KR20120060205A

KR20120060205A - 헤파라나제 활성 저해제

Info

Publication number: KR20120060205A
Application number: KR1020127004685A
Authority: KR
Inventors: ?스케 이리야마; 히로타다 후쿠니시; 마사루 스에츠구; 사토시 아마노
Original assignee: 가부시키가이샤 시세이도
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2010-09-29
Publication date: 2012-06-11
Also published as: RU2503454C1; AU2010301641A1; KR101431348B1; EP2484359B1; HK1171390A1; US8609075B2; US20120183481A1; US8901160B2; TWI461221B; EP2484359A4; CN102655863A; CN102655863B; JP5593323B2; EP2484359A1; US20140080878A1; IN2012DN02632A; JP2014111640A; BR112012007090A2; TW201117832A; JPWO2011040496A1

Abstract

하기 일반식 (I)로 표시되는 환형 카르복사미드 유도체(일반식 (I) 중, n은 1 내지 3의 정수이고, R¹은 수소 원자 또는 수산기로 치환되어도 좋은 탄소 수 1 내지 6의 탄화수소기이며, X는 -CH₂- 또는 -N(R²)-로 표시되는 기이고, R²는 수소 원자 또는 수산기로 치환되어도 좋은 탄소 수 1 내지 6의 탄화수소기를 의미한다.) 또는 그의 염을 활성 성분으로 포함하여 이루어지는 헤파라나제 활성 저해제.

Description

헤파라나제 활성 저해제{HEPARANASE ACTIVITY INHIBITOR}

본 발명은 일반식 (I)의 환형 카르복사미드 유도체를 활성 성분으로 하는 피부 외용제에 관한 것으로서, 특히 화장료로 사용함으로써 피부의 헤파라나제의 활성화를 억제하고, 헤파란황산을 케어함으로써 증식 인자의 제어의 파탄에 따른 피부 변화를 억제하여 생생한 피부의 상태를 유지할 수 있고, 나아가서는 미백 효과도 갖는 헤파라나제 저해제에 관한 것이다.

최근 항노화에 관한 연구가 진행되고 있다. 피부 노화의 원인은 거시적으로 보면 나이를 먹는 것이 중요한 요인이지만, 그 이외에 산화, 건조, 태양광(자외선) 등에 의한 요인도 피부 노화와 관련된 직접적인 인자로 들 수 있다. 피부의 노화의 구체적인 현상으로는 히알루론산을 비롯한 무코다당류의 감소, 콜라겐의 가교 반응, 자외선에 의한 세포의 손상 등이 알려져 있다.

또한, 피부 상해를 원인으로 하거나 자외선 폭로에 의한 피부 노화를 원인으로 하는 피부의 주름, 잔주름, 처짐 등의 억제, 개선을 목적으로 한 다양한 연구가 이루어지고 있다. 그 결과, 예컨대 히알루론산의 생산 촉진(일본 특허 공개 2001-163794호 공보: 특허 문헌 1), 매트릭스 금속 프로테이나제(MMP)의 생산·활성의 억제(일본 특허 공표 2000-503660호 공보: 특허 문헌 2), 콜라겐의 생산 촉진, 에스테라제의 활성의 저해(일본 특허 공개 평 11-335235호 공보: 특허 문헌 3), 혈관 신생의 억제(WO03/84302: 특허 문헌 4), 임파관 확장 억제(K. Kajiya et al., Am. J. Pathol., 2006, 169(4): 1496-1503. 참조: 비특허 문헌 1) 등이 유효한 것이 해명된 바 있다.

이러한 연구는 표피 또는 표피 세포에 주목한 잔주름 등의 억제, 개선을 도모하는 것과, 혈관이나 임파관을 포함하는 진피 변화의 억제에 주목한 큰주름 등의 억제, 개선을 도모하는 것의 두 개로 크게 나뉜다. 표피의 변화가 진피로 전해짐으로써 혈관이나 임파관을 포함하는 진피의 변화가 유도되는데, 그 과정에 헤파라나제가 깊이 관련되어 있다. 실제로 헤파라나제 저해제를 잔주름 모델에 도포함으로써 유의한 항주름 효과가 있음이 명백해졌다(PCT JP2009/056717).

특허 문헌 1 : 일본 특허 공개 2001-163794 특허 문헌 2 : 일본 특허 공표 2000-503660 특허 문헌 3 : 일본 특허 공개 평 11-335235호 공보 특허 문헌 4 : WO 03/84302 특허 문헌 5 : DE 2746550 특허 문헌 6 : 특허 제2901297호 특허 문헌 7 : 일본 특허 공개 2008-303186 특허 문헌 8 : 일본 특허 공표 2004-526758

비특허 문헌 1 : K. Kajiya et al., Am. J. Pathol., 2006, 169(4):1496-1503 비특허 문헌 2 : Vlodavsky I., et. al., Semin Cancer Biol., 2002;12(2): 121-129

본 발명의 과제는 헤파라나제와 피부 노화와의 관계의 관점에서 새로운 피부 노화의 예방, 억제에 유효한 약제나 기미, 주근깨, 칙칙함과 같은 색소 침착의 예방, 억제에 유효한 미백제를 발견하는 데 있다.

본 발명자는 예의 검토한 결과, 소정의 환형 카르복사미드 유도체가 헤파라나제 활성을 저해하고, 그 결과 노화나 색소 침착을 효과적으로 예방 또는 억제한다는 것을 발견했다.

따라서, 본원은 이하의 발명을 제공한다.

(1) 하기 일반식 (I)로 표시되는 환형 카르복사미드 유도체또는 그의 염을 활성 성분으로 포함하여 이루어지는 헤파라나제 활성 저해제.

