KR101276426B1

KR101276426B1 - 개불 추출물을 함유하는 의약 조성물

Info

Publication number: KR101276426B1
Application number: KR1020100139164A
Authority: KR
Inventors: 박찬익; 김상찬; 장정희; 안은미
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2013-06-19
Also published as: KR20120077268A

Abstract

본 발명은 해양생물인 개불 추출물로부터 제조되는 의약 조성물에 관한 기술로서, 각질 생성방지 효과, 항노화 효과 및 멜라닌 색소 형성 방지 효과를 가지는 의약 조성물을 제공한다.

Description

개불 추출물을 함유하는 의약 조성물{medical composition including urechis unicinctus extract}

본 발명은 개불 추출물을 함유하는 의약 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 각질 생성방지 효과 및 항노화 효과를 갖는 항산화 효과와, 멜라닌 색소 형성 방지 효과를 가지는 의약 조성물에 관한 것이다.

산소를 이용하여 살아가는 생물체는 생명유지를 위해 산소를 필수적으로 요구하지만, 산소의 대사과정 동안 발생하는 유해물질을 피할 수 없다. 이런 독성이 강한 물질을 활성 산소종(ROS ; reactive oxygen species)이라 하는데, 산소에 의해 파생되는 물질(oxygen-derived species)이라고도 일컬어지며, 일부는 최외각에 단일 전자를 하나 가지고 있어 반응성이 매우 크기 때문에 라디칼(radical)이라고도 알려져 있다. ROS는 수퍼 옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical; O₂ ^-), 히드록실 라디칼(hydroxyl radical; OH), 퍼옥실 라디칼(peroxyl radical; ROO) 등과 같은 산소 라디칼(radical) 뿐만 아니라, 단일상태산소(singlet oxygen, ¹O₂), 과산화수소(H₂O₂) 등과 같은 비-라디칼(non-radical)을 모두 지칭하는 말로써 그 종류가 매우 다양하다. ROS의 반응시간은 매우 짧지만 반응력은 매우 커서 생체 내에서 각종 단백질의 변성, 지질과 산화, DNA변이 등과 같은 유해한 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

ROS는 정상 대사 과정 중 진핵생물에서는 미토콘드리아, 원핵생물에서는 세포막의 전자전달계에서 전자 수용체로서 작용하고 궁극적으로 물로 환원된다. 이 과정에서 부분적인 산소의 환원에 의해 초과산화물 음이온(superoxide anion), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical), 과산화수소 등의 유해 물질이 생성된다. 세균의 침범에 대항하기 위한 식균 작용의 과정에서도 호중구의 NADPH 산화효소(respiratory burst oxidase)에 의해 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion)이 발생하며, 이 라디칼이 디스뮤타아제(dismutase), 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase)의 작용으로 반응성이 큰 라디칼들을 생성하고, 세포의 발아, 수정, 세포 분화 과정에서도 상당량의 산소 소비량의 증가(respiratory burst)에 수반되는 산소 라디칼의 생성이 보고되고 있다. 또한, 세포막의 산화 손상에 의해 생성되는 ROOH(lipid hydroperoxide)가 미량의 금속이온에 의해 분해되면 퍼옥실 라디칼(peroxyl radical), 알콕시 라디칼(alkoxyl radical), 히드록실 라디칼(hydroxyl radical) 등이 생성되기도 한다.

수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical)은 다른 활성 산소종들이 생기게 되는 핵심요소로서, NADPH 산화효소(NADPH oxidase) 또는 크산틴 산화효소(xanthine oxidase)와 같은 효소에 의해 산소에 전자 하나가 환원되면서 생성된다. 이렇게 생성된 수퍼옥사이드(superoxide)는 특정 효소에 의해서 과산화수소와 물과 산소로 분해된다. 퍼옥실 라디칼(peroxyl radical)은 지질 과산화의 결과 생성되는 것으로, 다른 ROS와 다르게 생물체 내에서 오래 지속하는 성질이 있으며, 단일상태산소는 산소가 빛을 받아 전자기적으로 불안정한 상태로 변형되어 생성된다. 이와 같이 생명체가 살아가는 동안 일어나는 수많은 화학 반응에서 세포에 독성을 나타내는 활성 산소종들이 다량 만들어지는 것으로 알려져 있다. 현재 퇴행성 질병과 노화의 기작에 대한 많은 가설 중 세포 내 활성산소종이 그 발생에 주된 원인이 된다는 것이 많은 지지를 얻고 있다. UV의 경우 피부노화에 매우 밀접한 관련이 있고, 피부암, 홍반, 부종을 일으키는 등 인체에 매우 유해한 반응을 일으킨다.

