WO2013064633A1 - Oncopeltus-peptidderivate als antimikrobielle peptide - Google Patents

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WO2013064633A1
WO2013064633A1 PCT/EP2012/071722 EP2012071722W WO2013064633A1 WO 2013064633 A1 WO2013064633 A1 WO 2013064633A1 EP 2012071722 W EP2012071722 W EP 2012071722W WO 2013064633 A1 WO2013064633 A1 WO 2013064633A1
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amino acid
acid residues
peptide
uncharged
acid
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PCT/EP2012/071722
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Ralf Hoffmann
Daniel Knappe
Kai Hilpert
Ralf Mikut
Serge RUDEN
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Amp-Therapeutics Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to antimicrobial peptides based on oncocin, in particular for use in medicine. Furthermore, the invention relates to compositions and methods which are suitable for killing microorganisms, in particular bacteria.
  • Antimicrobial peptides are found in almost all living things and are considered in today's research as alternatives to conventional antibiotics. To date, numerous native antimicrobial peptides have been identified that serve as a starting point for the synthesis of new antibiotics by altering the amino acid sequence and thereby improving the spectrum of action. Most AMPs contain less than 100 amino acids and can be divided into two main classes: the cationic and the anionic antimicrobial peptides.
  • Oncopeltus antimicrobial peptide 4 over Gram-negative bacteria such as Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli has been the subject of much research.
  • WO 2010/086401 A1 discloses derivatives of Oncopeltus antibacterial peptide 4 whose amino acid sequence corresponds to one of the following general formulas:
  • Oncopeltus antibacterial peptide 4 with arginine at position 11 forms a characteristic PRP triplet.
  • the peptide with the resulting amino acid sequence VDI PPYLPRPRPPRRIYNR-NH 2 (SEQ ID NO: 1) is referred to as oncocin (Knappe 2009).
  • Modifications of residues 13, 15, 16 and 19 of Oncocin to improve antimicrobial activity against Gram-negative bacteria are known, wherein at position 16 the substitution of the isoleucine residue by tertiary leucine is disclosed (Knappe D, Zahn M, Sauer U, Schiffer G, Sträter N, Hoffmann R.
  • WO 0078956 discloses pyrrhocoricin derivatives of the general formula:
  • variable radicals X, Y, X 'and Y' correspond to the positions 5, 6, 18 and 19 of pyrrhocoricin and are identical to those of oncocin.
  • the amino acid residues of pyrrhocoricin essential for antibacterial activity have been described by Kragol et al.
  • the disclosed amino acid sequences are shown in Table 1 (Kragol G, Hoffmann R, Chattergoon MA, Lovas S, Cudic M, Bulet P, Condie BA, Rosengren KJ, Montaner LJ, Otvos L Jr. (2002) Identification of crucial residues for the antibacterial activity of the proline-rich peptide, pyrrhocoricin, Eur J Biochem., 2002, Sep; 269 (17): 4226-37).
  • Cyclic derivatives of pyrrhocoricin are also known and are listed in Table 1 (Rosengren KJ, Göransson U, Otvos L Jr, Craik DJ. (2004) Cyclization of pyrrhocoricin retains structural elements critical for the antimicrobial activity of the native peptides (5): 446-58).
  • US Pat. No. 7,015,309 B1 discloses peptides derived from pyrrhocoricin and whose amino acid sequence corresponds to the following general formula:
  • WO 02079467 A2 discloses inter alia peptides which enable transport through the cell wall.
  • the peptide having the amino acid sequence VDKGSYLPRPTPPRPIYNC is disclosed, inter alia, as SEQ ID No. 27 of WO 02079467 A2.
  • Table 1 shows an alignment comparison of the general formulas and individual amino acid sequences of hitherto known oncocin derivatives and related peptides:
  • Hyp 4-hydroxyproline
  • Tie L-tertiary leucine (L-tertiary-butylglycine).
  • proline-rich antimicrobial peptides The action of proline-rich antimicrobial peptides is very complex as they must penetrate the cell membrane and invade the cytoplasm to inhibit a particular intracellular bacterial target molecule, without, however, being toxic to mammalian cells and blood cells.
  • improvements of Oncopeltus antibacterial peptide 4 have been proposed solely with respect to the effect on Gram-negative bacteria. There is therefore a need to improve the spectrum of activity of the Oncopeltus antibacterial peptide 4 derived antimicrobial peptides in terms of activity against Gram-positive bacteria, in particular against the pathogenic Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus.
  • Gram-positive bacteria do not have a true outer membrane, but a membrane-like structure of several Murein harshen (peptidoglycan).
  • the murein structure is about 80 nm thick and contains embedded Teichonklaren.
  • Active antimicrobial peptides active against Gram-positive bacteria must therefore be designed in such a way that they are suitable for penetrating the cell walls of Gram-positive bacteria which are more stable compared to the cell wall of gram-negative bacteria and which are crosslinked by peptidoglycans and teichoic acids.
  • the object of the invention is therefore to provide antimicrobial peptides having improved antimicrobial activity and an extended spectrum of action, which in particular have improved antimicrobial activity against Gram-positive bacteria.
  • an antimicrobial peptide containing an amino acid sequence according to the general formula A is achieved according to the invention by an antimicrobial peptide containing an amino acid sequence according to the general formula A.
  • the radicals K 3, X 2, P5, X3, R9, X 4, R is H, X5, P13, Ri 4, R 15, X ⁇ , Y17, X7, R19 independently selected from uncharged or positively charged amino acid residues.
  • the residues V b X], Y 6 and L 7 are independently selected from proteinogenic and nonproteinogenic amino acid residues.
  • the amino acid sequence according to formula A has at least 60%, preferably at least 70%, preferably at least 80% amino acid sequence identity to oncocin according to SEQ ID No. 1.
  • the amino acid sequence according to formula A contains a maximum of two negatively charged amino acid residues, preferably at most one negatively charged amino acid residue.
  • a peptide according to the invention at least one of the positions 2, 4, 8, 10, 12, 16 and 18 of SEQ ID No. 1 is modified such that at least one of the following conditions applies to the peptide according to formula A:
  • Xi is selected from uncharged amino acid residues, preferably having at least two non-hydrogen atoms (which are preferably selected from C, N and S) in the side chain, and positively charged amino acid residues,
  • X 2 is selected from positively charged amino acid residues
  • Xi is selected from positively charged amino acid residues
  • X 4 is selected from aliphatic, non-heterocyclic uncharged amino acid residues, aromatic, preferably non-heterocyclic, uncharged amino acid residues and positively charged amino acid residues,
  • X 5 is selected from aliphatic, non-heterocyclic, uncharged amino acid residues and positively charged amino acid residues
  • / or X 6 is selected from sulfur-containing amino acid residues, selenium-containing amino acid residues, nonpolar aromatic amino acid residues and positively charged amino acid residues having a maximum of two nitrogen atoms in the side chain, and / or
  • X 7 is selected from sulfur-containing amino acid residues, selenium-containing amino acid residues, aromatic amino acid residues, non-polar amino acid residues (preferably having at least one C-atom in the side chain, preferably no substitution at the first C-atom of the side chain), positively charged amino acid residues.
  • the invention is based on a substitution analysis of oncocin according to SEQ ID No. 1.
  • the analysis showed that the antimicrobial activity against the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus can be increased if at least one of the positions 2, 4, 8, 10, 12, 16 and 18 is substituted with a suitable amino acid residue (Table 3 of Example 2).
  • the antimicrobial activity against gram-negative bacteria is maintained by such substitution and is also partially improved ( Figure 1).
  • a negatively charged amino acid residue contains an amino acid side chain negatively charged under physiological conditions (e.g., aspartic acid, glutamic acid).
  • physiological conditions are understood to mean a pH of 7.4, a temperature of 37 ° C. and an osmotic pressure of 300 mosmol / kg.
  • a positively charged amino acid residue according to the invention contains a positively charged amino acid side chain under physiological conditions.
  • An uncharged amino acid residue (neutral amino acid residue) contains an uncharged amino acid side chain under physiological conditions. Uncharged amino acid residues are thus neither positively nor negatively charged under physiological conditions. Uncharged amino acid residues include both polar and nonpolar amino acid residues.
  • a polar amino acid residue has at least one polar group in the amino acid side chain.
  • These polar groups are preferably selected from hydroxyl, sulfhydryl, amine, amide and ester groups as well as other groups which allow the formation of hydrogen bonds.
  • a nonpolar (or even hydrophobic) amino acid residue has no polar groups and contains an uncharged amino acid side chain under physiological conditions, preferably with a hydropathic index above 0, more preferably above 3.
  • Preferred nonpolar hydrophobic side chains are selected from H, alkyl, alkylene - Alkoxy, alkenoxy, alkylsulfanyl and Alkenylsulfanylresten having 1 to 10, preferably 2 to 6 C-atoms, and aryl radicals having 5 to 12 carbon atoms.
  • Aromatic amino acid residues have at least one aryl or heteroaryl ring. The term includes polar and nonpolar aromatic amino acid residues.
  • Preferred amino acid side chains of polar aromatic amino acids are selected from aryl radicals having 5 to 12 C atoms, these radicals bearing at least one polar group and heteroaromatic radicals.
  • Preferred heteroaromatic amino acid side chains are heteroaryl radicals having 3 to 10 C atoms and 1 to 4 heteroatoms (preferably N, S or O) in the ring system.
  • Preferred amino acid side chains of nonpolar aromatic amino acids are selected from aryl radicals having 5 to 12 carbon atoms, these radicals bearing no polar groups.
  • Non-aromatic heterocyclic amino acid residues within the meaning of the invention have no aromatic amino acid side chains and at least one non-aromatic heterocyclic amino acid side chain (an exemplary such heterocyclic amino acid is proline).
  • the heteroatoms are preferably selected from N, S and O.
  • Aliphatic amino acids have an aliphatic (non-aromatic) amino acid side chain.
  • All proteinogenic amino acids, non-proteinogenic amino acids or amino acid derivatives (such as imino acids) which form the peptides or peptide derivatives of the present invention may be in either the L or D conformation. Unless otherwise specified, however, the building blocks in the sequences are preferably in the L-conformation.
  • Preferred positively charged amino acid residues are selected from positively charged non-aromatic amino acid residues, preferably arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal (-COOH in arginine is replaced by -CHO), 2-amino-3 guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine (preferably N (G) -nitro-arginine), nitrosoarginine (preferably N (G) -nitrosoarginine), methylarginine (preferably N-methyl-arginine), sym-dimethylarginine, asym- Dimethylarginine, 2,6-diaminohexanoic acid, lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-d
  • Preferred uncharged amino acid residues are selected from asparagine, cysteine, glutamine, serine, threonine, allo-threonine, tyrosine, 3,5-dinitrotyrosine, citrulline, N-methylserine, homoserine, ⁇ -homoserine, glycine, tert-butylglycine, alanine, cyclohexylalanine , ⁇ -alanine, leucine, N-methylleucine, tertiary leucine, norleucine, isoleucine, N-methylisoleucine, valine, norvaline, N-methylvaline, methionine, 1-amino-cyclohexylcarboxylic acid, phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine and tryptophan.
  • Preferred uncharged polar amino acid residues are selected from asparagine, cysteine, glutamine, serine, threonine, allo-threonine, tyrosine, 3,5-dinitrotyrosine, citrulline, N-methylserine, homoserine and ⁇ -homoserine.
  • Preferred aliphatic uncharged nonpolar amino acid residues are selected from glycine, tert-butylglycine, alanine, cyclohexylalanine, ⁇ -alanine, leucine, N-methylleucine, tertiary leucine, noreucine, isoleucine, N-methylisoleucine, valine, norvaline, N-methylvaline and methionine.
  • Preferred aromatic uncharged nonpolar amino acid residues are selected from phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine and tryptophan.
  • Preferred aromatic polar amino acid residues are selected from histidine, histidine derivatives, tyrosine and 3,5-dinitrotyrosine.
  • Histidine derivatives are histidine-derived amino acid residues obtained from histidine by structural modification of preferably one or two functional groups.
  • Preferred histidine derivatives are C 1 -C 3 -alkylated (preferably N-alkyl) histidines, in particular N-methyl-histidine.
  • Preferred aromatic nonpolar amino acid residues are selected from tryptophan, methyltryptophan, phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine, methylphenylalanine, phenyl-phenylalanine and benzoylphenylalanine, phenylglycine and 4-tert-butylphenylalanine.
  • Preferred sulfur or selenium-containing amino acid residues are selected from alkyl-alkoxy, alkenoxy, alkylsulfanyl and alkenylsulfanyl radicals having 1 to 10, preferably 2 to 6, C atoms, or aryl radicals having 5 to 12 C-atoms which contain at least one free (unsubstituted ) Thiol group (-SH) or selenol (-SeH) group carry.
  • Particularly preferred sulfur or selenium containing amino acid residues are cysteine or seleno-cysteine.
  • Preferred non-aromatic heterocyclic amino acid residues are selected from proline and proline derivatives.
  • Proline derivatives are proline-derived amino acid residues obtained from proline by structural modification of preferably one or two functional groups.
  • Preferred proline derivatives are selected from ⁇ -cyclohexylalanine, 3,4-cis-methanoproline, 3,4-dehydroproline, hydroxyproline, mercaptoproline, thioproline, fluoroproline and homoproline.
  • hydroxyproline includes, inter alia, cis-4-hydroxyproline, trans-4-hydroxyproline, cis-3-hydroxyproline and trans-3-hydroxyproline.
  • Hydroxyproline derivatives are hydroxyproline-derived amino acid residues obtained from hydroxyproline by structural alteration of a functional group.
  • Preferred hydroxyproline derivatives are selected from Hydroxy-.beta.-cyclohexylalanine and the above-mentioned proline derivatives which are substituted by a hydroxyl group.
  • a peptide according to the invention is composed of amino acids which are preferably linked to one another via a peptide bond.
  • a peptide according to the invention preferably comprises 19 to 100 amino acid residues, more preferably 19 to 50 amino acid residues.
  • the term "peptide” as used herein also includes peptide derivatives that have been altered by substitutions and / or modifications of one or more amino acid residues by chemical groups, which chemical groups are other than the natural protein-forming amino acid residues, such as Non-proteinogenic ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids, or altered backbone peptides
  • altered backbone means that at least one peptide bond is chemically replaced by a chemical bond that is not cleavable under physiological conditions and can not be cleaved by endoproteases.
  • the non-cleavable bond is a reduced peptide bond, an alkylated amide bond or a thioamide bond.
  • An alkylated amide bond is a peptide bond alkylated at either the nitrogen (N-alpha) or carbon (C-alpha).
  • the alkyl radical preferably has 1 to 3 C atoms. An example is N-methylation. Backbone modifications are preferred at positions susceptible to enzymatic degradation, especially in the arginine and lysine regions.
  • the peptide bond is preferably replaced by a non-cleavable for proteases bond. This non-cleavable bond is preferably selected from the group of reduced amide bonds, alkylated amide bonds or thioamide bonds.
  • altered backbone also includes the attachment of other groups which are capable of forming a covalent bond with both the COOH grappe of the foregoing amino acid residue and the NH 2 group of the following amino acid residue
  • Preferred such groups are the sugar amino acid dipeptide -Isosteres, azapeptides, 6-homopolymers, gamma-peptides, depsipeptides (backbone ester bridges), ⁇ -lactam analogues, 01igo (phenylene-ethylene) s, vinylogous sulfone peptides, poly-N-substituted glycines or oligocarbamates.
  • the peptides according to the invention are preferably linear.
  • the peptides of the invention are also cyclic, preferably the first (N-terminus) and the last amino acid (C-terminus) are linked to each other via a peptide bond or a linker peptide.
  • the peptides of the invention are derived from oncocin (according to SEQ ID NO: 1) by replacing (substituting) at least one and preferably at most 10 amino acids of the amino acid sequence of oncocin with another amino acid.
  • a peptide according to the invention may be present as part of a peptide multimer which is composed of several peptides and wherein a plurality of peptides according to the invention are linked to one another via a linker peptide.
  • the peptide at position 2 is substituted with an amino acid having a positive side chain, more preferably X is ( arginine or ornithine, and / or the peptide is substituted at position 12 such that X 5 is tryptophan having 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 substitutions, such that: X is arginine, proline or a derivative thereof; X 5 is tryptophan, arginine, tyrosine or a derivative thereof; X 2 is lysine or!
  • X 3 is arginine or a derivative thereof;
  • X 4 is arginine or a derivative thereof;
  • X 6 is cysteine, phenylalanine, lysine or a derivative thereof;
  • X 7 is tryptophan or a derivative thereof;
  • 9 is histidine or a derivative thereof.
  • a peptide according to the invention at least one of the positions 2, 4, 8, 10, 12, 16 and 18 of SEQ ID NO. 1, preferably at least one of the positions 2, 4, 8, 10, 12 and 18 of SEQ ID NO. 1 changed.
  • at least two amino acid residues have been changed in a peptide according to the invention compared with SEQ ID No. 1.
  • At least position 2 of SEQ ID No. 1 is particularly preferably changed.
  • at least position 10 of SEQ ID No. 1 is particularly preferably changed.
  • at least position 12 of SEQ ID No. 1 is particularly preferably changed.
  • at least position 16 of SEQ ID No. 1 is particularly preferably changed. Very particular preference is given to changing at least position 2 and at least one of the positions 10 and 12 of SEQ ID No. 1 in a peptide according to the invention.
  • a peptide according to the invention preferably contains at least one of the amino acids of positions 1, 11, 14, 17 and 18 of SEQ ID No. 1 unchanged.
  • the amino acid at position 11 and / or 17 of SEQ ID No. 1 is preferably unchanged.
