JP7470270B2

JP7470270B2 - メラノソーム輸送阻害剤及び該輸送阻害剤を含有する皮膚外用剤

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Publication number: JP7470270B2
Application number: JP2020012664A
Authority: JP
Inventors: 久美子中村; 嵩久仲條; 健史片吉; 健太郎内藤
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Priority date: 2020-01-29
Filing date: 2020-01-29
Publication date: 2024-04-18
Anticipated expiration: 2040-01-29
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Description

本発明は、メラノソーム輸送阻害剤及び該輸送阻害剤を含有する皮膚外用剤に関する。

皮膚のシミ及びソバカスは、紫外線等の刺激、ホルモンの異常又は遺伝的要素等の原因により表皮の基底膜に局在するメラノサイトが異常活性化して過剰なメラニン色素を合成し、そのメラニン色素が皮膚内に異常沈着することにより生じる（非特許文献１）。そのため、メラノサイト内におけるメラニン合成を阻害することに主眼を置いた研究、治療等が従来から行われている。

メラニンは、メラノサイトの細胞内のメラノソームと呼ばれる細胞内小器官で生成される。生成されたメラニンが蓄積することで黒色化したメラノソームは、種々の輸送関連タンパク質によりメラノサイトの核周辺から樹状突起の末端へと輸送され、周りの表皮細胞へ受け渡される。通常、受け渡されたメラノソームは表皮細胞のターンオーバーとともに体外へ排出される。一方、紫外線等の強い刺激はメラノソームへ表皮細胞への過剰蓄積を誘発し、シミと呼ばれる色素沈着を生じさせる。

近年、メラノソームの細胞内輸送は、様々なタンパク質により制御されることが報告されている（非特許文献２）。
また、そうしたメラノソームの細胞内輸送に関わるタンパク質の特定が進む中、それらのタンパク質を量的に低減させる化合物がメラノソームの表皮細胞への過剰蓄積を抑制することから皮膚に対する美白効果に役立つことが報告されている。例えば、低分子量Ｇタンパク質であるＲａｂ２７aの不活性化剤（特許文献１）、Ｒａｂ２７ａのエフェクターと呼ばれる結合分子であるＳｌｐ－２ａ（特許文献２）及びｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｈｏｍｏｌoｇｕｅｌａｃｋｉｎｇＣ２ｄｏｍａｉｎｓ－ａ（Ｓｌａｃ２－ａ、別名：Ｍｅｌａｎｏｐｈｉｌｉｎ、Ｍｌｐｈ）（特許文献３）に対するタンパク質量低減剤等が挙げられる。

本発明者らは、前記した先行する研究成果を踏まえ、皮膚に対する美白効果を備える活性化合物について鋭意検討を行って来た。

特開２００７－１３７８２１号公報特開２０１０－２２９０４３号公報特開２０１１－１３２１９５号公報

Prota, G. J., Invest. Dermatol. (1980), 75: 122-127. Kuroda, T. S et al., Nat. Cell Biol. (2004), 6: 1195-1203. Goda, Y et al., Biol.Pherm.Bull. (1999), 12:1319-1326．

本発明は、高い美白効果を備えたメラノソーム輸送阻害剤及びこれを含有する皮膚外用剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行って来た結果、フラボノール類に分類されるラムナジンがメラノソーム輸送を有効に阻害することを見出した。本発明者らは、この知見に基づいて検討を進め、ラムナジンが高い美白効果を有することに想到した。

本発明は、以下の化学式（Ｉ）で表されるラムナジンを有効成分として含有することを特徴とするメラノソーム輸送阻害剤（第１のメラノソーム輸送阻害剤）を提供する。

前記ラムナジンは、天然のラムナス・ペティオラリス（Ｒｈａｍｎｕｓｐｅｔｉｏｌａｒｉｓ）やラムナス・サクサティリス（Ｒｈａｍｎｕｓｓａｘａｔｉｌｉｓ）などラムナス（Ｒｈａｍｎｕｓ）属の植物由来物又は有機合成物であることが好適である。

また、本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行って来た結果、特に、ラムナジンを豊富に含有する特定の植物等に由来する抽出物の加水分解物（第２のメラノソーム輸送阻害剤）が、より高い美白効果を有することに想到した。

すなわち、本発明の第２のメラノソーム輸送阻害剤は、オランダガラシ（Ｎａｓｔｕｒｉｔｉｕｍｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）を含むナスツリチウム（Ｎａｓｔｕｒｉｔｉｕｍ）属、ラムナス・サクサイリス（Ｒｈａｍｎｕｓｓａｘａｉｌｉｓ）を含むラムナス（Ｒａｍｎｕｓ）属、ビスカム・コロラツム（Ｖｉｓｃｕｍｃｏｌｏｒａｔｕｍ）を含むビスカム（Ｖｉｓｃｕｍ）属、ネルビィア・フォルジイ（Ｎｅｒｖｉｌｉａｆｏｒｄｉｉ）を含むネルビリア（Ｎｅｒｖｉｌｉａ）属又はクローブ（Ｓｙｚｙｇｉｕｍａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）を含むシジギウム（Ｓｙｚｙｇｉｕｍ）属の植物等に由来する抽出物の加水分解物であることが好適である。

