KR20090002556A - 개불 유래의 새로운 항균 펩타이드 및 그의 용도

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KR20090002556A

Publication number: KR20090002556A
Application number: KR1020070065997A
Authority: KR
Inventors: 이동건; 성우상
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2007-07-02
Filing date: 2007-07-02
Publication date: 2009-01-09
Also published as: KR100879211B1

본 발명은 개불(Urechis unicinctus)로부터 분리 합성한 항균 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1 및 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 항균 펩타이드는 세포 독성이 없고 탁월한 항균 및 항진균 활성을 나타내므로 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

개불, 항균, 항진균, 항생제

개불 유래의 새로운 항균 펩타이드 및 그의 용도{Novel antimicrobial peptide and its application derived from echiuroid worm, Urechis unicinctus}

본 발명은 개불 (Urechis unicinctus)로부터 분리 합성한 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 항균, 항진균 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

병원성 미생물의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 병원성 미생물의 항생제 저항성 (resistance)이 야기되었다.

실제로, 병원성 미생물이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빨리 일어난다. 예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 등의 병원성 미생물 종들은 지금까지 알려진 모든 항생 제에 대한 저항력을 키워왔다 (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998).

항생제에 대한 내성 (tolerance)은 항생제에 대한 저항성 (resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스 (Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다 (Tomasz et al., Nature, 227, 138-140, 1970).

내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재 하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 상기 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신 (autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해 (autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 이러한 사실은 페니실린이 내인성 가수분해 효소 (endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.

병원성 미생물이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 내성 미생물을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다 (Handwerger and Tomasz, Rev . Infec . Dis., 7, 368-385, 1985).

아울러 내성이 생기는 것은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행 조건이라고 간주되며, 이것은 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다. 실제적으로 모든 저항성을 보이는 병 원성 미생물들은 내성도 가지고 있는 것으로 알려져 있으므로 (Liu and Tomasz, J. Infect. Dis., 152, 365-372, 1985), 이러한 항생제 저항성을 가지는 병원성 미생물을 죽일 수 있는 신규의 항생제의 개발은 시급한 실정이다.

상기 살펴본 바와 같이, 항생제에 저항성을 나타내는 병원성 미생물들과 싸우기 위하여 새로운 항생제의 개발이 필요하며, 아울러 오토라이신 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다. 또한, 그러한 새로운 항생제를 병원성 미생물의 감염을 효과적으로 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이 필요하다.

한편, 생물체는 항상성 (homestasis)을 유지하기 위한 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있는 물질들 중 일부가 각종 생물체 유래의 생리 활성 물질이다.

지금까지 수많은 생리 활성 물질에 대해 많은 연구가 진행되고 있으며, 그 중, 각종 생물체에서 분리된 항균 펩타이드는 박테리아, 곰팡이 및 바이러스에 이르기까지 다양하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 항균 펩타이드들은 숙주방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다 (Boman, H. G., Cell, 65, 205, 1991; Boman, H. G., Annu. Rev . Microbiol., 13, 61, 1995).

본 연구에서 사용되어진 펩타이드는 해양 생물인 개불 (Urechis unicinctus)에서 분리된 펩타이드로, 척추동물의 신경 전달 펩타이드와 유사한 서열을 가졌다는 것만 알려졌을 뿐, 항균 및 항진균 활성에 대한 연구는 미미한 실정이었다

이에 본 발명자는 개불에서 분리된 펩타이드의 항균 및 항진균 활성과 그 작 용 기작을 밝히고 상기 펩타이드가 항생제로 이용될 수 있는 항균 펩타이드임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항생제로 이용할 수 있는 세포 독성이 없고 우수한 항균 및 항진균 활성을 나타내는 항균 펩타이드 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개불 (Urechis unicinctus) 유래의 항균 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 항균 펩타이드를 항균 및 항진균용으로 사용하는 용도를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기의 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 및 항진균용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 항균 펩타이드는 개불 유래의 펩타이드로 항균 및 항진균성이 우수하여 항균제 또는 항진균제 등으로 바람직하게 적용된다.