위와 같은 활성산소는 스트레스, 공해, 흡연, 과음 등에 의해 생성되는 것으로, 피부 표면은 물론, 피부 세포, 콜라겐, 엘라스틴 등에 치명적인 손상을 입힌다. 이렇게 되면 피부 조직이 약해지고, 각질이 두꺼워져 피부가 건조해지고, 면역 기능이 약화하고, 잡티가 생기고, 탄력이 떨어져 결국 주름이 생기게 된다.

멜라닌(melanin)은 페놀류의 생체고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이며, 사람의 피부, 머리카락, 눈 등에서 관찰된다. 멜라닌은 자외선 등에 의한 피부의 광노화나 일광각화증을 억제하고 보호하는 긍정적인 기능이 있는 반면, 색소침착뿐만 아니라 멜라닌 전구물질들에 의한 독성으로 세포의 사멸을 촉진하는 부정적인 기능도 있다.

멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 색소세포(멜라닌 세포) 내의 멜라노솜(melanosome)에서 합성된다. 생성된 멜라닌은 각질형성세포로 전달되어 피부 상피층으로 배출된다. 피부의 과색소침착(hyperpigmentation)은 피부 내 멜라닌 세포에서 엔도셀린(endothelin), UV, α-MSH, NO 등의 여러 요인들에 의해 멜라닌 생성활동이 증가하고 이에 다량의 멜라닌이 축적된 결과이다. 멜라닌의 과색소침착은 기미, 주근깨를 형성하고, 더 나아가서는 피부암을 유발하기도 한다.

멜라닌 합성에 조효소는 티로시나아제이며, 티로시나아제의 활성 억제는 피부 내에서의 멜라닌의 생합성을 효과적으로 저해할 수 있기 때문에 피부미백제의 개발에 있어서 유용한 평가방법으로 인정되고 있다.

이에 본 발명자들은 각질 생성방지 효과, 항노화 효과 및 멜라닌 색소 형성 방지 효과에 대한 기능을 가진 개불의 가능성을 알아보고자, 개불의 추출물을 이용한 실험을 진행함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 해양생물인 개불로부터 각질 생성방지 효과, 항노화 효과 및 멜라닌 색소 형성 방지 효과를 가지는 성분을 추출하여 의약 조성물에 사용할 수 있도록 하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 것으로, 개불 추출물을 유효 성분으로 하는 각질 생성방지, 항노화 효과 및 멜라닌 색소 형성 방지 기능의 의약 조성물을 제공한다.

또한, 상기 개불 추출물은 열수를 이용하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 개불 추출물은 알코올을 이용하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의하면, 해양생물인 개불로부터 각질 생성방지 효과, 항노화 효과 및 멜라닌 색소 형성 방지 효과를 가지는 성분을 추출하여 의약 조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 개불 에탄올 추출물(UNE/E)의 HaCaT 세포에서 세포의 생존율에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 2는 개불 에탄올 추출물(UNE/E)이 UVB으로 유도된 HaCaT의 세포독성에 미치는 보호효과를 나타낸 그래프.
도 3은 개불 에탄올 추출물(UNE/E) 분획물의 UVB으로 유도된 HaCaT의 세포독성에 미치는 보호효과를 나타낸 그래프.
도 4는 노화 세포에서 개불 에탄올/열수 분획물 자체 독성을 나타낸 그래프.
도 5는 노화세포에서 자외선 손상에 대한 개불 에탄올/열수 추출물 분획물의 보호효과를 나타낸 그래프.
도 6은 미백 세포에서 개불 에탄올/열수 추출물 분획물의 자체 독성을 나타낸 그래프.
도 7은 미백 세포에서 자외선 손상에 대한 개불 에탄올/열수 추출물 분획물의 보호 효과를 나타낸 그래프.
도 8은 미백 세포에서 자외선 손상 및 멜라닌 생성에 대한 개불 에탄올/열수 추출물 분획물의 보호 효과를 나타낸 그래프.

