 결정하였다.
놀라운 결과는 600 ㎍/mL에서 시험된 항미생물 프롤린-풍부 펩티드 중 어느 것도 SH-SY5Y 또는 HeLa 세포에 대한 독성 효과를 가지고 있지 않다는 것을 보여주었다 (도 6). 실험은 3중 결정으로서 3회 독립적으로 수행하였고, 대사 활성 세포의 비율은 배지 중 음성 대조군 12％ PBS에 대해 정상화하였다. 결과는 이들 펩티드의 형광-표지된 유도체가 1시간의 인큐베이션 시간 후에 이들 세포의 내부에서 검출될 수 없다는 사실에 의해 확인되었다 (실시예 5 참조). 따라서, 세포외 표적 분자 또는 외부 세포막의 수용체와의 상호작용은 또한 SH-SY5Y 및 HeLa 세포의 경우에 제외될 수 있다.
페네트라틴 구축물의 세포독성 시험은 3중 결정으로서 희석 시리즈 50-400 ㎍/mL의 3가지 독립적인 실험으로 수행하였다. 대조군 역할을 하는 페네트라틴 단량체 (서열 105) 및 페네트라틴-타우 서열은 400 ㎍/mL의 최고 농도까지 HeLa 세포에 대해 어떠한 독성 작용도 나타내지 않았다 (도 6). 항미생물 펩티드를 갖는 페네트라틴 구축물로, 무시할 수 있을 정도로 작은 독성 효과가 100 ㎍/mL와 400 ㎍/mL 사이에서 관찰되었다. 페네트라틴 동종이량체 (서열 103)는 400 ㎍/mL에서 거의 100％ 독성인 반면, 페네트라틴-드로소신 및 페네트라틴-온코신 (서열 97 및 101)은 경미한 독성을 나타내었다. SH-SY5Y 세포를 사용한 조사에서, 400 ㎍/mL에서 페네트라틴 단량체 및 페네트라틴-타우 구축물이 성장하는 세포의 비율을 70％로 감소시켰다. 모든 페네트라틴-AMP 구축물은 바람직한 농도에서 놀랍게도 어떠한 독성 작용도 나타내지 않았다.
용혈 시험
펩티드 및 펩티드 유도체의 세포독성을 조사하기 위한 또 다른 가능성은 용혈 시험이다. 용혈 활성을 인간 적혈구 상에서 조사하였으며 (문헌 [Ryge T S ＆ Hansen P R. Potent antibacterial lysine-peptoid hybrids identified from a positional scanning combinatorial library. Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry 14:4444-51, 2006]), 이는 라이프치히(Leipzig) 대학 병원 (독일)이 나트륨 클로라이드-아데닌-글루코스-만니톨 완충제 중에서 인간 적혈구 농축물로서 제공하였다 (4℃에 보관됨). 적혈구를 1000 g에서 원심분리하고, 10배 부피의 냉각 포스페이트-완충 염수 (PBS, pH 7.4)로 3회 세척하였다. 적혈구를 PBS 중 1％의 최종 농도로 희석하였다. 적혈구 현탁액 100 마이크로리터를 96-웰 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트 (그라이너 바이오-원 게엠베하)의 각각의 V자형 웰로 피펫팅하였다. 이어서, PBS에 용해시킨 펩티드 100 ㎕를 각각의 위치에 첨가하여, 7개의 희석 단계에서 600 ㎍/mL부터 4.7 ㎍/mL까지의 희석 시리즈를 얻었다. 마이크로타이터 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 1000xg에서 원심분리하였다. 상청액으로부터 100 ㎕를 취하고, 96-웰 편평-바닥 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 (그라이너 바이오-원 게엠베하)로 옮기고, 선라이즈(Sunrise) 마이크로타이터 플레이트 판독기 (테칸 트레이딩 아게, 스위스 맨느도르프)로 405 nm에서 흡광도를 결정하여, 헴 기의 방출을 평가하였다. PBS 또는 0.1％ 트리톤 X-100® ((p-tert-옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올; 플루카 케미 게엠베하, 스위스 부치스) 및 멜리틴 (시그마-알드리치-래보케미칼리엔(SIGMA-Aldrich-Laborchemikalien), 독일 타우프키르헨)을 음성 또는 양성 대조군으로 사용하였다. 