상기 항균 펩타이드는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예 2를 통해 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 조사한 결과, 강력한 항균 펩타이드인 멜리틴 (Melittin)과 거의 동등한 항균 효과를 나타내었다.

구체적으로, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 병원성 세균의 최소 생육 저지 농도 (MIC)가 1.25∼5 ㎍으로 항균 활성을 가지고, 병원성 진균의 최소 생육 저지 농도 (MIC)가 1.25∼5 ㎍으로 우수한 항진균 활성을 가진다.

상기 병원성 세균으로는 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 앤테로코쿠스 파시움 (Enterococcus faecum), 스트렙토코쿠스 무탄스 (Streptococcus mutans), 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157), 슈도모나스 아루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 블니피쿠스 (Vibrio vulnificus)가 있으며, 병원성 진균으로는 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이 (Trichosporon beigelii), 및 마라세지아 펄펄 (Malassezia furfur) 등이 있으며, 이들 모두에 대해 우수한 항균 활성을 나타내었다 (표 2 참조).

이러한 항균 펩타이드는 진균의 세포막에 작용하며 (실시예 3 및 도 1 참조), 강력한 항균 펩타이드인 멜리틴과 같이 진균의 세포막에 구멍을 형성할 수 있음을 확인하였다 (실시예 4 참조).

또한, 본 발명의 항균 펩타이드를 이용하여 적혈구 파괴능을 조사한 결과, 서열번호 1 및 2로 기재되는 펩타이드는 세포 독성을 전혀 나타내지 않는 반면에 양성 대조군으로 사용한 벌독으로부터 분리한 펩타이드인 멜리틴은 세포 독성이 매우 높게 나타남을 확인하였다 (실시예 5 참조).

더불어 상기 항균 펩타이드는 랫트에 대한 비경구 투여 급성 독성 실험에서도 5 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않고 비경구 투여 최소 치사량이 10 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질임을 확인하였다 (실시예 6 참조).

따라서 본 발명에 따라 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드는 높은 항균, 항진균 활성을 가지고 있어 효과적인 항균 펩타이드임을 알 수 있다.

더욱이 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드는 세포 독성이 없고 경구 투여시에도 거의 무독한 결과를 나타내어 인체에 사용하여도 무방한 펩타이드이기 때문에 항균제 및 항진균제로 유용하게 사용될 수 있다. 이외에도 각종 식품 방부제, 화장품 보존제와 의약품 보존제의 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 항균 펩타이드는 임상 투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 항균 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제 라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 본 발명의 항균 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 항균 펩타이드의 유효용량은 1∼2 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.5∼1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제는 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분활 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 항균 펩타이드의 투여 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있다.

상기의 결과로부터, 본 발명의 서열번호 1 및 2로 기재되는 항균 펩타이드는 그램 양성균, 그램 음성균 및 진균 모두에서 탁월한 항균 작용을 나타내었고 세포 독성을 나타내지 않으므로, 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시하나, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것 일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 합성 및 분리 정제

본 실시예 1에서는 해양 생물인 개불 (Urechis unicinctus) 유래의 항균 펩타이드를 합성하였다. 이때 상기 항균 펩타이드는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

펩타이드	아미노산 서열
서열번호 1: Urechistachykinin 1	Leu-Arg-Gln-Ser-Gln-Phe-Val-Gly-Ser-Arg -NH₂
서열번호 2: Urechistachykinin 2	Leu-Arg-Gln-Ser-Gln-Phe-Val-Gly-Ser-Arg-NH₂

먼저, 항균 펩타이드를 합성하기 위하여, 본 발명자들은 Fmoc 아미노기 보호용기를 이용한 메리필드 (Merrifield)의 액상 고상법을 사용하여서 (Merrifield, RB., J. Am . Chem . Soc., 85, 2149, 1963) 서열번호 1 및 2로 기재되는 항균 펩타이드를 제조하였다.

상기 항균 펩타이드 합성의 방법은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노산의 N_α-amino group의 보호기 (protecting group)로 사용하는 고상법 (solid phase method)으로 합성하였다.