본 발명은 개불 추출물을 유효 성분으로 하는 각질 생성방지, 항노화 효과 및 멜라닌 색소 형성 방지 기능의 의약 조성물에 관한 것이다. 상기 각질 생성방지 효과 및 항노화 효과는 통칭하여 항산화 효과의 예라고 할 수도 있다.

이하, 본 발명을 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.

본 발명의 의약 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

삭제

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서, 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서, 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서, 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서, 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위하여 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

< 개불 추출물의 제조 >

(1) 에탄올 추출물의 제조

개불(Urechis unicinctus; 이하 "UNE/E"라 약칭)은 포항 죽도 시장에서 9월, 10, 11월, 12월에 걸쳐 구입하였으며, 개불의 염분을 물로 제거하고 약 7일간 건조한 후, 100% 에탄올을 가하여 상온에서 72시간 동안 추출하였다. 이것을 No.2 여과 종이(filter paper)(Nalgene, New York, NY, USA)로 여과하여, 여액을 진공회전농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축하고, 동결 건조하였으며 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 최종 수율은 3.92%이며, 인비트로(in vitro) 실험시 다이메틸 설폭사이드(DMSO)에 녹여 사용하였다.

(2) 열수 추출물의 제조

개불(Urechis unicinctus; 이하 "UNE/W"라 약칭)은 포항 죽도 시장에서 9월, 10, 11월, 12월에 걸쳐 구입하였으며, 개불의 염분을 물로 제거하고 약 7일간 건조한 후, 물을 가하여 3시간 진탕하였다. 이것을 No.2 여과 종이(Nalgene, New York, NY, USA)로 여과하여, 여액을 진공회전농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축하고, 동결 건조하였으며 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 최종 수율은 4.5%이며, 인비트로 실험시 다이메틸 설폭사이드(DMSO)에 녹여 사용하였다.

[ 실험예 1 : UVB 조사 인체 각질형성세포에서 개불 추출물에 의한 세포보호효과]

< 시약의 준비 >

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoleum (MTT)는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, Dulbecco's modified Eagle's medium/F12 (DMEM/F12), 페니실린, 스트렙토마이신, FBS(fetal bovine 세럼)은 Gibco/BRL(Eggenstein, Germany)에서 구입하였다.

< 세포배양 >

인체 각질형성 세포주인 HaCaT 세포(KCLRF, Seoul, Korea)는 DMEM/F12에 10% FBS 100U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 혼합한 배지를 사용하였고, 37℃, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터(Sanyo, Japan)에서 배양하였다.

< 세포생존율 측정 >

HaCaT 세포를 24 웰 플레이트에 1×10⁴ cells/well로 분주한 다음 24시간 후에 세럼을 포함하지 않는 배지로 교환하여 24시간 동안 배양하였다. 개불 추출물은 0.003, 0.01, 0.03, 0.1 ㎎/㎖로 처리한 다음 12시간 후에 배지 제거 후, PBS로 세척한 후 PBS 200 ㎕를 웰 플레이트에 넣은 다음 UVB를 25 또는 30 mJ/cm²로 조사하였다. UVB(UltraViolet Crosslinker, Cambrodge, England) 조사 후에 PBS를 제거하고 배지로 교환한 후, 개불 추출물을 0.003, 0.01, 0.03, 0.1㎎/㎖로 처리한 다음 24시간 후에 배지를 제거하고 MTT 용액을 넣고 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후 MTT 용액을 제거하고 생성된 포르마잔 결정(formazan crystal)을 DMSO에 녹여 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

< 통계적 검증 >

실험 결과는 평균±S.D로 나타내었으며, 티-테스트(t-test) 방법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였으며, 유의수준은 p < 0.05 미만인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

< 결과 >

개불 에탄올추출물(UNE/E)의 UVB로 유도된 세포독성에 대한 보호효과를 알아보았다.

도 1은 UNE/E의 HaCaT 세포에서 세포의 생존율에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, 도 2는 UNE/E이 UVB으로 유도된 HaCaT의 세포독성에 미치는 보호효과를 나타낸 그래프이다.