  • the amino acid at position 1, 14 and / or 15 of SEQ ID NO: 1 is unchanged.
  • the radicals Xi to X 6 in formula A are selected from the following amino acids:
  • Xi is selected from asparagine, cysteine, seleno-cysteine, glutamine, serine, threonine, allo-threonine, tyrosine, 3,5-dinitrotyrosine, citrulline, N-methylserine, homoserine, ⁇ -homoserine, glycine, tert-butylglycine, alanine , Cyclohexylalanine, ⁇ -alanine, leucine, N-methylleucine, tertiary leucine, norleucine, isoleucine, N-methylisoleucine, valine, norvaline, N-methylvaline, methionine, 1-amino-co-cohexylcarboxylic acid, phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine, tryptophan , Arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric
  • Xi is selected from phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine, histidine, N-methyl-histidine, isoleucine, N-methylisoleucine, lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2 , 2'-diaminopimelic acid, leucine, N-methylleucine, tertiary leucine, norleucine, methionine, asparagine, proline, proline derivatives, glutamine, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2 Amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, nitro
  • X ! selected from phenylalanine, histidine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, arginine, serine, threonine, valine, tryptophan, tyrosine, ornithine and D-arginine, in particular from arginine, proline, ornithine and D-arginine.
  • X 2 is selected from arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine , asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexynoic acid, lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, ornithine, p-aminobenzoic acid, 3-aminotyrosine, Histidine, 1-methyl histidine and 3-methyl histidine.
  • X 2 is preferably selected from lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, alloxylysine, 2,3-diaminopropionic acid and 2,2'-diaminopimelic acid, in particular lysine.
  • X 3 is selected from arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine , asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexynoic acid, lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diamino-propionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, ornithine, p-aminobenzoic acid, Aminotyrosine, histidine, 1-methyl histidine and 3-methyl histidine.
  • X is preferably selected from arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine , asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexynoic acid, ornithine, p-aminobenzoic acid, in particular, X ⁇ is arginine.
  • X 4 is selected from asparagine, cysteine, glutamine, serine, threonine, allo-threonine, tyrosine, 3,5-dinitrotyrosine, citrulline, N-methylserine, homoserine, ⁇ -homoserine, glycine, tert-butylglycine, alanine, cyclohexylalanine, ⁇ -alanine, leucine, N-methylleucine, tertiary leucine, norleucine, isoleucine, N-methylisoleucine, valine, norvaline, N-methylvaline, methionine, 1-aminocyclohexylcarboxylic acid, phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine, tryptophan, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-
  • X 4 is selected from aliphatic positively charged amino acid residues and uncharged aromatic amino acid residues.
  • X 4 is selected from arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym- Dimethylarginine, asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexynoic acid, lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diamino-pimelic acid, ornithine, p
  • X is particularly preferably selected from lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, alloxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D Arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine, asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexynoic acid, ornithine, p-aminobenzoic acid, alanine, cyclohexylalanine , ⁇ -alanine, phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine
  • X 4 is selected from lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diamino-pimelic acid, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -Homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine, asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexinic acid, ornithine and p-aminobenzoic acid , in particular lysine, arginine, ornithine and D-arginine.
  • X 5 is selected from asparagine, cysteine, seleno-cysteine, glutamine, serine, threonine, allo-threonine, tyrosine, 3,5-Dinitrotyrosin, citrulline, N-methylserine, homoserine, beta-homoserine, glycine, tert-butyl glycine, Alanine, cyclohexylalanine, ⁇ -alanine, leucine, N-methylleucine, tertiary leucine, norleucine, isoleucine, N-methylisoleucine, valine, norvaline, N-methylvaline, methionine, 1-aminocyclohexylcarboxylic acid, phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine, Tryptophan, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇
  • X 5 is selected from lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D Arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine, asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexynoic acid, ornithine, p-aminobenzoic acid, tryptophan, tyrosine , 3,5-dinitrotyrosine, especially from lysine, arginine, tryptophan and ty
  • X 6 is selected from lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, cysteine, seleno-cysteine, tryptophan, methyl-tryptophan, Phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine, methylphenylalanine, phenylphenylalanine and benzoylphenylalanine, phenylglycine and 4-tert-butylphenylalanine.
  • X 6 is selected from cysteine, seleno-cysteine, phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine and diphenylalanine.
  • X 7 is selected from cysteine, seleno-cysteine, phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine, histidine, histidine derivatives, tryptophan, tyrosine, 3,5-dinitrotyrosine, alanine, cyclohexylalanine, ⁇ -alanine, glycine, tert-butylglycine, leucine, N-methylleucine, tertiary leucine, norleucine, methionine, proline, proline derivatives, valine, norvaline, N-methylvaline, lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2 ' Diaminopimelic acid, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine
  • X 7 corresponds to a nonpolar amino acid residue, this preferably has at least one C atom in the side chain.
  • a non-polar amino acid residue X 7 has no substitution on the first carbon atom of the side chain (in this case the second carbon atom including the carboxy carbon atom, ie the beta-C atom, is present as CH 2 ), ie isoleucine and N- Methylisoleucine are less preferred.
  • X 7 is selected from tryptophan, alanine, cyclohexylalanine, ⁇ -alanine, cysteine, seleno-cysteine, phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine, lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3- Diaminopropionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine , sym-dimethylarginine, asym-dimethylarginine, 2,6-d
  • X 7 is particularly preferably selected from cysteine, seleno-cysteine, tryptophan, phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine tyrosine and 3,5-dinitrotyrosine, very particularly preferably X 7 is cysteine or tryptophan, in particular tryptophan.
  • the radicals Vi, K 3 , P 5 , L 7 , R 9 , R, i, P 13 , Ri 4 , R 15, Yiv and R m are selected from the following amino acids:
  • Vi is selected from polar aliphatic amino acid residues, nonpolar aliphatic amino acid residues and nonpolar aromatic amino acid residues.
  • V is selected from alanine, cyclohexylalanine, ⁇ -alanine, lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine,
  • 2,3-diaminopropionic acid 2,2'-diaminopimelic acid, leucine, N-methylleucine, tertiary leucine, norleucine, methionine, asparagine, proline, proline derivatives, glutamine, arginine, homoarginine,
  • 2,4-diaminobutyric acid ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine, asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexinic acid, Ornithine, p-aminobenzoic acid, serine, threonine, allo-threonine, valine, norvaline, N-methylvaline and tryptophan.
  • K 3 is selected from positively charged amino acid residues and uncharged nonpolar amino acid residues. Preferred is K, selected from lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, arginine, homoarginine,
  • 2,4-diaminobutyric acid ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine, asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexinic acid, Ornithine, p-aminobenzoic acid, proline, proline derivatives, valine, norvaline, N-methylvaline.
  • P 5 is selected from uncharged amino acid residues and positively charged amino acid residues.
  • P 5 is selected from glycine, tert-leucine, methionine, proline, proline derivatives, glutamine, serine, threonine, allo-threonine, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2 -Amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidino-butyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine, asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexinic acid, ornithine, p-aminobenzoic acid, tryptophan, tyrosine and
  • P 5 is selected from uncharged amino acid residues, preferably from glycine, tert-leucine, methionine, proline, proline derivatives, glutamine, serine, threonine, allo-threonine, tryptophan, tyrosine and 3,5-dinitrotyrosine.
  • Y 6 is selected from positively charged amino acid residues, negatively charged amino acid residues, and uncharged aromatic amino acid residues.
  • Y 6 is preferably selected from alanine, cyclohexylalanine, ⁇ -alanine, aspartic acid, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4- guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine, asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexynic acid, ornithine, p-aminobenzoic acid, phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine, histidine, histidine derivatives,
  • Y 6 is particularly preferably selected from arginine, homoarginine, 2,4- Diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine, asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexinic acid, ornithine, p-aminobenzoic acid, phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine, histidine, histidine derivatives, tyrosine and 3,5-dinitrotyrosine.
  • L 7 is selected from uncharged amino acid residues.
  • L 7 is selected from isoleucine, N-methylisoleucine, leucine, N-methylleucine, tertiary-leucine, norleucine, threonine, allo-threonine, valine, norvaline and N-methylvaline.
  • R 9 is selected from positively charged amino acid residues and uncharged amino acid residues.
  • R 9 is selected from asparagine, leucine, N-methylleucine, tertiary leucine, norleucine, lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, arginine , Homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine, asym-dimethylarginine, 2 , 6-diaminohexinic acid, ornithine and
  • R n is selected from positively charged amino acid residues and nonpolar aromatic amino acid residues.
  • R n is selected from phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine, lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, arginine, homoarginine, 2,4 Diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine, asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexinic acid, ornithine and p-amino
  • Pi3 is selected from positively charged amino acid residues, uncharged nonpolar amino acid residues, sulfur containing amino acid residues, and polar aromatic amino acid residues.
  • P J is selected from cysteine, histidine, histidine derivatives, isoleucine, N-methylisoleucine, lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, leucine, N Methylleucine, tertiary leucine, norleucine, methionine, proline, proline derivatives, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid , Nitroarginine, nitroso
  • Ri 4 is selected from positively charged amino acid residues and uncharged nonpolar amino acid residues.
  • R is selected from phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine, lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, leucine, N-methylleucine, tertiary Leucine, norleucine, methionine, proline, proline derivatives, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, Methylarginine, sym-di
  • Ri5 is selected from positively charged amino acid residues, uncharged polar amino acid residues and uncharged aromatic amino acid residues.
  • Ri 5 is selected from lysine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diamino-pimelic acid, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine , D-arginine, arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine, nitrosoarginine, methylarginine, sym-dimethylarginine, asym-dimethylarginine, 2,6-diaminohexynic acid, ornithine, p-aminobenzoic acid, serine , Threonine,
  • Yi7 is selected from uncharged aromatic amino acid residues.
  • Y 17 is selected from tyrosine and 3,5-dinitrotyrosine.
  • R 1Q is selected from positively charged amino acid residues, uncharged aromatic amino acid residues, uncharged polar amino acid residues, aliphatic nonpolar amino acid residues having at least one C atom in the side chain, and non-aromatic heterocyclic amino acid residues.
  • R] 9 is selected from leucine, N-methylleucine, tert-leucine, norleucine, methionine, valine, norvaline, N-methyl valine, cysteine, seleno-cysteine, phenylalanine, homophenylalanine, naphthylalanine, diphenylalanine, histidine, histidine derivatives, lysine, ⁇ -Hydroxylysine, ⁇ - ⁇ -methyllysine, allo-hydroxylysine, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, proline, proline derivatives, glutamine, arginine, homoarginine, 2,4-diaminobutyric acid, ⁇ -homoarginine, D-arginine, Arginal, 2-amino-3-guanidinopropionic acid, 2-amino-4-guanidinobutyric acid, nitroarginine,
  • R 15 and / or R 19 is selected from ornithine, D-arginine, proline and proline derivatives.
  • R 15 and / or R 19 is selected from ornithine, D-arginine, proline and proline derivatives.
  • X 6 is tert-leucine
  • R 15 is histidine
  • / or R ] 9 is a positively charged amino acid.
  • Particularly preferred peptides according to the invention contain an amino acid sequence according to one of SEQ ID Nos. 2 to 18, 20 to 22, 24 to 26, 28 to 30 (the sequences according to one of SEQ ID Nos. 2 to 18, 20 to 22, 24 to 26 , 28 to 30 are particularly preferred) or SEQ ID Nos. 68 to 100 as shown in Table 2.
  • these peptides have an unmodified N-terminus.
  • these peptides have a modified C-terminus, preferably an amidated C-terminus.
  • the invention relates to those peptides of Figure 1, which have a value less than 1, preferably less than 0.9, more preferably less than 0.8, more preferably less than 0.7, less than 0.6, less than 0.5 or less than 0.4.
  • these peptides include a residue R 19 at the C-terminus as defined herein.
  • the C-terminus of a peptide according to the invention is modified.
  • a "modification” is understood to mean that the carboxyl group of the C-terminal amino acid has been changed, for example reduced or substituted.
  • the N-terminus of a peptide according to the invention is preferably the residue Vj.
  • the C-terminus of a peptide according to the invention is preferably the radical R ] 9 .
  • N represents the nitrogen atom of the amino group of the N-terminal amino acid of the peptide and the radicals Ri and R 2 independently are selected from the following groups, wherein the following groups (Iii), (iv) and (v) are preferred:
  • reporter groups preferably fluorescent dyes (preferably fluorescein,
  • linkers for linking to the modified C-terminus of the peptide of general formula COR ? (Definition below), to form a cyclic peptide, preferably linkers based on guanidine, ethylene glycol oligomers, 2,4-diaminobutyric acid, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, desmosine or isodesmosine;
  • Linker for coupling another peptide (Y 2 ) via a chemical or enzymatic reaction, preferably based on iodo, bromo or chloroalkanoic acids (eg iodoacetic acid) or maleimide for coupling to a thiol-containing peptide or another reactive group (eg amino group, thiol group) for coupling a second peptide or peptide derivative (eg as an active ester, aldehyde or thioester) as a carrier or carrier protein;
  • a chemical or enzymatic reaction preferably based on iodo, bromo or chloroalkanoic acids (eg iodoacetic acid) or maleimide for coupling to a thiol-containing peptide or another reactive group (eg amino group, thiol group) for coupling a second peptide or peptide derivative (eg as an active ester, aldehyde or thioester) as
  • Preferred modifications of the carboxyl group of the C-terminal amino acid of a peptide of the invention are modifications of the general formula COR, wherein C is the Carbon atom of the carboxyl group of the C-terminal amino acid of the peptide and the radical R 3 is selected from the following groups:
  • COR is a carboxyl group
  • alkoxy preferably methoxy, ethoxy, propoxy, iso-propoxy or butoxy
  • COR 3 is an ester group
  • amine preferably selected from alkylamine, dialkylamine, methylamine, ethylamine, dimethylamine and cyclohexylamine,
  • COR 3 is an amide or amines selected to which another acid group, in particular the C-terminus of another peptide, an acid group of a polymer or a support material (preferably a carrier polymer) is bound, in these cases COR, is an imide );
  • branched amino acids to form a dimer or oligomeric structure of the peptide.
  • the branched-chain amino acids are preferably selected from lysine, hydroxylysine, ornithine, 2,4-diaminobutyric acid, 2,3-diaminopropionic acid, 2,2'-diaminopimelic acid, desmosine and isodesmosine.
  • R 3 corresponds to another peptide (preferably of 2-4 amino acids) containing a combination of the aforementioned amino acids;
  • linkers for the coupling of another peptide (Y 2 ) via a chemical or enzymatic reaction, preferably based on iodo, bromo or chloroalkanoic acids (eg iodoacetic acid) or maleimide for coupling to a thiol-containing peptide or another reactive group (eg amino group, thiol group) for coupling a second peptide or peptide derivative (eg as an active ester, aldehyde or thioester) as a carrier or carrier protein;
  • a chemical or enzymatic reaction preferably based on iodo, bromo or chloroalkanoic acids (eg iodoacetic acid) or maleimide for coupling to a thiol-containing peptide or another reactive group (eg amino group, thiol group) for coupling a second peptide or peptide derivative (eg as an active ester, aldehyde or thioester)
  • a peptide according to the invention has an amidated C-terminus.
  • Peptides of the general formula (I) with an amidated C-terminus, preferably arginine amide or ornithine amide, advantageously have a particularly high antibacterial activity. Preferably, this is done by a modification of the C-terminus by means of thioester synthesis and subsequent substitution with a primary amine.
  • the peptides according to the invention can be used individually, in combination with one another, as linear peptide multimers or as branched peptide multimers.
  • Suitable multimers of peptides according to the invention include dendrimers and concatamers in which the peptides according to the invention are linked together in series with one another or via linkers (preferably linker peptides, in particular glycine-serine linkers).
  • Peptide multimers may be composed of peptides of the invention having identical amino acid sequences or of peptides of the invention having different amino acid sequences.
  • the nucleic acid segments coding for the peptides according to the invention are preferably linked to one another, whereby upon their expression a recombinant protein is formed which contains a multiplicity of the peptides according to the invention.
  • a recombinant protein so produced is referred to herein as a peptide multimer. Due to the higher stability in the physiological medium, the use of the peptides according to the invention in the form of peptide multimers is preferred.
  • Peptide multimers containing peptides according to the invention comprise at least two, preferably at least four, peptides according to the invention. Any number of additional peptides may be added to any other amino acids of these peptides.
  • a peptide multimer contains a plurality of peptides, wherein one of the peptides is coupled to a branched skeleton of the other peptides of the basic structure.
  • Peptides or peptide multimers according to the invention which contain peptides according to the invention, are preferably coupled to a carrier polymer via a linker peptide.
  • Suitable carrier polymers are suitable for improving the stability, the administration or the production of the peptides according to the invention or their peptide multimers, or for altering the activity spectrum of the peptides.
  • Preferred carrier polymers are biocompatible proteins, in particular selected from human serum albumin, humanized antibodies, liposomes, micelles, synthetic polymers, nanoparticles and phages.
  • a particularly preferred carrier polymer is polyethylene glycol.
  • the peptides of the invention are in the form of a multiple antigenic peptide (MAP).
  • MAP multiple antigenic peptide
  • This system utilizes a central unit of lysine residues to which multiple copies of the same peptide of the invention are synthesized.
  • Each MAP contains multiple copies of one or more of the peptides of the invention.
  • One embodiment of a MAP contains at least three, but preferably four or more, peptides.
  • peptide multimers containing peptides of the invention are coupled to the surface of particles.