구체적으로, 카르복실말단이 -NH₂ 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링 (coupling)에 의한 펩타이드 사슬의 연장 (elongation)은 N-hydroxybenzo- triazole (HOBt)-dicyclo-hexylcar- bodiimide (DCC)법에 의하였다.

각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈 (NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 디클로로메탄 (DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다.

여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-H₂O-triisop- ropylsilane (85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다.

이렇게 하여 얻은 조(crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도 구배(acetonitrile gradient)로 하여 정제형 역상-HPLC (reverse phase-HPLC) column (Delta Pak, C₁₈ 300Å, 15μ, 19.0 mm×30 ㎝, Waters)을 이용하여 정제하였다.

각 합성 펩타이드를 6 N-HCl로 110 ℃에서 24시간 동안 가수분해한 후, 얻어진 잔사를 감압농축 한 뒤, 0.02 N-HCl에 녹여서 아미노산 분석기 (Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다.

또한 합성된 펩타이드의 시퀀스 (sequence)를 바탕으로 분자량을 계산하였고, MALDI 질량 분석법 (matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer)을 이용하여 정확한 분자량을 측정하였다. 그 결과 측정된 분자량과 계산된 분자량이 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

실시예 2: 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 병원성 미생물에 대한 항균 활성 조사

상기 실시예에서 제조된 항균 펩타이드의 항균 활성을 조사하기 위해 하기와 같이 수행하였다. 이때 꿀벌로부터 분리된 강력한 항균 펩타이드인 멜리틴 (Melittin)을 본 발명에서 양성 대조구로 사용하였다. 본 발명에서 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드는 -20℃에 보관하며, 멸균된 3차 증류수에 녹여서 사용하였다.

[항균 활성 측정]

서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 항균 활성을 측정하기 위하여, 먼저 병원성 세균인 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 앤테로코쿠스 파시움 (Enterococcus faecum), 스트렙토코쿠스 무탄스 (Streptococcus mutans), 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157), 슈도모나스 아루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 블니피쿠스 (Vibrio vulnificus)를 Mueller Hinton 항균 활성 측정용 배지 (Beef extract powder 0.2%, Acid digest of casein 1.75%, Soluble starch 0.15%)로 1×10⁶ 세포/1 mL의 균수가 되도록 희석하여, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 용액을 단계적으로 희석한 농도로 처리했다.

이어서, 37 ℃ 배양기에서 6시간 동안 진탕 배양을 하면서 ELISA 판독기 (reader)를 이용하여 620 nm의 파장 하에서 흡광도를 측정하여 최소 생육 저지농도 (MIC)를 측정하였으며, 얻어진 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[항진균 활성 측정]

서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 항진균 활성의 측정에는 병원성 진균인 캔디다 알비칸스 (Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이 (Trichosporon beigelii), 마라세지아 펄펄 (Malassezia furfur)를 YPD 완전 배지 (포도당 2%, peptone 1%, yeast extract 0.5%, pH 5,5)에 배양하였다. 또한 YPD 액체 배지로 2×10³ 세포/ 1 mL의 균수가 되도록 희석하여, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 용액을 단계적으로 희석한 농도로 처리했다.

이어서 28 ℃ 배양기에서 24시간 동안 진탕 배양한 후, MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액 [5 mg of MTT/mL of PBS (pH 7.4)]을 각각의 웰에 넣고, 37 ℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 이어서 MTT에 의하여 생성된 포르마잔 (Formazan)들을 용해하기 위해 0.02 N HCl이 포함된 20 % SDS를 20 ㎕를 넣은 후, 37 ℃에서 16시간 반응시켰다.