UNE/E이 단독적으로 HaCaT 세포에 독성을 유발하는지를 평가하기 위하여 MTT 어세이(assay)를 시행하여 세포생존율을 확인하였다. UNE/E 단독 처리 시 대조군과 비교하여 세포 생존율(cell viability)은 모든 농도에서 독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

HaCaT 세포에서 UVB의 조사에 의한 UNE/E의 세포 보호효과를 관찰하기 위하여 MTT assay를 시행하여 세포생존율을 확인하였다. UVB 단독 조사군은 대조군과 비교하여 UVB 조사에 의해 유의성 있게 세포 생존율이 감소하였고 UNE/E 0.1과 0.3 ㎎/㎖ 처리군에서 유의하게 세포가 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

[ 실험예 2 : UVB 조사 인체 각질형성세포에서 개불 에탄올추출물( UNE /E) 분 획물에 의한 세포보호효과]

도 3은 UNE/E 분획물의 UVB으로 유도된 HaCaT의 세포독성에 미치는 보호효과를 나타낸 그래프이다. HaCaT 세포에서 UVB의 조사에 의한 UNE/E 및 UNE/E 분획물의 세포 보호효과를 관찰하기 위하여 MTT 어세이를 시행하여 세포생존율을 확인하였다. UNE/E 분획물은 개불 에탄올 추출물(UNE/E)의 에틸아세테에트 분획(UNE/E-ethylacetate : UNE/E/Et), 부탄올 분획(UNE/E-butanol : UNE/E/B), 물분획 (UNE/E-H₂O : UNE/E/H)을 사용하였다. UVB 단독 조사군은 대조군과 비교하여 UVB 조사에 의해 유의성 있게 세포 생존율이 감소하였고, UNE/E 0.1 ㎎/㎖ 처리군과 UNE/E/H 0.03, 0.1 ㎎/㎖과 UNE/E/B 0.03 ㎎/㎖ 처리군에서 유의하게 세포가 증가한 것을 확인할 수 있었지만, UNE/E/B 0.1 ㎎/㎖과 UNE/E/Et 0.03, 0.1 ㎎/㎖ 처리군에서는 세포 보호효과를 확인할 수 없었다(도 3 참조). UNE/E/H과 UNE/E/B 처리군에서 세포 보호 효과가 있었지만 UNE/E과 비교하여 높은 세포 보호 효과를 확인할 수 없었다.

[ 실험예 3 : 피부세포 항노화 효능평가]

< 세포배양>

HS68 세포는 10% FBS, 페니실린(10,000 IU/ml) 및 스트렙토마이신(10,000 g/ml)을 포함하는 DMEM 배지를 이용하여, 5% CO₂, 37℃ 배양기를 사용하여 배양하였다. 세포배양 배지는 2일마다 새로운 배지로 갈아주었다. 실험을 위하여 4 × 10⁴개/ 300μl의 세포를 48-웰 플레이트 및 2 × 10⁶개/ 2 ml의 세포를 6-웰 플레이트에 접종한 후, 24시간 뒤 세포가 안정적으로 부착되면 열수 및 에탄올 추출물, 분획물을 처리하였다.

<자외선조사>

자외선 B 조사로 인한 세포독성 및 산화적 세포사멸에 대한 열수 및 에탄올 추출물, 분획물의 보호 효과를 확인하기 위해서 자외선 B를 하기와 같은 조건으로 처리하였다. HS68 세포를 80% 밀도가 되도록 배양한 뒤 배지를 걷어내고 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 1회 세척한 다음 자외선 조사장치(BLX-E254, Viber Lourmat, Paris, France)를 사용하여 120 mJ/cm²의 자외선 B를 조사하였다. 자외선 조사 후 다양한 농도의 열수 및 에탄올 추출물, 분획물을 처리하여 24시간 배양하였다.