  • Suitable particles are micro- or nanoparticles, preferably with magnetic or fluorescent properties.
  • the attachment of the peptide multimers to the surface of particles is preferably carried out by N-terminal biotinylation of the N-terminal end of the peptide multimer and the subsequent complex formation with streptavidin, which is bound to the surface.
  • Peptides of the invention advantageously have an antibacterial activity against both Gram-negative and Gram-positive bacteria.
  • the invention therefore also encompasses the use of a peptide according to the invention or of a peptide multimer which contains peptides according to the invention as antibiotic.
  • Another component of the invention is the use of a peptide of the invention as a pharmaceutical and / or for the preparation of an active substance which can be used as an antibiotic.
  • a further subject of the invention is the use of the peptides or peptide multimers according to the invention, which comprise peptides according to the invention, in medicine or pharmacy, preferably for the treatment of bacterial infections.
  • the invention also encompasses a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one peptide of the invention or at least one peptide multimer containing peptides of the invention in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the peptide or peptide multimer is preferably stabilized here.
  • the stabilization is preferably carried out by coupling the peptide or peptide multimer to a carrier polymer, in particular polyethylene glycol.
  • a pharmaceutical composition according to the invention contains further pharmaceutically active substances, in particular an antibiotic (preferably vancomycin, streptomycin, tetracycline or penicillin).
  • Further preferred pharmaceutically active substances are further antimicrobially active substances, preferably fungicides, such as intraconazole or myconazole.
  • Further preferred pharmaceutically active substances are substances which are suitable for relieving the symptoms associated with the infection (such as fever or rash).
  • An exemplary such substance is salicylic acid.
  • a pharmaceutical composition of the invention may contain one or more different peptides or peptide multimers of the invention.
  • the peptides or peptide multimers according to the invention which comprise peptides according to the invention are preferably present in a composition according to the invention on a carrier polymer (in particular Polyethylene glycol) coupled before.
  • a carrier polymer in particular Polyethylene glycol
  • the peptide of the invention or the peptide multimer are contained in a pharmaceutical composition in a therapeutically effective amount.
  • the peptide according to the invention is preferably produced synthetically or else recombinantly.
  • the pharmaceutical compositions of the invention are designed to treat infections of a bacteria-infected mammal, including humans.
  • Compositions according to the invention are effective in particular in infections with Gram-positive bacteria, in particular S. aureus.
  • the pharmaceutical composition of the invention contains at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to a biocompatible substance which does not induce the production of antibodies by itself which could be hazardous to the subject to whom the pharmaceutical composition of the invention is administered
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers within the meaning of the invention are solvents (preferably water, buffered aqueous solutions, brine, glycerol and ethanol), diluents or other liquid binders (such as dispersion or suspension aids), surface active agents, isotonic agents, thickeners, emulsifiers, preservatives, encapsulating agents, solid binders or lubricants , Liposomes or carrier polymers to which the peptides or peptide multimers of the invention are preferably coupled (preferably biocompatible proteins or polyethylene glycol)
  • Suitable carrier polymers are preferably slowly degradable macromolecules, especially b preferably proteins, polysaccharides, polylactic acids, polyglycolic acids, polymeric amino acids or inactivated viral
  • a pharmaceutical composition according to the invention contains auxiliaries, in particular humectants, emulsifiers and / or pH-buffering substances.
  • peptides or peptide multimers according to the invention which comprise peptides according to the invention are present in the form of their salts.
  • salts of the peptides or peptide multimers are prepared by known methods, typically by mixing the peptides or peptide multimers with a pharmaceutically acceptable acid to form an acid salt of the peptide, or with a pharmaceutically acceptable base, wherein a basic salt of the peptide Peptide is formed.
  • Suitable pharmaceutically acceptable acids are selected from formic, acetic, propionic, lactic, glycolic, oxalic, pyruvic, succinic, maleic, malonic, cinnamic, sulfuric, hydrochloric, hydrobromic, nitric, perchloric, phosphoric and thiocyanic acid. These acids form ammonium salts with the free amino groups of the peptides or peptide multimers.
  • Suitable pharmaceutically acceptable bases are selected from ethylamine, methylamine, dimethylamine, triethylamine, isopropylamine, diisopropylamine and other monoalkylamines, dialkylamines and trialkylamines and arylamines. These bases form carboxylates with the free carboxylic acid groups of the peptides or peptide multimers.
  • composition according to the invention is preferably in the form of capsules, tablets, troches, dragees, drops, suppositories, powders, sprays, ointments, pastes, creams, inhalants, patches or as an aerosol.
  • a subject is administered a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition of the invention.
  • the direct administration of the pharmaceutical composition according to the invention is carried out locally or systemically, preferably orally, parenterally, intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, pulmonarily or interstitially into the tissue.
  • the invention also includes methods of treating mammals or humans infected with bacteria (preferably Gram-positive bacteria, especially S. aureus).
  • a mammal or human is administered a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition according to the invention.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of the peptide or peptide multimer of the present invention which is capable of reducing or completely preventing the proliferation and colonization of the bacteria
  • the precise effective amount for a subject will depend on its size and condition , the type and extent of the disease and the therapeutics or the combination of several therapeutics selected for treatment.
  • the amount of a peptide according to the invention is determined taking into account the infection-causing pathogen, the severity of the infection and the age, weight, sex of the patient (and possibly further patient parameters).
  • the therapeutically effective amount of a peptide or peptide multimer according to the invention is between 0.01 nmol / kg and 50 nmol / kg, preferably between 0.2 nmol / kg and 10 nmol / kg.
  • the frequency of dosages depends on the factors mentioned above and is preferably between one and six doses per day over a treatment period of about three days to a maximum of one week.
  • the invention therefore also encompasses the use of a peptide or a peptide multimer according to the invention, which contains peptides according to the invention, in a disinfectant or cleaning agent, as a preservative or in a packaging material.
  • the invention additionally encompasses a bacteriocidal composition which contains at least one peptide according to the invention and / or at least one peptide multimer which contains peptides according to the invention, in combination with a carrier.
  • Suitable carriers are liquids or binders which are commonly used in bactericidal compositions, preferably ethanol.
  • a bactericidal composition according to the invention is preferably used for disinfecting or cleaning surfaces or objects, in particular for avoiding or removing biofilms.
  • a further field of application of bactericidal composition according to the invention is packaging, wherein the inventive peptides or peptide multimers are bound to packaging material.
  • Another use of bactericidal compositions according to the invention is the use as a preservative for other materials that can be readily degraded by microorganisms.
  • a bactericidal composition according to the invention is advantageously also suitable for the packaging of foods, since the peptides according to the invention have no toxic effect on contact or on ingestion.
  • Bacterial infections or bacterial contaminants that are used to control the peptides of the invention include infections and contaminants of both Gram-positive and Gram-negative bacteria.
  • Preferred indications are infections or contamination with Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Erwinia amylovora, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella clysenteriae, Yersinia enterocolitica, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter baumannii, Agrobacterium tumefaciens, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Pseudomonas syringae, Rhizobium meliloti, Haemophilus influenzae and Staphylococcus aureus.
  • Especially preferred indications of these are infections or contamination with S. enterica; K.
  • the invention therefore also encompasses the use of a peptide according to the invention in a screening method, preferably in a Screening method for the identification of substances that have an antimicrobial effect.
  • a microorganism preferably a bacterium, especially a Gram-positive bacterium which is sensitive to a peptide of the invention
  • test substance at least one substance to be tested (test substance),
  • the microorganism is first brought into contact with the peptide according to the invention, whereby the peptide according to the invention binds to the microorganism. Subsequently, the test substance is added. If the test substance has an antimicrobial effect on the microorganism, the peptide according to the invention is competitively displaced on the microorganism. The competitive displacement is determined by conventional methods and / or visualized.
  • peptides according to the invention are prepared synthetically, for example by conventional synthetic techniques, such as Merrifield solid phase peptide synthesis.
  • the peptides according to the invention are produced by recombinant methods by cloning a DNA fragment which contains a nucleic acid sequence coding for a peptide according to the invention and expressing it in a host cell (prokaryotic or eukaryotic).
  • the polynucleotides encoding a peptide of the invention are provided synthetically or by site-directed mutagenesis of an existing nucleic acid sequence.
  • the coding nucleic acid sequence can be amplified from the RNA (or DNA) with appropriately prepared primers in a polymerase chain reaction (PCR) by known techniques. After a purification step, for example by means of agarose gel electrophoresis, the PCR product is ligated into a vector and then the host cell is transformed with the vector. Suitable host cells for the recombinant production of peptides of the invention are E.
  • the peptide according to the invention can be expressed as a single peptide or as a peptide multimer.
  • the peptide multimers may contain several (possibly different inventive) peptides which are linked via their N- or C-terminus.
  • the peptides according to the invention preferably contain an N- or C-terminal tag (preferably a histidine tag), which makes possible a simplified purification of the peptides according to the invention.
  • the tag is subsequently enzymatically cleaved to obtain the active peptide sequence.
  • peptides according to the invention are isolated and purified either from the host cells (for example with cell disruption) or from the culture medium (for example with liquid chromatography, in particular affinity chromatography). These recombinant techniques have already been applied to many antimicrobial peptides.
  • a peptide of the invention itself can not be encoded or expressed, but this is highly similar (> 80% amino acid sequence identity) to a codable or expressible peptide
  • the method of recombinant production is first applied to the highly similar peptide. Subsequently, the highly similar peptide is converted in one or more steps chemically or enzymatically into the desired peptide according to the invention.
  • the invention also encompasses a polynucleotide which codes for a peptide according to the invention. Also encompassed by the invention are preferably non-human host cells which contain a polynucleotide of the invention. The host cells are preferably selected as described above and do not include human embryonic stem cells.
  • Fig. 1 shows the results of the substitution analysis of native oncocin (VDKPPYLPRPRPPR IYNR-NH 2 - SEQ ID NO: 1) in the peptide array described in Example 1.
  • the names of the amino acids correspond to the IUPAC one-letter code.
  • the values indicate the microbial activity compared to the unchanged oncocin. Values ⁇ 1 for the improvement of the antimicrobial activity and values> 1 for a deterioration of the antimicrobial over Pseudomonas lux.
  • Example 1 Substitution of oncocin and analysis of antibacterial activity in the peptide array
  • a substitution analysis was performed.
  • a substitution library was synthesized by SPOT synthesis and examined for antibacterial activity against Pseudomonas lux using a bioluminescence assay.
  • the SPOT synthesis of the peptide libraries was carried out on a 19 by 29 cm Whatman 50 filter paper cutout (Sigma-Aldrich, Germany) using the Fmoc method and a SPOT synthesizer (Intavis AG, Germany) (corresponding to Reineke, U., Volkmer-Engert, R. and Schneider-Mergener, J. (2001) Applications of peptide arrays prepared by SPOT-technology Curr. Opin., Biotechnol., 12: 59-64).
  • the luminescence screening method used is based on the publication by Hilpert and Hancock (Hilpert K.
  • the sealed master plates were stored at -20 ° C.
  • the master plates were designed so that each row contains 10 peptides and two controls (positive and negative).
  • the actual screening took place.
  • an overnight culture 37 ° C, 225 rpm, 18 h
  • the overmold culture was diluted 100-fold and grown to the optical density of 0.35 at 600 nm [OD600] (approximately 2 hours - logarithmic phase culture - LogK).
  • the incubation suspension (4 vol.% LogK in 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.3) with 40 mM sterile-filtered glucose) was then distributed on luminescence-suitable 96-well plates (VWR, Germany) and with a concentration series of the peptide library for 4 h long incubated at 37 ° C. After incubation, the luminescence was measured using the luminometer (Thermo, Finland).
  • the peptide sequences were selected which showed the highest activity in the assay. These peptides were conventionally synthesized on a polymeric support and examined for their antibacterial activity against S. aureus and Gram-negative bacteria by the MIC assay.
  • the minimum inhibitory concentrations (MIC) of the peptides were determined in a double determination of triplicates with a positive (gentamycin) and a negative control (0.9% NaCl solution) according to a modified protocol from Wiegand et al. (Wiegand, I., Hilpert, K. and Hancock, R.E. (2008) Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances, Nat. Protoc. 3: 163-75).
  • the peptides were dissolved in water and diluted in a double dilution series with 1/8 MHB (eight times diluted Mueller-Hinton medium - 2.6 g / L, Merck) in sterile 96-well plates (Greiner Bio-One GmbH) 128 ng / mL diluted in twelve dilution steps to 62.5 ng / mL. Overnight cultures were set at 1/8 MHB to approximately 1.5 x 10 7 colony forming units per mL. Of these, 50 were each of the bacterial solution to reach an initial concentration of 4 x 10 5 bacteria per well. After incubation for 20 hours at 37 ° C, the absorbance at 595 nm (microplate reader, Wallac Victor3, Perkin Elmer) was determined. The minimal inhibitory concentration was identified as the lowest peptide concentration at which no bacterial growth was detected.
  • the peptides of the invention also exhibit antimicrobial activity against the Gram-negative bacteria P. aeruginosa and E. coli.
  • Example 3 Minimal Inhibitory Concentration of Peptides Having Amidated C-Terminus of the Invention (vs. P. aeruginosa and S. aureus)
  • peptides according to the invention In all tested multi-modified peptides according to the invention an improved antibacterial activity against 5. aureus is noted.
  • the peptides of the invention tested contained at least substitutions of the native amino acid sequence of Oncocin (SEQ ID NO: 1) at positions 2 and 12. Also, a slight improvement in antibacterial activity could be seen also against P. aeruginosa.

Abstract

Die Erfindung betrifft antimikrobielle Peptide abgeleitet von Oncocin, einem Oncopeltus-Peptidderivat, insbesondere für die Anwendung in der Medizin. Weiterhin betrifft die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren, die zum Abtöten von MikiOorganismen, insbesondere von Bakterien, geeignet sind. Aufgabe der Erfindung ist es, antimikrobielle Peptide mit verbesserter antimikrobieller Wirkung und einem erweiterten Wirkungsspektrum zur Verfügung zu stellen, die insbesondere eine verbesserte antimikrobielle Aktivität gegenüber Gram-positiven Bakterien, insbesondere S. aureus, aufweisen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem ersten Aspekt durch ein antimikrobielles Peptid gemäß Anspruch 1 gelöst.

Description

Oncopeltus-Peptidderivate als antimikrobielle Peptide
Einleitung
Die Erfindung betrifft antimikrobielle Peptide auf der Basis von Oncocin, insbesondere für die Anwendung in der Medizin. Weiterhin betrifft die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren, die zum Abtöten von Mikroorganismen, insbesondere von Bakterien, geeignet sind.
Das Auftreten ernsthafter Bakterien- und Pilzinfektionen ist trotz bemerkenswerter Fortschritte in der Antibiotikatherapie ein steigendes Problem. Jedes Jahr gibt es mehr als 40 Millionen Krankenhausaufenthalte in den Vereinigten Staaten von Amerika. Mehr als 2 Millionen dieser Patienten infizieren sich im Krankenhaus. In 50-60% dieser Fälle sind Antibiotika-resistente Bakterien involviert. Diese im Krankenhaus erworbenen Krankheiten führen zu schätzungsweise 60.000-70.000 Todesfällen in den USA und bis zu 10.000 Todesfällen in Deutschland.
Antimikrobielle Peptide (AMP) liegen in nahezu allen Lebewesen vor und werden in der heutigen Forschung als Alternativen für herkömmliche Antibiotika angesehen. Bisher wurden zahlreiche native antimikrobielle Peptide identifiziert, die als Ausgangspunkt für die Synthese neuer Antibiotika durch Veränderung der Aminosäuresequenz und einer damit verbundenen Verbesserung des Wirkungsspektrums dienen. AMPs enthalten zumeist weniger als 100 Aminosäuren und lassen sich in zwei Hauptklassen einteilen: die kationischen und die anionischen antimikrobiellen Peptide.
In Experimenten von Schneider et al. 2001 wurden Nymphen und Puppen der Milchkrautwanze Oncopeltus fasciatus aus der Familie der Lygaeidae mit zwei verschiedenen gram-negativen Pseudomonas Spezies infiziert und die Immunantwort von O. fasciatus wurde analysiert (Schneider M., Dorn A.; Differential Infectivity of Two Pseudomonas Species and the Immune Response in the Milkweed Bug, Oncopeltus fasciatus (Insecta: Hemiptera). Journal of Invertebrate Pathology 78 (2001), 135-140). Während eine Infektion der Nymphen von O. fasciatus mit dem humanen Pathogen Pseudomonas aeruginosa 48 h nach Infektion den Tod aller Individuen zur Folge hatte, überlebten 71 % der mit weniger pathogenen Pseudomonas putida infizierten Individuen mindestens 96 h. Wurden die Nymphen von O. fasciatus zuerst mit P. putida und nach 24 h mit P. aeruginosa infiziert, stieg die Überlebensrate der doppelt infizierten Individuen innerhalb der ersten 24 h signifikant auf 73%. Es wurde anschließend untersucht, ob die gesteigerte Immunität durch die Induktion antimikrobieller Peptide, durch die sich Insekten im Rahmen ihres angeborenen Immunsystems gegen eindringende Mikroorganismen wehren, vermittelt wird. Es wurden vier Peptide (Oncopeltus antibakterielles Peptid 1-4) mit Molekulargewichten von 15, 8, 5 und 2 kDa identifiziert, denen die antibakterielle Wirkung zugeschrieben wurde. Die Sequenzanalyse nach Edman ergab neben einer 34 Aminosäure langen Teilsequenz für Peptid 1 (15 kDa) auch die unvollständige Sequenz des Prolin-reichen 2 kDa Peptids 4. Es wird für das native Oncopeltus antimikrobiellen Peptid 4 die 20 Aminosäuren lange Sequenz VDKPPYLPRP(X/P)PPRRIYN(NR) (SEQ ID Nr. 31) (Schneider et al. 2001) vorgeschlagen, wobei die Positionen 11,19 und 20 nicht eindeutig identifiziert wurden.