모든 용혈 시험은 이중 결정으로서 독립적으로 2회 수행하였고, 용혈의 정도를 하기 식으로부터 결정하였다 (문헌 [Park Y et al. A Leu-Lys-rich antimicrobial peptide: activity and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics 1645:172-82, 2003]):
(E펩티드 - EPBS)/(E트리톤 - EPBS) x 100％
E = 405 nm에서의 소거
분석된 항미생물 프롤린-풍부 펩티드는 어느 것도 600 ㎍/mL의 농도까지 용혈 활성을 나타내지 않았다 (표 12). 이는, 심지어는 결정된 MIC 값보다 100배 더 높은 농도에서, 인간 적혈구의 어떠한 용해도 관찰되지 않았다는 것을 의미한다. 모든 펩티드의 용혈률은, 트리톤 X-100®에 비해, 단지 약 1％였으며, 이는 상기 시험의 오차 한계 내에 포함된다. 비이온성 계면활성제 트리톤 X-100®이 상기 시험 설정에서 1시간 이내에 적혈구 세포를 완전히 파괴하므로, 이를 양성 대조군으로서 사용하였다. 멜리틴 (생봉독)은 생물학적 막에 대해 강력하게 용해 작용을 하는 α-나선형 펩티드를 갖고, 심지어는 5 ㎍/mL의 농도에서 원핵 및 진핵 세포 막을 모두 파괴한다. 이 세포 시험은 펩티드 및 펩티드 유도체가 인간 적혈구에 대한 부작용을 나타내지 않고 혈중에서 고농도로 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
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[도면 설명]
도 1은 아가 확산 검정에서 에스케리키아 콜라이 BL21 AI에 대한 온코신 유사체 (Ala-스캔)의 항박테리아 활성을 보여준다. 크로스-해치형 막대는 부분적 억제를 나타낸다.
도 2는 아가 확산 검정에서 미크로코쿠스 루테우스 ATCC 10240에 대한 온코신 유사체 (알라닌 스캔)의 항박테리아 활성을 보여준다
도 3은 5,6-카르복시플루오레세인-표지된 온코신 (CF-온코신 서열 94) 및 페네트라틴-온코신 (CF-페네트라틴-온코신 서열 102)과 인큐베이션한 후에 HeLa 및 SH-SY5Y 세포의 형광 현미경 사진을 보여준다. 상부 열: 위상 대조; 하부 열: 형광 (517 nm 방사). A, B: SH-SY5Y를 CF-온코신과 인큐베이션하고; C, D: SH-SY5Y를 CF-페네트라틴-온코신과 인큐베이션하고; E, F: HeLa를 CF-온코신과 인큐베이션하고; G, H: HeLa를 CF-페네트라틴-온코신과 인큐베이션한다. 막대는 20 ㎛에 상응한다.
도 4는 에스케리키아 콜라이 BL21 AI의 공초점 레이저 주사 현미경 사진을 보여준다. 펩티드 농도 30 μmol/L; TAMRA 농도 180 μmol/L. 상부 열: 위상 대조; 하부 열: 형광. A, B: CF-온코신과 20분 인큐베이션; C, D: CF-온코신과 50분 인큐베이션; E, F: CF-페네트라틴-온코신과 50분 인큐베이션; G, H: CF-페네트라틴 동종이량체와 90분 인큐베이션. 막대는 5 ㎛에 상응한다.
도 5는 미크로코쿠스 루테우스 10240의 공초점 레이저 주사 현미경 사진을 보여준다. 펩티드 농도 30 μmol/L; TAMRA 농도 180 μmol/L. 상부 열: 위상 대조; 하부 열: 형광. A, B: CF-피로코리신; C, D: CF-페네트라틴-피로코리신; E, F: CF-드로소신; G, H: CF-페네트라틴-드로소신; I, J: CF-페네트라틴 동종이량체. 막대는 5 ㎛에 상응한다.