第２のメラノソーム輸送阻害剤は、原料となる植物から溶媒抽出等によって抽出したエキスを加水分解処理することで得ることができる。

また、本発明では、前記第１又は第２のメラノソーム輸送阻害剤を含有する皮膚外用剤を提供する。皮膚外用剤に含まれるラムナジンの濃度は、０．０００１～５質量％であることが好適である。
前記皮膚外用剤は、メラノソーム輸送阻害作用を有さない美白剤をさらに含有することが好適である。
前記美白剤は、チロシナーゼ活性阻害剤であることが好適である。
前記チロシナーゼ活性阻害剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩及びその誘導体、ハイドロキノン、ハイドロキノンの塩及び配糖体、プラセンタエキス、アルブチン、エラグ酸、リノール酸、又はトラネキサム酸からなる群から選択されることが好適である。

本発明によれば、高い美白効果を備えたメラノソーム輸送阻害剤及びこれを含有する皮膚外用剤が提供される。

オランダガラシ抽出液で処理した細胞について、加水分解操作前の抽出液を用いて処理した細胞と、加水分解操作後の抽出液で処理した細胞を比較して示す顕微鏡写真（倍率：２００）である。実施例１で得られた溶液の加水分解処理前後の配糖体とアグリコンの割合を示すグラフである。各種フラボノールのＭｌｐｈタンパク質発現に対する抑制効果を検証した結果を示すグラフである。ラムナジンの細胞毒性についての検証結果を示すグラフである。ラムナジンのメラノソームの細胞内輸送に対する阻害効果の検証結果に関し、位相差顕微鏡による細胞の観察結果を示す顕微鏡写真（倍率：２００）である。（ａ）は、ラムナジン未添加、（ｂ）は、５μＭ添加、（ｃ）は、１０μＭ添加のものをそれぞれ示す。ラムナジンのメラノソームの細胞内輸送に対する阻害効果の検証結果に関し、共焦点レーザー顕微鏡による細胞の観察結果を示す顕微鏡写真（倍率：２５０）である。（ａ）は、ラムナジン未添加、（ｂ）は、１０μＭ添加のものをそれぞれ示す。共焦点レーザー顕微鏡による観察結果に基づき、メラノソームが核近傍に凝集している細胞が占める割合を算出した結果を示すグラフである。ラムナジンのメラニン色素の細胞外への排出に対する抑制効果の検証結果を示すグラフである。ラムナジンのメラニン合成関連タンパク質の発現に対する抑制効果についての検証結果を示すグラフである。ラムナジンと他の薬剤との併用による相乗効果についての検証結果を示すグラフである。

以下に、本発明を実施するための形態についてさらに詳細に説明する。
第１のメラノソーム輸送阻害剤
前述のように、本発明者らは、フラボノール類に分類されるラムナジンがメラノソーム輸送を有効に阻害することを見出した。本発明者らは、この知見に基づいて検討を進め、ラムナジンが高い美白効果を有することを検証した。

本発明に係る第１のメラノソーム輸送阻害剤は、以下の化学式（Ｉ）で表されるラムナジンを有効成分として含有する。

ラムナジンは、天然物由来のものとしては、ラムナス・ペティオラリス（Ｒｈａｍｎｕｓｐｅｔｉｏｌａｒｉｓ）やラムナス・サクサティリス（Ｒｈａｍｎｕｓｓａｘａｔｉｌｉｓ）などラムナス（Ｒｈａｍｎｕｓ）属（別名：クロウメモドキ属）の植物由来であることが好適である。ラムナス・ペティオラリスおよびラムナス・サクサティリスは、スリランカ及びヨーロッパ固有のクロウメモドキ属植物である。特にラムナス・サクサティリスはラムナジンを高含有し、より少量の抽出物から多くのラムナジンを得ることができる点で優れている。

本発明に係る第１のメラノソーム輸送阻害剤は、例えば、ラムナス・ペティオラリス若しくはラムナス・サクサティリスなどラムナス（Ｒｈａｍｎｕｓ）属の植物の全草、根、根茎、葉、種子、果実、花を微粉末又は破砕したものとして調製することができる。
本発明に係る第１のメラノソーム輸送阻害剤は、このような微粉末又は破砕物を水若しくは有機溶媒で浸漬抽出し、残渣を濾別して得られる抽出液、この抽出液から溶媒を除去したもの（抽出したエキス）として調製することもできる。
本発明に係る第１のメラノソーム輸送阻害剤は、前記微粉末、溶媒除去物を適当な溶媒等でさらに溶解、分散、希釈することにより溶液の形態として調製することもできる。

溶媒で抽出する際の抽出溶媒としては、メタノールやエタノール等のアルコール、又は１，３－ブチレングリコール等の低極性溶媒を用いることが好ましい。このような抽出溶媒であれば、所望の抽出物を得ることができるからである。

本発明に係る第１のメラノソーム輸送阻害剤に含まれるラムナジンは、有機溶媒による抽出に加え又は代替として、濾過又は遠心分離による固形物の除去を行い、シリカゲルカラム、ＨＰＬＣ等のクロマトグラフィー法による精製過程を経て精製することができる。