Die Verbesserung der antimikrobiellen Aktivität des Oncopeltus antimikrobiellen Peptid 4 gegenüber Gram-negativen Bakterien, wie Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli, ist Gegenstand umfangreicher Forschungsarbeiten.
Es sind Derivate des Oncopeltus antibakteriellen Peptids 4 mit Variationen an Position 11 bekannt (Knappe D, Stegemann C, Nimptsch A, Kolobov A Jr, Korableva E, Shamova O, Kokryakov VN, Hoffmann R; Chemical modifications of short antimicrobial peptides from insects and vertebrates to fight multi-drug resistant bacteria. Adv Exp Med Biol.611 (2009), 395-396). Diese lassen sich durch die folgende allgemeine Formel beschreiben:
H-VDKPPYLPRP (Xu) PPRRIYN (NR) -OH mit Xn = Pro, Thr, His, Lys oder Arg
WO 2010/086401 AI offenbart Derivate des Oncopeltus antibakteriellen Peptids 4, deren Aminosäuresequenz einer der folgenden allgemeinen Formeln entspricht:
Sub1-X1-D2-K3-P4-P5-Y.j-L7-P8-R9-P10-X2-P12-Pi3-Ri4-X3-Ii6-Yi7-Ni8-X4-Sib2
Sub1-X1-D2-K3-P4-P5-Y6-Lv-P8-R9-P10-X2-P12-Pii-Ri4-X3-Ii6-Yi7-Ni8-N19-X4- Sub2
Sub1-X1-D2-K3-P4-P5-Y6-L7-P8-Ra-P1o-X2-Pi2-Pi3-Ri4-X3-Iie-Pi7-N18-X4-Sub2
In den modifizierten Peptiden aus WO 2010/086401 AI sind die Positionen D2 (Asparagmsäure) und Pn (Prolin) konserviert und entsprechen damit der ursprünglichen Aminosäure im Oncopeltus antimikrobiellen Peptid 4.
Durch die Modifikation des Oncopeltus antibakteriellen Peptids 4 mit Arginin an Position 11 wird ein charakteristisches PRP-Triplett gebildet. Das Peptid mit der dabei erhaltenen Aminosäuresequenz VDI PPYLPRPRPPRRIYNR-NH2 (SEQ ID Nr. 1) wird als Oncocin bezeichnet (Knappe 2009). Es sind Modifikationen der Reste 13, 15, 16 und 19 von Oncocin zur Verbesserung der antimikrobiellen Aktivität gegenüber Gram-negativen Bakterien bekannt, wobei an Position 16 die Substitution des Isoleucinrests durch tertiär-Leucin offenbart ist (Knappe D, Zahn M, Sauer U, Schiffer G, Sträter N, Hoffmann R. (20 I Ia) Rational design of oncocin derivatives with superior protease stabilities and antibacterial activities based on the high-resolution structure of the oncocin- Dna complex. Chembiochem. 201 1 Apr 11 ; 12(6): 874-6).
Um die Proteasestabilität von Oncocin zu erhöhen, ist bekannt, Argininreste des Oncocin durch die nicht-proteinogene Aminosäure a-Amino-3-guanido-Propionsäure (Agp) zu substituieren (Knappe D, Henklein P, Hoffmann R, Hilpert K. (2010) Easy strategy to protect antimicrobial peptides from fast degradation in serum. Antimicrob Agents Chemother. 2010 Sep;54(9):4003-5). Ferner ist bekannt, die Hauptproteasen-Spaltstelle des Oncocin durch Substitution der Argininreste an den Positionen 15 und 19 durch nicht-proteinogene Aminosäuren mit positiv geladener Seitenkette zu stabilisieren (Knappe D, Kabankov N, Hoffmann R. (2011b) Bactericidal oncocin derivatives with superior serum stabilities. Int J Antimicrob Agents. 201 1 Feb;37(2): 166-70).
WO 0078956 offenbart Pyrrhocoricinderivate der allgemeinen Formel:
Rl - Asp-Lys-Gly-X- Y-Leu-Pro-Arg-Pro-Thr-Pro-Pro-Arg-Pro-Ile-Tyr-X'-Y'-R
Dabei entsprechen die variablen Reste X, Y, X' und Y' den Postionen 5, 6, 18 und 19 des Pyrrhocoricins und sind identisch mit denen des Oncocins. Die für die antibakterielle Aktivität wesentlichen Aminosäurereste des Pyrrhocoricins wurden von Kragol et al. untersucht, die offenbarten Aminosäuresequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt (Kragol G, Hoffmann R, Chattergoon MA, Lovas S, Cudic M, Bulet P, Condie BA, Rosengren KJ, Montaner LJ, Otvos L Jr. (2002) Identification of crucial residues for the antibacterial activity of the proline-rich peptide, pyrrhocoricin. Eur J Biochem. 2002 Sep;269(17):4226-37). Cyclische Derivate von Pyrrhocoricin sind ebenfalls bekannt und in Tabelle 1 aufgeführt (Rosengren KJ, Göransson U, Otvos L Jr, Craik DJ. (2004) Cyclization of pyrrhocoricin retains structural elements crucial for the antimicrobial activity of the native peptide. Biopolymers. 2004;76(5):446-58). US 7,015,309 B l offenbart Peptide, die von Pyrrhocoricin abgeleitet sind, und deren Aminosäuresequenz der folgenden allgemeinen Formel entspricht:
Rl -DKGSYLPRPTPPRPIYNR-R2. WO 02079467 A2 offenbart u. a. Peptide, die den Transport durch die Zellwand ermöglichen. Als konkretes Peptid ist dabei u.a. als SEQ ID Nr. 27 von WO 02079467 A2 das Peptid mit der Aminosäuresequenz VDKGSYLPRPTPPRPIYNC offenbart. In Tabelle 1 ist ein Alignment-Vergleich der allgemeinen Formeln und einzelnen Aminosäuresequenzen von bisher bekannten Oncocin-Derivaten und verwandten Peptiden dargestellt:
Tabelle 1 :
Figure imgf000006_0001
variierte Positionen, Hyp = 4-Hydroxyprolin, Tie = L-tertiär-Leucin (L-tertiär-Butylglycin).
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass in den bekannten Oncocin-Derivaten und verwandten Peptiden insbesondere die Positionen, die den Aminosäuren D2, P4, P10, P12, 116 und N18 denen des nativen Oncopeltus antibakteriellen Peptids 4 entsprechen und konserviert sind (Buchstabenbezeichnungen der Aminosäuren entsprechen dem IUPAC Einbuchstaben-Code).
Die Wirkung Prolin-reicher antimikrobielle Peptide ist sehr komplex, da sie die Zellmembran durchdringen und in das Zytoplasma eindringen müssen, um ein spezielles intrazelluläres bakterielles Zielmolekül zu inhibieren, ohne jedoch auf Säugetierzellen und Blutzellen toxisch zu wirken. Bisher wurden Verbesserungen des Oncopeltus antibakteriellen Peptids 4 ausschließlich hinsichtlich der Wirkung auf Gram-negative Bakterien vorgeschlagen. Es besteht daher Bedarf, das Wirkungsspektrum der vom Oncopeltus antibakteriellen Peptid 4 abgeleiteten antimikrobiellen Peptide hinsichtlich der Wirksamkeit gegenüber Gram-positiven Bakterien, insbesondere gegenüber dem pathogenen Gram-positiven Bakterium Staphylococcus aureus, zu verbessern.
Gram-positive Bakterien weisen keine echte äußere Membran auf, dafür jedoch eine membranähnliche Struktur aus mehreren Mureinschichten (Peptidoglycan). Die Mureinstruktur ist etwa 80 nm dick und enthält darin eingelagerte Teichonsäuren. Gegen Gram-positive Bakterien aktive antimikrobielle Peptide müssen daher derart gestaltet sein, dass diese geeignet sind, die im Vergleich zur Zellwand von Gram-negativen Bakterien stabileren, durch Peptidoglykane und Teichonsäuren vernetzten Zellwände, von Gram-positiven Bakterien zu durchdringen.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, antimikrobielle Peptide mit verbesserter antimikrobieller Wirkung und einem erweiterten Wirkungsspektrum zur Verfügung zu stellen, die insbesondere eine verbesserte antimikrobielle Aktivität gegenüber Gram-positiven Bakterien aufweisen.
Abkürzungen
AMP antimikrobielles Peptid
arg D-Arginin
D-Arg D-Arginin
Hyp 4-trans-Hydroxyprolin
MAP multiples Antigenpeptid {multiple antigenic peptide)
MHK minimale Hemmkonzentration
O Ornithin
Orn Ornithin
Tie tertiär-Leucin Beschreibung
Die Aufgabe wird erfmdungsgemäß gelöst durch ein antimikrobielles Peptid, enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß der allgemeinen Formel A
V1 - X1 - K3 - X2 - P5 - Y6 - L7 - 3 - R9 - X4 - i1 - X5 - P13 - R14 - i5 - X6 - Yi7 - X7 - Ri 9 (Formel A)
Dabei sind die Reste, K3, X2, P5, X3, R9, X4, RH, X5, P13, Ri4, R15, XÖ, Y17, X7, R19 unabhängig voneinander ausgewählt aus ungeladenen oder positiv geladenen Aminosäureresten. Die Reste Vb X], Y6 und L7 sind unabhängig voneinander ausgewählt sind aus proteinogenen und nichtproteinogenen Aminosäureresten. Erfindungsgemäß weist die Aininosäuresequenz gemäß Formel A mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 % Aminosäuresequenzidentität zu Oncocin gemäß SEQ ID Nr. 1 auf. Die Aminosäuresequenz gemäß Formel A enthält maximal zwei negativ geladene Aminosäurereste, vorzugsweise maximal einen negativ geladenen Aminosäurerest.
In einem erfindungsgemäßen Peptid ist zumindest eine der Positionen 2, 4, 8, 10, 12, 16 und 18 von SEQ ID Nr. 1 so verändert, dass auf das Peptid gemäß Formel A mindestens eine der folgenden Bedingungen zutrifft:
Xi ist ausgewählt aus ungeladenen Aminosäureresten, vorzugsweise mit mindestens zwei Nicht-Wasserstoffatomen (die bevorzugt ausgewählt sind aus C, N und S) in der Seitenkette, und positiv geladenen Aminosäureresten,
X2 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten,
Xi ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten,
X4 ist ausgewählt aus aliphatischen, nicht heterozyklischen ungeladenen Aminosäureresten, aromatischen, vorzugsweise nicht heterozyklischen, ungeladenen Aminosäureresten und positiv geladenen Aminosäureresten,
X5 ist ausgewählt aus aliphatischen, nicht heterozyklischen ungeladenen Aminosäureresten und positiv geladenen Aminosäureresten, und/oder X6 ist ausgewählt aus schwefelhaltigen Aminosäureresten, selenhaltigen Aminosäureresten, unpolaren aromatischen Aminosäureresten und positiv geladenen Aminosäureresten mit maximal zwei Stickstoffatomen in der Seitenkette, und/oder
X7 ist ausgewählt aus schwefelhaltigen Aminosäureresten, selenhaltigen Aminosäureresten, aromatischen Aminosäureresten, unpolaren Aminosäureresten (vorzugsweise mit mindestens einem C-Atom in der Seitenkette, vorzugsweise ohne Substitution am ersten C- Atom der Seitenkette), positiv geladenen Aminosäureresten.
Die Erfindung beruht auf einer Substitutionsanalyse von Oncocin gemäß SEQ ID Nr. 1. Die Analyse zeigte, dass die antimikrobielle Aktivität gegenüber dem Gram-positiven Bakterium Staphylococcus aureus gesteigert werden kann, wenn mindestens eine der Positionen 2, 4, 8, 10, 12, 16 und 18 mit einem geeigneten Aminosäurerest substituiert wird (Tabelle 3 aus Beispiel 2). Die antimikrobielle Aktivität gegenüber Gram-negativen Bakterien bleibt durch eine derartige Substitution erhalten und wird teilweise ebenfalls verbessert (Fig. 1 ).
Ein negativ geladener Aminosäurerest enthält eine unter physiologischen Bedingungen negativ geladene Aminosäureseitenkette (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure). Unter physiologischen Bedingungen werden im Sinne der Erfindung ein pH-Wert von pH 7,4, eine Temperatur von 37 °C und ein osmotischer Druck von 300 mosmol/kg verstanden. Ein positiv geladener Aminosäurerest im Sinne der Erfindung enthält eine unter physiologischen Bedingungen positiv geladene Aminosäureseitenkette. Ein ungeladener Aminosäurerest (neutraler Aminosäurerest) enthält eine unter physiologischen Bedingungen ungeladene Aminosäureseitenkette. Ungeladene Aminosäurereste sind somit unter physiologischen Bedingungen weder positiv noch negativ geladen. Ungeladene Aminosäurereste umfassen sowohl polare als auch unpolare Aminosäurereste.
Ein polarer Aminosäurerest weist mindestens eine polare Gruppe in der Aminosäureseitenkette auf. Diese polaren Gruppen sind bevorzugt ausgewählt aus Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Amin-, Amid- und Estergruppen sowie anderen Gruppen, welche die Ausbildung von Wasserstoffbrücken erlauben.
Ein unpolarer (oder auch hydrophober) Aminosäurerest weist keine polaren Gruppen auf und enthält eine unter physiologischen Bedingungen ungeladene Aminosäureseitenkette, bevorzugt mit einem Hydropathie-Index über 0, besonders bevorzugt über 3. Bevorzugte unpolare, hydrophobe Seitenketten sind ausgewählt aus H, Alkyl-, Alkylen- Alkoxy-, Alkenoxy-, Alkylsulfanyl- und Alkenylsulfanylresten mit 1 bis 10, bevorzugt 2 bis 6 C-Atomen, und Arylresten mit 5 bis 12 C- Atomen. Aromatische Aminosäurereste weisen mindestens einen Aryl- oder Heteroarylring auf. Der Begriff umfasst polare und unpolare aromatische Aminosäurereste. Bevorzugte Aminosäureseitenketten polarer aromatischer Aminosäuren sind ausgewählt aus Arylresten mit 5 bis 12 C-Atomen, wobei diese Reste mindestens eine polare Gruppe tragen und heteroaromatischen Resten. Bevorzugte heteroaromatische Aminosäureseitenketten sind Heteroarylreste mit 3 bis 10 C-Atomen und 1 bis 4 Heteroatomen (bevorzugt N, S oder O) im Ringsystem. Bevorzugte Aminosäureseitenketten unpolarer aromatischer Aminosäuren sind ausgewählt aus Arylresten mit 5 bis 12 C-Atomen, wobei diese Reste keine polare Gruppen tragen. Nicht-aromatische heterozyklische Aminosäurereste im Sinne der Erfindung weisen keine aromatischen Aminosäureseitenketten und mindestens eine nicht-aromatische heterozyklische Aminosäureseitenkette auf (eine beispielhafte derartige heterozyklische Aminosäure ist Prolin). Die Heteroatome sind vorzugsweise ausgewählt aus N, S und O. Aliphatische Aminosäuren weisen eine aliphatische (nicht aromatische) Aminosäureseitenkette auf.
Alle proteinogenen Aminosäuren, nicht-proteinogenen Aminosäuren oder Aminosäurederivate (wie z.B. Iminosäuren), welche die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate bilden, können entweder in der L- oder D-Konformation vorliegen. Wenn nicht anders spezifiziert sind die Bausteine in den Sequenzen jedoch bevorzugt in der L-Konformation.
Bevorzugte positiv geladene Aminosäurereste sind ausgewählt aus positiv geladenen nichtaromatischen Aminosäurereresten, vorzugsweise Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal (-COOH in Arginin ist ersetzt durch -CHO), 2-Amino-3- guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin (bevorzugt N(G)-Nitro- arginin), Nitrosoarginin (bevorzugt N(G)-Nitrosoarginin), Methylarginin (bevorzugt N-Methyl- Arginin), sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Lysin, δ- Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'- Diaminopimelinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure und 3-Aminotyrosin und positiv geladenen aromatischen Aminosäureresten, vorzugsweise Histidin, 1 -Methylhistidin und 3-Methylhistidin.
Bevorzugte ungeladene Aminosäurereste sind ausgewählt aus Asparagin, Cystein, Glutamin, Serin, Threonin, allo-Threonin, Tyrosin, 3,5-Dinitrotyrosin, Citrullin, N-Methylserin, Homoserin, ß- Homoserin, Glycin, tert.-Butylglycin, Alanin, Cyclohexylalanin. ß-Alanin, Leucin, N- Methylleucin, tertiär-Leucin, Norleucin, Isoleucin, N-Methylisoleucin, Valin, Norvalin, N- Methylvalin, Methionin, 1 -Aminocylcohexylcarbonsäure, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin und Tryptophan. Bevorzugte ungeladene polare Aminosäurereste sind ausgewählt aus Asparagin, Cystein, Glutamin, Serin, Threonin, allo-Threonin,Tyrosin, 3,5-Dinitrotyrosin, Citrullin, N-Methylserin, Homoserin und ß-Homoserin.
Bevorzugte aliphatische ungeladene unpolare Aminosäurereste sind ausgewählt aus Glycin, tert.- Butylglycin, Alanin, Cyclohexylalanin, ß-Alanin, Leucin, N-Methylleucin, tertiär-Leucin, Nor- leucin, Isoleucin, N-Methylisoleucin, Valin, Norvalin, N-Methylvalin und Methionin.