도 6은 "세포 증식 키트 I"을 사용하여 결정된 SH-SY5Y (크로스-해치형 칼럼) 및 HeLa 세포 (흑색 칼럼)에 대한 항미생물 펩티드를 위한 세포독성 시험의 결과를 보여준다. 600 ㎍/mL 온코신, 온코신 R15O R19O, 드로소신 및 아피다에신 1b (서열 18, 72, 89 및 87)와 배지 중에서 24시간 인큐베이션한 후에 시험한다. 양성 대조군 12％ DMSO 및 100 ㎍/mL 멜리틴. 음성 대조군 12％ PBS에 대해 정상화한다.
도 7은 "세포 증식 키트 I"을 사용하여 결정된 HeLa 세포에 대한 페네트라틴 구축물을 위한 세포독성 시험의 결과를 보여준다. 50-400 ㎍/mL 페네트라틴-드로소신 (서열 96), 페네트라틴-아피다에신 1b (서열 94), 페네트라틴-피로코리신 (서열 98), 페네트라틴-온코신 (서열 100), 페네트라틴 동종이량체 (서열 102), 페네트라틴 (서열 105)과 배지 중에서 24시간 인큐베이션한 후에 시험한다. 음성 대조군 12％ PBS 및 양성 대조군 12％ DMSO.
도 8은 "세포 증식 키트 I"을 사용하여 결정된 SH-SY5Y 세포에 대한 페네트라틴 구축물을 위한 세포독성 시험의 결과를 보여준다. 50-400 ㎍/mL 페네트라틴-드로소신 (서열 96), 페네트라틴-아피다에신 1b (서열 94), 페네트라틴-피로코리신 (서열 98), 페네트라틴-온코신 (서열 100), 페네트라틴 동종이량체 (서열 102), 페네트라틴 (서열 105), 페네트라틴-타우 (서열 106)와 배지 중에서 24시간 인큐베이션한 후에 시험한다. 12％ PBS를 음성 대조군으로 사용하고, 12％ DMSO를 양성 대조군으로 사용한다.
도 9는 펩티드 온코신, 드로소신 및 아피다에신 1b (서열 18, 89 및 87)에 대한 용혈 시험의 결과를 보여준다. 펩티드 희석 시리즈 4.7-600 ㎍/mL. 양성 대조군: 멜리틴 및 트리톤 X-100®, 음성 대조군 PBS.
도 10: "세포 증식 키트 I"을 사용하여 결정된 HeLa 세포에 대한 항미생물 펩티드를 위한 세포독성 시험의 결과를 보여준다. 600 ㎍/mL 온코신 및 온코신 유도체 (서열 18, 63, 72, 107 내지 110) 및 비교 실시예 아피다에신 1b 및 드로소신 (서열 87 및 89)과 배지 중에서 24시간 인큐베이션한 후에 시험한다. 양성 대조군 12％ DMSO 및 100 ㎍/mL 멜리틴. 음성 대조군 12％ PBS에 대해 정상화한다. 다이아그램은 3회 반복한 2개의 독립적인 시험의 평균값을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> AMP Therapeutics GmbH & Co. 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is 4Hyp <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 24 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Xaa Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 25 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is 4Hyp <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 25 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Orn <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is Asparagine amide <400> 26 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa Xaa 20 <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Asparagine amide <400> 27 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Xaa <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <400> 28 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn <210> 29 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 29 Ala Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 30 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 30 Val Ala Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 31 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 31 Val Asp Ala Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 32 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 32 Val Asp Lys Ala Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 33 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 33 Val Asp Lys Pro Ala Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 34 Val Asp Lys Pro Pro Ala Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 35 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 35 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Ala Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 36 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 36 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Ala Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 37 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 37 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Ala Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 38 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 38 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Ala Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 39 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 39 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Ala Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 40 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 40 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Ala Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 41 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 41 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Ala Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 42 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 42 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Ala Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 43 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 43 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Ala Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 44 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 44 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ala 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 45 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 45 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Ala Asn Xaa <210> 46 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 46 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Ala Xaa <210> 47 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Alanine amide <400> 47 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <400> 48 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Pro Ile 1 5 10 15 Arg Val <210> 49 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa is Leucine amide <400> 49 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro Arg Xaa 20 25 <210> 50 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Ornithine amide <400> 50 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 51 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Asparagine amide <400> 51 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 52 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is 2,3-Diamino-3-N-acetylpropionic acid amide <400> 52 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 53 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Histidine amide <400> 53 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 54 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is 2-Amino-3-guanidinopropionic acid amide <400> 54 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 55 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Nitroarginine amide <400> 55 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 56 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is N-Methyl-arginine amide <400> 56 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 57 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Homoarginine amide <400> 57 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 58 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine propyl amide <400> 58 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 59 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 59 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 60 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 60 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Pro Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 61 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Orn <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 61 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 62 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is beta-Homoarginine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 62 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro 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<223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is 2-Amino-3-guanidinopropionic acid <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is 2-Amino-3-guanidinopropionic acid amide <400> 66 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 67 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Homoarginine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is is Homoarginine amide <400> 67 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 68 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Homoarginine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is 2-Amino-3-guanidinopropionic acid amide <400> 68 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 69 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Orn <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is 2-Amino-3-guanidinopropionic acid amide <400> 69 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 70 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Orn <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Homoarginine amide <400> 70 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 71 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Orn <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine propyl amide <400> 71 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 72 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Orn <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Ornithine amide <400> 72 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 73 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Orn <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Ornithine amide <400> 73 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Leu 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 74 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Orn <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is is Ornithine amide <400> 74 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Gln Xaa <210> 75 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 75 Val Glu Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 76 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 76 Val Asp Arg Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 77 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 77 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Ile Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 78 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 78 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Leu 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 79 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 79 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Gln Xaa <210> 80 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-Acetyl-Valine <400> 80 Xaa Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Arg <210> 81 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-Formyl-Valine <400> 81 Xaa Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Arg <210> 82 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Ornithine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 82 Xaa Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 83 