(일반식 (I) 중, n은 1 내지 3의 정수이고, R¹은 수소 원자 또는 수산기로 치환되어도 좋은 탄소 수 1 내지 6의 탄화수소기이고, X는 -CH₂- 또는 -N(R²)-로 표시되는 기이고, R²는 수소 원자 또는 수산기로 치환되어도 좋은 탄소 수 1 내지 6의 탄화수소기를 의미한다.)

상기한 "탄화수소기"는 특별히 한정되지 않으며, 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬알킬, 할로알킬, 알콕시알킬, 알콕시카르보닐알킬 등일 수도 있으며, 특히 바람직하게는 알킬이다.

(2) 일반식 (I) 중, n=1인 (1)의 헤파라나제 활성 저해제.

(3) 상기 환형 카르복사미드 유도체가 2-이미다졸리디논, 1-(2-히드록시에틸)-2-이미다졸리디논 및 1-(2-히드록시에틸)-2-피롤리돈으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수 종인 (1)의 헤파라나제 활성 저해제.

(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 헤파라나제 활성 저해제를 유효 성분으로 함유하는 주름 개선제.

(5) (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 헤파라나제 활성 저해제를 유효 성분으로 함유하는 큰주름 개선제.

(6) (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 헤파라나제 활성 저해제를 유효 성분으로 함유하는 미백제.

본 발명의 헤파라나제 활성 저해제는 헤파라나제 활성을 효율적으로 저해할 수 있으므로, 예컨대 주름 개선제의 유효 성분으로서, 주름(특히 큰주름) 형성의 예방 혹은 억제에, 나아가서는 기미, 주근깨, 칙칙함 등의 색소 침착의 예방 혹은 억제에 유효한 미백제로서 적합하게 사용할 수 있다.

도 1은 정상 인간 각화 세포의 자외선 조사 및 미조사 조건 하에서의 헤파라나제 활성의 차이를 나타낸 그래프이다.
도 2는 정상 인간 둔부 조직의 자외선 조사 부위 및 미조사 부위에서의 헤파라나제 및 헤파란황산의 면역 염색 화상이다.
도 3의 (a), (b)는 모두 유사 피부 모델을 나타내는 모식도이다. (a)는 기저막 시트에 헤파란황산을 포함하지 않는 "헤파란황산 분해 모델"(헤파란 황산(-))을 나타내고, (b)는 기저막 시트에 헤파란황산을 포함하지 않는 "정상 모델"(헤파란황산(+))을 나타낸다.
도 4는 도 3(a), (b)의 유사 피부 모델을 이용한 VEGF의 투과성의 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 도 3(a), (b)의 유사 피부 모델을 이용한 혈관 신생의 평가 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 도 5의 사진에서의 혈관 면적의 해석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 멜라노사이트를 포함하는 피부 모델(MEL-FT, MatTeK사 제조, USA)의 외관 사진을 나타낸다.
도 8은 각 피부 모델의 표피 중의 멜라닌 양의 비교 결과를 나타낸다.
도 9는 노인성 색소반과 그 근방 부위의 정상 조직의 퍼레칸, 헤파란황산의 면역 염색 결과를 나타낸다.
도 10은 혈관 마커인 항 CD31 항체에 의한 면역 염색의 결과와 화상 해석 결과를 나타낸다.
도 11은 임파관 마커인 항 LYVE-1 항체에 의한 면역 염색의 결과와 화상 해석 결과를 나타낸다.
도 12는 노인성 색소반 조직에서의 in situ bFGF 결합 분석의 결과를 나타낸다.
도 13은 지루성 색소반 조직에서의 in situ bFGF 결합 분석의 결과를 나타낸다.

헤파라나제는 다양한 세포에 존재하여 다양한 헤파란황산 프로테오글리칸의 헤파란황산쇄를 특이적으로 분해하는 효소이다. 피부에서는 표피를 구성하는 표피 각화 세포 및 진피의 섬유아 세포, 혈관 내피 세포 등이 생산된다. 각종 암 세포에서도 생산이 높아지고 있음이 알려져 있으며, 암의 악성도와의 관련도 시사된 바 있다. 암 세포에서 헤파라나제의 생산이 높으면 전이성이 높아 혈관 신생의 유도능도 높은 것이 알려져 있다(Vlodavsky I., et. al., Semin Cancer Biol., 2002; 12(2):121-129(비특허 문헌 2) 참조).

헤파란황산 프로테오글리칸은 헤파란황산 결합성 증식 인자(bFGF, HGF, VEGF, HB-EGF 등)를 세포 밖으로 축적시키는 활동을 한다. 헤파란황산 프로테오글리칸의 일종인 퍼레칸은 표피와 진피의 경계부에 존재하는 표피 기저막에도 존재하며, 피부에서는 헤파란황산 결합성 증식 인자를 표피 기저막에 결합시킴으로써 표피, 진피 사이의 증식 인자의 이동을 제어하고 있다. 또한, 표피 기저막에 존재하는 퍼레칸은 기저막에 결합되어 있는 표피 기저 세포에 대한 증식 인자의 작용도 제어하고 있어 표피의 양호한 증식 및 분화에 필수적인 것이 판명되었다.

따라서, 헤파라나제의 활성화 또는 발현 항진에 의한 퍼레칸의 헤파란황산쇄의 분해는 축적된 증식 인자의 방출 및 표피, 진피 사이의 증식 인자의 제어를 붕괴시키고, 표피의 분화·증식 제어의 파탄 및 진피의 비후(肥厚)를 일으켜 주름 형성을 촉진시킨다. 바꾸어 말하면, 상기 헤파라나제 활성을 억제하는 것은 헤파란황산의 분해에 따른 증식 인자의 유리를 억제하여 표피, 진피 사이의 증식 인자의 이동을 억제하는 데 유용하다.