Bevorzugte aromatische ungeladene unpolare Aminosäurereste sind ausgewählt aus Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin und Tryptophan.
Bevorzugte aromatische polare Aminosäurereste sind ausgewählt aus Histidin, Histidinderivaten, Tyrosin und 3,5-Dinitrotyrosin. Histidinderivate sind von Histidin abgeleitete Aminosäurereste, die aus Histidin durch strukturelle Veränderung bevorzugt genau einer oder zweier funktionellen Gruppe erhalten wird. Bevorzugte Histidinderivate sind Cl-C3-alkylierte (bevorzugt N-Alkyl) Histidine, insbesondere N-Methyl-Histidin.
Bevorzugte aromatische unpolare Aminosäurereste sind ausgewählt aus Tryptophan, Methyl- tryptophan, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Methylphenylalanin, Phenyl-Phenylalanin und Benzoylphenylalanin, Phenylglycin und 4-tert-Butylphenylalanin.
Bevorzugte schwefel- oder selenhaltige Aminosäurereste sind ausgewählt aus Alkyl-Alkoxy-, Alkenoxy-, Alkylsulfanyl- und Alkenylsulfanylresten mit 1 bis 10, bevorzugt 2 bis 6 C-Atomen, oder Arylresten mit 5 bis 12 C-Atomen, die mindestens eine freie (unsubstituierte) Thiol-Gruppe (- SH) oder Selenol (-SeH) Gruppe tragen. Besonders bevorzugte schwefel- oder selenhaltige Aminosäurereste sind Cystein oder Seleno-Cystein.
Bevorzugte nicht-aromatische heterozyklische Aminosäurereste sind ausgewählt aus Prolin und Prolinderivaten. Prolinderivate sind von Prolin abgeleiteten Aminosäurereste, die aus Prolin durch strukturelle Veränderung bevorzugt genau einer oder zweier funktionellen Gruppe erhalten werden. Bevorzugte Prolinderivate sind ausgewählt aus ß-Cyclohexylalanin, 3,4-cis-Methanoprolin, 3,4- Dehydroprolin, Hydroxyprolin, Mercaptoprolin, Thioprolin, Fluorprolin und Homoprolin. Der Begriff Hydroxyprolin umfasst unter anderem cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, cis-3- Hydroxyprolin und trans-3-Hydroxyprolin. Hydroxyprolinderivate sind von Hydroxyprolin abgeleitete Aminosäurereste, die aus Hydroxyprolin durch strukturelle Veränderung einer funktionellen Gruppe erhalten werden. Bevorzugte Hydroxyprolinderivate sind ausgewählt aus Hydroxy-ß-Cyclohexylalanin und den oben genannten Prolinderivaten, die mit einer Hydroxylgruppe substituiert sind.
Ein erfindungsgemäßes Peptid ist aus Aminosäuren zusammengesetzt, die miteinander vorzugsweise über eine Peptidbindung verknüpft sind. Ein erfindungsgemäßes Peptid umfasst vorzugsweise 19 bis 100 Aminosäurereste, besonders bevorzugt 19 bis 50 Aminosäurereste. Die Bezeichnung ..Peptid" wie sie hierin verwendet wird, umfasst auch Peptidderivate, die durch Substitutionen und/oder Modifikationen von einem oder mehreren Aminosäureresten durch chemische Gruppen verändert wurden, wobei diese chemischen Gruppen andere als die natürlichen Protein-bildenden Aminosäurereste sind, wie z.B. nicht-proteinogene a- Aminosäuren, ß- Aminosäuren oder Peptide mit verändertem Rückgrat. Der Begriff ..verändertes Rückgrat" bedeutet, dass mindestens eine Peptidbindung chemisch durch eine unter physiologischen Bedingungen nicht spaltbare chemische Bindung ersetzt ist, die nicht durch Endoproteasen geschnitten werden kann. Bevorzugt ist die nicht spaltbare Bindung eine reduzierte Peptidbindung, eine alkylierte Amidbindung oder eine Thioamidbindung. Eine reduzierte Amidbindung ist eine Peptidbindung in der die Carbonylgruppe (C=0) zu einer Hydroxylgruppe (HCOH) oder zu einer Methylengruppe (CH2) reduziert ist. Eine alkylierte Amidbindung ist eine entweder am Stickstoff (N-alpha) oder Kohlenstoffatom (C-alpha) alkylierte Peptidbindung. Der Alkylrest hat bevorzugt 1 bis 3 C-Atome. Ein Beispiel ist die N-Methylierung. Modifikationen des Rückgrats sind an Positionen bevorzugt, die anfällig für enzymatischen Abbau sind, besonders im Bereich von Argininen und Lysinen. Hier wird die Peptidbindung bevorzugt durch eine für Proteasen nicht spaltbare Bindung ersetzt. Diese nicht spaltbare Bindung ist vorzugsweise aus der Gruppe der reduzierten Amidbindungen, alkylierten Amidbindungen oder Thioamidbindungen ausgewählt.
Außerdem umfasst die Bezeichnung„verändertes Rückgrat" auch die Bindung anderer Gruppen, die geeignet sind, eine kovalente Bindung sowohl mit der COOH-Grappe des vorangegangenen Aminosäurerestes als auch der NH2-Gruppe des folgenden Aminosäurerestes zu bilden. Bevorzugte derartige Gruppen sind Zuckeraminosäure-Dipeptid-Isostere, Azapeptide, 6-Homopolymere, gamma-Peptide, Depsipeptide (Esterbrücken im Rückgrat), γ-Lactam-Analoga, 01igo(phenylenethylen)e, vinyloge Sulfonpeptide, poly-N-substituierte Glycine oder Oligocarbamate.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind bevorzugt linear. Alternativ sind die erfindungsgemäßen Peptide auch zyklisch, wobei bevorzugt die erste (N-Terminus) und die letzte Aminosäure (C- Terminus) miteinander über eine Peptidbindung oder ein Linkerpeptid verknüpft sind. Umfasst sind auch Zyklisierungen zwischen einer Seitenkette (z. B. Lysin) und dem C-Terminus des Peptids, einer Seitenkette (z. B. Glutaminsäure oder Asparaginsäure) und dem N-Terminus des Peptids oder zwischen zwei Seitenketten (z. B. Lysin und Glutaminsäure oder Asparaginsäure).
Die erfindungsgemäßen Peptide sind von Oncocin (gemäß SEQ ID Nr. 1 ) abgeleitet, indem mindestens eine und vorzugsweise maximal 10 Aminosäuren der Aminosäuresequenz von Oncocin gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht (substituiert) wurden. Ein erfindungsgemäßes Peptid kann als Bestandteil eines Peptid-Multimers vorliegen, das aus mehreren Peptiden zusammengesetzt ist und wobei mehrere erfindungsgemäße Peptide über ein Linkerpeptid miteinander verknüpft sind.
Bevorzugt ist das Peptid an der Position 2 mit einem Aminosäure mit positiver Seitenkette substituiert, besonders bevorzugt ist X( Arginin oder Ornithin, und/oder das Peptid ist an der Position 12 substituiert, so dass X5 Tryptophan ist. Alternativ kann das erfindungsgemäße Peptid 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 Substitutionen aufweisen, so dass gilt: X! ist Arginin, Prolin oder ein Derivat davon; X5 ist Tryptophan, Arginin, Tyrosin oder ein Derivat davon; X2 ist Lysin oder ein Derivat davon; X3 ist Arginin oder ein Derivat davon; X4 ist Arginin oder ein Derivat davon; X6 ist Cystein, Phenylalanin, Lysin oder ein Derivat davon; X7 ist Tryptophan oder ein Derivat davon; R|9 ist Histidin oder ein Derivat davon.
In einem erfindungsgemäßen Peptid ist mindestens eine der Positionen 2, 4, 8, 10, 12, 16 und 18 von SEQ ID Nr. 1 , vorzugsweise mindestens eine der Positionen 2, 4, 8, 10, 12 und 18 von SEQ ID Nr. 1 verändert. Bevorzugt sind in einem erfindungsgemäßen Peptid gegenüber SEQ ID Nr. 1 mindestens zwei Aminosäurereste verändert.
Besonders bevorzugt ist in einem erfindungsgemäßen Peptid mindestens Position 2 von SEQ ID Nr. 1 verändert. Besonders bevorzugt ist in einem erfmdungsgemäßen Peptid mindestens Position 10 von SEQ ID Nr. 1 verändert. Besonders bevorzugt ist in einem erfindungsgemäßen Peptid mindestens Position 12 von SEQ ID Nr. 1 verändert. Besonders bevorzugt ist in einem erfindungsgemäßen Peptid mindestens Position 16 von SEQ ID Nr. 1 verändert. Ganz besonders bevorzugt ist in einem erfindungsgemäßen Peptid mindestens Position 2 und mindestens eine der Positionen 10 und 12 von SEQ ID Nr. 1 verändert.
Ein erfindungsgemäßes Peptid enthält vorzugsweise mindestens eine der Aminosäuren der Positionen 1 , 1 1 , 14, 17 und 18 von SEQ ID Nr. 1 unverändert. Vorzugsweise ist dabei die Aminosäure an Position 1 1 und/oder 17 von SEQ ID Nr. 1 unverändert. Vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 1 , 14 und/oder 15 von SEQ ID Nr. 1 unverändert. In bevorzugten erfindungsgemäßen Peptiden, an denen zumindest eine der Positionen 2, 4, 8, 10, 12, 16 und 18 von SEQ ID Nr. 1 (vorzugsweise mindestens eine der Positionen 2, 4, 8, 10, 12 und 18) verändert ist, sind die Reste Xi bis X6 in Formel A aus folgenden Aminosäuren ausgewählt:
Xi ist ausgewählt aus Asparagin, Cystein, Seleno-Cystein, Glutamin, Serin, Threonin, allo- Threonin, Tyrosin, 3,5-Dinitrotyrosin, Citrullin, N-Methylserin, Homoserin, ß-Homoserin, Glycin, tert.-Butylglycin, Alanin, Cyclohexylalanin, ß-Alanin, Leucin, N-Methylleucin, tertiär-Leucin, Norleucin, Isoleucin, N-Methylisoleucin, Valin, Norvalin, N-Methylvalin, Methionin, 1 -Amino- cylcohexylcarbonsäure, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Tryptophan, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diamino- pimelinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, 3-Aminotyrosin, Histidin und Histidinderivaten. Bevorzugt ist Xi ausgewählt aus Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Histidin, N-Methyl-Histidin, Isoleucin, N-Methylisoleucin, Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν- Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Leucin, N- Methylleucin, tertiär-Leucin, Norleucin, Methionin, Asparagin, Prolin, Prolinderivaten, Glutamin, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3- guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p- Aminobenzoesäure, 3-Aminotyrosin, Serin, Threonin, allo-Threonin, Valin, Norvalin, N- Methylvalin, Tryptophan, Tyrosin und 3,5-Dinitrotyrosin. Ganz besonders bevorzugt ist X! ausgewählt aus Phenylalanin, Histidin, Isoleucin, Lysin, Leucin, Methionin, Asparagin, Prolin, Glutamin, Arginin, Serin, Threonin, Valin, Tryptophan, Tyrosin, Ornithin und D-Arginin, insbesondere aus Arginin, Prolin, Ornithin und D-Arginin.
X2 ist ausgewählt aus Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6- Diaminohexinsäure, Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, 3-Aminotyrosin, Histidin, 1 -Methylhistidin und 3-Methylhistidin. Bevorzugt ist X2 ausgewählt Lysin, δ- Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure und 2,2'- Diaminopimelinsäure, insbesondere Lysin. X3 ist ausgewählt aus Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6- Diaminohexinsäure, Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diamino- propionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, 3-Aminotyrosin, Histidin, 1 -Methylhistidin und 3 -Methylhistidin. Bevorzugt ist X ausgewählt aus Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3- guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p- Aminobenzoesäure, insbesondere ist X} Arginin.
X4 ist ausgewählt aus Asparagin, Cystein, Glutamin, Serin, Threonin, allo-Threonin, Tyrosin, 3,5- Dinitrotyrosin, Citrullin, N-Methylserin, Homoserin, ß-Homoserin, Glycin, tert.-Butylglycin, Alanin, Cyclohexylalanin, ß-Alanin, Leucin, N-Methylleucin, tertiär-Leucin, Norleucin, Isoleucin, N-Methylisoleucin, Valin, Norvalin, N-Methylvalin, Methionin, 1 -Aminocylcohexylcarbonsäure, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Tryptophan, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3- guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Lysin, δ- Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diamino- pimelinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, 3-Aminotyrosin, Histidin, 1 -Methylhistidin und 3- Methylhistidin. Heterozyklische Aminosäurereste sind davon für den Rest X4 weniger bevorzugt. Bevorzugt ist X4 ausgewählt aus aliphatischen positiv geladenen Aminosäureresten und ungeladenen aromatischen Aminosäureresten. Bevorzugt ist X4 ausgewählt aus Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3- guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diamino- pimelinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, 3-Aminotyrosin, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Threonin, allo-Threonin und Tryptophan. Besonders bevorzugt ist X ausgewählt aus Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, Alanin, Cyclohexylalanin, ß-Alanin, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Threonin, allo-Threonin, Tryptophan, Tyrosin und 3,5-Dinitrotyrosin, insbesondere Lysin, Arginin, Ala in, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin. Ganz besonders bevorzugt ist X4 ausgewählt aus Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diamino- pimelinsäure, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin und p-Aminobenzoesäure, insbesondere Lysin, Arginin, Ornithin und D-Arginin.
X5 ist ausgewählt aus Asparagin, Cystein, Seleno-Cystein, Glutamin, Serin, Threonin, allo- Threonin, Tyrosin, 3,5-Dinitrotyrosin, Citrullin, N-Methylserin, Homoserin, ß-Homoserin, Glycin, tert.-Butylglycin, Alanin, Cyclohexylalanin, ß-Alanin, Leucin, N-Methylleucin, tertiär-Leucin, Norleucin, Isoleucin, N-Methylisoleucin, Valin, Norvalin, N-Methylvalin, Methionin, 1-Amino- cyclohexylcarbonsäure, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Tryptophan, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Lysin, δ- Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'- Diaminopimelinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, 3-Aminotyrosin, Histidin und Histidmderivaten. Bevorzugt ist X5 ausgewählt aus Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4- guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym- Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, Tryptophan, Tyrosin, 3,5-Dinitrotyrosin, Alanin, Cyclohexylalanin, ß-Alanin, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Glycin, tert.-Butylglycin, Isoleucin, N-Methylisoleucin, Lysin, δ- Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'- Diaminopimelinsäure, Leucin, N-Methylleucin, tertiär-Leucin, Norleucin, Methionin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, allo-Threonin, Valin, Norvalin und N-Methylvalin. Bevorzugt ist X5 ausgewählt aus Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Arginin, Homoarginin, 2,4- Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2- Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, Tryptophan, Tyrosin, 3,5-Dinitrotyrosin, insbesondere aus Lysin, Arginin, Tryptophan und Tyrosin.
X6 ist ausgewählt aus Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Cystein, Seleno-Cystein, Tryptophan, Methyl-tryptophan, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Methylphenylalanin, Phenyl- Phenylalanin und Benzoylphenylalanin, Phenylglycin und 4-tert-Butylphenylalanin. Bevorzugt ist X6 ausgewählt aus Cystein, Seleno-Cystem, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin und Diphenylalanin.
X7 ist ausgewählt aus Cystein, Seleno-Cystein, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Histidin, Histidinderivaten, Tryptophan, Tyrosin,3,5-Dinitrotyrosin, Alanin, Cyclohexylalanin, ß-Alanin, Glycin, tert.-Butylglycin, Leucin, N-Methylleucin, tertiär-Leucin, Norleucin, Methionin, Prolin, Prolinderivaten, Valin, Norvalin, N-Methylvalin, Lysin, δ- Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'- Diaminopimelinsäure, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6- Diaminohexinsäure, Ornithin und p-Aminobenzoesäure.
Entspricht X7 einem unpolaren Aminosäurerest, so weist dieser vorzugsweise mindestens ein C- Atom in der Seitenkette auf. Vorzugsweise weist ein unpolarer Aminosäurerest X7 keine Substitution am ersten C-Atom der Seitenkette auf (in diesem Fall liegt das zweite Kohlenstoffatom einschließlich des Carboxy-Kohlenstoffatoms, also das beta-C-Atom, als CH2 vor), d. h. Isoleucin und N-Methylisoleucin sind weniger bevorzugt.
Bevorzugt ist X7 ausgewählt aus Tryptophan, Alanin, Cyclohexylalanin, ß-Alanin, Cystein, Seleno- Cystein, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3- guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p- Aminobenzoesäure, Serin, Valin, Norvalin, N-Methylvalin, Tyrosin und 3,5-Dinitrotyrosin. Besonders bevorzugt ist X7 ausgewählt aus Cystein, Seleno-Cystein, Tryptophan, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin Tyrosin und 3,5-Dinitrotyrosin, ganz besonders bevorzugt ist X7 Cystein oder Tryptophan, insbesondere Tryptophan.
In bevorzugten erfindungsgemäßen Peptiden sind in Formel A die Reste Vi, K3, P5, L7, R9, R, i, P13, Ri4, R15, Yiv und Rm aus folgenden Aminosäuren ausgewählt: Vi ist ausgewählt aus polaren aliphatischen Aminosäureresten, unpolaren aliphatischen Aminosäureresten und unpolaren aromatischen Aminosäureresten. Bevorzugt ist V, ausgewählt aus Alanin, Cyclohexylalanin, ß-Alanin, Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin,
2.3- Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Leucin, N-Methylleucin, tertiär-Leucin, Norleucin, Methionin, Asparagin, Prolin, Prolinderivaten, Glutamin, Arginin, Homoarginin,
2.4- Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym- Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, Serin, Threonin, allo-Threonin, Valin, Norvalin, N-Methylvalin und Tryptophan.