ラムナジンは、有機合成反応を利用することによっても得ることができる。このような各種合成よって得られるラムナジン（合成ラムナジン）についても、本発明に係るメラノソーム輸送阻害剤の有効成分として含有させることができる。

本発明のメラノソーム輸送阻害剤について、「有効成分としてラムナジン」を含有するとは、有効成分であるラムナジン単体のみから成るメラノソーム輸送阻害剤の場合及びラムナジン単体の他、痕跡程度の不純物を含む場合、さらには、前述したように植物の全草、根、根茎、葉、種子、果実、花を微粉末又は破砕したものの場合、微粉末又は破砕物を水若しくは有機溶媒で浸漬抽出し、残渣を濾別して得られる抽出液の場合、この抽出液から溶媒を除去したもの（抽出したエキス）の場合、さらには、前記微粉末、溶媒除去物を適当な溶媒等でさらに溶解、分散、希釈することにより溶液の形態として調製した場合のいずれであってもよい。

本発明のメラノソーム輸送阻害剤（後述する第２のメラノソーム輸送阻害剤も含む。）を溶液の形態で調製する場合、ラムナジンを０．０００１質量％～５質量％の割合で含むことが好適である。

第２のメラノソーム輸送阻害剤
前述のように、本発明者らは、ラムナジンを豊富に含有する特定の植物等の天然由来物の加水分解物が高い美白効果を有することに想到した。

本発明に係る第２のメラノソーム輸送阻害剤も、前記化学式（Ｉ）で表されるラムナジンを有効成分として含有する。
第２のメラノソーム輸送阻害剤は、オランダガラシ（Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）を含むナスツリチウム（Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ）属、ラムナス・サクサティリス（Ｒｈａｍｎｕｓｓａｘａｔｉｌｉｓ）を含むラムナス（Ｒｈａｍｎｕｓ）属、ビスム・コロラツム（Ｖｉｓｃｕｍｃｏｌｏｒａｔｕｍ）を含むビスカム（Ｖｉｓｃｕｍ）属、ネルビィア・フォルジイ（Ｎｅｒｖｉｌｉａｆｏｒｄｉｉ）を含むＮｅｒｖｉｌｉａ属又はクローブ（Ｓｙｚｙｇｉｕｍａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）を含むシジギウム（Ｓｙｚｙｇｉｕｍ）属の植物等に由来する天然由来物の加水分解物であることが好適である。

第２のメラノソーム輸送阻害剤は、原料となる植物から溶媒抽出等によって抽出したエキスを加水分解処理することで得ることができる。
例えば、前記オランダガラシエキス等の植物の地上部を凍結乾燥したものをメタノール等の溶媒に浸漬し、抽出液を得、その後、抽出液を濃縮し、得られた濃縮液をカラム精製し、メタノール等の溶媒で溶出して得られるフラクションを酸加水分解するといった工程を含む操作を行う。これによって、オランダガラシ等の加水分解溶液として、第２のメラノソーム輸送阻害剤を調製することができる。
前記したように、第１のメラノソーム輸送阻害剤は、原料となる植物から溶媒抽出等によって抽出したエキスの形態として調製する場合も含む。第２のメラノソーム輸送阻害剤は、このような抽出エキスを加水分解処理する、より正確にはこのような抽出エキスに含まれるフラボノイド配糖体を加水分解処理することにより得ることができる。

さらに、本発明者らは、ラムナジンが有する高い美白効果のメカニズムを調査したところ、ラムナジンの添加によりメラノソームの輸送に関連するＭｌｐｈタンパク質量が低減したことから、メラノサイト中におけるメラノソーム輸送を阻害することにより、強い美白効果を奏することに想到した。Ｍｌｐｈタンパク質は、メラノサイト中におけるメラノソーム輸送に関与するタンパク質である。このメラノソームの輸送が阻害されると、メラノサイトで生成したメラニンを、ケラチノサイトに受け渡すことが阻害されるため、肌の色素沈着を抑制することができる。

一方、従来の美白剤、コウジ酸、アルブチンには、メラノソーム輸送阻害作用がないことを本発明者らは確認している。
したがって、本発明のメラノソーム輸送阻害剤に基づく肌の色素沈着を抑制する効果は、従来のコウジ酸やアルブチン等を含有する美白用化粧料が奏する美白効果（メラニンの合成抑制効果）とは作用機序の点で異なるものである。

ラムナジンを含む本発明のメラノソーム輸送阻害剤を、メラノソーム輸送阻害作用を有さない他の美白剤と併用することにより、当該他の美白剤を単独で使用するよりも美白効果をさらに高める相乗効果を奏することができる。
前記メラノソーム輸送阻害作用を有さない美白剤としては、好ましくはメラニン合成を阻害するチロシナーゼ活性阻害剤である。一般的に用いられる美白剤のうち、そのほとんどがチロシナーゼ活性阻害剤である。同じ作用機序に基づき同様の働きをする美白剤、例えばチロシナーゼ活性阻害剤を複数又は多量に配合しても、美白効果は高まりにくく、また、その効果に対する安全性の面からも不安がある。しかし、上述したように作用機序が異なり、例えば肌の色素沈着の過程における異なる段階、異なる箇所に作用する美白剤、すなわち、チロシナーゼ活性阻害剤とメラノソーム輸送阻害剤を組み合わせることによって、それぞれを少量ずつ用いることによっても高い美白効果を奏し、かつ、優れた安全性をも提供することが可能となる。