따라서, 헤파라나제 활성을 지표로 하여 스크리닝한 결과, 헤파라나제 활성을 유의하게 억제할 수 있는 어떠한 종류의 환형 카르복사미드 유도체가 발견되었다. 환형 카르복사미드 유도체로는 다양한 화합물이 알려져 있으며, 예컨대 피부 보습제로서의 용도(DE 2746550: 특허 문헌 5), 삼투 촉진 화합물로서의 용도(일본 특허 제2901297: 특허 문헌 6), 각질 세포막(cornified envelope)도 형성·성숙화 촉진제로서의 용도(일본 특허 공개 2008-303186: 특허 문헌 7)는 알려져 있다. 그러나, 환형 카르복사미드 유도체가 헤파라나제 활성 저해 작용을 나타내는 것은 종래 기술에 있어서 전혀 알려져 있지 않다.

실시예의 난에서 상세하게 설명한 바와 같이, 본 발명자는 이번에 배양 정상 각화 세포에 자외선을 조사하면, 정상 각화 세포의 헤파라나제가 활성화되는 것도 밝혔다(도 1 참조). 또한, 인간의 피부에 자외선이 조사됨으로써 표피에서 헤파라나제의 양이 증가하여 기저막의 헤파란황산이 저하하는 것을 밝혔다(도 2 참조). 여기서, 잔주름 모델뿐만 아니라 자외선에 의해서도 헤파라나제가 활성화되는 것이 판명되었다.

또한, 헤파라나제가 활성화되면 기저막 헤파란황산이 분해되므로 본 발명자들은 유사 피부 모델로서 기저막에 헤파란황산을 포함하는 정상 모델과 기저막에 헤파란황산을 포함하지 않는 헤파란 황산 분해 모델을 제작하여 VEGF의 투과성 및 혈관 신생의 평가를 행했다. 그 결과, 정상 모델과 비교하여 헤파란황산 분해 모델에서는 VEGF의 투과성이 증가하여 혈관신생이 유도됨을 밝혔다(도 3 내지 6 참조).

현재까지 야노 등은 자외선에 의해 진피에서 혈관 신생이 유도되어 진피의 변화가 일어나는 것이 큰주름 형성에 중요하다는 것을 개시하고 있으므로(일본 특허 공표 2004-526758: 특허 문헌 8), 헤파라나제는 잔주름 형성뿐만 아니라 큰주름 형성에도 깊게 관여하는 효소임을 발견했다. 즉, 헤파라나제 활성을 저해하는 것은 건조에 의한 잔주름의 예방뿐만 아니라 장기간 일광 폭로 등에 의한 큰주름의 예방에도 효과적이다. 여기서 "큰주름"이란 눈꼬리나 비순구(鼻唇溝) 등에 생기는 근육면에 대해 수직 방향의 크고 깊은 주름을 말하며, 표피뿐만 아니라 진피에도 변화가 생긴 결과 형성되는 것을 말한다.

헤파라나제의 활성을 지표로 하는 일차 평가에 있어서는 하기의 실시예에 있어서 상세하게 기재한 바와 같이 비오틴화한 헤파란황산을 96웰에 고정화한 후, 약제 존재 하에서 헤파라나제를 작용시키고, 비오틴화 헤파란황산의 감소량을 퍼옥시다아제 표지한 아비딘을 작용시키고 발색시킴으로써 헤파라나제 활성을 평가한다. 일차 평가에 있어서 헤파라나제 활성 저해 효과가 있었던 약제는 이차 평가계에서 재현성 및 농도 의존성의 평가를 했다. 그 결과, 환형 카르복사미드 유도체가 헤파라나제 활성을 저해하는 것을 발견했다.

본 명세서에 있어서 "항노화"란 나이가 들어감에 따른 또는 광 노화에 따른 기저막 프로테오글리칸의 헤파란황산의 분해에 의한 헤파란황산 결합성 증식 인자에 수반되는 피부 변화, 구체적으로는 표피 분화 이상, 진피 혈관 신생, 임파관 확장, 엘라스틴 분해를 억제함으로써 피부의 주름, 처짐, 경화 등을 방지하고 개선하여 탄력이 있는 생생한 건강한 피부의 상태를 유지하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명자는 실시예의 난에서 상세하게 설명한 바와 같이 노인성 색소반 조직은 노광부 피부와 비교하여 기저막의 헤파란황산을 분해하고 있음을 밝혔다. 헤파란황산의 분해에 따라 표피에서 발현하고 있는 혈관 내피 세포 증식 인자-A(VEGF-A)의 제어가 파탄되고, 이에 따라 진피의 혈관이나 임파관의 변화에 의해 염증을 발생시키고 멜라노사이트를 활성화시켜 멜라노좀으로의 멜라닌 저장을 촉진시킨다. 또한, 진피에서 발현되고 있는 섬유아 세포 증식 인자-7(FGF7)의 제어가 파탄됨으로써 멜라노사이트로부터 표피 세포에서 멜라노좀의 주고받음이 촉진된다. 즉, 헤파라나제 활성화에 따른 헤파란황산의 분해는 염증에 의한 멜라노사이트의 활성화와 FGF-7 제어의 파탄에 따른 멜라노좀 주고받음 촉진에 의해 상승적으로 멜라노좀이 케라티노사이트에 축적되는 것으로 생각된다. 따라서, 헤파라나제 활성 저해제는 주름의 예방이나 억제뿐만 아니라 기미, 칙칙함, 주근깨 등의 색소 침착의 예방, 억제를 위한 미백제로도 유용하다.