K3 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten und ungeladenen unpolaren Aminosäureresten. Bevorzugt ist K, ausgewählt aus Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo- Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Arginin, Homoarginin,
2.4- Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym- Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, Prolin, Prolinderivaten, Valin, Norvalin, N-Methylvalin.
P5 ist ausgewählt aus ungeladenen Aminosäureresten und positiv geladenen Aminosäureresten. Bevorzugt ist P5 ausgewählt aus Glycin, tert.-Leucin, Methionin, Prolin, Prolinderivaten, Glutamin, Serin, Threonin, allo-Threonin, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidino- buttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, Tryptophan, Tyrosin und
3.5- Dinitrotyrosin. Besonders bevorzugt ist P5 ausgewählt aus ungeladenen Aminosäureresten, vorzugsweise aus Glycin, tert.-Leucin, Methionin, Prolin, Prolinderivaten, Glutamin, Serin, Threonin, allo-Threonin, Tryptophan, Tyrosin und 3,5-Dinitrotyrosin.
Y6 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten, negativ geladenen Aminosäureresten und ungeladenen aromatischen Aminosäureresten. Bevorzugt ist Y6 ausgewählt aus Alanin, Cyclohexylalanin, ß-Alanin, Asparaginsäure, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß- Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4- guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym- Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Histidin, Histidinderivaten, Tyrosin und 3,5- Dinitrotyrosin. Besonders bevorzugt ist Y6 ausgewählt aus Arginin, Homoarginin, 2,4- Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2- Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Histidin, Histidinderivaten, Tyrosin und 3,5- Dinitrotyrosin.
L7 ist ausgewählt aus ungeladenen Aminosäureresten. Vorzugsweise ist L7 ausgewählt aus Isoleucin, N-Methylisoleucin, Leucin, N-Methylleucin, tertiär-Leucin, Norleucin, Threonin, allo- Threonin, Valin, Norvalin und N-Methylvalin.
R9 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten und ungeladenen Aminosäureresten. Vorzugsweise ist R9 ausgewählt aus Asparagin, Leucin, N-Methylleucin, tertiär-Leucin, Norleucin, Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'- Diaminopimelinsäure, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6- Diaminohexinsäure, Ornithin und p-Aminobenzoesäure. Bevorzugt ist Rq ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten, vorzugsweise den vorstehenden positiv geladenen Aminosäureresten.
Rn ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten und unpolaren aromatischen Aminosäureresten. Vorzugsweise ist Rn ausgewählt aus Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Arginin, Homoarginin, 2,4- Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2- Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin und p-Aminobenzoesäure.
Pi3 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten, ungeladenen unpolaren Aminosäureresten, schwefelhaltigen Aminosäureresten und polaren aromatischen Aminosäureresten. Vorzugsweise ist PJ ausgewählt aus Cystein, Histidin, Histidinderivaten, Isoleucin, N-Methylisoleucin, Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3- Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Leucin, N-Methylleucin, tertiär-Leucin, Norleucin, Methionin, Prolin, Prolinderivaten, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß- Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4- guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym- Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, Tryptophan, Tyrosin und 3,5-Dinitrotyrosin, insbesondere aus Prolin und Prolinderivaten. Ri4 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten und ungeladenen unpolaren Aminosäureresten. Vorzugsweise ist R ausgewählt aus Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3- Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Leucin, N-Methylleucin, tertiär-Leucin, Norleucin, Methionin, Prolin, Prolinderivaten, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß- Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4- guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym- Dimethylarginin, 2,6-Diamino-hexinsäure, Ornithin und p-Aminobenzoesäure.
Ri5 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten, ungeladenen polaren Aminosäureresten und ungeladenen aromatischen Aminosäureresten. Vorzugsweise ist Ri5 ausgewählt aus Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diamino- pimelinsäure, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3 -guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, Serin, Threonin, allo-Threonin, Tyrosin und 3,5-Dinitrotyrosin.
Yi7 ist ausgewählt aus ungeladenen aromatischen Aminosäureresten. Vorzugsweise ist Y17 ausgewählt aus Tyrosin und 3,5-Dinitrotyrosin.
R1Q ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten, ungeladenen aromatischen Aminosäureresten, ungeladenen polaren Aminosäureresten, aliphatischen unpolaren Aminosäureresten mit mindestens einem C-Atom in der Seitenkette und nicht-aromatischen heterozyklischen Aminosäureresten. Vorzugsweise ist R]9 ausgewählt aus Leucin, N- Methylleucin, tertiär-Leucin, Norleucin, Methionin, Valin, Norvalin, N-Methylvalin, Cystein, Seleno-Cystein, Phenylalanin, Homophenylalanin, Naphtylalanin, Diphenylalanin, Histidin, Histidinderivaten, Lysin, δ-Hydroxylysin, ε-Ν-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Prolin, Prolinderivaten, Glutamin, Arginin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, ß-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, Methylarginin, sym- Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, Serin, Threonin, allo-Threonin und Tryptophan.
Bevorzugt sind R15 und/oder R19 ist ausgewählt aus Ornithin, D-Arginin, Prolin und Prolinderivaten. In bevorzugten erfindungsgemäßen Peptiden, in denen gegenüber SEQ ID Nr. 1 mindestens zwei Aminosäurereste verändert sind, ist X6 tert.-Leucin, R15 Histidin und/oder R] 9 eine positiv geladene Aminosäure.
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Peptide enthalten eine Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID Nr. 2 bis 18, 20 bis 22, 24 bis 26, 28 bis 30 (die Sequenzen gemäß einer der SEQ ID Nr. 2 bis 18, 20 bis 22, 24 bis 26, 28 bis 30 sind besonders bevorzugt) oder SEQ ID Nr. 68 bis 100, wie in Tabelle 2 angegeben. Bevorzugt weisen diese Peptide einen unmodifizierten N-Terminus auf. Bevorzugt weisen diese Peptide einen modifizierten C-Terminus auf, vorzugsweise einen amidierten C-Terminus.
Tabelle 2:
Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.
VR PPYLPRPRPPRRIYN 2
VP PPYLPRPRPPRRIYNR 3
VDKKPYLPRPRPPRRIYNR 4
VDKPPYLPRRRPPRRIYNR 5
VDKPPYLPRPRRPRRIYNR 6
VDKPPYLPRPRWPRRIYNR 7
VDKPPYLPRPRYPRRIYNR 8
VDKPPYLPRPRPPRRCYNR 9
VDKPPYLPRPRPPRRFYNR 10
VDKPPYLPRPRPPRRKYNR 11
VDKPPYLPRPRPPRRIYWR 12
VRKPPYLPRPR PRRIYNR 13
VPKPPYLPRPRPPRRKYNR 14
VRKPPYLPRPR PRRFYNR 15
VPKPPYLPRPRPPRRFYNH 16
VPKPPYLPRPRPPRRKYNR 17
Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.
VDKPPYLRRPRPPRRIYNR 18
VRKPPYLPRPRWPROIYNO 20
VOKPPYLPRPRWPROIYNO 21
V-d-Arg-KPPYLPRPRWPROIYNO 22
VRKPPYLPRPRW-Hyp-R-Hyp-Tle-YNO 24
VOKPPYLPRPRW-Hyp-R-Hyp-Tie-YNO 25
V-d-Arg-KPPYLPRPRW-Hyp-R-Hyp-Tle-YNO 26
VRKPPYLPRPRWPR-d-Arg- IYN-d-Arg 28
VOKPPYLPRPRWPR-d-Arg- IYN-d-Arg 29 V-d-Arg-KPPYLPRPRWPR-d-Arg-IYN-d-Arg 30
VOKPPYLPRPRPPRRIYNR 68
V-d-Arg-KPPYLPRPRPPRRIYNR 69
VDKPPYLORPRPPRRIYNR 70
VDKPPYL-d-Arg-RPRPPRRIYNR 71
VDKPPYLPRORPPRRIYNR 72
VDKPPYLPR-d-Arg-RPPRRIYNR 73
VRKPPYLPRPRRPRRIYNR 74
VRKPPYLPRPRYPRRIYNR 75
VPKPPYLPRPRWPRRIYNR 76
VPKPPYLPRPRRPRRIYNR 77
VPKPPYLPRPRYPRRIYNR 78
VPKPPYLPRPRPPRRCYNR 79
VPKPPYLPRPRPPRRFYNR 80
VRKPPYLPRPRPPRRKYNR 81
VRKPPYLPRPRPPRRCYNR 82
VRKPPYLPRPRPPRRFYNR 83
VRKPPYLPRPRRPRRFYNR 84
VRKPPYLPRPRYPRRFYNR 85
VRKPPYLPRPR PRRCYNR 86
VRKPPYLPRPRRPRRCYNR 87
VRKPPYLPRPRYPRRCYNR 88
VRKPPYLPRPRWPRRKYNR 89
VRKPPYLPRPRRPRRKYNR 90
VRKPPYLPRPRYPRRKYNR 91
VPKPPYLPRPRWPRRFYNR 92
VPKPPYLPRPRRPRRFYNR 93
VPKPPYLPRPRYPRRFYNR 94
VPKPPYLPRPRWPRRCYNR 95
VPKPPYLPRPRRPRRCYNR 96
VPKPPYLPRPRYPRRCYNR 97
VPKPPYLPRPRWPRRKYNR 98
VPKPPYLPRPRRPRRKYNR 99
VPKPPYLPRPRYPRRKYNR 100
Weiterhin betrifft die Erfindung diejenigen Peptide der Figur 1 , denen ein Wert kleiner als 1 , bevorzugt kleiner als 0,9, bevorzugter kleiner als 0,8, noch bevorzugter kleiner als 0,7, kleiner als 0,6, kleiner als 0,5 oder kleiner als 0,4 zugeordnet ist. Optional umfassen diese Peptide einen Rest R19 am C-Terminus gemäß der hier genannten Definition.
Bevorzugt ist der C-Terminus eines erfindungsgemäßen Peptids modifiziert. Unter einer ..Modifikation" wird dabei im Sinne der Erfindung verstanden, dass die Carboxylgruppe der C- tenninalen Aminosäure verändert sind, beispielsweise reduziert oder substituiert. Der N-Terminus eines erfindungsgemäßen Peptids ist vorzugsweise der Rest Vj. Der C-Terminus eines erfmdungsgemäßen Peptids ist vorzugsweise der Rest R] 9.
Für den Fall, dass der N-Terminus eines erfindungsgemäßen Peptids modifiziert ist, weisen geeignete Modifikationen die Struktur der allgemeinen Formel NRjR2 auf, wobei N das Stickstoffatom der der Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure des Peptids darstellt und die Reste Ri und R2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus folgenden Gruppen, wobei die folgenden Gruppen (Iii), (iv) und (v) bevorzugt sind:
(i) geradkettigen, verzweigten, zyklischen und heterozyklischen Alkylgruppen, vorzugsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl und Cyclohexyl;
(ii) geradkettigen, verzweigten, zyklischen und heterozyklischen Alkanoylgruppen, vorzugsweise Acetyl, Methanoyl (Formyl), Propionyl, n-Butyryl, Isobutyryl, Pentanoyl, Hexanoyl und Cyclohexanoyl;
(iii) Reportergruppen, vorzugsweise Fluoreszenzfarbstoffen (vorzugsweise Fluorescein,
Alexa488) oder Biotin;
(iv) Linkern zur Verbindung mit dem modifizierten C-Terminus des Peptids der allgemeinen Formel COR? (Definition siehe unten), zur Ausbildung eines zyklischen Peptids, vorzugsweise Linkern basierend auf Guanidin, Ethylenglycololigomeren, 2,4- Diaminobuttersäure, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Desmosin oder Isodesmosine;
(v) Linkem zur Kopplung eines weiteren Peptids (Y2) über eine chemische oder enzymatische Reaktion, vorzugsweise basierend auf Iod-, Brom- oder Chloralkansäuren (z.B. Iodessigsäure) oder Maleimid zur Kopplung an ein Thiol-haltiges Peptid oder auch einer anderen reaktiven Gruppe (z.B. Aminogruppe, Thiolgruppe) zur Kopplung eines zweiten Peptids oder Peptidderivats (z.B. als Aktivester, Aldehyd oder Thioester) als Träger- oder Carrierprotein;
(vi) Linkern analog zu (v), an welche ein weiteres Peptid oder Peptidderivat Y2 gekoppelt ist.
Bevorzugte Modifikationen der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure eines erfindungsgemäßen Peptids sind Modifikationen der allgemeinen Formel COR , wobei C das Kohlenstoffatom der der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure des Peptids darstellt und der Rest R3 ausgewählt ist aus folgenden Gruppen:
(i) Hydroxyl (COR ist eine Carboxylgruppe), Alkoxy (vorzugsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, iso-Propoxy oder Butoxy; COR3 ist ein Estergruppe), Amin (vorzugsweise ausgewählt aus Alkylamin, Dialkylamin, Methylamin, Ethylamin, Dimethylamin und Cyclohexylamin, in diesen Fällen ist COR3 ein Amid oder ausgewählt aus Aminen, an welche eine weitere Säuregruppe, insbesondere der C-Terminus eines anderen Peptids, eine Säuregruppe eines Polymers oder eines Trägermaterials (vorzugsweise Trägerpolymers) gebunden ist, in diesen Fällen ist COR, ein Imid);
(ii) Linkern, die den N-Terminus des Peptids mit dem C-Terminus verbinden, so dass ein zyklisches Peptid gebildet wird;
(iii) verzweigten Aminosäuren, zur Ausbildung einer Dimer- oder Oligomerstruktur des Peptids. Dabei sind die verzweigten Aminosäuren vorzugsweise ausgewählt aus Lysin, Hydroxylysin, Ornithin, 2,4-Diaminobuttersäure, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'- Diaminopimelinsäure, Desmosin und Isodesmosin. Alternativ entspricht R3 zur Ausbildung einer Dimer- oder Oligomerstruktur des Peptids einem weiteren Peptid (vorzugsweise mit 2 - 4 Aminosäuren), welches eine Kombination der vorgenannten Aminosäuren enthält;
(iv) Linkern zur Kopplung eines weiteren Peptids (Y2) über eine chemische oder enzymatische Reaktion, vorzugsweise basierend auf Iod-, Brom- oder Chloralkansäuren (z.B. Iodessigsäure) oder Maleimid zur Kopplung an ein Thiol-haltiges Peptid oder auch einer anderen reaktiven Gruppe (z.B. Aminogruppe, Thiolgruppe) zur Kopplung eines zweiten Peptids oder Peptidderivats (z.B. als Aktivester, Aldehyd oder Thioester) als Träger- oder Carrierprotein;
(v) Linkern analog zu (iv), an welche ein weiteres Peptid oder Peptidderivat Y2 gekoppelt ist.
Ganz besonders bevorzugt weist ein erfindungsgemäßes Peptid einen amidierten C-Terminus auf. Peptide der allgemeinen Fonnel (I) mit einem amidierten C-Terminus, vorzugsweise Arginin-Amid oder Ornithin-Amid, weisen vorteilhaft eine besonders hohe antibakterielle Aktivität auf. Bevorzugt erfolgt dafür eine Modifikation des C-Terminus mittels Thioestersynthese und anschließender Substitution mit einem primären Amin. Die erfindungsgemäßen Peptide können einzeln, in Kombination untereinander, als lineare Peptid- Multimere oder als verzweigte Peptid-Multimere eingesetzt werden. Geeignete Multimere erfmdungsgemäßer Peptide umfassen Dendrimere und Konkatamere, in denen die erfindungsgemäßen Peptide seriell miteinander oder über Linker (vorzugsweise Linkerpeptide, insbesondere Glycin-Serin-Linker) miteinander verknüpft sind. Peptid-Multimere können aus erfindungsgemäßen Peptiden mit identischen Aminosäuresequenzen oder aus erfindungsgemäßen Peptiden mit verschiedenen Aminosäuresequenzen zusammengesetzt sein. Bevorzugt werden dafür die für die erfindungsgemäßen Peptide kodierenden Nukleinsäureabschnitte miteinander verknüpft, wodurch bei deren Expression ein rekombinantes Protein gebildet wird, das eine Vielzahl der erfindungsgemäßen Peptide enthält. Auch ein derart hergestelltes rekombinantes Protein wird hierin als Peptid-Multimer bezeichnet. Aufgrund der höheren Stabilität im physiologischen Milieu wird der Einsatz der erfindungsgemäßen Peptide in Form von Peptid-Multimeren bevorzugt.
Peptid-Multimere, die erfindungsgemäße Peptide enthalten, umfassen mindestens zwei, vorzugsweise mindestens vier erfindungsgemäße Peptide. Eine beliebige Anzahl weiterer Peptide können an beliebige weitere Aminosäuren dieser Peptide angefügt sein. Bevorzugt enthält ein Peptid-Multimer mehrere Peptide, wobei eines der Peptide an ein verzweigtes Gerüst der anderen Peptide der Grundstruktur gekoppelt ist.
Vorzugsweise liegen erfindungsgemäße Peptide oder Peptid-Multimere, die erfindungsgemäße Peptide enthalten, über ein Linkerpeptid an ein Trägerpolymer gekoppelt vor. Geeignete Trägerpolymere sind dazu geeignet, die Stabilität, die Darreichung oder die Produktion der erfindungsgemäßen Peptide oder deren Peptid-Multimere zu verbessern, oder das Aktivitätsspektrum der Peptide zu verändern. Bevorzugte Trägerpolymere sind biokompatible Proteine, insbesondere ausgewählt aus humanem Serumalbumin, humanisierten Antikörpern, Liposomen, Mizellen, synthetischen Polymeren, Nanopartikeln und Phagen. Ein besonders bevorzugtes Trägerpolymer ist Polyethylenglykol.