<세포생존율 측정(MTT dye reduction assay)

세포 생존율 측정을 위하여 MTT 분석법을 이용하였으며, 이는 노란색의 테트라졸륨(tetrazolium)이 살아있는 세포의 미토콘리아 효소에 의해 보라색의 포르마잔으로 변환되는 것을 측정하는 분석 방법이다. HS68 및 B16 세포를 48-웰 플레이트에 4 × 10⁴개/ 300μl의 세포를 접종한 후 24시간 뒤 세포가 안정적으로 부착되면 열수 및 에탄올 추출물, 분획물을 처리, 또는 자외선 B를 조사한다. 자외선 조사 후 24시간 배양한 다음 MTT(최종 농도 1 mg/ml) 시약을 첨가하여 2시간 동안 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 배양하였다. 상등액을 제거한 후 200 μl DMSO를 가하여 포르마잔을 용해한 다음, 엘리사 리더(Emax, Molecular device, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 추출물 및 분획물을 첨가하지 않은 배지만 넣고 배양한 대조군의 흡광도를 기준으로 세포생존율(%)을 산출하였다.

<미토콘드리아 막전압(mitocondrial transmembrane potential, ΔΨ) 측정>

미토콘드리아 막전압을 측정하기 위하여 TMRE(tetramethylrhodamine ethyl ester) 염료를 사용하였다. 세포(6 x 10⁴개/ 500 μl)를 챔버 슬라이드에 넣고 자외선 B를 조사한 후 열수 추출물을 처리하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 배지를 덜어낸 후 PBS(Phosphate Buffer saline)로 2회 세척한 뒤 10nM TMRE를 가하여 37℃에서 30분간 반응을 시킨 후, 형광의 변화를 여기(excitation) 파장 540 nm 및 방출(emission) 파장 590nm에서 형광 현미경(fluorescence microscopy)으로 측정하였다(SpectraMax Gemini XS, Molecular Device).

<세포 내 활성산소종 생성 측정>

세포 내에 생성되는 활성산소는 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(H₂DCF-DA)를 사용하여 측정하였다. H₂DCF-DA는 지용성 물질로 세포 내로 쉽게 투과되며 에스터라아제(esterase)에 의해 아세틸기가 가수분해되어 수용성인 HDCF가 활성산소와 반응하여 형광을 띠는 DCF을 생성하며, 이 형광감도를 측정함으로써 활성산소 생성량을 측정할 수 있다. 활성산소의 측정을 위하여 HS68 세포에 120mJ 강도의 UVB를 조사한 후 열수 추출물을 처리하여 3시간 배양한 다음 50μM H₂DCF-DA을 처리하여 37℃에서 20분간 배양하였다. 20분 뒤 PBS로 세척한 다음, DMSO를 사용하여 세포를 용해시켜 형광의 변화를 여기 파장 485nm 및 방출 파장 535nm에서 형광 현미경으로 측정하였다(SpectraMax Gemini XS, Molecular Device).

Total RNA의 추출은 인비트로젠(Invitrogen)사의 TRIzol Reagent(Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 제시된 방법에 따라 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA로부터 cDNA 합성은 M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 합성하였으며, 항산화 효소들의 유전자 발현을 비교 측정하기 위하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 진행한 후 95℃에서 30초, 53 ~ 61℃에서 1분, 72℃에서 1분을 40 사이클 수행한 후 72℃ 5분간 더 반응시켰다. 각 PCR 산물들은 에디티움 브로마이드(edithium bromide)를 포함하고 있는 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에서 50V로 전기영동한 후, BIO-RAD사의 이미지 분석 장비(Gel Doc XR System, Hercules, CA, USA)를 사용하여 항산화 효소의 유전자 발현을 측정하였으며, Quantity One Software(BIO-RAD)를 이용하여 정량분석하였다. 실험에 사용된 각 항산화 효소(표 1) 및 노화관련 단백질(표 2)의 특정 프라이머(primer) 서열은 하기의 표와 같다.

< 결과 >

자외선 B로 인한 세포 손상에 대한 개불 추출물의 보호 효과를 알아보았다. 도 4는 노화 세포에서 개불 에탄올/열수 분획물의 자체 독성을 나타낸 그래프이고, 도 5는 노화세포에서 자외선 손상에 대한 개불 에탄올/열수 추출물 분획물의 보호효과를 나타낸 그래프이다.