본 명세서에 있어서, "미백"이란 기저막의 헤파란황산의 분해에 수반되는 멜라노사이트의 활성화의 결과 생기는 케라티노사이트에서의 멜라노좀의 축적에 의한 피부의 흑색화를 억제하여 기미, 주근깨, 칙칙함 등을 개선하는 것을 의미한다. 본 발명에서 말하는 "미백 방법"이란 특별히 언급이 없는 한 미용 목적을 의미하는데, 경우에 따라 의료 목적으로 하는 경우도 있다.

본 발명의 헤파라나제 활성 저해제는 헤파라나제 활성과 관련된 그 밖의 다양한 상태 또는 증상의 치료, 개선 또는 예방에 이용할 수도 있다. 여기서 "헤파라나제 활성과 관련된 상태 또는 증상"으로는 암 세포의 증식 또는 전이, 혈관 신생 등을 들 수 있다. 따라서 본 발명의 헤파라나제 활성 저해제를 함유하는 의약 조성물은 암 세포의 증식 또는 전이의 억제, 혈관 신생의 억제 등에도 이용된다.

본 발명의 일반식 (I)의 환형 카르복사미드 유도체가 공지의 물질인 경우, 공지의 방법에 의해 용이하게 합성할 수 있으며, 또는 시판품을 용이하게 구입할 수 있고, 또한 비록 신규한 화합물이라 하더라도 당업자라면 공지의 방법에 의해 용이하게 합성할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명의 일반식 (I)의 환형 카르복사미드 유도체는 공지의 방법에 의해 무기염 또는 유기염으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서 이용되는 염으로는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 무기염으로는 염산염, 황산염, 인산염, 브롬화수소산염, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 암모늄염 등을 들 수 있다. 유기염으로는 아세트산염, 락트산염, 말레산염, 푸마르산염, 타르타르산염, 시트르산염, 메탄술폰산염, p-톨루엔술폰산염, 트리에탄올아민염, 디에탄올아민염, 아미노산염 등을 들 수 있다.

본 발명의 헤파라나제 활성 저해제는 식 (I)의 환형 카르복사미드 유도체 또는 그의 염을 1종만 단독으로 포함하고 있을 수도 있는데, 2종 이상의 식 (I)의 환형 카르복사미드 유도체 또는 그의 염을 임의의 조합 및 비율로 포함하고 있을 수도 있다.

본 발명의 헤파라나제 활성 저해제에서의 식 (I)의 환형 카르복사미드 유도체 또는 그의 염의 함유량은 헤파라나제 활성의 저해 작용을 유효하게 발휘하기에 충분한 양이면 특별히 한정되지 않으며, 헤파라나제 활성 저해제의 용도에 따라 적당히 선택하면 된다. 단 일반적으로는 헤파라나제 활성 저해제 전체에 대한 식 (I)의 환형 카르복사미드 유도체 또는 그의 염의 비율을 통상 0.0001 질량% 이상, 그 중에서도 0.0001 질량% 이상, 그리고 통상 1 질량% 이하, 그 중에서도 0.2 질량% 이하로 하는 것이 바람직하다. 2종 이상의 식 (I)의 환형 카르복사미드 유도체 또는 그의 염을 사용하는 경우에는 이들의 합계량이 상기 범위를 만족시키도록 하면 된다.

또한, 본 발명의 헤파라나제 활성 저해제는 식 (I)의 환형 카르복사미드 유도체 또는 그의 염에 의한 헤파라나제 활성의 저해 작용을 실질적으로 해치지 않는 한에 있어서, 식 (I)의 환형 카르복사미드 유도체 또는 그의 염 이외에 다른 임의의 성분을 함유하고 있을 수도 있다. 다른 성분으로는 헤파라나제 활성의 저해 작용을 갖는 다른 화합물(다른 활성 성분)이나 의약적으로 허용될 수 있는 담체 및/또는 보조제를 들 수 있다. 이러한 다른 성분은 1종을 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 임의의 조합 및 비율로 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 헤파라나제 활성 저해제는 상법을 따라 제조할 수 있으며, 또한 피부 외용제를 구성하는 성분으로서 일반식 (1)의 환형 카르복사미드 유도체 또는 그의 염의 1종 또는 2종 이상 단독으로도 조제 가능한데, 통상 의약부외품을 포함하는 화장품이나 의약품 등의 피부 외용제 등에 사용되는 성분, 예컨대 유분, 계면 활성제, 분말, 색재, 물, 알콜류, 증점제, 킬레이트제, 실리콘류, 산화 방지제, 자외선 흡수제, 보습제, 향료, 각종 약효 성분, 방부제, pH 조정제, 중화제 등필요에 따라 적당히 배합된다.