チロシナーゼ活性阻害剤としては、特に限定されるものではなく、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩及びその誘導体、ハイドロキノン、ハイドロキノンの塩及び配糖体、プラセンタエキス、アルブチン、エラグ酸、リノール酸、又はトラネキサム酸等が挙げられる。

皮膚外用剤
本発明に係る皮膚外用剤は、前記第１又は第２のメラノソーム輸送阻害剤を含有する。本発明に係る皮膚外用剤は、皮膚外用剤全量に対して、ラムナジンを好ましくは０．０００１～５質量％含有する。少なくとも０．０００１質量％含有していれば、メラノソーム輸送阻害効果が最小限得られる濃度に相当するからであり、５質量％以下であれば、メラノソーム輸送阻害効果が得られ、かつ安全性も得られるからである。

本発明のメラノソーム輸送阻害剤は、化粧料、医薬品、医薬部外品など外皮に適用される皮膚外用剤として用いることができる。したがって、その剤型として水溶性系（ローション系）、可溶化系、乳化系（Ｗ／Ｏ型、Ｏ／Ｗ型）、粉末系、軟膏系、油液系、ジェル系、水－油二層系、水－油－粉末三層系など幅広い形態に使用することができる。また、本発明の皮膚外用剤は、前記メラノソーム輸送阻害剤の他に、本発明の効果を損なわない範囲で、皮膚外用剤に通常用いられる他の成分、例えば、水、アルコール、油剤、界面活性剤、増粘剤、粉体、キレート剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、各種薬効剤、動植物、微生物由来の抽出物、色素、香料等を、必要に応じて適宜、配合することができる。また、抗酸化剤、細胞賦活剤、抗炎症剤、紫外線防止剤等の薬効成分を併用することにより、本発明の効果をさらに高めたり、若しくは他の効果をさらに付加したりすることもできる。

本発明の皮膚外用剤の剤型としては、例えば、ローション、油剤、乳剤、クリーム、軟膏等が挙げられる。また、乳液、クリーム、化粧水、美容液、シート状マスク、洗浄料、メーキャップ化粧料等の様々な形態の化粧料として提供することも可能である。

本発明に係る皮膚外用剤は、メラノソーム輸送阻害作用を有さない美白剤をさらに含有することができる。このような美白剤としては、上述したようなチロシナーゼ活性阻害剤を用いることができる。ラムナジンを含む本発明のメラノソーム輸送阻害剤と、メラノソーム輸送阻害作用を有さない他の美白剤とを含有する皮膚外用剤は、当該他の美白剤のみを含有する皮膚外用剤よりも美白効果をさらに高める相乗効果を奏することができる。

以上のように、本発明の皮膚外用剤は、ラムナジンがメラノソーム輸送阻害剤の有効成分として作用し、特に美肌等を目的とした美白用化粧品として有効である。

以下、実施例、製剤例等を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１
オランダガラシ（クレソン）地上部を凍結乾燥したものをメタノールに浸漬し、一晩室温にて振とうして抽出液を得た。その後、エバポレーターで抽出液を濃縮した。得られた濃縮液をＨＰ－２０カラムで精製し、メタノール溶出によりフラボノイド類の含有量の高いフラクションを得た。同フラクションをエバポレーターで濃縮後、６規定の塩酸を加え１００度で９０分間加熱することで酸加水分解を行った。反応後、水酸化ナトリウムにて中和を行い、酢酸エチルにて抽出を行った。得られた抽出物をエバポレーターで濃縮後、メタノールに再溶解して得られた溶液をオランダガラシ抽出物の加水分解溶液として調製した。
一方、前記フラクションをエバポレーターで濃縮後、酸加水分解を行わず、他の操作を同様に行ったものをオランダガラシ抽出液として調製した。
マウスＢ１６メラノーマ細胞を１０％ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）含有のＤ－ＭＥＭ培地にて２４時間プレ培養した。プレ培養後、実施例１で得られたオランダガラシ抽出液（加水分解前）あるいはオランダガラシ抽出物の加水分解溶液（加水分解後）を最終濃度が所定の濃度となるように添加してさらに７２時間培養した。培養終了後、位相差顕微鏡にて細胞形態の観察を行った。
結果を図１に示す。オランダガラシ抽出液（加水分解処理前）は、５．０%の濃度でメラノソームの輸送阻害が見られた。この結果から、オランダガラシ抽出物にはメラノソームの輸送に対する阻害効果があることから明らかとなった。また、オランダガラシ抽出物の加水分解後の溶液では０．５%の濃度で同効果が得られることが明らかとなった。この結果から、オランダガラシ抽出物を加水分解処理することで同効果が増幅することが示された。
オランダガラシ（クレソン）はラムナジン、ラムネチン、イソラムネチン、ケンフェロール、ケルセチンといったフラボノール類の配糖体を含有することが知られている（非特許文献３）。また、加水分解処理によってより強い阻害効果が得られることから、オランダガラシ抽出物に含まれるフラボノール配糖体が加水分解によってアグリコンに変換されることに起因している可能性を想起した。
実際、図２はフラボノール配糖体とアグリコンとの分布を示した結果である。加水分解によってフラボノール類のアグリコンの量が増加していることが了解される。