다음으로 ELISA 판독기로 570 nm의 파장 하에서의 각 웰의 흡광도를 측정하여 최소 생육 저지농도 (MIC)를 측정하였으며, 얻어진 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

서열번호 1의 항균 펩타이드의 병원성 미생물에 대한 최소 생육 저지 농도 (MIC)

	병원성 미생물에 대한 MIC ^a(㎍/mL)
	Urechistachykinin 1서열번호 1	Urechistachykinin 2 서열번호 2	멜리틴(Melittin)
그램 양성 세균
스태필로코쿠스 아우레우스	5	2.5	1.25
스트렙토코쿠스 무탄스	2.5	1.25	0.3125
앤테로코쿠스 파시움	2.5	2.5	0.625
그램 음성 세균
대장균 0-157	1.25	1.25	0.3125
슈도모나스 아루지노사	2.5	1.25	0.3125
비브리오 블니피쿠스	5	2.5	1.25
진균
캔디다 알비칸스	5	2.5	2.5
트리코스포론 베이겔라이	2.5	1.25	1.25
마라세지아 펄펄	5	5	2.5
[주] a: 병원성 미생물의 생육이 전혀 안 되는 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 농도

[항균 활성]

상기 표 2를 참조하면, 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 항균 활성은 그람 양성과 음성균을 포함한 넓은 범위의 병원성 세균에서 항균 활성을 가짐을 알 수 있다. 또한 이때 최소 생육 저지 농도 (MIC)는 대부분 1.25∼5 ㎍으로, 강력한 항균 펩타이드인 멜리틴과 유사하거나 조금 약한 항균 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

[항진균 활성]

상기 표 2를 참조하면, 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 항진균 활성 측정의 결과, 병원성 진균에 대해서 1.25∼5 ㎍의 최소 생육 저지 농도 (MIC)를 나타내었다. 이는 대조군인 사용된 강력한 항진균제인 멜리틴과 유사하거나 조금 약한 항진균 활성으로 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드가 강력한 항진균 활성을 나타냄을 의미한다.

실시예 3: 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 병원성 미생물에서의 항균 활성 위치의 확인

서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 병원성 미생물에서의 항균 활성 위치의 확인은 다음과 같이 실시하였다.

펩타이드에 형광 물질을 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 붙였다. FITC (Fluorescein isothiocyanate)라는 물질은 항진균 활성을 비롯하여 세포에 어떠한 영향도 끼치지 않는 형광 물질이며, 공초점 형광 현미경로 조사 시 녹색의 형광을 띄므로 보편적으로 이용되는 물질이다. 이때 FITC와 펩타이드가 결합했는지를 확인하기 위하여 트라이신-겔 SDS-폴리아크리라마이드 겔 전기영동을 이용하여 알아보았다.

이렇게 FITC로 표지된 펩타이드를 이용하여 펩타이드의 세포 내 분포를 알아보기 위하여 공초점 레이저 조사 현미경법 (CLSM; Confocal laser scanning microscopy)이 수행되었다. 진균인 C. albicans를 FITC로 표지된 서열번호 1의 펩타이드와 28 ℃에서 5분 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후에 세포들을 인산-염화나트륨 완충액, pH 7.4 (PBS) 용액으로 씻어줌으로써 반응되지 않은 FITC를 제거하였다.

이어서 FITC로 표지된 펩타이드의 가시화 위치 확인은 Leica DAS upright 현미경에 연결된 Leica TCS 4D를 이용하여 수행하였으며 (Leica Lasertech GimbH, Heidelberg, Germany), 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 항균 펩타이드가 세포의 어느 부위에 영향을 주어 항균 활성을 나타내는지를 확인하기 위하여 형광 물질 (FITC; Fluorescein isothiocyanate)로 표지된 항균 펩타이드를 캔디다 알비칸스 (Candida albicans) 균체에 처리한 다음 공초점 형광 현미경으로 균체를 찍은 사진이다. 이때 도 1의 (가)는 서열번호 1의 항균 펩타이드를 처리한 사진이고, (나)는 서열번호 2의 항균 펩타이드를 처리한 사진이다.

도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드는 모두 진균의 세포막에 작용함을 알 수 있다.

실시예 4: 서열번호 1의 항균 펩타이드의 병원성 미생물의 세포막에 대한 영향 검토

서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 세포막에 대한 구체적인 영향을 확인하기 위하여 1,6-디페닐-1,3,5-헥사트리엔 (DPH) 분석을 실시하였다.