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-alpha-Acetyl-Ornithine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 83 Xaa Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 84 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-Guanidino-Valine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 84 Xaa Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 85 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-Guanidino-Valine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Orn <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Ornithine amide <400> 85 Xaa Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 86 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Arginine amide <400> 86 Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile Tyr 1 5 10 15 Asn Xaa <210> 87 <211> 18 <212> PRT <213> Apis mellifera <400> 87 Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro 1 5 10 15 Arg Leu <210> 88 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is 5(6)-Carboxyfluorescein-Glycine <400> 88 Xaa Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro 1 5 10 15 Arg Leu <210> 89 <211> 19 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 89 Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro Thr Ser His Pro Arg Pro 1 5 10 15 Ile Arg Val <210> 90 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is 5(6)-Carboxyfluorescein-Glycine <400> 90 Xaa Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro Thr Ser His Pro Arg Pro 1 5 10 15 Ile Arg Val <210> 91 <211> 20 <212> PRT <213> Pyrrhocoris apterus <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is Asparagine amide <400> 91 Val Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Thr Pro Pro Arg Pro Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Arg Xaa 20 <210> 92 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is 5(6)-Carboxyfluorescein-Valine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is Asparagine amide <400> 92 Xaa Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Thr Pro Pro Arg Pro Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Arg Xaa 20 <210> 93 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 93 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 94 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is 5(6)-Carboxyfluorescein-Valine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 94 Xaa Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 95 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-Acetyl-Glycine with Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-C ys coupled to the alpha-C of the acetyl residue via an thioether bond to the S of Cysteine <400> 95 Xaa Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro 1 5 10 15 Arg Leu <210> 96 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-Acetyl-Glycine with N-alpha-5(6)-Carboxyfluorescein-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-A sn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys coupled to the alpha-C of the acetyl residue via an thioether bond to the S of Cysteine <400> 96 Xaa Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro 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misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-Acetyl-Valine with Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-C ys coupled to the alpha-C of the acetyl residue via an thioether bond to the S of Cysteine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is Asparagine amide <400> 99 Xaa Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Thr Pro Pro Arg Pro Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Arg Xaa 20 <210> 100 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-Acetyl-Valine with N-alpha-5(6)-Carboxyfluorescein-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-A sn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys coupled to the alpha-C of the acetyl residue via an thioether bond to the S of Cysteine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is Asparagine amide <400> 100 Xaa Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Thr Pro Pro Arg Pro Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Arg Xaa 20 <210> 101 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 101 Xaa Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 102 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-Acetyl-Valine with N-alpha-5(6)-Carboxyfluorescein-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-A sn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys coupled to the alpha-C of the acetyl residue via an thioether bond to the S of Cysteine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 102 Xaa Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 103 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cysteine with Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-C ys coupled to the S via a disulfide bond to the S of cysteine <400> 103 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Xaa <210> 104 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-alpha-5(6)-Carboxyfluorescein-Arginine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cysteine with N-alpha-5(6)-Carboxyfluorescein-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-A