본 발명의 헤파라나제 활성 저해제의 투여 경로 및 제형은 모두 한정되지 않으며, 그 용도에 따라 적당히 선택하면 된다. 투여 경로의 예로는 국소 투여(피부 외용 등), 경구 투여, 비경구 투여(정맥 투여, 복강내 투여 등) 등을 들 수 있는데, 항노화제로서 사용하는 경우에는 피부 외용제로서 사용하는 것이 바람직하다. 제형으로는 국소 투여(피부 외용재)의 경우, 용액계, 가용화계, 유화계, 분말 분산계, 물-오일 이층계, 물-오일-분말 삼층계 등을 패치제, 연고, 크림, 유액, 화장수, 겔, 에어졸 등으로 한 형태를 들 수 있다. 경구투여의 경우, 정제, 코팅정, 당의정, 과립제, 산제, 캡슐제(예컨대 하드 또는 소프트 젤라틴 캡슐) 등의 고형 제제나 내복액제, 시럽제 등의 액체 제제(용액, 현탁액) 등의 형태를 들 수 있다. 비경구 투여의 경우, 주사액 등의 형태를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 헤파라나제 활성 저해제에는 일반식 (1)의 환형 카르복사미드 유도체 또는 그의 염에 의한 헤파라나제 활성의 저해 작용을 실질적으로 해치지 않는 한에 있어서, 본 발명의 일반식 (1)의 환형 카르복사미드 유도체 또는 그의 염 이외에 다른 1종 또는 2종 이상의 임의의 성분을 배합할 수도 있다. 다른 성분은 특별히 한정되지 않으며, 의약 조성물의 용도, 제형, 투여 형태 등에 따라 적당히 선택하면 되는데, 예로서는 의약적으로 허용될 수 있는 담체 및/또는 보조제를 들 수 있다. 보조제로는 예컨대 희석제, 결합제, 붕괴제, 증점제, 분산제, 재흡수 촉진제, 교미제, 완충제, 계면 활성제, 용해 보조제, 보존제, 유화제, 등장화제, 안정화제, pH 조정제 등을 들 수 있다.

구체적인 예로서 본 발명의 헤파라나제 활성 저해제를 피부 외용제로 하는 경우, 외용제에 통상 사용되는 성분, 예컨대, 미백제, 보습제, 산화 방지제, 유성 성분, 자외선 흡수제, 계면 활성제, 증점제, 알콜류, 분말 성분, 색제, 수성 성분, 물, 각종 피부 영양제 등을 필요에 따라 적당히 배합할 수 있다. 또한, 에데트산2나트륨, 에데트산3나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속 이온 봉쇄제, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 부틸파라벤 등의 방부제, 카페인, 탄닌, 베라파밀, 트라넥섬산 및 그 유도체, 감초 추출물, 글라브리딘(glabridin), 모과 과실의 열수 추출물, 각종 생약, 아세트산 토코페롤, 글리시리진산 및 그 유도체 또는 그의 염 등의 약제, 비타민 C, 아스코르빈산 인산마그네슘, 아스코르빈산 글루코시드, 알부틴, 누룩산 등의 미백제, 글루코오스, 프럭토스, 만노스, 자당, 트레할로스 등의 당류, 레티노인산, 레티놀, 아세트산 레티놀, 팔미틴산 레티놀 등의 비타민 A 유도체류 등도 적당히 배합할 수 있다.

상기 성분은 예시로서 이들에 한정되는 것이 아니다. 또한 이들 성분은 원하는 형태에 따른 처방에 따라 적당히 조합하여 배합하는 것이 가능하다.

본 발명의 피부 외용제의 제형은 특별히 한정되는 것이 아니며, 예컨대, 용액계, 가용화계, 유화계, 분말 분산계, 물-오일 이층계, 물-오일-분말 삼층계, 연고, 겔, 에어졸 등의 임의의 제형을 취할 수 있다. 또한, 사용 형태도 특별히 한정되지 않으며, 예컨대, 화장수, 유액, 크림, 에센스, 젤리, 젤, 연고, 팩, 마스크, 파운데이션 등의 임의의 형태를 취할 수 있다.

본 발명의 헤파라나제 저해제는 피부에 적용함으로써 큰주름의 형성의 예방 및/또는 형성된 주름의 경감·소실을 도모하기 위한 미용 방법에 이용할 수 있다. 이러한 미용 방법에서의 본 발명의 피부 외용제의 용법, 용량도 특별히 한정되지 않으며, 제형이나 처치할 피부의 주름의 상태에 따라 적당히 결정되는데, 전형적으로는 1일 당 수 회, 예컨대 1회 내지 5회, 적당량, 예컨대 1 평방 cm² 당 0.1 ml 내지 1 ml, 피부에 직접 문질러 바르거나, 또 그 적량을 거즈 등에 스며들게 하고 나서 피부에 붙일 수 있다.

이상, 본 발명에 대해 구체적인 예를 들어 설명했지만, 이상의 구체적인 예는 어디까지나 예시로서, 본 발명은 특허청구범위를 벗어나지 않는 범위에서 임의의 변경을 가하여 실시하는 것이 가능하다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 하기의 실시예에 한정되는 것이 아니다.

실시예

1. 헤파라나제 활성의 저해율을 지표로 한 평가

A431 세포(침윤성 인간 상피 암세포)를 10% 혈청 함유 DMEM(달베코 변법 이글 배지)에서 배양했다. 배양 세포를 용해 버퍼(Lysis Buffer)(50 mM 트리스, 0.5% TritonX-100, 0.15M 염화나트륨, pH 4.5)에서 가용화하고 스크레이퍼로 회수한 후, 피페팅을 행하고, 얼음 위에서 30분간 정치했다. 그 후, 10,000 rpm으로 10분 원심하여 불용해물을 제거하고 상청을 세포 추출액으로서 회수했다. 이 세포 추출액 중의 단백질량을 BCA 단백질 정량 키트(BCA Protein Assay Kit, PIERCE, CA46141)로 측정했다.