자외선 B로 유도된 섬유아세포의 산화적 손상 및 독성에 대한 개불 추출물의 보호효과를 검토하기 위하여, 우선 개불 추출물을 단독으로 처리하고 세포생존에 미치는 영향을 살펴보았다. 개불 에탄올 추출물(UNE/E)의 에틸아세테에트 분획(UNE/E-ethylacetate : UNE/EEt), 부탄올 분획(UNE/E-butanol : UNE/EB), 물분획 (UNE/E-H₂O : UNE/EH), 개불 열수 추출물(UNE/W)의 부탄올 분획(UNE/W-butanol : UNE/WB), 물분획 (UNE/W-H₂O : UNE/WH)의 효능을 검토하였다. 다양한 농도의 개불분획물(0, 10, 30, 100 μg/ml)을 HB86 세포주에 24시간 동안 처리하고 MTT reduction assay로 세포생존 정도를 정량하였다(도 4 참조).

개불 추출물이 자체 독성을 나타내지 않는 농도에서 자외선 B를 조사하여 세포독성에 미치는 보호효과를 검토하였다. 자외선 B를 조사한 경우 세포생존율이 68% 정도로 감소하였으며, 개불 에탄올 추출물(UNE/E) 에틸아세테이트 및 부탄올 분획(UNE/EEt 10 μg/ml 및 UNE/EB 30 μg/ml)을 함께 처리한 그룹에서 세포생존율이 각각 79.7, 83.8%로 증가함을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

[ 실험예 4 : 피부 멜라닌 생성 억제 효능평가]

<세포배양>

B16 세포는 10% FBS, 페니실린(10,000 IU/ml) 및 스트렙토마이신(10,000 g/ml)을 포함하는 DMEM 배지를 이용하여, 5% CO₂, 37℃ 배양기를 사용하여 배양하였다. 세포배양 배지는 2일마다 새로운 배지로 갈아주었다. 실험을 위하여 4 × 10⁴개/ 300 μl의 세포를 48-웰 플레이트 및 2 × 10⁶개/ 2 ml의 세포를 6-웰 플레이트에 접종한 후, 24시간 뒤 세포가 안정적으로 부착되면 열수 및 에탄올 추출물, 분획물을 처리하였다.

<α-MSH 처리 및 자외선 조사>

α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone) 처리 및 자외선 B 조사로 인한 멜라닌 생성 대한 열수 및 에탄올 추출물, 분획물의 억제 효과를 검토하기 위해서 α-MSH를 50nM의 농도로 열수 및 에탄올 추출물, 분획물과 함께 24시간 처리한 뒤 자외선 B를 하기와 같은 조건으로 처리하였다. 24시간 뒤 배지를 걷어내고 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 1회 세척한 다음 자외선 조사장치(BLX-E254, Viber Lourmat, Paris, France)를 사용하여 30 mJ/cm²의 자외선 B를 조사하였다. 자외선 조사 후 열수 및 에탄올 추출물, 분획물을 처리하여 18시간 더 배양하였다.

<세포생존율 측정(MTT dye reduction assay)>

세포 생존율 측정을 위하여 MTT 분석법을 이용하였으며, 이는 노란색의 테트라졸리움이 살아있는 세포의 미토콘리아 효소에 의해 보라색의 포르마잔으로 변환되는 것을 측정하는 분석 방법이다. HS68 및 B16 세포를 48-웰 플레이트에 4 × 10⁴개/ 300μl의 세포를 접종한 후 24시간 뒤 세포가 안정적으로 부착되면 열수 및 에탄올 추출물, 분획물을 처리, 또는 자외선 B를 조사한다. 자외선 조사 후 24시간 배양한 다음 MTT(최종 농도 1 mg/ml) 시약을 첨가하여 2시간 동안 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 배양하였다. 상등액을 제거한 후 200 μl DMSO를 가하여 포르마잔을 용해한 다음, 엘리사 리더(Emax, Molecular device, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 추출물 및 분획물을 첨가하지 않은 배지만 넣고 배양한 대조군의 흡광도를 기준으로 세포생존율(%)을 산출하였다.

<멜라닌 생성 측정 >

B16 흑색종 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 1 x 10⁵cells/well이 되도록 6-웰 플레이트에 깐 다음 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 α-MSH를 50nM의 농도로 열수 및 에탄올 추출물, 분획물과 함께 가하여 24시간 동안 더 배양하였다. 24시간 후 배지를 걷어내고 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 1회 세척한 다음 자외선 조사장치(BLX-E254, Viber Lourmat, Paris, France)를 사용하여 30mJ/cm²의 자외선 B를 조사하였다. 자외선 조사 후 열수 및 에탄올 추출물, 분획물을 처리하여 18시간 더 배양하였다. 배양액에 생성된 멜라닌 및 세포 내에 생성된 멜라닌을 405nm에서 흡광도를 엘리사 리더(Emax, Molecular device, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 세포 내 생성된 멜라닌 측정을 위하여 배양액을 제거하고 10% DMSO가 함유된 1N NaOH 용액을 가하여 50℃ 항온조에서 1시간 동안 배양하여 멜라닌을 용해시켰으며, 멜라닌 표준 정량곡선을 이용하여 멜라닌 양을 구한 다음 총 단백질로 보정하였다.