sn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys coupled to the S via a disulfide bond to the S of cysteine <400> 104 Xaa Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Xaa <210> 105 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <400> 105 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 106 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-Acetyl-alpha-Amino hexanoic acid with Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-C ys coupled to the alpha-C of the acetyl residue via an thioether bond to the S of Cysteine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is alpha-Amino hexanoic acid <400> 106 Xaa Xaa Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Arg Gly Ser 1 5 10 <210> 107 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is 4Hyp <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Orn <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Ornithine amide <400> 107 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Xaa Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 108 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is 4Hyp <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is 4Hyp <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Ornithine amide <400> 108 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro 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<222> (15)..(15) <223> Xaa is D-Arginine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arginine amide <400> 111 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 112 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is D-Arginine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is D-Arginine amide <400> 112 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 113 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Orn <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Orn <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Valine amide <400> 113 Xaa Asn Tyr Ile Xaa Arg Pro Pro Arg Pro Arg Pro Leu Tyr Pro Pro 1 5 10 15 Lys Asp Xaa <210> 114 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Orn <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is 4Hyp <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Valine amide <400> 114 Xaa Asn Tyr Ile Xaa Arg Pro Pro Arg Pro Arg Pro Leu Tyr Pro Pro 1 5 10 15 Lys Asp Xaa <210> 115 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is D-Arginine amide <400> 115 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 116 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is D-Orn <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is D-Ornithine amide <400> 116 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 117 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> All amino acids ar D-amino acids <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is D-Valine amide <400> 117 Arg Asn Tyr Ile Arg Arg Pro Pro Arg Pro Arg Pro Leu Tyr Pro Pro 1 5 10 15 Lys Asp Xaa <210> 118 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> All amino acids are D-amino acids <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is D-Orn <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is D-Orn <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is D-Valine amide <400> 118 Xaa Asn Tyr Ile Xaa Arg Pro Pro Arg Pro Arg Pro Leu Tyr Pro Pro 1 5 10 15 Lys Asp Xaa <210> 119 <211> 18 <212> PRT <213> Apis mellifera <400> 119 Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro 1 5 10 15 Arg Ile <210> 120 <211> 16 <212> PRT <213> Myrmecia gulosa <400> 120 Gly Arg Pro Asn Pro Val Asn Asn Lys Pro Thr Pro Tyr Pro His Leu 1 5 10 15 <210> 121 <211> 15 <212> PRT <213> Palomena prasina <400> 121 Val Asp Lys Pro Asp Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Pro Pro Asn Met 1 5 10 15 <210> 122 <211> 34 <212> PRT <213> Oncopeltus fasciatus <400> 122 Glu Val Ser Leu Lys Gly Glu Gly Gly Ser Asn Lys Gly Phe Ile Gln 1 5 10 15 Gly Ser Gly Thr Lys Thr Leu Phe Gln Asp Asp Lys Thr Lys Leu Asp 20 25 30 Gly Thr <210> 123 <211> 20 <212> PRT <213> Oncopeltus fasciatus <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Pro or any other naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Optional residues <400> 123 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Xaa Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Asn Arg 20 <210> 124 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Alanine amide <400> 124 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Xaa <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <400> 125 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 126 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <400> 126 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg 1 5 10

Claims (29)

  1. 하기 서열 중 하나를 함유하는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
    Figure pct00031

    여기서,
    X1은 비극성 소수성 측쇄, 또는 순 양전하 또는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는 잔기이고;
    D2는 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기이고,
    K3은 순 양전하 또는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는 잔기, 바람직하게는 리신 또는 아르기닌이고,
    X2 및 X4는 순 양전하 또는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는 잔기로부터 서로 독립적으로 선택되고,