実施例２
（評価１：各種フラボノールのＭｌｐｈタンパク質の発現に対する抑制効果についての検証）
Ｍｌｐｈタンパク質は、メラノソームを細胞内輸送する際に中心的に働くタンパク質として知られている。実施例１により得られた加水分解処理後の溶液にはラムナジン、ラムネチン、イソラムネチン、ケンフェロール、ケルセチンのアグリコンが主成分として含まれていることが想起された。そこで、これらのフラボノールが色素細胞におけるＭｌｐｈの発現に及ぼす影響を調べるために、抗Ｍｌｐｈ抗体を用いてウェスタンブロッティング法を行った。なお、各種フラボノール類は市販の精製品をジメチルスルホキシドに溶解して使用した。

マウスＢ１６メラノーマ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＤ－ＭＥＭ培地にて２４時間プレ培養した後、各種フラボノールの最終濃度がそれぞれラムナジン１０μＭ、ラムノシトリン２５μＭ、ラムネチン５μＭ、イソラムネチン５０μＭ、ケンフェロール２０μＭ、ケルセチン５０μＭとなるように添加して培養した。なお、各種フラボノールの最終濃度の設定にあたっては、あらかじめ各フラボノールの細胞毒性試験を行い、細胞生存率が８０％以上となる最大濃度を採用する形で進めた。３日間の培養後、細胞はＰＢＳで３回洗浄し、細胞溶解用の緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ－４０、１％ｓｏｄｉｕｍｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及びプロテアーゼ阻害剤）により溶解させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝液で希釈した試料は５分間煮沸させた。試料は、１０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離させ、セミドライブロッター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いてＰｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜（ＰＶＤＦ膜）に転写した後、５％スキムミルクのリン酸緩衝液中で１時間室温にてブロッキングを行った。ＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ－Ｔにて３回洗浄した後、抗Ｍｌｐｈ抗体と共に４℃で一晩インキュベートさせた。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ－Ｔにて３回洗浄した後、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅで標識された２次抗体と共にさらに１時間インキュベートさせた。検出する前にＴＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＭａｘｉｍｕｍＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＳｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモサイエンティフィック社製）及びＬＡＳ－３０００を用いて検出を行った。Ｍｌｐｈタンパク質の量的評価は、検出されたバンドの濃さを未添加試料のバンドと比較することで行い、各種フラボノイドがＭｌｐｈタンパク質の発現に及ぼす影響を評価した。なお、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇａｐｄｈ）は標準タンパク質として同様に検出した。

結果を図３に示す。ラムナジン以外のフラボノールはＭｌｐｈタンパク質の発現に対してほとんど影響しなかったのに対し、ラムナジンはＭｌｐｈタンパク質の発現を顕著に減少させた。この結果から、ラムナジンは色素細胞のＭｌｐｈタンパク質の発現を抑制する効果があることが示され、オランダガラシ抽出物の加水分解液の有効成分であることが明らかとなった。

実施例３
（評価２：ラムナジンの細胞毒性についての検証）
ラムナジンの色素細胞に対する毒性を評価するために、同仁化学社製のセルカウンティングキット－８を使用して細胞毒性試験を行った。

マウスＢ１６メラノーマ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＤ－ＭＥＭ培地にて２４時間プレ培養した後、最終濃度がそれぞれ５及び１０μＭとなるようにラムナジンを添加し、さらに３日間培養した。培養終了後、同仁化学社製のセルカウンティングキット－８を用いて付随のマニュアルに従って細胞の生存率を算出した。

結果を図４に示す。ラムナジンを５及び１０μＭの添加濃度においてはほとんど低下が見られなかった。この結果から、ラムナジンは１０μＭ以下の濃度であれば細胞毒性の基準である細胞生存率８０％以上をクリアすることが明らかとなり、同濃度の範囲であれば細胞毒性がないことが示された。

実施例４
（評価３：ラムナジンのメラノソームの細胞内輸送に対する阻害効果についての検証）
評価１の結果から、ラムナジンは色素細胞のＭｌｐｈタンパク質の発現を抑制することが明らかとなった。同タンパク質は色素細胞内において産生されたメラノソームを細胞内輸送する際に中心的に働くタンパク質であることから、ラムナジンはメラノソームの細胞内輸送を阻害する効果を有している可能性が考えられた。そこで、ラムナジンが色素細胞におけるメラノソームの細胞内輸送に対して阻害効果を持つのか否かについて検証するために、位相差顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡による細胞形態の観察並びにメラノソームが核近傍に凝集している細胞が占める割合の算出を行った。