전체 RNA의 추출은 인비트로젠(Invitrogen)사의 TRIzol Reagent(Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 제시된 방법에 따라 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA로부터 cDNA 합성은 M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 합성하였으며, 멜라닌 합성 관련 효소들의 유전자 발현을 비교 측정하기 위하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 진행한 후 95℃에서 30초, 53 ~ 61℃에서 1분, 72℃에서 1분을 40 사이클 수행한 후, 72℃에서 5분간 더 반응시켰다. 각 PCR 산물들은 에디티움 브로마이드(edithium bromide)를 포함하고 있는 1.5% 아가로스 겔에서 50V로 전기영동한 후, BIO-RAD사의 이미지 분석(Gel Doc XR System, Hercules, CA, USA) 장비를 사용하여 항산화 효소의 유전자 발현을 측정하였으며, Quantity One Software(BIO-RAD)를 이용하여 정량분석하였다. 실험에 사용된 각 미백 관련 효소의 특정 프라이머(primer) 서열은 하기의 표 3과 같다.

< 결과 >

도 6은 미백 세포에서 개불 에탄올/열수 분획물의 자체 독성을 나타낸 그래프이고, 도 7은 미백 세포에서 자외선 손상에 대한 개불 에탄올/열수 분획물의 보호 효과를 나타낸 그래프이고, 도 8은 미백 세포에서 자외선 손상 및 멜라닌 생성에 대한 개불 에탄올/열수 분획물의 보호 효과를 나타낸 그래프이다.

자외선 B로 유도된 멜라노사이트(melanocytes)의 세포독성 및 멜라닌 생성에 대한 개불 추출물의 보호효과를 검토하기 위하여, 우선 개불 추출물을 단독으로 처리하고 세포생존에 미치는 영향을 살펴보았다. 다양한 농도로 분획물(0, 10, 30, 100 μg/ml)을 B16 세포주에 48시간 동안 처리하고 MTT reduction assay로 세포생존 정도를 정량하였다(도 6 참조).

이를 바탕으로 개불 추출물이 자체 독성을 나타내지 않는 농도에서 자외선 B를 조사하여 세포독성에 미치는 보호효과를 검토하였다. 자외선 B를 조사한 경우 세포생존율이 66.3%로 감소하였으며, 개불 에탄올 추출물(UNE/E) 에틸아세테이트 분획(UNE/EEt 30 μg/ml)을 함께 처리한 그룹에서 세포생존율이 각각 78.8%로 증가함을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

이후 실험에서는 개불 추출물이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 B16 세포를 이용하여 멜라닌 양을 측정하였다. α-MSH를 24시간 처리한 다음 자외선 B를 30 mJ로 조사한 경우 배지 내 멜라닌 함량이 388.9% 정도로 증가하였으며, 이는 개불 에탄올 추출물 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획(UNE/EEt, UNE/EB, UNE/EH)을 함께 처리한 그룹에서 각각 166.7%로 감소함을 확인할 수 있었다(도 8 참조). 개불은 자외선 B로 인한 세포 독성 및 멜라닌 생성에 대해서 강력한 보호 효능을 나타내었다.

본 발명은 개불 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 개불 추출물은 각질 생성방지 효과, 항노화 효과 및 멜라닌 색소 형성 방지 효과를 나타냄을 확인함으로써, 피부 노화방지, 미백 또는 각질 제거용 피부 외용 약학 조성물 및 화장료 조성물로 이용될 수 있다.

Claims

개불 추출물을 유효 성분으로 하는 각질 생성방지, 항노화 효과 및 멜라닌 색소 형성 방지 기능의 의약 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 개불 추출물은 열수를 이용하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 개불 추출물은 알코올을 이용하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
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