In einer Ausführungsfonn der Erfindung liegen die erfindungsgemäßen Peptide in der Form eines multiplen Antigenpeptides (multiple antigenic peptide; MAP) vor. Dieses System nutzt eine zentrale Einheit aus Lysinresten, an die mehrere Kopien des gleichen erfindungsgemäßen Peptids synthetisiert werden. Jedes MAP enthält mehrere Kopien eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Peptide. Eine Ausführungsart eines MAP enthält mindestens drei, vorzugsweise aber vier oder mehr Peptide. Ein Fachmann kann einfach eine beliebige Anzahl multimerer Verbindungen gemäß den in obiger Formel identifizierten Peptiden herstellen. Alle derartigen multimeren Arrangements und Konstrukte sind Bestandteil dieser Erfindung. Vorzugsweise liegen Peptid-Multimere, die erfindungsgemäße Peptide enthalten, an die Oberfläche von Partikeln gekoppelt vor. Geeignete Partikel sind Mikro- oder Nanopartikel, vorzugsweise mit magnetischen oder fluoreszierenden Eigenschaften. Die Anbindung der Peptid-Multimere an die Oberfläche von Partikeln erfolgt bevorzugt durch N-terminale Biotinylierung des N-terminalen Endes des Peptid-Multimers und die anschließende Komplexbildung mit Streptavidin, welches an die Oberfläche gebunden ist.
Erfindungsgemäße Peptide besitzen vorteilhaft eine antibakterielle Wirkung sowohl gegen Gramnegative als auch gegen Gram-positive Bakterien. Die Erfindung umfasst daher auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids oder eines Peptid-Multimers, welches erfindungsgemäße Peptide enthält, als Antibiotikum. Ein weiterer Bestandteil der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids als Pharmazeutikum und/oder zur Herstellung eines Wirkstoffs, der als Antibiotikum eingesetzt werden kann. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide oder Peptid-Multimere, die erfmdungsgemäße Peptide enthalten, in der Medizin oder Pharmazie, vorzugsweise zur Therapie von bakteriellen Infektionen.
Von der Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung umfasst, die mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid oder mindestens ein Peptid-Multimer, welches erfindungsgemäße Peptide enthält, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. Das Peptid oder Peptid-Multimer liegt dabei bevorzugt stabilisiert vor. Die Stabilisierung erfolgt bevorzugt durch Kopplung des Peptids oder Peptid-Multimers an ein Trägerpolymer, insbesondere Polyethylenglykol.
Vorzugsweise enthält eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung weitere pharmazeutisch aktive Substanzen, insbesondere ein Antibiotikum (bevorzugt Vancomycin, Streptomycin, Tetracyclin oder Penicillin). Weitere bevorzugte pharmazeutisch aktive Substanzen sind weitere antimikrobiell aktive Substanzen, vorzugsweise Fungizide, wie Intraconazol oder Myconazol. Weitere bevorzugte pharmazeutisch aktive Substanzen sind Substanzen, die geeignet sind, die mit der Infektion einhergehende Symptome (wie Fieber oder Hautausschlag) zu lindern. Eine beispielhafte derartige Substanz ist Salizylsäure.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann eines oder mehrere verschiedene erfindungsgemäße Peptide oder Peptid-Multimere enthalten. Vorzugsweise liegen die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptid-Multimere, die erfindungsgemäße Peptide enthalten, in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung an ein Trägerpolymer (insbesondere Polyethylenglykol) gekoppelt vor. Dadurch kann vorteilhaft die Pharmakokinetik und/oder die Bioverfügbarkeit verbessert werden.
Das erfmdungsgemäße Peptid oder das Peptid-Multimer sind in einer pharmazeutischen Zusammensetzung in einer therapeutisch wirksamen Menge enthalten. Für die Anwendung in einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung wird das erfindungsgemäße Peptid vorzugsweise synthetisch oder auch rekombinant hergestellt. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind dazu bestimmt, Infektionen eines mit Bakterien infizierten Säugetiers einschließlich des Menschen zu behandeln. Dabei sind erfindungsgemäße Zusammensetzungen insbesondere bei Infektionen mit Gram-positiven Bakterien, insbesondere S. aureus, wirksam.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung enthält mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Der Begriff„pharmazeutisch akzeptabler Träger" bezieht sich auf eine biokompatible Substanz, die die Produktion von Antikörpern selbst nicht auslöst, die für das Subjekt, dem die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht wird, gefährlich sein könnten. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger im Sinne der Erfindung sind Lösungsmittel (bevorzugt Wasser, gepufferte wässrige Lösungen, Salzwasser, Glycerol und Ethanol), Streckmittel oder andere flüssige Bindemittel (wie Dispersions- oder Suspensionshilfsmittel), oberflächenaktive Agenzien, isotonische Wirkstoffe, Dickungsmittel, Emulgatoren, Konservierungsmittel, Umhüllungsmittel {encapsulating agents), feste Bindestoffe oder Gleitmittel, Liposomen oder Trägerpolymere, an die die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptid-Multimere vorzugsweise gekoppelt sind (bevorzugt biokompatible Proteine oder Polyethylenglykol). Geeignete Trägerpolymere sind vorzugsweise langsam abbaubare Makromoleküle, besonders bevorzugt Proteine, Polysaccharide, Polylactonsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren oder inaktivierte Virusbestandteile. Die Träger werden nach deren Kompatibilität mit dem Peptid und nach der jeweiligen Anwendung und Dosierung geeignet ausgewählt.
Vorzugsweise enthält eine erfmdungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung Hilfsstoffe, insbesondere Befeuchtungsmittel, Emulgatoren und/oder pH-puffernde Substanzen.
Vorzugsweise liegen erfindungsgemäße Peptide oder Peptid-Multimere, die erfmdungsgemäße Peptide enthalten, in Form von deren Salzen vor. Dafür werden Salze der Peptide oder Peptid- Multimere mit bekannten Methoden hergestellt, typischerweise durch Vermischen der Peptide oder Peptid-Multimere mit einer pharmazeutisch akzeptablen Säure, wobei ein saures Salz des Peptids gebildet wird, oder mit einer pharmazeutisch akzeptablen Base, wobei ein basisches Salz des Peptids gebildet wird. Dafür geeignete pharmazeutisch akzeptable Säuren sind ausgewählt aus Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Oxalsäure, Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Zimtsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure, Phosphorsäure und Thiocyansäure. Diese Säuren bilden mit den freien Aminogruppen der Peptide oder Peptid-Multimere Ammoniumsalze aus. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Basen sind ausgewählt aus Ethylamin, Methylamin, Dimethylamin, Triethylamin, Isopropylamin, Diisopropylamin und anderen Monoalkylaminen, Dialkylaminen und Trialkylaminen sowie Arylaminen. Diese Basen bilden mit den freien Carbonsäuregruppen der Peptide oder Peptid-Multimere Carboxylate aus.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung liegt vorzugsweise in Form von Kapseln, Tabletten, Pastillen, Dragees, Tropfen, Zäpfchen, Puder, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Inhalaten, Pflastern oder als Aerosol vor.
Zur Behandlung einer bakteriellen Infektion wird einem Subjekt eine therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht. Die direkte Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung erfolgt lokal oder systemisch, bevorzugt oral, parenteral, intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, pulmonal oder interstitiell ins Gewebe.
Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Behandlung von Säugetieren oder Menschen, die mit Bakterien (bevorzugt Gram-positiven Bakterien, insbesondere S. aureus) infiziert sind. Dafür wird einem Säugetier oder Menschen eine therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht. Die hierin verwendete Bezeichnung „therapeutisch wirksame Menge" bezeichnet die Menge des erfindungsgemäßen Peptids oder Peptid-Multimers, welche geeignet ist, die Vermehrung und Kolonienbildung der Bakterien zu reduzieren oder ganz zu verhindern. Die genaue effektive Menge für ein Subjekt hängt von dessen Größe und Gesundheitszustand, der Art und dem Ausmaß der Erkrankung und den Therapeutika oder der Kombination mehrerer Therapeutika ab, die zur Behandlung ausgewählt wurden.
Die Menge eines erfindungsgemäßen Peptids, die für eine antibakteriell effektive Dosis notwendig ist, wird unter Berücksichtigung des infektionsauslösenden Pathogens, der Schwere der Infektion sowie des Alters, Gewichts, Geschlechts des Patienten (sowie ggf. weiterer Patientenparameter) festgelegt. Bevorzugt beträgt die therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Peptids oder Peptid-Multimers bezogen auf das Gewicht des zu behandelnden Individuums zwischen 0,01 nmol/kg und 50 nmol/kg, vorzugsweise zwischen 0,2 nmol/kg und 10 nmol/kg. Die Häufigkeit der Dosierungen hängt von den zuvor genannten Faktoren ab und beträgt vorzugsweise zwischen ein und sechs Dosen pro Tag über einen Behandlungszeitraum von etwa drei Tagen bis maximal einer Woche.
Neben der therapeutischen Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide zur Behandlung von Infektionen, sind diese auch vorteilhaft in Desinfektions- oder Reinigungsmitteln anwendbar. Die Erfindung umfasst daher auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids oder eines Peptid-Multimers, welches erfindungsgemäße Peptide enthält, in einem Desinfektions- oder Reinigungsmittel, als Konservierungsmittel oder in einem Verpackungsmaterial. Die Erfindung umfasst zudem eine bakteriozide Zusammensetzung, die mindestens ein erfmdungsgemäßes Peptid und/oder mindestens ein Peptid-Multimer, welches erfindungsgemäße Peptide enthält, in Kombination mit einem Träger, enthält. Geeignete Träger sind Flüssigkeiten oder Bindemittel, die üblicherweise in bakteriziden Zusammensetzungen zum Einsatz kommen, vorzugsweise Ethanol. Eine erfindungsgemäße bakterizide Zusammensetzung wird vorzugsweise zur Desinfektion oder Reinigung von Oberflächen oder Gegenständen verwendet, insbesondere zur Vermeidung oder Entfernung von Biofilmen. Ein weiteres Anwendungsgebiet erfindungsgemäßer bakterizider Zusammensetzung sind Verpackungen, wobei die erfmdungsgemäßen Peptide oder Peptid- Multimere an Verpackungsmaterial gebunden sind. Eine weitere Verwendung erfindungsgemäßer bakterizider Zusammensetzungen ist der Einsatz als Konservierungsmittel für andere Materialien, die leicht durch Mikroorganismen abgebaut werden können. Eine erfindungsgemäße bakterizide Zusammensetzung ist vorteilhaft auch für die Verpackung von Lebensmitteln geeignet, da die erfindungsgemäßen Peptide weder beim Kontakt noch bei der Aufnahme toxisch wirken.
Bakterielle Infektionen oder bakterielle Verunreinigungen, bei deren Bekämpfung die erfindungsgemäßen Peptide eingesetzt werden, umfassen Infektionen und Verunreinigungen sowohl Gram-positiver als auch Gram-negativer Bakterien. Bevorzugte Indikationen sind Infektionen oder Verunreinigungen mit Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Erwinia amylovora, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella clysenteriae, Yersinia enterocolitica, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter baumannii, Agrobacterium tumefaciens, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Pseudomonas syringae, Rhizobium meliloti, Haemophilus influenzae und Staphylococcus aureus. Ganz besonders bevorzugte Indikationen davon sind Infektionen oder Verunreinigungen mit S. enterica; K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa und S. aureus.
Aufgrund der bakteriziden Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide eignen sich diese auch in der pharmazeutischen Forschung zur Identifikation antibakteriell wirksamer Substanzen in einem kompetitiven Screeningverfahren. Die Erfindung umfasst daher auch die die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids in einem Screeningverfahren, vorzugsweise in einem Screeningverfahren zur Identifikation von Substanzen, die eine antimikrobielle Wirkung aufweisen.
Ein bevorzugtes Screeningverfahren zur Identifizierung einer Substanz, die eine vermeintlich antibakterielle Wirkung aufweist, umfasst:
(i) die Durchführung eines kompetitiven Assays, unter Einsatz:
(a) eines Mikroorganismus (vorzugsweise ein Bakterium, insbesondere ein Grampositives Bakterium) der gegenüber einem erfindungsgemäßen Peptid empfindlich ist;
(b) dem erfindungsgemäßen Peptid und
(c) mindestens einer zu testenden Substanz (Testsubstanz),
wobei (a) mit (b) in Kontakt gebracht werden und anschließend (c) zugegeben wird; und wobei
(ii) die Auswahl einer Testsubstanz als antibakterielle Substanz erfolgt, wenn diese das an den Mikroorganismus gebundene erfindungsgemäße Peptid kompetitiv verdrängt.
In dem Screeningverfahren wird zunächst der Mikroorganismus mit dem erfindungsgemäßen Peptid in Kontakt gebracht wird, wodurch das erfindungsgemäße Peptid an den Mikroorganismus bindet. Anschließend wird die Testsubstanz zugegeben. Weist die Testsubstanz eine antimikrobielle Wirkung gegenüber dem Mikroorganismus auf, so wird das erfmdungsgemäße Peptid kompetitiv am Mikroorganismus verdrängt. Die kompetitive Verdrängung wird durch gängige Methoden bestimmt und/oder visualisiert.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide erfolgt entweder synthetisch oder durch rekombinante Methoden. Bevorzugt werden erfindungsgemäße Peptide synthetisch hergestellt, beispielsweise mit konventionellen Synthesetechniken, wie der Merrifield- Festphasenpeptidsynthese. Alternativ erfolgt die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide durch rekombinante Methoden, indem ein DNA-Fragment, welches eine für ein erfindungsgemäßes Peptid kodierende Nukleinsäuresequenz enthält, kloniert und in einer Wirtszelle (prokaryontisch oder eukaryontisch) exprimiert wird.
Die für ein erfindungsgemäßes Peptid kodierenden Polynukleotide werden synthetisch oder durch seitenspezifische Mutagenese einer existierenden Nukleinsäuresequenz bereitgestellt. Die kodierende Nukleinsäuresequenz kann von der RNA (oder DNA) mit entsprechend hergestellten Primern in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) mit bekannten Techniken amplifiziert werden. Nach einem Reinigungsschritt, beispielsweise mittels Agarose-Gelelektrophorese, wird das PCR- Produkt in einen Vektor ligiert und anschließend wird die Wirtszelle mit dem Vektor transformiert. Geeignete Wirtszellen für die rekombinante Hersteilung erfindungsgemäßer Peptide sind E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Streptomyces, Säugerzellen (vorzugsweise CHO, COS-1 , HEK293-Zellen), Hefezellen (vorzugsweise Saccharomyces, Schizophyllum) oder Insektenzellen. Bevorzugte Vektoren sind bakterielle oder virale Vektoren. Das erfindungsgemäße Peptid kann dabei als einzelnes Peptid oder als Peptid-Multimer exprimiert werden. Dabei können die Peptid-Multimere mehrere (ggf. unterschiedliche erfindungsgemäße) Peptide enthalten, die über deren N- oder C- Terminus verknüpft sind. Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Peptide bei der rekombinanten Herstellung einen N- oder C-terminalen Tag (vorzugsweise ein Histidin-Tag), der eine vereinfachte Reinigung der erfindungsgemäßen Peptide ermöglicht. Der Tag wird nachträglich enzymatisch abgespalten, um die aktive Peptidsequenz zu erhalten.
Zur Isolation der erfindungsgemäßen Peptide werden diese entweder aus den Wirtszellen (beispielsweise mit Zellaufschluss) oder aus dem Kulturmedium isoliert und gereinigt (beispielsweise mit Flüssigchromatographie, insbesondere Affinitätschromatographie). Diese rekombinanten Techniken wurden bereits für viele antimikrobielle Peptide angewandt.
Es ist auch möglich, nicht natürlich vorkommende Aminosäuren gentechnisch in die Peptide einzubringen (Noren C et al. 1989; Ellman J et al. 19 1).
Für den Fall, dass ein erfindungsgemäßes Peptid selbst nicht kodiert oder exprimiert werden kann, dieses aber hochgradig ähnlich (> 80% Aminosäuresequenzidentität) zu einem kodierbaren oder exprimierbaren Peptid ist, wird die Methode der rekombinanten Herstellung zunächst auf das hochgradig ähnliche Peptid angewandt. Anschließend wird das hochgradig ähnliche Peptid in einem oder mehreren Schritten chemisch oder enzymatisch in das gewünschte erfindungsgemäße Peptid überführt.
Die Erfindung umfasst auch ein Polynukleotid, das für ein erfindungsgemäßes Peptid kodiert. Ebenfalls von der Erfindung umfasst sind, vorzugsweise nicht-menschliche, Wirtszellen, welche ein erfindungsgemäßes Polynukleotid enthalten. Die Wirtszellen sind bevorzugt wie oben beschrieben ausgewählt und umfassen keine humanen embryonalen Stammzellen.
Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele soll die Erfindung näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken. Figurenbeschreibung
Fig. 1 zeigt die Ergebnisse der Substitutionsanalyse von nativem Oncocin (VDKPPYLPRPRPPR IYNR-NH2 - SEQ ID Nr. 1 ) in dem in Beispiel 1 beschriebenen Peptid- Array. Die Bezeichnungen der Aminosäuren entsprechen dem IUPAC- Einbuchstabencode. Die Werte geben die mikrobielle Aktivität im Vergleich zum unveränderten Oncocin an. Dabei stehen Werte < 1 für die Verbesserang der antimikrobiellen Aktivität und Werte > 1 für eine Verschlechterung der antimikrobiellen gegenüber Pseudomonas lux.