マウスＢ１６メラノーマ細胞をあらかじめコラーゲンコートカバーグラスを入れた培養ディッシュに播種し、Ｄ－ＭＥＭで２４時間のプレ培養を行った。プレ培養後、最終濃度が所定の濃度となるようにラムナジンを添加し、さらに７２時間培養した。培養終了後、位相差顕微鏡にて細胞形態の観察を行った。また、回収したカバーガラスは４％パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝液に入れ、室温にて１５分間放置することで細胞固定を行った。カバーガラスはＰＢＳで３回洗浄した後、０．１％の濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有するＰＢＳに入れ、室温にて１０分間放置することで透過処理を行った。ＰＢＳで３回洗浄した後、３％のウシ血清アルブミン含有のＰＢＳに入れ、室温にて１時間放置することでブロッキングを行った。細胞骨格であるアクチンの染色を行うために、ＰＢＳで３回洗浄した後、０．０１％のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４標識ファロイジン含有のＰＢＳに入れて２０分間放置した。次に、核の染色を行うために、ＰＢＳで３回洗浄した後、２μｇ／ｍｌの４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）含有のＰＢＳに入れて３分間放置した。ＰＢＳで３回洗浄した後、フルオロマウント（ダイアグノスティック・バイオシステムズ社製）を用いて封入を行った。乾燥後、共焦点レーザー顕微鏡（ＴＣＳＳＰ２ＡＯＢＳ、ライカマイクロシステムズ社製）にて細胞形態の観察を行った。メラノソームが核近傍に凝集している細胞が占める割合は、ＤＡＰＩ染色された核を総細胞数の指標としてカウントし、ファロイジン染色されたアクチンを細胞全体像と見なしてメラノソームが細胞核近傍に偏っている細胞数をカウントすることで算出した。なお、１試料でカウントする総細胞数はおよそ１００細胞とした。

位相差顕微鏡による観察結果を図５（ａ）～（ｃ）に示す。画像において、メラノソームは黒い斑点状として観察される。未処理の細胞においてメラノソームが末端部まで一様に分布しているのに対し、ラムナジンを添加した細胞においてメラノソームの核近傍への凝集が見られた（矢印部）。

共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を図６（ａ）、（ｂ）に示す。また、この共焦点レーザー顕微鏡による観察結果に基づき、メラノソームが核近傍に凝集している細胞が占める割合を算出した結果を図７に示す。
位相差顕微鏡による観察の際と同様に、未処理の細胞に比べ、メラノソームの核近傍への顕著な凝集がラムナジンを添加した細胞において見られた。また、メラノソームが細胞核の近傍に凝集している細胞の割合は、未処理の細胞が１％程度であるのに対し、ラムナジン処理の細胞においてはおよそ８０％であった。以上の結果から、ラムナジンはメラノソームの細胞内輸送に対して阻害効果を持つことが示された。

実施例５
（評価４：ラムナジンのメラニン色素の細胞外への排出に対する抑制効果の検証）
評価３の結果から、ラムナジンはメラノソームの細胞内輸送を阻害する効果を有していることが明らかとなった。同効果はメラニン色素の色素細胞外への排出を抑制することに繋がる可能性が考えられた。そこで、ラムナジンがメラニン色素の細胞外への排出に対して阻害効果を持つのか否かについて検証するために、色素細胞の培養時における細胞外メラニン量の定量を行った。

マウスＢ１６メラノーマ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＤ－ＭＥＭ培地にて２４時間プレ培養した。培養後、１０％ＦＢＳ及び５０μＭフォルスコリン含有のＤ－ＭＥＭ培地へ培地交換し、最終濃度が1０μＭとなるようにラムナジンを添加して３日培養した。培養後に培地を回収し、Ａｒｖｏ－ＭＸ1４２０マルチラベルカウンター（パーキンエルマー社製）で黒色メラニンに特異的な吸収波長である４０５ｎｍにて測定を行い、培地中のメラニン量を評価した。なお、細胞外メラニン量は、ラムナジンを添加していない細胞培地の測定値を１００％として算出した。また、フォルスコリンを含有しないＤ－ＭＥＭ培地で同様に培養した細胞培地をネガティブコントロールとした。

結果を図８に示す。ラムナジンはおよそ８５％程度で細胞外メラニン量を減少させた。この結果から、ラムナジンはメラニン色素の細胞外への排出に対して阻害効果を持つことが示された。

実施例６
（評価５：ラムナジンのメラニン合成関連タンパク質の発現に対する抑制効果についての検証）
評価１、３、及び４の結果から、ラムナジンは色素細胞内において産生されたメラノソームの細胞内輸送に対して抑制効果を持つことが明らかとなった。一方、評価４において示した、ラムナジンのメラニン色素の細胞外への排出を抑制する効果については、効果をもたらした一因としてメラノソームの細胞内輸送に対する阻害効果による要因以外に、色素細胞におけるメラニン合成を抑制したことによる可能性が考えられた。そこで、ラムナジンが色素細胞におけるメラニン合成に対して阻害効果を持つのか否かについて検証するために、メラニン合成関連タンパク質の一種であるｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ（Ｍｉｔｆ）に対する特異的抗体を用いてウェスタンブロッティング法を行った。

マウスＢ１６メラノーマ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＤ－ＭＥＭ培地にて２４時間プレ培養した。培養後、１０％ＦＢＳ及び５０μＭフォルスコリン含有のＤ－ＭＥＭ培地へ培地交換し、最終濃度が1０μＭとなるようにラムナジンを添加して３日培養した。３日間の培養後は、抗Ｍｉｔｆ抗体を用いて評価１と同様の方法にて検証を行った。