이어서, 전술한 A431 세포 추출액을 분석 버퍼(50 mM HEPES, 50 mM 아세트산나트륨, 150 mM 염화나트륨, 9 mM 염화칼슘, 0.1% BSA)에서 500 ㎍/mL로 희석했다. 계속해서, 시험 대상인 화합물을 DMSO에 용해하고, 이 희석 세포 추출액에 대해 0.0005 질량%, 0.005 질량% 및 0.05 질량%의 비율이 되도록 첨가하고 혼합하여 시료 용액을 제작했다(DMSO의 마지막 농도 5%). 컨트롤 용액은 희석 세포 추출액에 대해 DMSO를 마지막 농도 5%가 되도록 혼합한, 이들 시료 용액 및 컨트롤 용액을 비오틴화 헤파란황산 고정화 플레이트에 100 μL/웰의 비율로 파종했다. 37℃에서 2시간 반응시키고, PBS-T로 3회 세정하고 나서 10,000배 희석 HRP-아비딘(Vector, A-2004)/PBS-T를 100 μL/웰의 비율로 가하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 다시 PBS-T로 3회 세정하고, TMB 시약(BIO-RAD, 172-1066)을 100 μL/웰의 비율로 가하여 반응시키고, 1N 황산으로 반응을 정지한 후, 475nm에서의 흡광도(OD475)를 측정했다.

또한, 전술한 A431 세포 추출액의 어세이 버퍼에 의한 단계 희석액(세포 추출액 농도 500 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 0.5 ㎍/mL)에 시험 대상인 화합물을 첨가하지 않고, DMSO를 마지막 농도 5%가 되도록 첨가하여 혼합했다(검량선용 용액). 이 검량선용 용액에 대해 전술한 바와 동일한 순서로 비오틴화 헤파란황산 고정화 플레이트에의 파종 이후의 처리를 행하고 OD475를 측정했다.

이어서, 검량선용 용액의 OD475의 값에 기초하여 단백질 농도의 검량선을 작성하고, 이 검량선을 이용하여 시험 대상 화합물을 각 첨가 농도로 첨가한 시료 용액의 OD475의 값으로부터 각 시료 용액의 단백질 농도를 산출했다. 또한, 컨트롤용 용액에 대해서도 마찬가지로 단백질 농도를 산출했다. 각 시료 용액의 단백질 농도와 컨트롤용 용액의 단백질 농도와의 비율(%)로부터 각 시료 용액의 헤파라나제 활성의 저해율을 구했다.

또한, 이상의 순서에 대해서는 일본 특허 공표 2003-502054호 공보를 참조하라.

이상의 순서로 각종 환형 카르복사미드 유도체의 헤파라나제 활성 저해 작용을 시험했다. 결과를 표 1에 나타냈다. 표 1로부터, 각종 환형 카르복사미드 유도체는 첨가 농도 0.0005%에서도 37.64%, 첨가 농도 0.05%에서는 94.74%나 되는 저해율을 나타내어 헤파라나제 활성을 효과적으로 저해하는 것이 자명해졌다. 2-이미다졸리디논, 1-(2-히드록시에틸)-2-이미다졸리디논 및 1-(2-히드록시에틸)-2-피롤리돈

2. 자외선에 의한 헤파라나제의 활성 변화의 평가

정상 인간 각화 세포를 정상 각화 세포용 배지 EpiLife에서 배양했다. 배지를 PBS로 일시적으로 치환하고 나서 50 mJ의 UVB를 조사하고, 1시간, 2시간, 4시간 배양 후에 세포를 용해 버퍼(Lysis Buffer)로 가용화한 것을 자외선 조사군의 시료 용액으로 사용했다. 또한, 배지를 PBS로 일시적으로 치환하고, 자외선을 조사하지 않은 것을 컨트롤용 용액으로 사용했다. 이들 시료 용액 및 컨트롤용 용액을 이용하여, 실시예 1과 동일한 처리를 행하고 OD475를 측정했다. 얻어진 OD475의 값에 기초하여 실시예 1과 동일한 방법으로 헤파라나제 활성을 평가했다. 그 결과를 도 1에 나타냈다. 자외선을 조사하지 않는 컨트롤과 비교하여 자외선 조사군에서는 헤파라나제가 유의하게 활성화하는 것이 자명해졌다.

자외선 조사 인간 피부에서의 헤파라나제 및 헤파란황산의 면역 염색

20대 인간 둔부에 2MED의 자외선을 조사하고, 2일 후에 조사 부위와 근방의 자외선을 조사하지 않은 둔부 피부를 바이옵시(biopsy)로 채취하고, AMeX법으로 파라핀 블록을 제작했다. 3 μm의 조직 절편을 제작하고, 헤파라나제 및 헤파란황산의 면역 염색을 실시했다. 얻어진 면역 염색 화상을 도 2에 나타냈다. 자외선 조사 부위에서는 미조사 부위와 비교하여 헤파라나제의 양이 증가해 있었으며, 또한 헤파란황산의 양은 저하되어 있음이 자명해졌다.

헤파란황산의 유무에 따른 VEGF의 투과성 및 혈관 신생의 평가

헤파란황산 2 mg 및 아가로스 10 mg을 PBS 1 ml(1% 아가로스 용액)에 가열 용해하고 나서 인서트(코닝사제 24웰용 트랜스 웰)에 도포함으로써 헤파란황산을 포함하는 시트를 형성했다. 또한, 컨트롤로서 헤파란황산을 사용하지 않고 아가로스만을 사용한 것 이외에는 동일한 순서에 의해 헤파란황산을 포함하지 않는 시트를 형성했다. 이와 같이 해서 인서트 안을 표피측, 시트를 기저막, 웰을 진피측으로 선정한 유사 피부 모델을 제작했다(도 3a, b).

이와 같이 하여 얻어진 유사 피부 모델은 기저막으로 선정한 시트(이하 "기저막 시트"라고 함)에서의 헤파란황산의 유무에 따라 VEGF의 투과성 및 혈관 신생을 평가하는 평가계로서 사용할 수 있다. 또한, 이하의 기재에서는 기저막 시트 중에 헤파란황산을 포함하는 유사 피부 모델을 "정상 모델", 기저막 시트 중에 헤파란황산을 포함하지 않는 유사 피부 모델을 "헤파란황산 분해 모델"이라고 한다.