Beispiele
Beispiel 1: Substitution von Oncocin und Analyse der antibakteriellen Aktivität im Peptid- Array
Zur Verbesserung der antimikrobiellen Aktivität des Peptids Oncocin wurde eine Substitutionsanalyse durchgeführt. Dafür wurden mittels SPOT-Synthese eine Substitutionsbibliothek synthetisiert und mithilfe eines Bioluminenszenz-Assays auf die antibakterielle Aktivität gegenüber Pseudomonas lux untersucht.
Die SPOT-Synhese der Peptidbibliotheken erfolgte auf einem Whatman 50-Filterpapierausschnitt (Sigma-Aldrich, Deutschland) der Größe 19x29 cm mittels Fmoc-Methode und einem SPOT- Synthesizer (Intavis AG, Deutschland) (entsprechend Reineke, U., Volkmer-Engert, R. und Schneider-Mergener, J. (2001) Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Curr. Opin. Biotechnol. 12: 59-64). Die verwendete Lumineszenz-Screening-Methode basiert auf der Veröffentlichung von Hilpert und Hancock (Hilpert K. und Hancock, R.E. (2007) Use of luminescent bacteria for rapid Screening and characterization of short cationic antimicrobial Peptides synthesized on cellulose using peptide array technology. Nat. Protoc. 2: 1652-60). Die auf der Membran synthetisierten Peptide wurden abgespalten und die Peptidspots mit Hilfe eines Lochers aus der Peptidmembran ausgestanzt und in eine 96-Well-Mikrotiterplatte (Corning, USA) überführt und pro Well 200 iL dest. Wasser zugegeben. Die Platte wurde mit Aluminiumfolie (Biorad, Deutschland) versiegelt und für 18 h bei RT leicht geschüttelt. Auf diese Weise wurde jedes Peptid des Arrays auf genau ein Well einer Mikrotiterplatte übertragen, die Masterplatten genannt werden. Die versiegelten Masterplatten wurden bei -20°C gelagert. Die Masterplatten wurden so konzipiert, dass jede Reihe 10 Peptide sowie zwei Kontrollen (positiv und negativ) enthält. Im zweiten Schritt erfolgte das eigentliche Screening. Hierfür wurde eine Übernachtkultur (37°C, 225 rpm, 18 h) des lumineszierenden Bakterienstammes Pseudomonas lux angesetzt. Die Übemachtkultur wurde 100-fach verdünnt und bis zur optischen Dichte von 0,35 bei 600 nm [OD600] wachsen gelassen (ca. 2 Stunden - logarithmische Phase Kultur - LogK). Die Inkubationssuspension (4 vol.% LogK in 100 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,3) mit 40 mM sterilfiltrierter Glukose) wurde nun auf lumineszenzgeeignete 96-Well-Platten (VWR, Deutschland) verteilt und mit einer Konzentrationsreihe der Peptidbibliothek 4 h lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte die Lumineszenz-Messung mithilfe des Luminometers (Thermo, Finnland).
Aus den Ergebnissen der Substitutionsanalyse wurden die Peptidsequenzen ausgewählt, die im Assay die höchste Aktivität zeigten. Diese Peptide wurden konventionell an einem polymeren Träger synthetisiert und auf ihre antibakterielle Aktivität gegen S. aureus und gegen Gram-negative Bakterien mittels des MHK-Assays untersucht.
Beispiel 2: Minimale Hemmkonzentration von erfindungsgemäßen Peptiden (gegenüber P. aeruginosa, S. aureus und E. coli)
Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) der Peptide wurden in einer Doppelbestimmung von Triplikaten mit einer Positiv-(Gentamycin) und einer Negativkontrolle (0,9 % NaCl-Lösung) nach einem modifizierten Protokoll aus Wiegand et al. (Wiegand, I., Hilpert, K. und Hancock, R.E.(2008) Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat. Protoc. 3: 163-75) ermittelt.
Die Peptide wurden dazu in Wasser gelöst und in einer zweifachen Verdünnungsreihe mit 1/8 MHB (achtfach verdünntes Mueller-Hinton-Medium - 2,6 g/L, Merck) in sterilen 96-Well-Platten (Greiner Bio-One GmbH) von 128 ng/mL in zwölf Verdünnungsschritten auf 62,5 ng/mL verdünnt. Übernachtkulturen wurden mit 1/8 MHB auf ca. 1 ,5 x 107 Kolonie bildende Einheiten pro mL eingestellt. Davon wurden jeweils 50
Figure imgf000033_0001
der Bakterienlösung vermischt, um eine Anfangskonzentration von 4 x 105 Bakterien pro Well zu erreichen. Nach 20 Stunden Inkubation bei 37 °C wurde die Absorption bei 595 nm (Mikroplatten- Leser, Wallac Victor3, Perkin Elmer) bestimmt. Die minimale Hemmkonzentration wurde als die niedrigste Peptidkonzentration identifiziert, bei der kein bakterielles Wachstum nachgewiesen wurde.
Im Experiment wurde die antibakterielle Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide gegenüber Staphylococcus aureus DSM 1 104 /ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa PAOl (Wildtypstamm) und Escherichia coli UB1005 (F-, nalA37, metBl) bestimmt. In der folgenden Tabelle 3 sind die Ergebnisse des Versuchs dargestellt:
Tabelle 3: Minimale Hemmkonzentrationen in 1/8 MHB in μηιοΐ/ΐ
Figure imgf000034_0001
* Vergleichsbeispiel
Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass Substitutionen des nativen Oncocins, insbesondere an den Positionen 2, 4, 8, 10, 12, 16 und 18 die antimikrobielle Aktivität gegenüber dem Gram-positiven Bakterium S. aureus deutlich erhöht.
Die erfindungsgemäßen Peptide zeigen ebenfalls eine antimikrobielle Aktivität gegenüber den Gram-negativen Bakterien P. aeruginosa und E. coli. Beispiel 3: Minimale Hemmkonzentration von erfindungsgemäßen Peptiden mit amidiertem C-Terminus (gegenüber P. aeruginosa und S. aureus)
Es wurde von den in Tabelle 3 aufgeführten erfindungsgemäßen Peptiden mit amidiertem C- Terminus wie in Beispiel 2 beschrieben die minimale Hemmkonzentration gegenüber Pseudomonas aeruginosa PAOl (Wildtypstamm) und Staphylococcus aureus DSM 1 104 /ATCC 25923 bestimmt. In der folgenden Tabelle 4 sind die Ergebnisse des Versuchs dargestellt:
Tabelle 4: Minimale Hemmkonzentrationen in 1/8 MHB in μg/ml (Hyp ... 4-trans-Hydroxyprolin; Orn ... Ornithin; Tie ... tert-Leucin, arg ... D-Arginin)
Figure imgf000035_0001
* Vergleichsbeispiel; 100% MH B-Medium
Bei allen getesteten mehrfach modifizierten erfindungsgemäßen Peptiden ist eine verbesserte antibakterielle Wirkung gegenüber 5. aureus festzustellen. Die getesteten erfindungsgemäßen Peptide enthielten zumindest Substitutionen der nativen Aminosäuresequenz von Oncocin (SEQ ID Nr. 1) an den Positionen 2 und 12. Auch gegenüber P. aeruginosa konnte eine leichte Verbesserung der antibakteriellen Aktivität festgestellt werden.
In einem weiteren Experiment wurde von den vorgenannten Peptiden die antibakterielle Aktivität gegenüber weiteren Gram-negativen Bakterienstämmen ermittelt. Die Versuche wurden ebenfalls analog zu Beispiel 2 durchgeführt. In der folgenden Tabelle 5 sind die Ergebnisse des Versuchs dargestellt:
Tabelle 5: Minimale Hemmkonzentrationen in 12,5% MHB-Medium in g/ml
Figure imgf000036_0001
* Vergleichsbeispiel
Es konnte für die getesteten erfindungsgemäßen Peptide eine gute antibakterielle Aktivität gegenüber E. coli, S. enterica und K. pneumoniae nachgewiesen werden.

Claims

Patentansprüche
Antimikrobielles Peptid, enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß der allgemeinen Formel A
V1-X1-K3-X2-P5-Y6-Lv-X3-Rg-X4-R11-X5-P13-R14-Ri5-X6-Yi7-X7-Ri9 (Formel A) wobei die Aminosäuresequenz gemäß Formel A mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 % Aminosäuresequenzidentität zu Oncocin gemäß SEQ ID Nr.1 und maximal zwei negativ geladene Aminosäurereste aufweist, wobei in Formel A die Reste, K3, X2, P5, X?, R9, X4, R11, X5, P13, RH, R15, Χό, Yi7, X7, R19 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus ungeladenen oder positiv geladenen Aminosäureresten, wobei Vi, Xi, Y6 und L7 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäureresten, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine der Positionen 2, 4, 8, 10, 12, 16 und 18 von
SEQ ID Nr. 1 so verändert ist, dass auf das Peptid gemäß Formel A mindestens eine der folgenden Bedingungen zutrifft:
Xi ist ausgewählt aus ungeladenen Aminosäureresten und positiv geladenen Aminosäureresten, vorzugsweise ist Xi Arginin oder Ornithin,
X5 ist ausgewählt aus aliphatischen, nicht heterozyklischen ungeladenen Aminosäureresten und positiv geladenen Aminosäureresten, vorzugsweise ist X5 Tryptophan,
X2 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten,
X3 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten,
X4 ist ausgewählt aus aliphatischen, nicht heterozyklischen ungeladenen Aminosäureresten, aromatischen ungeladenen Aminosäureresten und positiv geladenen Aminosäureresten, X6 ist ausgewählt aus schwefelhaltigen Aminosäureresten, selenhaltigen Aminosäureresten, unpolaren aromatischen Aminosäureresten und positiv geladenen Aminosäureresten mit maximal zwei Stickstoffatomen in der Seitenkette und/oder
X7 ist ausgewählt aus schwefelhaltigen Aminosäureresten, selenhaltigen Aminosäureresten, aromatischen Aminosäureresten, unpolaren Aminosäureresten, positiv geladenen Aminosäureresten.
Peptid nach Anspruch 1 , wobei in Formel A gilt:
Vi ist ausgewählt aus polaren aliphatischen Aminosäureresten, unpolaren aliphatischen Aminosäureresten und unpolaren aromatischen Aminosäureresten;
K3 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten und ungeladenen unpolaren Aminosäureresten;
P5 ist ausgewählt aus ungeladenen Aminosäureresten und positiv geladenen Aminosäureresten;
Y6 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten, negativ geladenen Aminosäureresten und ungeladenen aromatischen Aminosäureresten;
L7 ist ausgewählt aus ungeladenen unpolaren Aminosäureresten;
R9 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten und ungeladenen Aminosäureresten;
RH ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten und unpolaren aromatischen Aminosäureresten;
Pi3 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten, ungeladenen unpolaren Aminosäureresten, schwefelhaltigen Aminosäureresten und polaren aromatischen Aminosäureresten; Ri4 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten und ungeladenen unpolaren Amino säureresten; i 5 ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten, ungeladenen polaren Aminosäureresten und ungeladenen aromatischen Aminosäureresten;
Yi 7 ist ausgewählt aus ungeladenen aromatischen Aminosäureresten und/oder
Rio ist ausgewählt aus positiv geladenen Aminosäureresten, ungeladenen aromatischen Aminosäureresten, ungeladenen polaren Aminosäureresten und nicht-aromatischen heterozyklischen Aminosäureresten.
Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest Xi Arginin oder Ornithin ist und/oder wobei zumindest X5 Tryptophan ist.
Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest X[ Arginin, Prolin oder ein Derivat davon ist, wobei zumindest X5 Tryptophan, Arginin, Tyrosin oder ein Derivat davon ist, wobei zumindest X2 Lysin oder ein Derivat davon ist, wobei zumindest X3 Arginin oder ein Derivat davon ist, wobei zumindest X4 Arginin oder ein Derivat davon ist, wobei zumindest X6 Cystein, Phenylalanin, Lysin oder ein Derivat davon ist, wobei zumindest X7 Tryptophan oder ein Derivat davon ist und/oder wobei zumindest R19 Histidin oder ein Derivat davon ist.
Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens eine der Positionen 2, 4, 8, 10, 12 und 18 von SEQ 1D Nr. 1 verändert ist.
Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei gegenüber SEQ ID Nr. 1 mindestens zwei Aminosäurereste verändert sind.
Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich mindestens an Position 2 von SEQ ID Nr. 1 eine Substitution befindet.
8. Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich mindestens an Position 12 von SEQ ID Nr. 1 eine Substitution befindet.
9. Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz nach SEQ ID Nr. 1 an mindestens einer der Positionen 1 , 11, 14, 15 und 17 unverändert ist.
10. Peptid nach Anspruch 1 , umfassend eine der folgenden Aminosäuresequenzen, wobei d-Arg für d-Arginin, Hyp für Hydroxyprolin, O für Ornithin und Tie für tertiär-Butylglycin steht und wobei der C-Terminus des Peptids ggf. amidiert ist:
Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.
VRKPPYLPRPRPPRRIYNR 2
VPKPPYLPRPRPPRRIYNR 3
VDKKPYLPRPRPPRRIYNR 4
VDKPPYLPRRRPPRRIYNR 5
VDKPPYLPRPRRPRRIYNR 6
VDKPPYLPRPRWPRRIYNR 7
VDKPPYLPRPRYPRRIYNR 8
VDKPPYLPRPRPPRRCYNR 9
VDKPPYLPRPRPPRRFYNR 10
VD PPYLPRPRPPRRKYNR 11
VDKPPYLPRPRPPRRIYWR 12
VRKPPYLPRPRWPRRIYNR 13
VPKPPYLPRPRPPRRKYNR 14
VRKPPYLPRPRWPRRFYNR 15
VPKPPYLPRPRPPRRFYNH 16
VPKPPYLPRPRPPRRKYNH 17
VDKPPYLRRPRPPRRIYNR 18
VRKPPYLPRPRWPROIYNO 20
VOKPPYLPRPR PROIYNO 21
-d-Arg-KPPYLPRPRWPROIYNO 22
VRKPPYLPRPRW-Hyp-R-Hyp-Tie-YNO 24
VOKPPYLPRPRW-Hyp-R-Hyp-Tie-YNO 25
V-d-Arg-KPPYLPRPRW-Hyp-R-Hyp-Tle-YNO 26
VRKPPYLPRPRWPR-d-Arg-IYN-d-Arg 28
VOKPPYLPRPRWPR-d-Arg-IYN-d-Arg 29
V-d-Arg-KPPYLPRPRWPR-d-Arg- IY -d-Arg 30
VOKPPYLPRPRPPRRIYNR 68
V-arg-KPPYLPRPRPPRRIYNR 69
VDKPPYLORPRPPRRIYNR 70
VDKPPYL-d-Arg-RPRPPRRIYNR 71 VDKPPYLPRO PPRRIYNR 72
VDKPPYLPR - d-Arg-RPPRRIYNR 73
VRKPPYLPRPRRPRRIYNR 74
VRKPPYLPRPRYPRRIYNR 75
VPKPPYLPRPRWPRRIYNR 76
VPKPPYLPRPRRPRRIYNR 77
VPKPPYLPRPRYPRRIYNR 78
VPKPPYLPRPRPPRRCYNR 79
VPKPPYLPRPRPPRRFYNR 80
VRKPPYLPRPRPPRRKYNR 81
VRKPPYLPRPRPPRRCYNR 82
VRKPPYLPRPRPPRRFYNR 83
VRKPPYLPRPRRPRRFYNR 84
VRKPPYLPRPRYPRRFYNR 85
VRKPPYLPRPRWPRRCYNR 86
VRKPPYLPRPRRPRRCYNR 87
VRKPPYLPRPRYPRRCYNR 88
VRKPPYLPRPRWPRRKYNR 89
VRKPPYLPRPRRPRRKYNR 90
VRKPPYLPRPRYPRRKYNR 91
VPKPPYLPRPRWPRRFYNR 92
VPKPPYLPRPRRPRRFYNR 93
VPKPPYLPRPRYPRRFYNR 94
VP PPYLPRPRWPRRCYNR 95
VPKPPYLPRPRRPRRCYNR 96
VPKPPYLPRPRYPRRCYNR 97
VP PPYLPRPRWPRRKYNR 98
VPKPPYLPRPRRPRRKYNR 99
VPKPPYLPRPRYPRRKYNR 100
1 1. Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, in welchem der C-Terminus direkt oder über einen Linker mit mindestens einem weiteren Peptid, Protein, Polymer und/oder Träger, vorzugsweise mit einem Polymer, besonders bevorzugt mit Polyethylenglykol, verbunden ist.
12. Peptid-Multimer umfassend mindestens zwei Peptide nach einem der Anspräche 1 bis 1 1 , wobei die mindestens zwei Peptide miteinander über ein Linkerpeptid verknüpft sind.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 oder ein Peptid-Multimer nach Anspruch 12, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wobei das Peptid oder das Peptid-Multimer vorzugsweise stabilisiert ist. 14. Medikament umfassend ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 oder ein Peptid- Multimer nach Anspruch 12 zur Verwendung als Antibiotikum.
5 15. Polynukleotid kodierend für ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1.
16. Nicht-menschliche Wirtszellen enthaltend ein Polynukleotid nach Anspruch 15.
17. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 oder eines Peptid-Multimers iü nach Anspruch 12 in einem Desinfektions- oder Reinigungsmittel, als Konservierungsmittel oder in einem Verpackungsmaterial.
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