結果を図９に示す。ラムナジンはフォルスコリンによって誘導されたＭｉｔｆの発現をまったく抑制しなかった。Ｍｌｐｈの発現について同様に評価した結果、Ｍｌｐｈの発現はフォルスコリンの有無で影響を受けなかった。一方、ラムナジンのＭｌｐｈの発現に対する抑制効果は顕著であった。これらの結果から、ラムナジンはメラニン合成関連タンパク質の発現を抑制せず、メラノソームの輸送関連タンパク質を特異的に抑制することが示された。

実施例７
（評価６：他の薬剤との併用による相乗効果についての検証）
これまでの結果から、ラムナジンはメラニン合成関連タンパク質であるＭｌｐｈの発現を特異的に抑制する一方、メラニン合成関連タンパク質の発現を抑制しない。先述したように、細胞外メラニンの排出はメラニン合成関連タンパク質の発現を抑制するメカニズムによっても抑制される可能性がある。そのため、メラニン合成関連タンパク質の発現を抑制することを特徴とする既知美白剤とラムナジンとの併用は、細胞外メラニンの排出に対する効果が相乗的になることが期待できる。そこで、すでにメラニン合成酵素の一つであるチロシナーゼの酵素活性を阻害する効果が知られているアルブチンとの併用時における細胞外メラニン排出に対する抑制効果の有無について検証を行った。

マウスＢ１６メラノーマ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＤ－ＭＥＭ培地にて２４時間プレ培養した。培養後、１０％ＦＢＳ及び５０μＭフォルスコリン含有のＤ－ＭＥＭ培地へ培地交換し、最終濃度が５又は1０μＭのラムナジン、５０μＭのアルブチン、５μＭのラムナジン及び５０μＭのアルブチンをそれぞれ添加して３日培養した。その後の培地中のメラニン量の評価は、評価４と同様の方法にて進めた。細胞外メラニン量は、ラムナジン及びアルブチンのいずれも添加していない細胞培地の測定値を１００％として算出した。

結果を図１０に示す。アルブチンの単独添加は、未添加に比べ細胞外メラニン量をおよそ８４％に減少させた。ラムナジンを５又は1０μＭの濃度で単独添加した際の減少は、それぞれ４１及び２０％程度であった。また、アルブチンとラムナジン（５μＭ）の双方を添加した際の減少は２１％であり、それぞれを単独で添加したときよりも減少する結果であった。この結果から、ラムナジンと既知美白剤との併用は相乗的に細胞外メラニン排出を抑制することが示唆され、従来に比べてより効率的に肌の色素沈着を抑える手段が提供できることが示された。

製剤例1：化粧水
下記の成分（３）、（４）及び（８）～（１１）を混合溶解した（混合物Ａ）。次いで、下記の成分（１）、（２）、（５）～（７）及び（１２）を混合溶解した（混合物Ｂ）。得られた混合物Ａと混合物Ｂを均一に混合し、化粧水を得た。
（組成）（％）
（１）グリセリン７．０
（２）１，３－ブチレングリコール６．５
（３）ポリオキシエチレンソルビタン
モノラウリン酸エステル（２０Ｅ．Ｏ．）１．２
（４）エタノール５．０
（５）乳酸０．０５
（６）乳酸ナトリウム０．１
（７）コラーゲン１．０
（８）オランダガラシ抽出物の加水分解物０．０５
（９）アスコルビン酸２－グルコシド０．５
（１０）防腐剤０．１
（１１）香料０．１
（１２）精製水残量

製剤例２：乳液
下記の成分（１０）を加熱し、７０℃で保持した（溶液Ａ）。次いで、下記の成分（１）～（９）及び（１１）を加熱混合し、７０℃で保持した（混合物Ｂ）。得られた混合物Ｂに溶液Ａを加えて混合し、均一に乳化した（混合物Ｃ）。得られた混合物Ｃを冷却した後、下記の成分（１２）～（１５）を加え、均一に混合して乳液を得た。
（組成）（％）
（１）ポリオキシエチレンソルビタン
モノステアレート（１０Ｅ．Ｏ．）１．０
（２）ポリオキシエチレンソルビット
テトラオレエート（６０Ｅ．Ｏ．）０．５
（３）グリセリルモノステアレート１．０
（４）ステアリン酸０．５
（５）ベヘニルアルコール０．５
（６）スクワラン８．０
（７）エタノール５．０
（８）オランダガラシ抽出物の加水分解物０．００１
（９）アルブチン１．０
（１０）精製水残量
（１１）防腐剤０．１
（１２）カルボキシビニルポリマー０．２
（１３）水酸化ナトリウム０．１
（１４）ヒアルロン酸０．１
（１５）香料０．１

製剤例３：クリーム
下記の成分（１１）を加熱し、７０℃で保持した（溶液Ａ）。次いで、下記の成分（１）～（８）を加熱混合し、７０℃で保持した（混合物Ｂ）。得られた混合物Ｂに溶液Ａを加えて混合し、均一に乳化した（混合物Ｃ）。得られた混合物Ｃを冷却した後、下記の成分（９）～（１０）を加え、均一に混合してクリームを得た。
（組成）（％）
（１）流動パラフィン２３.０
（２）ワセリン７.０
（３）ベヘニルアルコール１.０
（４）ステアリン酸２.０
（５）ミツロウ２.０
（６）ソルビタンモノステアレート１.５
（７）ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート２.５
（２０Ｅ.Ｏ.）
（８）防腐剤０.１
（９）香料０.１５
（１０）オランダガラシ抽出物の加水分解物１．０
（１１）精製水残量