C. albicans을 YPD 배지에 연속 배양한 후에 세포수가 2ㅧ105 개가 되도록 YPD 배지로 희석한 후, 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드를 처리하였다. 이어서, 2 시간 동안 28 ℃ 배양기에서 배양한 다음, 0.37% (v/v) 포름알데하이드로 30 분간 처리하여 세포를 고정시켰다. 이어서 액체 질소로 세포를 얼리고, 녹이는 과정을 2번 반복하였다.

일반적으로, 세포막의 지질 이중층 사이에 붙는 것으로 알려진 0.6 mM의 1,6-디페닐-1,3,5-헥사트리엔 (DPH) 용액과 함께 28 ℃에서 45 분 동안 배양하여 염색하였다. 배양이 끝난 후, 세포를 인산-염화나트륨 완충액, pH 7.4 (PBS) 용액으로 4번 씻고, 0.5 ml PBS 용액을 넣고, 2 분 동안 초음파 기계를 통하여 세포를 파괴하고, 원심 분리를 하여 상등액을 350 nm 여기(excitation), 425 nm 발광(emission)의 파장 하에서 형광 광도계를 이용하여 DPH의 양을 측정하였으며, 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2는 항균 펩타이드가 미생물의 세포막에 구체적으로 어떤 영향을 주는지를 확인하기 위하여 항균 펩타이드를 캔디다 알비칸스 (Candida albicans) 균체에 처리한 다음 일반적으로 세포막의 지질 이중층 사이에 붙는 것으로 알려진 형광 물질 (DPH; 1,6-diphenyl- 1,3,5-hexatriene)로 염색하여 형광 광도계를 이용하여 형광 물질의 양을 측정한 그래프이다. 이때 ●는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드(Urechistachykinin 1)이고, ○는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드(Urechistachykinin 2)이고, ▼는 멜리틴을 나타낸다.

도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드의 경우 그 처리량이 늘어날수록 DPH의 양이 감소하고 있으며, 양성 대조구로 사용된 멜리틴의 경우에도 펩타이드의 양이 늘어날수록 DPH의 양이 크게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

멜리틴은 세포막에 구멍를 형성하는 것으로 알려져 있으며, 상기 도 2의 결과를 통해 본 발명에 따른 항균 펩타이드가 양성 대조구인 멜리틴과 같이 진균의 세포막에 구멍을 형성할 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 인간 적혈구 세포에 대한 세포 독성 측정

인간 적혈구 세포에 대한 세포 독성의 측정은 다음과 같이 실시하였다.

적혈구 세포(Human erythrocytes)를 인산-염화나트륨 완충액, pH 7.4 (PBS)로 세 번 세척한 후, 인산-염화나트륨 완충액으로 희석하여, 8.0 %의 적혈구 세포 용액을 제조하였다. 그런 후, 8.0 % 적혈구 세포 용액을 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후에 서열번호 1 및 2 각각의 항균 펩타이드의 단계적으로 희석한 용액을 섞어주었다.

이어서 모든 웰 에 총액의 양이 200 ㎕가 되도록 생리 식염수 (Saline 0.85 % NaCl)을 넣어주고, 37 ℃ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝난 후, 원심 분리기에서 1000 rpm의 회전 속도로 10분간 원심 분리하여 상등액을 옆 웰로 옮겼다.

적혈구 세포에 대한 파괴능은 ELISA 판독기로 414 nm의 파장 하에서의 흡광도를 측정하여 파괴능을 분석하였다. 그리고 대조군으로 0.1 % 트리톤 X-100으로 처리하였을 경우의 값을 100 % 파괴능으로 계산하였으며, 적혈구 세포만을 넣은 경우를 0 % 파괴능으로 계산하였다. 이때 항균 펩타이드의 파괴능은 하기 수학식 1에 의하여 계산하였으며, 얻어진 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

인간 적혈구 세포 (Human erythrocytes)에 대한 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 세포 독성의 측정

상기 표 3을 참조하면, 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드는 고농도에서도 세포 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 그에 비해 강력한 항균 펩타이드인 멜리틴의 경우에는 낮은 농도에서도 세포 독성이 매우 높게 나타냄을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명에서 발견된 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드는 인간의 신체에 피해 없이 인간에 대해 사용이 가능함을 의미한다.