먼저, VEGF의 투과성을 평가하기 위해, 각 모델의 표피측(인서트 내)에 10 ㎍/mL의 VEGF 수용액을 첨가하여 실온에서 3시간 정치하고, 진피측의 웰 내의 VEGF 농도를 VEGF ELISA 키트(R&D systems)로 검출했다. 그 결과를 도 4에 나타냈다. 정상 모델에서는 헤파란황산 분해 모델과 비교하여 VEGF의 투과량이 현저하게 감소해 있었다.

다음, 혈관 신생을 평가하기 위해, 각 모델의 표피측(인서트 내)에 100 ㎍/mL의 VEGF 수용액을 첨가하고, 혈관 신생 키트(쿠라보사)에 세팅하여 11일간 배양한 후, 배양물의 광학 현미경 사진을 촬영했다. 얻어진 화상을 도 5에 나타냈다. 헤파란황산 분해 모델에서는 농도 의존적으로 현저한 혈관 신생이 인정되었으나, 정상 모델에서는 혈관 신생은 인정되지 않았다.

또한, 혈관 신생 키트용 해석 소프트(쿠라보사)를 이용하여 도 5의 화상의 혈관 면적을 해석했다. 그 결과를 도 6에 나타냈다. 헤파란황산 분해 모델에서는 정상 모델과 비교하여 현저한 혈관 면적의 증가가 인정되어 혈관 신생이 유의하게 일어나 있음을 밝혔다.

3. 헤파라나제 저해제에 의한 미백 효과의 평가

멜라노사이트를 포함하는 피부 모델을 이용하여 헤파라나제 저해제인 1-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-3-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-우레아의 미백 효과에 대해 검토했다.

멜라노사이트를 포함하는 피부 모델(MEL-FT, MatTeK사 제조, USA)을 전용 배지(MEL-FT-NMM-113, MatTeK사 제조, USA)에서 배양을 시작했다. 배양 2일째부터는 컨트롤군은 DMSO, 헤파라나제 저해제군은 마지막 농도 50μM이 되도록 1-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-3-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-우레아를 가하고 배양을 행하고, 배지 교환을 2일 또는 3일마다 행했다. 배양 10일째, 14일째에 피부 모델을 채취하여 외관 사진을 촬영했더니, 헤파라나제 저해제군에서는 외관의 색이 컨트롤군보다 얇고 흰 것을 알 수 있었다.

또한 그 피부 모델의 표피만을 채취하고, 0.2N 수산화나트륨 용액 300 μL를 가하고 교반한 후, 24시간 실온에서 정치하고, 30분간 95℃에서 가열함으로써 표피를 완전히 가용화시켰다. 가용화 후의 용액의 475nm 흡광도를 측정함으로써 표피 중에 포함되는 멜라닌량을 검토하면, 헤파라나제 저해제군은 컨트롤군과 비교하여 유의하게 OD475nm의 값이 낮은, 즉 멜라닌량이 적은 것이 자명해졌다.

도 7은 MEL-FT 피부 모델의 외관 사진을 나타낸다. 배양 10일, 14일째에 헤파라나제 저해제군에서 명백하게 흰 것을 알 수 있다. 도 8은 각 피부 모델의 표피 중의 멜라닌량의 비교 결과를 나타낸다. 배양 10일, 14일에 있어서 헤파라나제 저해제군에서 멜라닌의 지표가 되는 OD475nm의 흡광도치가 유의하게 낮은 것을 알 수 있었다. 따라서, 헤파라나제 저해제에 미백 효과가 있음이 입증되었다.

4. 동결 인간 조직의 면역 염색

노인성 색소반 및 근방의 정상 부위 피부의 동결 조직 블록을 새로 절편화하여 8 μm의 절편을 작성했다. 8 μm로 박리하여 자른 조직 절편은 차가운 아세톤에 의해 고정하고 건조한 후, PBS로 탈 OCT를 행했다. 3% 과산화수소수 처리로 조직 내재성 퍼옥시다아제를 불활화하고 나서 10% 정상 염소 혈청으로 블로킹하고, 표 1의 1차 항체, 2차 항체의 순서로 반응시켰다. HRP 표지시킨 조직은 PBS로 5회 세정한 후, AEC로 발색시켰다. 발색 후의 조직은 흐르는 물로 충분히 세정하고 나서 수용성 마운트제를 이용하여 봉입했다.

5. in situ bFGF 분석

25 ㎍의 bFGF를 200 μL의 팽윤 헤파린-세파로스(CL-6B; Pharmacia Biotech)에 결합시키고, DMSO에 용해한 NH₂-반응성-비오틴(Dojindo molecular tech.)을 실온에서 5분 반응시키고, 800 μL의 세정 버퍼(20mmol/L HEPES, pH 7.4, 400mmol/L NaCl)로 세정하고, 200 μL의 용출 버퍼(20mmol/L HEPES, pH 7.4, 0.2% BSA, 3mol/L NaCl)로 2회 용출시킴으로써 고염농도 비오틴화 bFGF를 회수했다. 그 후, Ultra free C3LGC 칼럼(아미콘)에 넣고 PBS로 3회 세정함으로써(0.25g/L) 비오틴화 bFGF를 얻었다.