    X3은 순 양전하 또는 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 갖는 잔기, 또는 프롤린 또는 프롤린 유도체이고,
    L7은 비극성 소수성 측쇄를 갖는 잔기, 바람직하게는 류신, 이소류신 및 발린으로부터 선택되고,
    I16은 비극성 소수성 측쇄를 갖는 잔기, 바람직하게는 류신, 이소류신, tert-부틸글리신 및 발린으로부터 선택되고,
    Y6 및 Y17은 각각의 경우에 티로신이고, R9 및 R14는 각각의 경우에 아르기닌이고, N18은 아스파라긴 또는 글루타민이고, N19는 아스파라긴 또는 글루타민이거나 또는 존재하지 않고, P4, P5, P8, P10, P12, P13 및 P17은 프롤린 및 프롤린 유도체 또는 히드록시프롤린 및 히드록시프롤린 유도체로부터 서로 독립적으로 선택되고,
    Sub1은 아미노산 X1의 유리 N-말단 또는 변형된 N-말단 아미노 기이고,
    Sub2는 C-말단 아미노산의 유리 C-말단 카르복실 기 (-COOH) 또는 변형된 C-말단 카르복실 기이다.
  2. 제1항에 있어서, P13 및 R14가 교환되고/거나 D2, P4, P5, P8, P10, P12, P13, P17 및 Y17로부터 선택된 잔기 중 1개 또는 2개가 임의의 잔기로 대체되는 것인 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-말단이 다른 펩티드에 직접 연결되거나 또는 링커를 통해 연결되는 것인 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Sub2에 적어도 하나의 추가의 잔기 X5 및/또는 X6을 함유하며, 여기서 X5는 프롤린, 프롤린 유도체, 및 순 양전하를 갖거나 생리적 조건하에 양으로 하전된 측쇄를 보유하는 빌딩 블록을 포함하는 군으로부터 선택되고, X6은 프롤린, 프롤린 유도체, 극성 빌딩 블록 또는 소수성 빌딩 블록으로부터 선택되는 것인 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 X1이 아르기닌, 리신, δ-히드록시리신, 호모아르기닌, 2,4-디아미노부티르산, β-호모아르기닌, D-아르기닌, 아르기날, 2-아미노-3-구아니디노프로피온산, 니트로아르기닌, N-메틸아르기닌, ε-N-메틸리신, 알로-히드록시리신, 2,3-디아미노프로피온산, 2,2'-디아미노피멜산, 오르니틴, sym-디메틸아르기닌, asym-디메틸아르기닌, 2,6-디아미노헥신산, p-아미노벤조산, 3-아미노티로신, 발린, 이소류신, 류신 및 메티오닌, 알라닌, 페닐알라닌, N-메틸류신, tert-부틸글리신, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, 1-아미노시클로헥실카르복실산, N-메틸이소류신, 노르류신, 노르발린 및 N-메틸발린으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 X2 및/또는 잔기 X4가 아르기닌, 리신, δ-히드록시리신, 호모아르기닌, β-호모아르기닌, D-아르기닌, 아르기날, 2,4-디아미노부티르산, 2-아미노-3-구아니디노프로피온산, 니트로아르기닌, 니트로소아르기닌, N-메틸-아르기닌, ε-N-메틸리신, 알로-히드록시리신, 2,3-디아미노프로피온산, 2,2'-디아미노피멜산, 오르니틴, sym-디메틸아르기닌, asym-디메틸아르기닌, 2,6-디아미노헥신산, p-아미노벤조산 및 3-아미노티로신으로부터 서로 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 X3이 아르기닌, 리신, δ-히드록시리신, 호모아르기닌, β-호모아르기닌, D-아르기닌, 아르기날, 2,4-디아미노부티르산, β-호모아르기닌, 2-아미노-3-구아니디노프로피온산, 니트로아르기닌, 니트로소아르기닌, N-메틸-아르기닌, ε-N-메틸리신, 알로-히드록시리신, 2,3-디아미노프로피온산, 2,2'-디아미노피멜산, 오르니틴, sym-디메틸아르기닌, asym-디메틸아르기닌, 2,6-디아미노헥신산, p-아미노벤조산, 3-아미노티로신, 프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시프롤린, 시스-3-히드록시프롤린, 트랜스-3-히드록시프롤린, β-시클로헥실알라닌, 3,4-시스-메타노프롤린, 3,4-데히드로프롤린, 호모프롤린 및 슈도프롤린으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 5 내지 9, 14 내지 26, 29, 30, 32, 33, 36, 38, 40, 41, 44 내지 46, 49, 50, 53 내지 59, 61 내지 85, 93, 94, 101, 102 및 107 내지 112를 포함하는 서열의 군으로부터 선택되는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  9. 항박테리아 펩티드 및 세포-침투 펩티드를 함유하는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항박테리아 펩티드가 아피다에신, 드로소신, 포르마에신 1, 피로코리신 및 메탈니코윈 1을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 항박테리아 펩티드가 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 청구된 펩티드 또는 펩티드 유도체를 포함하는 것인 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-침투 펩티드가 페네트라틴, Tat 펩티드, 모델 양친매성 펩티드, 트랜스포르탄, SynB 및 시스-γ-아미노-1-프롤린-함유 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 95 내지 102 및 106을 포함하는 군으로부터 선택되는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 주쇄의 펩티드 결합 중 적어도 하나가 화학적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  15. 제14항에 있어서, X6과 X7 사이의 결합이 생리적 조건하에 절단될 수 없는 화학적 결합인 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 화학적으로 변형된 결합이 환원된 아미드 결합, 알킬화된 아미드 결합 또는 티오아미드 결합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질에 연결되거나 또는 중합체에 커플링되거나 또는 담체에 결합되는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  18. 적어도 2개의 펩티드 또는 펩티드 유도체가 함께 연결되어 있으며, 상기 펩티드 또는 펩티드 유도체 중 적어도 하나가 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 청구된 펩티드 또는 펩티드 유도체인 것을 특징으로 하는 다량체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 적어도 하나의 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체를 함유하는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 펩티드 또는 펩티드 유도체 또는 다량체를 화학적 합성 또는 재조합 방법에 의해 생성하는 것을 특징으로 하는, 상기 펩티드 또는 펩티드 유도체 또는 다량체의 생성 방법.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체의 의약품 생산을 위한 용도.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체의, 살균제 및/또는 세정제로서, 보존제로서 및/또는 포장 재료에서의 용도.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물, 박테리아 또는 진균 감염의 치료에 사용하기 위한 펩티드, 펩티드 유도체 및/또는 다량체.
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 펩티드, 펩티드 유도체 및/또는 다량체의, 미생물, 박테리아 또는 진균에 의한 오염을 제거하기 위한 용도.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체의, 제약 연구 또는 스크리닝 방법에서의 용도.
  26. (i) (a) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체에 민감성인 미생물,
    (b) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체, 및
    (c) (a)를 (b) 및 (c)와 접촉시킴으로써 시험되는 적어도 하나의 물질
    을 사용하여 경쟁적 검정을 수행하는 단계; 및
    (ii) 미생물에 대한 펩티드, 펩티드 유도체 또는 다량체의 결합을 경쟁적으로 대체하는 시험 물질을 선별하는 단계
    를 포함하는, 항박테리아 또는 항진균 작용을 하는 물질을 확인하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 미생물이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 모르가넬라 모르가니이(Morganella morganii), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 시겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae), 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 및 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)를 포함하는 속의 군으로부터 선택된 종인 방법.
  28. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 펩티드 또는 다량체를 코딩하는 핵산.
  29. 제28항에 청구된 하나 이상의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
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