실시예 6: 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성 실험

6주령의 특정병원체부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성 독성 실험을 실시하였다.

본 발명의 서열번호 1 및 2로 기재되는 항균 펩타이드 각각을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 실험군 당 2 마리씩의 동물에 1 g/㎏/15 ㎖의 용량으로 단회 비경구 투여하였다. 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 본 발명의 항균 펩타이드를 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중 변화, 혈액 검사, 혈액 생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다. 또한, 본 발명의 항균 펩타이드는 랫트에서 5 ㎎/㎏까지 독성 변화를 나타내지 않으며, 비경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 10 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

도 1은 항균 펩타이드가 세포의 어느 부위에 영향을 주어 항균 활성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 형광 물질 (FITC; Fluorescein isothiocyanate)로 표지된 항균 펩타이드를 캔디다 알비칸스 (Candida albicans) 균체에 처리한 다음 공초점 형광 현미경으로 균체를 찍은 사진으로,

(가)는 서열번호 1의 항균 펩타이드 (Urechistachykinin 1)를 처리한 사진이고, (나)는 서열번호 2의 항균 펩타이드 (Urechistachykinin 2)를 처리한 사진이다.

도 2는 항균 펩타이드가 미생물의 세포막에 구체적으로 어떤 영향을 주는지를 확인하기 위하여, 항균 펩타이드를 캔디다 알비칸스 (Candida albicans) 균체에 처리한 다음, 세포막의 지질 이중층 사이에 붙는 것으로 알려진 형광 물질 (DPH; 1,6-diphenyl- 1,3,5-hexatriene)로 염색하여 형광 광도계를 이용하여 형광 물질의 양을 측정한 그래프이다:

●: 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드 (Urechistachykinin 1)

○: 서열번호 2의 아니노산 서열을 가지는 항균 펩타이드 (Urechistachykinin 2)

▼: 멜리틴 (Melitin)

<110> KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Novel antimicrobial peptide and its application derived from echiuroid worm, Urechis unicinctus <130> DP20070172 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Urechistachykinin 1 <400> 1 Leu Arg Gln Ser Gln Phe Val Gly Ser Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Urechistachykinin 2 <400> 2 Ala Ala Gly Met Gly Phe Phe Gly Ala Arg 1 5 10

% 인간 적혈구 파괴능 ^a(㎍/ml)

Urechistachykinin 1, 서열번호 1

Urechistachykinin 2, 서열번호 2

[주] a: 인간에 대한 세포 독성은 인간 적혈구 세포에 대한 서열번호 1의 항균 펩타이드의 파괴능으로 측정

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드.
서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드.
서열번호 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 및 항진균용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,

상기 펩타이드는 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 앤테로코쿠스 파시움 (Enterococcus faecum), 스트렙토코쿠스 무탄스 (Streptococcus mutans), 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157), 슈도모나스 아루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 블니피쿠스 (Vibrio vulnificus), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이 (Trichosporon beigelii), 및 마라세지아 펄펄 (Malassezia furfur)의 병원성 미생물에 대해 항균 활성을 가지는 항균 및 항진균용 약학적 조성물.
서열번호 2의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 및 항진균용 약학적 조성물.
제5항에 있어서,

상기 펩타이드는 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 앤테로코쿠스 파시움 (Enterococcus faecum), 스트렙토코쿠스 무탄스 (Streptococcus mutans), 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157), 슈도모나스 아루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 블니피쿠스 (Vibrio vulnificus), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이 (Trichosporon beigelii), 및 마라세지아 펄펄 (Malassezia furfur)의 병원성 미생물에 대해 항균 활성을 가지는 항균 및 항진균용 약학적 조성물.