5 μm로 박리하여 자른 파라핀 조직 절편(노인성, 지루성 각화증 부위와 그 근방 정상 부위)를 크실렌으로써 탈파라핀한 후, 에탄올(100%→70%)로 치환하고, 3% 과산화수소수 처리로 조직 내재성 퍼옥시다아제를 불활화했다. 그 후, pH 5의 버퍼(0.5M NaCl 함유), pH 10의 버퍼(0.5M NaCl 함유)로 세정함으로써 내재성의 헤파란황산 결합 인자를 유리시켰다. 10% 혈청으로 블로킹하고, 비오틴화 bFGF(10nmol/L)를 실온 1시간 반응시키고, PBS로 3회 세정했다. 그 후, 퍼옥시다아제 표지 스트렙토아비딘(Nichirei, Japan)을 실온에서 15분 작용시키고, PBS로 3회 세정하고, DAB로 발색시켰다. 발색 후의 조직은 흐르는 물로 충분히 세정하고 나서 헤마톡실린으로 핵을 염색시키고, 에탄올(70%→100%) 치환, 크실렌 치환하고 나서 봉입했다.

6. 혈관, 임파관 화상 해석

CD31 염색, LYVE1 염색 조직은 하나의 절편 당 3장의 사진을 촬영하고, win roof(Mitani Corporation)로 염색된 혈관, 임파관의 수, 면적을 화상 해석으로 산출했다. 또한, 진피 유두층 영역의 진피 총 면적도 화상 해석으로 산출함으로써 혈관이나 임파관의 밀도, 크기를 산출했다.

도 9는 노인성 색소반과 그 근방 부위의 정상 조직의 퍼레칸, 헤파란황산의 면역 염색 결과를 나타낸다. 정상 조직에서는 퍼레칸, 헤파란황산 모두 기저막이 염색되어 있지만, 노인성 색소반 조직에서는 퍼레칸 염색만 염색되고, 헤파란황산의 염색은 현저하게 저하해 있었다. 이 결과로부터, 노인성 색소반 부위에서는 헤파란황산이 특이적으로 분해를 받고 있음을 알 수 있다.

도 10은 혈관 마커인 항 CD31 항체에 의한 면역 염색의 결과와, 화상 해석 결과를 나타낸다. 각 염색 조직을 화상 해석 소프트 win roof로, cd31로 염색된 혈관의 수, 굵기, 면적을 산출함으로써 노인성 색소반 부위와 그 근방 정상 부위의 혈관의 변화를 해석했다. 노인성 색소반 부위에서 혈관의 크기, 혈관 면적이 유의하게 높은 것이 자명해졌다. 이 결과로부터 노인성 색소반 부위에서는 혈관 확장이 일어나고 있음이 자명해졌다.

도 11은 임파관 마커인 항 LYVE-1 항체에 의한 면역 염색의 결과와 화상 해석 결과를 나타낸다. 각 염색 화상을 해석 소프트 win roof로, LYVE-1로 염색된 임파관의 수, 굵기, 면적을 산출함으로써 노인성 색소반 부위와 그 근방 정상 부위의 임파관의 변화를 해석했다. 노인성 색소반 부위에서 임파관의 크기, 임파관 면적이 유의하게 높은 것이 자명해졌다. 이 결과로부터 노인성 색소반 부위에서는 임파관 확장이 일어나고 있음이 자명해졌다.

도 12는, 노인성 색소반 조직에서의 in situ bFGF 결합 분석의 결과를 나타낸다. 노인성 색소반의 근방의 정상 조직에서는 기저막이 갈색으로 염색되어 있으므로 bFGF가 결합하는 것을 나타내고 있지만, 노인성 색소반 부위에서는 기저막의 염색이 보이지 않는, 즉 bFGF가 결합 가능하지 않음을 나타내고 있어, 헤파란황산의 분해에 의해 bFGF가 결합할 수 없었던 것으로 생각된다.

도 13은 지루성 색소반 조직에서의 in situ bFGF 결합 분석의 결과를 나타낸다. 지루성 색소반의 근방의 정상 조직에서는 기저막이 갈색으로 염색되어 있으므로 bFGF가 결합하는 것을 나타내고 있지만, 지루성 색소반 부위에서는 기저막의 염색이 보이지 않는, 즉 bFGF가 결합 가능하지 않음을 나타내고 있어 헤파란황산의 분해에 의해 bFGF가 결합할 수 없었던 것으로 생각된다.

본 발명의 헤파라나제 활성 저해제는 헤파라나제 활성을 효율적으로 저해할 수 있으므로 예컨대 주름 개선제의 유효 성분으로서 주름(특히 큰주름)의 형성의 예방, 억제, 또는 기미, 주근깨, 칙칙함 등의 색소 침착의 예방, 억제 등에 사용할 수 있다.

Claims

하기 일반식 (I)로 표시되는 환형 카르복사미드 유도체 또는 그의 염을 활성 성분으로 포함하여 이루어지는 헤파라나제 활성 저해제.

(일반식 (I) 중, n은 1 내지 3의 정수이고, R¹은 수소 원자 또는 수산기로 치환되어도 좋은 탄소 수 1 내지 6의 탄화수소기이며, X는 -CH₂- 또는 -N(R²)-로 표시되는 기이고, R²는 수소 원자 또는 수산기로 치환되어도 좋은 탄소 수 1 내지 6의 탄화수소기를 의미한다.)
제1항에 있어서, 일반식 (I) 중, n=1인 헤파라나제 활성 저해제.
제1항에 있어서, 상기 환형 카르복사미드 유도체가 2-이미다졸리디논, 1-(2-히드록시에틸)-2-이미다졸리디논 및 1-(2-히드록시에틸)-2-피롤리돈으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수 종인 헤파라나제 활성 저해제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 헤파라나제 활성 저해제를 유효 성분으로 함유하는 주름 개선제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 헤파라나제 활성 저해제를 유효 성분으로 함유하는 큰주름 개선제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 헤파라나제 활성 저해제를 유효 성분으로 함유하는 미백제.