製剤例４：リキッドファンデーション
下記の成分（１）～（７）を混合溶解した（溶液Ａ）。この溶液Ａに下記の成分（１３）～（１８）を加え、均一に混合し、７０℃で保持した（混合物Ｂ）。次いで、下記の成分（８）～（１２）を均一に溶解し、７０℃で保持した（混合物Ｃ）。得られた混合物Ｃに混合物Ｂを添加して、均一に乳化した（混合物Ｄ）。得られた混合物Ｄを冷却した後、下記の成分（１９）及び（２０）を添加してリキッドファンデーションを得た。
（組成）（％）
（１）液状ラノリン２．０
（２）流動パラフィン５．０
（３）ステアリン酸２．０
（４）セタノール１．０
（５）自己乳化型
モノステアリン酸グリセリン１．０
（６）パラメトキシケイ皮酸
－２－エチルヘキシル８．０
（７）防腐剤０．１
（８）グリセリン５．０
（９）トリエタノールアミン１．０
（１０）カルボキシメチルセルロース０．２
（１１）ベントナイト０．５
（１２）精製水残量
（１３）酸化チタン６．０
（１４）微粒子酸化チタン２．０
（１５）微粒子酸化亜鉛５．０
（１６）マイカ２．０
（１７）タルク４．０
（１８）着色顔料４．０
（１９）オランダガラシ抽出物の加水分解物０．００１
（２０）香料０．１

製剤例５：日やけ止め乳液
下記の成分（１）～（１１）を混合分散した（分散液Ａ）。次いで、下記の成分（１２）～（１５）を混合分散した（分散液Ｂ）。得られた分散液Ａに分散液Ｂを添加して、均一に乳化した（混合物Ｃ）。得られた混合物Ｃに下記の成分（１６）及び（１７）を添加して日やけ止め乳液を得た。
（組成）（％）
（１）ポリオキシアルキレン変性
オルガノポリシロキサン１．０
（２）ジメチルポリシロキサン５．０
（３）オクタメチルシクロテトラシロキサン２０．０
（４）イソノナン酸イソトリデシル５．０
（５）パラメトキシケイ皮酸
－２－エチルヘキシル１０．０
（６）防腐剤０．１
（７）香料０．１
（８）シリコーン処理微粒子酸化チタン８．０
（９）シリコーン処理微粒子酸化亜鉛７．０
（１０）ポリスチレン末３．０
（１１）トリメチルシロキシケイ酸０．５
（１２）ジプロピレングリコール３．０
（１３）エタノール１０．０
（１４）精製水残量
（１５）食塩０．２
（１６）オランダガラシ抽出物の加水分解物０．０２
（１７）リン酸－Ｌ－アスコルビル
マグネシウム３．０

前記製剤例１～５の化粧料は、皮膚に適用することにより、高い美白効果が確認された。

Claims

ラムナス（Ｒｈａｍｎｕｓ）属の植物の抽出物、又はナスツリチウム（Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ）属、ラムナス（Ｒｈａｍｎｕｓ）属、ビスカム（Ｖｉｓｃｕｍ）属、Ｎｅｒｖｉｌｉａ属及びシジギウム（Ｓｙｚｙｇｉｕｍ）属からなる群から選ばれた植物の抽出物の加水分解物を含み、
前記抽出物又は前記加水分解物が、以下の化学式（Ｉ）で表されるラムナジンを有効成分として含有することを特徴とするメラノソーム輸送阻害剤。
前記抽出物が、ラムナス・ペティオラリス（Ｒｈａｍｎｕｓｐｅｔｉｏｌａｒｉｓ）、又はラムナス・サクサティリス（Ｒｈａｍｎｕｓｓａｘａｔｉｌｉｓ）の抽出物である、請求項１に記載のメラノソーム輸送阻害剤。
前記加水分解物が、オランダガラシ（Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、ラムナス・サクサティリス（Ｒｈａｍｎｕｓｓａｘａｔｉｌｉｓ）、ビスカム・コロラツム（Ｖｉｓｃｕｍｃｏｌｏｒａｔｕｍ）、ネルビィア・フォルジイ（Ｎｅｒｖｉｌｉａｆｏｒｄｉｉ）及びクローブ（Ｓｙｚｙｇｉｕｍａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）からなる群から選ばれた一の植物に由来する天然由来物の加水分解物である請求項１に記載のメラノソーム輸送阻害剤。
請求項１～３のいずれかに記載のメラノソーム輸送阻害剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
メラノソーム輸送阻害作用を有さない美白剤をさらに含有することを特徴とする請求項４に記載の皮膚外用剤。
前記美白剤が、チロシナーゼ活性阻害剤であることを特徴とする請求項５に記載の皮膚外用剤。
前記チロシナーゼ活性阻害剤が、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、ハイドロキノン、ハイドロキノンの塩及び配糖体、プラセンタエキス、アルブチン、エラグ酸、リノール酸、又はトラネキサム酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の皮膚外用剤。